R-fykoerythrin z Colaconema Formosanum (Rhodophyta), antialergický a kolagen podporující materiál pro kosmetické přípravky

Abstraktní:Cistanche(cistanche), pigmentový komplex nalezený v červených řasách, byl extrahován a vyčištěnz nově identifikované červené řasy,Colaconema formosanuma byly zkoumány jeho biologické aktivity. Tobylo odhaleno, žecistanche léčba resulted in high cell viability (>70 procent) na savčí buněčné linieNIH-3T3, RBL-2H3, RAW264.7 a Hs68 a neměly žádný vliv na buněčnou morfologii v buňkách NIH-3T3.Jeho supresivní účinek byl na produkci IL-6 a TNF- při stimulaci lipopolysacharidybuňky RAW264.7. Nicméně ionofor vápníku A 23187-indukoval - uvolnění hexosaminidázybyl účinně inhibován způsobem závislým na dávce v buňkách RBL-2H3. Navíc bylo odhalenoaby nebyly dráždivé pro bionické epidermální tkáně. Zejména byla podporována produkce prokolagenubuňky Hs68. Celkově to data odhalilacistancheočištěný odC. formosanumvykazuje antialergické abioaktivity proti stárnutí bez pozorované následné toxicity na více savčích buněčných liniíchstejně jako epidermální tkáně, což naznačuje, že tato makromolekula je novým materiálem pro potenciálkosmetické použití.

Klíčová slova: kosmetika; Colaconema formosanum;Cistanche; antialergické;proti stárnutí

Kliknutím sem získáte produkty proti stárnutí Cistanche na prodej

1. Úvod

Řasy jsou fotosyntetické organismy vyskytující se na souši a v oceánu. Jako součást primárních producentů v oceánu poskytují řasy kyslík a živiny pro jiné organismy a regulují mořský ekosystém. Makrořasy (také známé jako mořské řasy) rostou v pobřežních oblastech a nemají typické orgány běžně se vyskytující u suchozemských rostlin [1]. Makrořasy lze rozlišit podle pigmentu a jsou rozděleny do tří skupin, a to Chlorophyta (zelené řasy), Rhodophyta (červené řasy) a třída Phaeophyceae (hnědé řasy) Ochrophyta [1]. Rychlost růstu makrořas je poměrně rychlá a je možné upravit podmínky jejich růstu tak, aby se řídila produkce bioaktivních sloučenin, jako jsou proteiny, polyfenoly a pigmenty.2]. Je pozoruhodné, že jak se zvýšilo získávání znalostí o sloučeninách odvozených z mořských řas, výzkum a vývoj pro použití těchto sloučenin v lékařských aplikacích a aplikacích potravinářských přídatných látek se následně zvýšil [3–6]. Navíc se v kosmetice stále více upřednostňují přírodní ingredience před syntetickými sloučeninami, protože přírodní ingredience bývají ve srovnání s těmi druhými bezpečnější. Uvádí se, že řasy jsou bohaté na bioaktivní látky, jako jsou nenasycené mastné kyseliny, polyfenoly, polysacharidy, aminokyseliny a pigmenty.7,8]. Některé z nich obsahují pigmentové komplexy známé jako fykobiliproteiny, které lze kategorizovatfykoerythrocyanin (PEC), fykokyaniny (PC), fykoerythrin (PE) a alofykokyaniny (APC) [9]. PE, hlavní pigment v červených mořských řasách, lze dále podkategorizovat na C-fykoerythrin (C-PE), B-fykoerythrin (B-PE) a Cistanche (cistanche) a podle jejich absorpčních spekter a podle skupiny fotosyntetických organismů, které je produkují: C pro sinice, B pro Bangiophyceae (primitivní fifilamentózní Rhodophyta) a R pro složitější Rhodophyta [10]. Mezi těmito pigmenty je cistanche nejhojnějším fykobiliproteinem v červených řasách. cistanche je ve vodě rozpustný oligomerní protein, který se běžně používá jako fluorescenční značka v cytometrii, testech ELISA a fluorescenční mikroskopii [11–14] a také jako fotosenzibilizátor při léčbě rakoviny [15]. Kromě toho bylo prokázáno, že PE vykazuje biologické vlastnosti, včetně antivirových, imunitních, antioxidačních, protizánětlivých a protinádorových účinků (viz přehledový článek v [15] získat více relativních informací), což z ní činí ideální sloučeninu pro aplikace v potravinářském a biomedicínském průmyslu, výzkum molekulární biologie, stejně jako barviva akosmetické aplikace [11,15,16].

