Studie účinků kalcitriolu proti stárnutí na lidské přirozené zabijácké buňky in vitro

ABSTRAKTNÍ

Vitamin D je široce považován za látku, která má regulační účinek na imunitní systém. Některé klinické studie ukázaly, že poptávka povitamín D se zvyšuje s věkem. Kalcitriol je biologicky aktivní formaVitamín D. Jeho účinek na lidské přirozené zabíječe (NK) však zůstává nejasný. Proto jsme v této studii zkoumali anti-aging a imunomodulační účinky kalcitriolu na NK buňky pomocí řady imunologických metod, abychom prozkoumali jeho důležitou roli ve vrozené imunitě. Zjistili jsme, že kalcitriol zvrátil expresi biomarkerů souvisejících se stárnutím v NK buňkách a inhiboval jejich expanzi udržováním těchto buněk ve fázi G1, bez jakékoli apoptózy a vyčerpání. Kalcitriol potlačil uvolňování cytokinů souvisejících se zánětem, jako je interleukin-5 (IL-5), interleukin-13 (IL-13), interferon-gama (IFN- ), a tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF-). Degranulace NK buněk byla downregulována kalcitriolem, když byly tyto buňky kokultivovány s nádorovými buňkami K562. Zjistili jsme také, že kalcitriol upreguloval se stárnutím související dráhu sirtuin 1- protein/kinázy R-like endoplazmatické retikulum kinázy (SIRT1/pERK) a expresi SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8) aktivací receptoru vitaminu D (VDR). Kromě toho by kalcitriol mohl být potenciálním negativním regulátorem NK buněkapoptózaamitochondriální inaktivacekterá je způsobena tímoxidační stres. Tak se projevuje kalcitriolúčinky proti stárnutína lidských NK buňkách in vitro aktivací osy SIRT1-PERK aodolává oxidačnímu stárnutí.

Kliknutím sem získáte doplňky proti stárnutí Cistanche

1. Úvod

Mnoho studií zjistilo, že stárnutí má přímý vliv na několik onemocnění, jako jsou infekční onemocnění, kardiovaskulární onemocnění, neurodegenerativní onemocnění, autoimunitní poruchy a rakovina. Stárnutí organismu je doprovázeno imunosenescencí. Mezi společné rysy stárnutí patří především zánětlivé stárnutí s chronickým nízkým zánětem [1], nestabilita genomu, nerovnováha exprese proteinů, mitochondriální inaktivace, buněčná senescence a změny v mezibuněčné komunikaci [2]. Jako hlavní složka vrozené imunity hrají NK buňky důležitou roli v protiinfekčních a protinádorových účincích a také v regulaci imunitního systému [3]. NK buňky mohou eliminovat cílové buňky přímo nebo prostřednictvím buněčné cytotoxicity závislé na protilátkách (ADCC), místo toho, aby vykazovaly jakékoli antigenně nebo protilátkově specifické odpovědi [4]. NK buňky jsou také spojovány s hypersenzitivními reakcemi a autoimunitními onemocněními [5]. Když imunitní systém stárne, exprese povrchových aktivačních receptorů, jako je přirozený zabijácký člen skupiny 2 D (NKG2D) [6], zabíječský imunoglobulinový receptor (KIR), shluk povrchových markerů diferenciace 57 (CD57) [7] se zvýšil shluk diferenciace 16 (CD16) [8]. Tato molekula by mohla aktivovat zabíjející funkci NK buněk, což může vést k buněčné nerovnováze a zánětu u starších lidí. Mezitím se snížily inhibiční molekuly NK buněk, jako je přirozený zabíječ skupiny 2 člen A (NKG2A), přirozený zabíječský člen skupiny 2 C (NKG2C) a přirozené receptory cytotoxicity (NCR) [6]. Dalšími markery NK buněk souvisejícími se stárnutím jsou imunoglobulin T buněk a protein 3 obsahující mucinovou doménu (TIM3) a zvýšená programovaná buněčná smrt-1 (PD{30}}). Upregulace PD-1 a TIM3 během imunosenescence může inhibovat funkce NK buněk a vést k depleci NK buněk [9].

