Část 2: Kanabinoidní receptor typu 2 podporuje fibrózu ledvin prostřednictvím řízení - kateninové signalizace

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Obrázek 4| Komplex -arrestin 1( -arr1)/SRC proto-onkogen (Src) zprostředkovává kanabinoidním receptorem typu 2 (CB2) indukovanou aktivaci signalizace -catenin( -cat). (a) Reprezentativní grafy ukazují vazbu CB2 s -arr1 nebo Src. Člověkledvinaproximálnítrubkový(HKC-8) buňky byly ošetřeny aminokylindolem (AM1241; 10 uM) samotným nebo společně ošetřeny XL-001 (10 uM) po dobu 24 hodin. Celobuněčné lyzáty byly imunoprecipitovány protilátkou proti CB2 a blotovány protilátkami proti -arr1 a Src. (pokračování)

Cistanche je dobrý na renální fibrózu

CB2 zesiluje Wnt signalizaci podporou dráhy -arrestin 1/Src/ -catenin

Jak je znázorněno na obrázku 6a-c, ektopická exprese CB2 nebo Wnt1 indukovala upregulaci -arestinu 1 a fosfo-Src (Tyr15), aktivní formy Src. Hladiny exprese -arestinu 1 a fosfo-Src(Tyr416) ​​byly dále zvýšeny koexpresí CB2 a Intl. Poté jsme provedli cos-trénink na CB2 s -cateninem in situ hybridizací a imunofluorescencí u UIRI myší s koexpresí CB2 a Wnt1. Téměř všechny CB2-pozitivní tubulární buňky exprimovaly -catenin, což naznačuje potenciální roli -cateninu v dráze CB2 (obrázek 6d). Dále jsme testovali expresi -arestinu 1 a aktivního -kateninu imunofluorescenčním barvením. Jak je znázorněno na obrázku 6e, CB2 spolupracoval s Wntl na zvýšení jejich exprese. Navíc u UIRI myší byla CB2-nebo Wntl indukovaná aktivace -cateninu a jeho cílů MMP-7 a Snail dále zvýšena vzájemnou koexpresí (obrázek 6f-i). Podobný expresní vzorec Kim-1, jak byl hodnocen imunohistochemií a analýzou Western blot, také ukázal, že CB2 měl synergicky stimulační účinek na Wnt1-indukované tubulární poškození (obrázek 6e, f a j).

Cistanchemůže zlepšitledvinafunkce

Exogenní CB2 a Wnt1 synergicky indukují -catenin signalizaci a renální fibrózu u nefropatie vyvolané kyselinou listovou

Detailní návrh experimentu je znázorněn na obrázku 7a. Jak je znázorněno na obrázcích 7b a c, při indukci kyselinou listovouledvinyektopická exprese CB2 nebo Wntl indukovala upregulaci CB2 a hladiny CB2 byly dále zvýšeny koexpresí CB2 a Wntl. Poté jsme zkoumali expresi -arestinu 1 a fosfo-Src(Tyr416). Jak je znázorněno na obrázku 7d-g, exogenní CB2 a Wnt1 synergicky zvýšily expresi jak -arestinu 1, tak fosfo-Src. Kromě toho imunobarvení aktivního -cateninu ukázalo, že CB2 nebo Wntl zvýšily aktivaci -cateninu a měly kooperativní účinek (obrázek 7d). Podobné výsledky byly získány, když byla exprese aktivního -kateninu a jeho downstream cílů MMP-7 a Snail hodnocena pomocí Western blotu (obrázek 7h-k). Expresní hladiny Kim-1, fibronektinu a a-SMA byly upregulovány ektopickou expresí CB2 nebo Wnt1 a dále zvýšeny jejich koexpresí (obrázky 7h a 1 a 8a-c). Podobné výsledky byly získány, když bylo hodnoceno barvení fibronektinem, kolagenem I, Kim-1 a Massonovým trichromem (obrázek 8d). Tyto výsledky dále naznačují, že CB2 hraje aktivní roli v kateninové dráze indukované -arestinem 1/Src.

Cistanchemůže zlepšitledvinafunkce

Knockdown -arestin 1 zlepšuje -catenin signalizaci a renální fibrózu u AM1241-indukovaných UIRI myší

Poté jsme zkoumali roli krátké vlásenkové RNA zprostředkované in vivo umlčení -arestinu 1 u UIRI myší, kterým byl injekčně podán AM1241 (obrázek 9a). Umlčovací účinnost -arestinu 1 byla potvrzena kvantitativní PCR v reálném čase (obrázek 9b). Podávání AM1241 dále zvýšilo hladiny sérového kreatininu a dusíku močoviny v krvi; avšak knockdown -arestinu 1 významně inhiboval tato zvýšení dokonce i u UIRI myší po podání AM1241 (obrázek 9c a d). Kvantifikace barvení kyselinou periodickou-Schiff (doplňkový obrázek S3) ukázala, že knockdown -arestinu 1 velmi chránil před AM1241-indukovaným tubulárním poškozením (obrázek 9e). Výsledky imunobarvení ukázaly, že knockdown -arestinu 1 inhiboval AM1241-upregulovanou expresi aktivního -cateninu (obrázek 9f). Kromě toho výsledky barvení fibronektinu, kolagenu I a Kim-1 dále potvrdily ochrannou roli interference s -arrestinem 1 vledvinafibrogeneze(Obrázek 9g). Podobné výsledky byly pozorovány při hodnocení exprese aktivního -kateninu, MMP-7, hlemýžďů, fibronektinu, a.-SMA nebo Kim{4}} analýzou Western blot (obrázek 9h-n). Je zajímavé, že jsme pozorovali, že knockdown -arrestinu 1 inhiboval expresi CB2, což naznačuje aktivační smyčku mezi CB2, -arrestinem 1 a -cateninem (obrázek 9h a o). Massonovo trichromové barvení a kvantifikace fibrotické oblasti dále prokázaly - umlčení arerestinu 1 silně inhibovalo AM1241-urychlenéledvinovéfibróza(Obrázek 9g a p).

CB2 je následným cílem -cateninu a usnadňuje aktivační smyčku s -cateninem

V promotorových oblastech lidských i myších genů CB2 bylo mnoho kopií dokonalých předpokládaných vazebných míst pro faktor T-buněčný faktor / lymfoidní enhancer (obrázek 10a). HKC-8 buňky byly transfekovány N-koncově zkrácenými, FLAG-značenými, konstitutivně aktivovanými

Cistanchemůže zlepšitledvinafunkce