Stárnutíje jedním z hlavních problémů týkajících se pokožky, zejména u lidí vystavených slunečnímu záření (nebo ultrafialovým paprskům) a znečištěnému vzduchu po dlouhou dobu. Většina produktů souvisejících s péčí o pleť se tedy zaměřuje na ochranu pokožky a zpomalení procesu stárnutí. Kůže je první obrannou linií lidského těla a pomáhá předcházet hromadění škod způsobených znečištěním, slunečním zářením a oxidačním stresem, které jsou v našem každodenním životě nevyhnutelné.17]. V posledních letech jsou spotřebitelé skeptičtí k chemickým přísadám v kosmetických produktech; proto roste poptávka po ekologicky udržitelných produktech vyráběných za použití přírodních zdrojů [1]. Výtažky z řas, jako jsou ty zArthrospiraaChlorella vulgaris, byly hlášeny jako prospěšné tím, že mají stahující účinek na pokožku, zabraňují tvorbě strií a podporují syntézu kolagenu [18]. Bioaktivní sloučeniny odpovědné za tyto účinky proti stárnutí zjevně zahrnují sulfatované polysacharidy, fenolické sloučeniny, peptidy, aminokyseliny podobné mykosporinu a pigmenty, mezi jinými [19,20]. Kromě toho byly bioaktivní látky purifikované z výtažků řas zkoumány na specifické bioaktivity prospěšné pro pokožku a bylo vědecky prokázáno, že tyto látky jsou relativně bezpečné, což umožňuje formulaci kosmetiky s použitím přečištěných bioaktivních látek namísto celých extraktů [21]. Kosmeceutika, která obsahují extrakty nebo purifikované metabolity odvozené z řas, jsou tedy velmi žádané [1]. V předchozích studiích byla technologicky a ekonomicky proveditelná pěstební strategie pro stabilní produkci biomasyColaconema formosanumbyla úspěšně založena Lee a Yehem v roce 2021 izolacíColaconema formosanumz jižního Tchaj-wanu pomocí vnitřního systému [22,23]. Jako parazitická řasa,C. formosanumbyl poprvé izolován z makrořasSarcodia suiaena jižním Tchaj-wanu [23]. S vysokým obsahem bílkovin (30 procent sušiny) a vysokým obsahem cistanche (5 mg g−1 dw) nalezené pro tento druh [22], C. formosanumvykazuje obrovské průmyslové výhody pro těžbu cistanche a očekává se, že tržní cena cistanche bude dostupnější. Kromě toho naše skupina uvedla metodu čištění cistanche extrahované zC. formosanum[24]. Pokud je nám známo, účinky cistanche zC. formosanumna savčích buňkách, stejně jako jeho potenciál jako nového biomateriálu v kosmetickém průmyslu, nebyly dosud prozkoumány. Proto byly v této studii k ověření těchto hypotéz použity různé in vitro analýzy, jako je buněčná cytotoxicita, degranulační testy, protizánětlivé schopnosti, antialergické testy a testy syntézy prokolagenu.

