Identifikace běžných jaterních metabolitů přírodní bioaktivní sloučeniny echinakosidu, purifikované z Cistanche

3.1. Kvantifikace echinakosidu A v analýze S9 jater potkana a člověka

echinakosidA byla zkoumána pomocí frakcí S9 potkaních a lidských jater a kvantifikována pomocíHPLC-QQQ/MS v různých časových bodech. Zbývající verše časový profil echinakosiduA, v léčbě frakcí S9 potkaních a lidských jater, jsou znázorněny na obrázku1. Pomocí 'dobře promíchanémodel“ a výpočet vzorce [27], předpokládaná hodnota je uvedena v tabulce1. Krysajátra S9 metabolizovala ~75,4 procenta echinakosidu A během 60 minut. Lidská játra S9 metabolizována~49,8 procenta echinakosidu A během 120 minut. V přítomnosti NADPH byl echinakosid Ametabolizován pomaleji, s at1/2 = 114.92 min u lidí. EH je frakce drogyje filtrován játry v jednom průchodu, při kterém je léčivo nevratně odstraněno (extrahováno).Zjistili jsme, že EH u krys byl vyšší než u lidí. Tento výsledek je rozumný,soudě podlet1/2 hodnoty, protože se uvádí, že krysí játra metabolizují rychleji nežlidská játra [28]. Ve srovnání s jinými zprávami o sloučeninách s použitím potkaních jater S9, GKB202 ofaAntrodia cinnamomeamycelium (t1/2 = 3.68 min) byl metabolizován rychleji než echinakosid A [29]. 

Obrázek 1.EchinakosidProfil zbývajícího času v krysích a lidských játrech S9. Údaje jsou uvedeny vstřední hodnoty trojitého měření.

Předchozí zpráva ukázala, že nebyl pozorován žádný nepříznivý účinek 3 g/kgtělesná hmotnost/den HE obohacená o echinakosid A v 28-denní perorální krmení u potkanů ​​Sprague–Dawley.Současná studie dávkování pro metabolismus jaterních buněk poskytuje rozumnou korelaci,s předchozímin vivostudie farmakokinetiky sloučeniny echinakosidu A (PK) [30,31]. V jednom nedávnémin vivozpráva, Tsai et al. skupina detekovala echinakosid A v plazmě potkanů ​​poorální podání HE mycelia (50 mg/kg) v 60 min [32]. To může korelovat saktuálníin vitrozjištění, ve kterých jsme teoreticky prokázali, že stále existuje ~24,6 procentazbytek sloučeniny po metabolismu S9 v krysích játrech. Navíc přibližně polovinanemetabolizovaného echinakosidu A byly nalezeny ve zbývajících lidských játrech S9, což prokazuježe kompletní složené struktury by mohly vstoupit do krevního oběhu, což přispívá k jehoúčinnost v neuroprotekci. Bez ohledu na to, zda běžné metabolity poskytují, nebo nebiologická funkce je stále předmětem zkoumání a bude uvedena v samostatné studii

Klikněte sem a zjistěte funkci Cistanche Echinacoside

3.2. In vitro identifikace metabolitů u potkanů ​​a lidí

K identifikaci metabolitů v pozitivním a negativním režimu byla použita ultravýkonná kapalinová chromatografie/kvadrupólová hmotnostní spektrometrie s časem letu (UPLC-QTOF/MS). Srovnání metabolitů echinakosidu A v této studii s metabolity S9 jater potkana a člověka je uvedeno v tabulce2. Po inkubaci echinakosidu A bylo nalezeno 24 metabolitů, které byly označeny jako M1-M24 (tabulka S1). Po inkubaci s potkaními a lidskými játry S9 bylo detekováno pět běžných metabolitů. Hromadné chyby byly všechnyMenší nebo rovno5 ppm. Tři nejhojnější metabolity, podle plochy píku, byly konjugace glutation plus demethylace (M6), demethylace (M2) a demethylace plus hydrogenace (M3). Dehydratace alkoholů (M1), demethylace (M2), demetylace plus hydrogenace (M3), 2× Hydroxylace (M4), demethylace a dva metabolity hydroxylace (M5) byly identifikovány v játrech potkana a člověka S9. Navrhovaná metabolická dráha a možné metabolity echinakosidu A jsou znázorněny na obrázku2. 

Tabulka 2Běžné jaterní metabolity echinakosidu A byly detekovány v krysích a lidských játrech S9, s anUPLC-QTOF/MS.