Dalším faktorem vedoucím k imunosenescenci je imunitní zánět [10]. Bylo hlášeno, že vysoké hladiny zánětlivých cytokinů uvolňovaných NK buňkami způsobují poškození DNA, oxidační stres a stárnutí buněk. Navíc buněčná nerovnováha NK buněk a stav zánětu mohou vést k autoimunitnímu onemocnění [11]. Hladiny interleukinu-1 (IL-1), interleukinu-4 (IL-4), interleukinu-6 (IL-6), interleukinu -10 (IL-10) a tumor nekrotizující faktor alfa (TNF- ) jsou vyšší u starších lidí [12]. I když počet celkových imunitních buněk se stárnutím klesal, populace NK buněk se pozoruhodně zvýšila, což může být způsobeno infiltrací zánětlivých buněk [13].

Vitamin D existuje v lidském těle ve dvou aktivních formách jako vitamin D2 (ergokalciferol) a vitamin D3 (kalcitriol). Primární funkcí vitaminu D je podporovat vstřebávání vápníku a fosforu. Vitamin D také reguluje imunitní funkce [14]. Ačkoli se mnoho zpráv soustředilo na jeho protiinfekční a protinádorové funkce [15], kalcitriol vykazuje také protizánětlivé účinky [16]. Receptor vitaminu D (VDR) je exprimován na různých imunitních buňkách [17]. Pokles produkce zánětlivých cytokinů přispívá ke snížení zánětlivých reakcí. Je známo, že kalcitriol potlačuje produkci TNF-, interleukinu-1 (IL-1), interleukinu-2 (IL-2), interferonu-gama (IFN-) a jiné zánětlivé cytokiny v B a T buňkách. Může také uvolňovat protizánětlivé cytokiny jako IL-4 a IL-10 [18] a regulovat autofagii proti infiltraci zánětlivých buněk [19].

Antioxidační vlastnosti kalcitriolu byly popsány u deprese, ztučnění jater [20], kardiovaskulárních onemocnění a dalších onemocnění souvisejících se zánětem. Volné radikály a reaktivní formy kyslíku (ROS) se také hromadí v buňkách a tkáních během stárnutí. Publikované údaje prokázaly, že oxidační stres ovlivňuje různé signální dráhy v buňkách [21], včetně drah SIRT1, mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) a nukleárního faktoru-κB (NF-κB). Gen SIRT1 je považován za gen pro dlouhověkost a suprese tohoto genu má za následek poruchy související s expresí proteinů, buněčným cyklem a metabolismem [22]. SIRT1-ΔExon8 je nová izoforma SIRT1, která existovala u savců alternativním sestřihem. SIRT1-ΔExon8 byl také považován za koregulační faktor SIRT1 plné délky [23].

Dosud se jen velmi málo studií zaměřuje na účinky stárnutí a oxidativní stárnutí na NK buňky. Účinky kalcitriolu na SIRT1-ΔExon8 také nebyly hlášeny. Proto se tato studie zaměřila na zkoumání účinků kalcitriolu na stárnutí a oxidační senescenci NK buněk, protože tyto buňky zaujímají centrální pozici v lidském vrozeném imunitním systému.

2. Materiály a metody

2.1 Buněčná kultura a činidla

Tři vzorky lidské periferní krve byly získány od dárců, kteří neměli žádné aktivní autoimunitní onemocnění, akutní nebo chronické zánětlivé onemocnění, rakovinu nebo jiná onemocnění související s imunitou. Věk dárců se pohyboval od 48 do 65 let. Mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly izolovány pomocí Lymphoprep Ficoll. NK buňky byly expandovány a udržovány pomocí NK Cell Culture Kit (MoreCell, Shenzhen, Čína) při 37 stupních / 5 procent CO2.

2.2 Analýza průtokovou cytometrií

Po ošetření kalcitriolem po dobu 72 hodin byly NK buňky obarveny anti-lidským FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 a PE-KIR (BioLegend, Kalifornie, USA). Všechny testy FACS byly provedeny pomocí průtokového cytometru DxFLEX (Beckman, Kalifornie, USA).

2.3 Měření buněčné expanze, uvolňování cytokinů a test buněčného cyklu

Buněčná expanze byla stanovena pomocí sady Cell Counting Kit-8 [24] (CCK8; Beyotime, Shanghai, Čína). NK buňky byly ošetřeny kalcitriolem po dobu 48 hodin a supernatant byl odebrán pro test uvolňování cytokinů. Hladiny cytokinů byly zkoumány pomocí LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Kalifornie, USA). Nejprve byly perličky zachycené cytokiny inkubovány se standardy nebo vzorky a poté dále inkubovány s biotinylovanými detekčními protilátkami. Následně byl přidán roztok vázající biotinylovanou detekční protilátku, streptavidin (SA)-PE, aby poskytl fluorescenční signál [25]. Tyto signály byly poté analyzovány pomocí testu FACS.