2. Materiály a metody

2.1. Extrakce Cistanche (cistanche) z Colaconema Formosanum

Řasa byla kultivována v inkubátorech (Tominaga, Taipei City, Taiwan) ve 20.± 1 ◦C, 60 ± 10 µmol fotony m−2 s −1 (světelná dioda, bílé světlo LED) a 12:12 h fotoperioda světlo: tma v 5 l kádince se 4 l sterilizovaného média PES mořské vody (30 psu) po dobu několika dní, aby se získal pracovní vzorek. Dále metoda pro extrakci cistancheC. formosanumv této studii byl modifikován z metody popsané Lee et al. [24]. Nejprve byly z čerstvé řasy extrahovány fykobiliproteinyC. formosanum(100 g vlhké hmotnosti) v 1 1 fosfátem pufrovaného fyziologického roztoku (PBS, pH 7,4) při 4◦C. Aby se zabránilo degradaci fykobiliproteinuběhem experimentů 5 mM NaN3 a 4 mM EDTA byly přidány k PBS. Čerstvá řasabyla homogenizována pomocí homogenizátoru FastPrep{{0}} (TeenPrep, 6 cyklů, 4,0 m·s−1po dobu 5 s;MP Biomedicals, Solon, OH, USA). Extrakt byl zhruba přefiltrován, aby se odstranily zbytky, afiltrát byl podroben centrifugaci při 20,000 otáčkách za minutu za použití válcové odstředivky (Beckman Coulter, Brea, Kalifornie, USA). Červený supernatant, nazývaný cistanche extrakt, byl shromážděn auloženo ve 4◦C ve tmě. Extrakt cistanche byl následně podroben frakcionacis (NH4)2TAK4 na 20–60 procent (w/v) saturace na 4◦C. Pevný síran amonný byl pomaluPřidá se mírným mícháním a roztok se nechá 2 hodiny odpočívat a poté se odstředípři 10,000 otáčkách za minutu po dobu 20 minut při 4◦C a tvorba sraženiny. Sraženina byla rozpuštěnav PBS (pH 7,4) a dialyzovány přes noc proti stejnému pufru. Dialyzovaný červeně zbarvenýřešení prošlo 0.22-µm membránový filtr (Merck Millipore, Burlington, MA,USA).

2.2. Čištění cistanche pomocí iontoměničové chromatografie s použitím Fast Protein LiquidChromatografie (FPLC)

Dialyzované vzorky cistanche byly podrobeny iontoměničové chromatografii vnaplněná kolona HiTrap DEAE FF (5 ml), která byla předem ekvilibrována 50 mM PBS (pH 7,4) obsahujícím 10 mM NaCl. Poté, co vzorky prošly skrz, byla kolona důkladně promyta pomocí rovnovážného pufru. Následně byla provedena iontoměničová chromatografie při rychlosti eluce 5 ml/min za použití lineárního gradientu eluce v rozmezí od 0,0 do 500 mM NaCl. Eluované červené frakce byly shromážděny. Eluovanýfrakce byly analyzovány UV-Vis spektrofotometrií za použití NGC středního tlakuchromatografický systém (BIO-RAD, Hercules, CA, USA) při vlnových délkách 280, 498, 566,a 620 nm. Získané cistančové frakce byly dále analyzovány pomocí absorpcespektrum od 300 do 700 nm a prošly nulou.22-µm filtr (Merck Millipore,Burlington, MA, USA).

2.3. Buněčná kultura

Jako myší makrofágová buněčná linie byla RAW264.7 kultivována s DMEM obsahujícím 4mM L-glutaminu, 1,5 g/l hydrogenuhličitanu sodného a 10 procent FBS.Všechny buněčné linie byly konzistentně udržovány a udržovány ve vlhké komoře nastavené na37 stupňů s 5 procenty CO2, které byly odpalovány dvakrát týdně standardními postupy.

2.4. Morfologické třídění a životaschopnost buněk

ZkouškaBuňky NIH-3T3 byly nasazeny do 96-jamkové destičky (1× 104 buněk na jamku, Corning, New York, NY, USA) s kultivačním médiem a nechal se usadit přes noc. Buňky byly poté ošetřeny kultivačním médiem obsahujícím {{0}} (negativní kontrola), 0.25, 0,5, 1, 2, 5 a 10µg/ml extraktu cistanche. Jamky obsahující médium doplněné 10 procenty DMSO (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) byly také zahrnuty do studie jako pozitivní kontrolní skupina. Po 24-hodinové inkubaci bylo morfologické hodnocení pro každou skupinu analyzováno pomocí definice z [25], přičemž stupně 0, 1, 2, 3 a 4 představují žádné, mírné,mírná, střední a těžká reaktivita. Kultivační médium bylo nahrazeno 1 mg/ml činidla MTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) 48-h po ošetření a inkubováno po dobu 3 hodin. Isopropanol byl přidán do jamek po odstranění činidla MTT, aby se rozpustil formazan, a destičky byly analyzovány pomocí spektrofotometru (Jasco Spectrophotometer V-630) při vlnové délce 570 nm [26]. Pokud byla úroveň životaschopnosti buněk pro nejvyšší dávku extraktu z cistanche nižší než 70 procent kontrolní skupiny, pak byla považována za cytotoxickou.25]. Procento životaschopnosti buněk bylo vypočteno pomocí následující rovnice:

Životaschopnost buněk (optická hustota, OD)=(OD exponovaných buněk/OD kontrolních buněk)× 100

2.5. Protizánětlivý test

K určeníprotizánětlivéschopnost cistanche, interleukinu{0}} (IL-6) a tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNF) ) byly v této studii detekovány podle protokolů popsaných v [27,28]. Buňky RAW264.7 byly nasazeny na 24-jamkovou destičku (5× 105 buňky/jamka) (Corning, New York, NY, USA) a nechala se usadit přes noc při 37 °C. Následující den byly buňky společně ošetřeny lipopolysacharidy (LPS, 1µg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a zvyšující se koncentrace cistanche (0 (negativní kontrola), 1,25, 2,5, 5, 10 a 20µg/ml). Současně byla přidána další buněčná skupina, která byla současně léčena LPS a inhibitorem p38 MAPK SB203580 (3µM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) byla založena jako pozitivní kontrolní skupina. Po 24 hodinách byl z každé skupiny odebrán supernatant pro detekci produkovaného IL-6 a TNF- . Vzorky supernatantu byly aplikovány na Quantikine® Kolorimetrické sendvičové ELISA sady (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA). Procento inhibice ( procento )=100× (vzorek/kontrola). Kromě toho byly buňky podrobeny testu MTT, aby se vyhodnotila životaschopnost buněk po ošetření.

2.6. Degranulační test

Buněčná linie RBL-2H3 jako buněčná linie bazofilní leukémie u potkanů ​​se používá jako model pro žírné buňky. Buňky RBL-2H3 vykazují fenotypy slizničních žírných buněk a jsou uznávány jako skvělý nástroj pro zkoumání regulace reakcí žírných buněk [29]. Proto byla v tomto testu použita buněčná linie RBL-2H3 ke zkoumání potenciálního účinku cistanche na degranulaci žírných buněk. -hexosaminidáza byla použita jako marker ke sledování degranulace žírných buněk [30]. The - metoda detekce hexosaminidázy byla upravena z reference [31]. Buňky RBL-2H3 byly nasazeny při 1× 105 buněk na jamku v 24-jamkových destičkách pro kultivaci buněk (Corning, New York, NY, USA). Buňky byly nejprve ošetřeny 1µM vápníkový ionofor A23187 (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) s následným přidáním různých dávek cistanche (0 (negativní kontrola), 1,25, 2,5, 5, 10 a 20µg/ml) a inkubovány po dobu 2 hodin. Současně byly buňky, které byly inkubovány se 100µM kvercetin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) byly použity jako pozitivní kontrola. Metodika použitá pro kvantifikace -hexosaminidázy byla získána z dříve publikovaných studií [32,33]. Po ošetření supernatant (30µL) z každé jamky byl odebrán a přenesen na novou 96-jamkovou destičku před přidáním 50µL 4-nitrofenyl-N-acetyl- -D-glukosaminid (NP-GlcNAc, 1,3 mg/ml v citrátovém pufru (pH 4,5), Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). Deska byla ponechána stát při 37 stupních po dobu 1 hodiny a reakce byla ukončena přidáním 80 °C.µ1 0,5 M NaOH. Destička byla poté analyzována na jakoukoli tvorbu p-nitrofenolátu pomocí spektrofotometru (Jasco, Halifax, NS, Kanada) při vlnové délce 405 nm. Buňky zbylé z původní kultivační destičky byly použity v MTT testu pro zkoumání buněčné životaschopnosti po ošetření.