Mateřská sloučenina vzorce echinakosidu A byla C25H36O6. MS spektrumechinakosidA bylo nalezeno na [M plus H]Plus= 433.2573 a [M plus Na]Plus= 455.2405 (obrázek3A). TheMS/MS spektrum při srážkové energii 10 V je znázorněno na obrázku3B, která odpovídáštěpení etherové vazby CO ([C20H29O2] Plus= 301.2162 a [C20H27O]Plus= 283.2052) (Postava3C) [15,32]. Vzorec metabolitů dehydratace alkoholu (M1) byl C25H34O5, s echinakosidem A ztrácí H2O [33,34]. MS spektrum M1 bylo nalezeno při [M plus H]Plus= 415.2472 a [M plus Na]Plus= 437.2255. Při srážkové energii 10V jsou hlavním produktem iontybylim/z 283.2036, 215.1701, 181.1249, 135.0817, 119.0856, 105.0709 a 69.0327 (obr.4A). Dva produktyionty byly analogické s ionty echinakosidu A (m/z 283,2036 am/z 119.0856) a výrobum/z 301.2162 zmizel. Dehydratovaný M1 může býtpoužívá se k označení ztráty vody ve fragmentech pentózy [35]. Demethylační metabolity (M2)vzorec byl C24H34O6, přičemž echinakosid A ztrácí methylen (-CH2) [36]. Při srážceenergie 40 V, MS spektrum M2 bylo nalezeno při [M plus H]Plus= 419.2407. Hlavní produktbyly iontym/z 312.0488, 269.9469, 231.0432, 123.0552 a 179.0486 (obr.4B). Produkcenam/z 269,9469, 179,0486 odpovídalo štěpení methylenu (-CH3) a plusHPlus. Vzorec metabolitů demethylace plus hydrogenace (M3) byl C24H36O6 sSnížení M2 v alkenu (plus H2) [37–39]. MS spektrum M3 bylo nalezeno při [M plus H]Plus= 421.2569 a [M plus Na]Plus= 443.2355. Při srážkové energii 40 V je hlavním produktembyly iontym/z 353.2141, 277.2183, 147.1172 a 77.0054 (obr.4C). Výroba vm/z 353,2141, 277,2183 odpovídaly hydrogenaci. 2× HydroxylaceVzorec metabolitů (M4) byl C25H36O8 s echinakosidem A Hydroxylace isopropylupostranní řetězec a cyklopenten [40–42]. MS spektrum M4 bylo nalezeno při [M plus H]Plus= 465,2461 a [M plus Na]Plus= 487.2315. Při srážkové energii 20V byly hlavním produktem iontym/z 297,1842, 255,1389, 177,1115, 133,0860 a 89,0597 (obr.4D). Výroba vm/z 297,1842 a 89,0598 odpovídaly hydroxylaci. Demethylace aVzorec dvou hydroxylačních metabolitů (M5) byl C24H34O8 s M11 ztrácí methylen(-CH2). MS spektrum M5 bylo nalezeno při [M plus H]Plus= 451.2413 a [M plus Na]Plus= 473,2158. Při srážkové energii 40 V byly hlavním produktem iontym/z 321.1516, 178.1225, 101.0705 a 59.0601 (obr4E). Výroba vm/z 321,1516 odpovídalo M4štěpení methylenu (-CH3) a plus HPlus.

Z obou HE sporoforů bylo izolováno 70 různých sekundárních metabolitůnebo mycelium. Tyto metabolity jsou identifikovány jakopolysacharidy, polyketidy,fenoly, terpenoidy abioaktivní molekuly [43–45]. Spekulovali jsme, že tyto běžné metabolity,které jsme analyzovali, mohou být také prekurzory nebo meziprodukty myceliasekundární metabolity uvedené výše. Nicméně bylo hlášeno, že M1, M2,M3, M4 a M5 mohou představovat klíčové meziprodukty mezi echinakosidem A a sekundárnímmetabolity pro studie na potkanech a lidech. Vzhledem k rostoucímu používání HE mycelia jako afunkční doplněkidentifikace těchto metabolitů také odhalí užitečné biomarkery.Vezmeme-li cholesterol jako příklad, prekurzory nebo meziprodukty různýchlátky, produkované procesem jaterních enzymů, byly metabolizovány na oxysterol, tjnyní chápán jako silný metabolit v metabolismu sterolů aregulace syntézy [46]. 

Obrázek 3(A) MS spektrum echinakosidu A s ultra vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií-tandemkvadrupólová hmotnostní spektrometrie doby letu. (B) MS/MS spektrum echinakosidu A s anultra-vysokoúčinná kapalinová chromatografie-tandemová kvadrupólová hmotnostní spektrometrie doby letu.(C) Navrhované struktury produktových iontů, produkovaných echinakosidem A, při srážkové energii 10 V.(a) [C20H29O2]Plus= 301.2162, (b) [C20H27O]Plus= 283.2052.  : Rodičovský ion.