Buněčný cyklus byl měřen pomocí soupravy Cell Cycle Detection Kit (Beyotime, Shanghai, Čína). NK buňky byly ošetřeny kalcitriolem po dobu 72 hodin. Tyto buňky byly fixovány v 70% ledově chladném ethanolu a poté obarveny ribonukleázou A (RNáza A) a propidium jodidem (PI) (Beyotime, Shanghai, Čína) [26].

2.4 Test zabíjení NK buněk

Lidské erytroleukemické buňky, buňky K562 (ATCC, Virginia, USA), byly inkubovány s 10 uM 3,3 -dioktadecyl-oxakarbocyaninu (DIOBeyotime, Shanghai, Čína) po dobu 15 minut a poté přidány k NK buňkám ošetřeným kalcitriolem v různých poměrech (E/T'=1:1, 5:1 a 10:1) po dobu 4 hodin, resp. (27].

2.5 Oxidační indukce stárnutí a analýza barvení X-gal

Model stárnutí NK buněk in vitro využívající peroxid vodíku (H2O2). Aby se stanovil antioxidační účinek kalcitriolu, byly NK buňky nejprve ošetřeny kalcitriolem a poté vystaveny 100 μM H2O2 po dobu 24 hodin. Aktivita -galaktosidázy byla měřena pomocí barvení 5-brom-4-chlor-3-indolyl- -D-galaktopyranosidem (X-gal). Ošetřené buňky byly fixovány ve 4% paraformaldehydu a barveny roztokem pro barvení -galaktosidázou (Beyotime, Shanghai, China) přes noc při 37 stupních [28]. Obarvené buňky byly poté suspendovány v PBS a snímky těchto buněk byly získány pomocí systému fluorescenčního inverzního mikroskopu Leica. Pro každou skupinu byly náhodně shromážděny tři mikroskopické snímky z různých pozic při 40násobném zvětšení. Procento buněk obarvených X-gal bylo vypočteno a použito k posouzení stárnutí buněk pomocí softwaru ImageJ V.1.45S.

2.6 Barvení a analýza potenciálu mitochondriální membrány

Chloromethyl-X-Rosamin (CMXRos) a Hoechst (Beyotime, Shanghai, Čína) byly použity k posouzení potenciálu mitochondriální membrány. Buněčná jádra (modrá) byla lokalizována Hoechstovým barvením, zatímco mitochondriální membránový potenciál byl stanoven mitochondriální specificitou označující fluorescenční barvivo, CMXRos. Buňky Hoechst plus CMXRos (označené bílými šipkami) vykazovaly nízkou aktivitu. Relativní hladina fluorescence byla vypočtena vydělením počtu Hoechst-pozitivních buněk CMXRos-pozitivními buňkami [29]. Buňky byly inkubovány s 200 nM CMXRos a Hoechst (30 min, 37 stupňů) a detekovány za použití invertovaného mikroskopu Leica při excitačních vlnových délkách 579 nm a 350 nm. Procento buněk Hoechst plus CMXRos plus bylo vypočteno tak, jak je popsáno v části 2.5.

2.7 Western blotting

Buňky byly lyžovány pomocí lyzačního pufru pro radioimunoprecipitační test (RIPA) (Beyotime, Shanghai, Čína) s inhibitorem fosfatázy PhosSTOP (Roche, Basilej, Švýcarsko) a 1 uM fenylmethylsulfonylfluoridem (PMSF) (Beyotime, Shanghai, Čína). Celkový protein byl kvantifikován pomocí soupravy Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokio, Japonsko). Vzorky proteinů byly separovány elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu sodného (SDS-PAGE) a přeneseny na 0.22 μm polyvinylidenfluoridové (PVDF) membrány (membrána Immobilon-P; Millipore, Massachusetts, USA). Po zablokování byly membrány sondovány primárními protilátkami a inkubovány se sekundárními protilátkami [30]. Membrány byly detekovány pomocí systému Odyssey (LI-COR, Nebraska, USA).

2.8 Statistická analýza

Data byla analyzována jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA) s použitím GraphPad Prism a prezentována jako průměr ± standardní odchylka (SD). 6846 W. LI ET AL. Rozdíly byly považovány za statisticky významné při P < 0,05. Výsledky byly také analyzovány pomocí softwaru GraphPad.

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950