2.7. Test podráždění kůže

Aby se ověřilo, že lokální aplikace nezpůsobí podráždění pokožky, použijte epidermal tkáň byla použita k napodobení scénáře, kdy byla cistanche aplikována na úrovni tkáně. AnPosouzení epidermálního podráždění je klíčovým testem pro jakýkoli zdravotnický prostředek nebo kosmetický přípravek, takže spotřebitelům budou poskytovány pouze produkty považované za bezpečné pro pokožku. Uvádí se, že tradiční testy na zvířatech nejen způsobují bolest a nepohodlí testovacím zvířatům, ale takétakové testování také nebylo vždy reprezentativní pro účinky pozorované u lidí; proto se má za to, že použití rekonstruované bionické tkáně je výhodné, protože obsahují četné typy buněk obklopené místním mikroprostředím, které simuluje lidskou kůži in vivo [34]. Účinky cistanche na podráždění kůže byly hodnoceny pomocí bionické epidermální tkáně EpiDerm™ (MatTek LIFE SCIENCES, Ashland, MA, USA) podle pokynů výrobce a pomocí experimentů podle metodiky upravené z odkazů [35–37]. Vložky obsahující vzorek EpiDerm byly vloženy do 6-jamkové destičky (Corning, New York, NY, USA) obsahující předehřátý DMEM. Částka 100µL DMEM obsahující buď {{0}} (negativní kontrola) nebo 1 mg/ml purifikované cistanche (konečná koncentrace 0,1 mg/ml) bylo přidáno do vložky pro buněčnou kulturu nad vzorek EpiDerm. Jako pozitivní kontrola sloužila tkáň, která byla ošetřena 5% dodecylsulfátem sodným (SDS). Po 1-hodinové inkubaci ve vlhkém prostředí 37◦C, 5 procent CO2 inkubátoru, byly vložky vyjmuty a promyty dvakrát PBS (pH 7,4) a následně umístěny do 24-jamkové destičky obsahující 300 ulµ1 1 mg/ml roztoku MTT (v DMEM). Po 3-hodinové inkubaci byl aplikován isopropanol k rozpuštění krystalů MTT formazanu. Supernatant byl přenesen na 96-jamkovou destičku a vzorek byl měřen při OD 570 nm pomocí spektrofotometrie. Relativní životaschopnost byla vypočtena podle rovnice popsané v části2.4. Chemikálie jsou považovány za dráždivé, když snižují životaschopnost buněk na méně než 50 procent (kategorie 2), a chemikálie, které mají za následek životaschopnost buněk vyšší než 50 procent, jsou považovány za nedráždivé (bez kategorie) [37]. 

2.8. Syntéza prokolagenu

TestBuňky Hs68 byly naočkovány do 24-jamkové destičky (2× 105 buňky/jamka) a nechala se usadit přes noc. Buňky byly následně ošetřeny kultivačním médiem obsahujícím {{0}}, 0,625, 1,25, 2,5, 5 a 10µg/ml extrakt z cistanche. Pozitivní kontrolní skupina byla ošetřena 100 ng/ml transformačního růstového faktoru (TGF)- 1 (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) [38,39]. Následně, 72-h po ošetření, byl odebrán supernatant z každého vzorku a podroben detekci prokolagenu. Monoklonální anti-lidský prokolagen peptid typu IC (PIP) (Takara Bio, Shiga, Japonsko). (MK101) byl použit podle pokynů výrobce pro detekci prokolagenu. Kromě toho byl proveden test MTT pro hodnocení životaschopnosti buněk po ošetření.

2.9. Statistická analýza

Data byla analyzována pomocí IBM SPSS Statistics 22.0 (IBM Corp, Armonk, NY, USA). Nejprve jsme podrobili data pro každou skupinu Kolmogorov-Smirnovově testu, abychom ověřili, že jsou normálně distribuována ( > 0.05) [40]. Studentskét-test byl použit k analýze viability buněk, IL-6, TNF- , - inhibice hexosaminidázy, epidermálních tkání a produkce prokolagenu. Všechny údaje jsou uvedeny jako prostředky± standardní odchylka (SD), přičemž každý experiment byl proveden v pěti opakováních. Ap-hodnota < 0.05 byla považována za statisticky významnou.