Obrázek 4.MS a MSMS spektrum (A) Dehydratace alkoholů (M1), (B) Demetylační metabolity(M2), (C) Metabolity demethylace plus hydrogenace (M3), (D) 2 × Hydroxylační metabolity (M4),(E) Demethylace a dva metabolity hydroxylace (M5) za použití kapaliny s velmi vysokou účinnostíchromatografie-tandemová kvadrupólová hmotnostní spektrometrie doby letu. : Rodičovský ion.

M2 a M3 byly detekovány po 60 minutách u potkaních jater S9, zatímco u lidíjátra S9, M2 a M3 byly detekovány po 10, 30, 60 a 120 minutách. Předpokládali jsme, že by se mohla vyrábět M3dvěma odlišnými metabolickými cestami; jeden z echinakosidu A na M3 a druhý byl odvozenz M1. Naproti tomu M4 a M5 byly detekovány u krys po 10, 30 a 60 minutáchjátra S9. V lidskéjátra S9, M4 byla detekována po 10, 30, 60 a 120 minutách. M5 byla detekována v120 min. Časvzhled může vysvětlit, že metabolická dráha M5 může být odvozena z M4.

Tato studie poskytuje další informace pro klinické studie HE myceliachybějící informace, což je metabolický účinek bioaktivní sloučeniny. Vnedávná randomizovaná, dvojitě zaslepená placebem kontrolovaná studie, tři 350 mg/g HE mycelia(obsahující 5 mg/g echinakosidu A) intervence tobolek po dobu 49 týdnů byla prokázána vyššíNástroj pro screening kognitivních schopností, Mini-Mental State Zkouška, aInstrumentálníAktivity denního života skórea dosáhli lepší kontrastní citlivosti u pacientů svěk > 50 let a diagnózapravděpodobná Alzheimerova choroba, ve srovnání splacebo skupina [19]. Pochopením profilu metabolitů echinakosidu A můžeme interpretovatžeechinakosid A obohacený HE mycelia zlepšil neurokognitivní poruchu, což by mohlo býtpřispíval většinou z nemetabolizované sloučeniny. Pokud jde o echinakosid A,metabolity jsoujsou dobře snášeny a mohou být důležité pro dosažení neuronutričních přínosů, což budebýt prozkoumány v budoucích studiích. 

Toto je první studie, která stanovila hmotnostní spektrometrickou analýzu metabolické stabilitya identifikovat patnáct běžných metabolitů echinakosidu A nalezených v krysích a lidských játrech S9zlomky. Výsledky této studie pomohou pochopit vlastnosti, bezpečnost aúčinnost této jedinečné bioaktivní sloučeniny. Naše výsledky tomu nasvědčujíechinakosid Aje klinickývýhody mohou pocházet ze sloučeniny a jejích metabolitů. V budoucnu budeme analyzovatmetabolitů z krve, orgánů a tkání k vytvoření kompletní databáze metabolismu.Očekává se, že taková práce pomůže funkčnímu výzkumu potravin, nutraceutických doplňků aprecizní medicína.

Doplňkové materiály:Následující jsou k dispozici online na adrese1, Tabulka S1: Identita metabolitů echinakosidu A v játrech potkana a člověka S9s UPLC-QTOF/MS.

Příspěvky autora:Interpretace dat, Y.-HK, T.-WL, J.-YL, Y.-WC a T.-JL; metodologie;Y.-HK, T.-WL a T.-JL; vyšetřování vedené T.-JL a C.-CC; suroviny poskytuje:Y.-HK, T.-WL, J.-YL, Y.-WC, T.-JL a C.-CC; vizualizace: Y.-HK; původní příprava návrhubylo provedeno Y.-HK, T.-WL, T.-JL a C.-CC; psaní—recenze a redakce, Y.-HK, T.-JL aC.-CC Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.

Financování:Tento výzkum nezískal žádné externí financování.

Prohlášení o dostupnosti dat:Suroviny a sloučeniny uvedené v této studii jsou dostupnéna vyžádání od odpovídajícího autora.

Střet zájmů:Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Vzorová dostupnost:Vzorky sloučenin jsou dostupné u autorů.

Reference

1. Mitra, V.; Metcalf, J. Funkční anatomie a prokrvení jater.Anaesth. Intensive Care Med.2009, 10, 332–333. [CrossRef] 

2. Alamri, ZZ Role jater v metabolismu: Aktualizovaný přehled s fyziologickým důrazem.Int. J. Basic Clin. Pharmacol.2018, 7, 2271. [CrossRef] 

3. Russell-Jones, G. Potenciální použití receptorem zprostředkované endocytózy pro perorální podávání léků.Adv. Drug Deliv. Rev.1996, 20, 83–97. [CrossRef] 

4. Shugarts, S.; Benet, LZ Úloha transportérů ve farmakokinetice perorálně podávaných léčiv.Pharm. Res.2009, 26, 2039–2054. [CrossRef]

5. Richardson, SJ; April, B.; Kulkarni, AA; Moghaddam, MF Efficiency in Drug Discovery: Liver S9 Fraction Assay as screenpro metabolickou stabilitu.Drug Metab. Lett.2016, 10, 83–90. [CrossRef] 

6. Corsini, A.; Bortolini, M. Lékem vyvolané poškození jater: Role metabolismu a transportu léčiv.J. Clin. Pharmacol.2013, 53, 463–474. [CrossRef] [PubMed] 

7. Lam, WW; Chen, J.; Xu, RF; Silva, J.; Lim, H.-K. Identifikace metabolitů při objevování léčiv. vOptimalizace v Drug Discovery.Metody farmakologie a toxikologie; Caldwell, G., Yan, Z., Eds.; Humana Press: Totowa, NJ, USA, 2014; s. 445–459.

8. Prasad, B.; Garg, A.; Takwani, H.; Singh, S. Identifikace metabolitů kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií.Trendy TrACAnální. Chem.2011, 30, 360–387. [CrossRef] 

9. Zhang, D.; Luo, G.; Ding, X.; Lu, C. Preklinické experimentální modely metabolismu léčiv a dispozice při objevování léčiv arozvoj.Acta Pharm. Hřích. B2012, 2, 549–561. [CrossRef] 

10. Wang, M.; Gao, Y.; Xu, D.; Konishi, T.; Gao, Q.Hericium erinaceus(Yamabushitake): Jedinečný zdroj pro vývoj funkčníchpotraviny a léky.Funkce jídla.2014, 5, 3055–3064. [CrossRef]

11. Hu, T.; Hui, G.; Li, H.; Guo, Y. Biofortifikace selenu vHericium erinaceus(Houba Lví hříva) a jejíin vitrobioaccessischopnost.Food Chem.2020, 331, 127287. [CrossRef] 12. Kim, KH; No, HJ; Choi, SU; Lee, KR Isohericenone, nový cytotoxický isoindolinový alkaloid z Hericium erinaceum.J. Antibiot.2012, 65, 575–577. [CrossRef] 

13. Khan, MA; Tania, M.; Liu, R.; Rahman, MMHericium erinaceus: Jedlá houba s léčivými hodnotami.J. DoplňkovéIntegrovat. Med.2013, 10, 253–258. [CrossRef]

14. On, X.; Wang, X.; Fang, J.; Chang, Y.; Ning, N.; Guo, H.; Huang, L.; Huang, X.; Zhao, Z. Struktury, biologické aktivity aprůmyslové aplikace polysacharidů zHericium erinaceus(Lví hříva) houba: Recenze.Int. J. Biol. Macromol.2017, 97, 228–237. [CrossRef] 

15. Kawagishi, H.; Shimada, A.; Shirai, R.; Okamoto, K.; Ojima, F.; Sakamoto, H.; Ishiguro, Y.; Furukawa, S. echinacosides A, B a Csilné stimulátory syntézy nervového růstového faktoru (NGF) z mycelia Hericium erinaceum.Tetrahedron Lett.1994, 35, 1569–1572. [CrossRef] 

16. Lee, KF; Chen, JH; Teng, CC; Shen, CH; Hsieh, MC; Lu, CC; Lee, KC; Lee, LY; Chen, WP; Chen, CC; a kol. OchrannýÚčinkycistanche tubulosaa jeho izolovaný echinakosid A proti smrti neuronových buněk vyvolané ischemiíInhibice iNOS/p38 MAPK a nitrotyrosinu.Int. J. Mol. Sci.2014, 15, 15073–15089. [CrossRef] 

17. Tzeng, TT; Chen, CC; Chen, CC; Tsay, HJ; Lee, LY; Chen, WP; Shen, CC; Shiao, YJ Cyanthin Diterpenoid andSesterterpenové složkycistanche tubulosaZmírněte patologie související s Alzheimerovou chorobou v APP/PS1Transgenní myši.Int. J. Mol. Sci.2018, 19, 598. [CrossRef]

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950