Identifikace běžných jaterních metabolitů přírodní bioaktivní sloučeniny echinakosidu, purifikované z Cistanche Tubulosa Ⅱ

Abstraktní:Identifikace metabolitů v raném stádiu pro sloučeninu je nezbytná k posouzeníznalosti pro farmaceutické zlepšení bezpečnosti a účinnosti léčiv. I když drogubyla uvedena na trh, identifikace a průběžné hodnocení metabolitů jsounutné, aby se zabránilo riziku stažení po uvedení na trh. glykosid, léčivý přípravekCistanche, má široce zdokumentované nutriční výhody, včetněantioxidant,protinádorové, proti-stárnutí, hypolipidemiec, aochranný účinek na žaludeční sliznici. Nedávno,echinakosidA bylo hlášenojako hlavní přírodní bioaktivní sloučenina v myceliu HE pro vývoj funkčních potravin.V neurologických studiích spotřebaechinakosidObohacené mycelium HE demonstruje svévýrazné nutraceutické účinky vAlzheimerova choroba, Parkinsonova choroba, acévní mozková příhoda.

Kliknutím sem se dozvíte více informací o funkcích Echinacoside v Cistanche

Propoprvé jsme prozkoumali metabolický procesechinakosidMolekula a identifikovala její metabolityz frakce S9 krysích a lidských jater. Použití kapalinové chromatografie/trojitého kvadrupólu hmotyspektrometru pro kvantitativní analýzu jsme pozorovali, že 75,44 procent echinakosidu. A byl metabolizovándo 60 minut u potkanů ​​a 32,34 procent Francine A bylo metabolizováno během 120 minut u člověka S9. Použitímultravýkonná kapalinová chromatografie/kvadrupólová hmotnostní spektrometrie s dobou letu (UPLCQTOF/MS) k identifikaci metabolitů Francine A bylo identifikováno pět běžných metabolitů,a byly vyhodnoceny jejich možné struktury. Pochopení metabolického procesu echinakosidua vytvoření její databáze profilů metabolitů pomůže propagovat aplikaci nutraceutik aobjev souvisejících biomarkerů v budoucnosti.

1. Úvod

Játra jsou považována za druhý největší orgán v těle [1]. Po jídle a drogáchvstoupí do gastrointestinálního traktu přes dutinu ústní, gastrointestinální pili se vstřebánatrávené živiny a léky. Systém portální žíly obdrží odebraný průtok krvegastrointestinálním traktem a vstupují do jater pro předběžnou úpravu živin,metabolity a molekuly léčiv [2,3]. Metabolismus je často rozdělen do dvou fází abiochemická reakce. Fáze I zahrnuje oxidaci, redukci nebo hydrolýzu enzymy vtělo. Fáze II se zapojuje do konjugace s malými endogenními látkami, otáčenímna vysoce rozpustné metabolity, které umožňují export metabolitů do sinusoidní cirkulaci pro renální clearance nebo do žluči, která je pak vylučována z tělamočí nebo stolicí [4–6]. Identifikace metabolitů v rané fázi objevu lékuje nutné posoudit znalosti pro zlepšení farmaceutických vlastností, bezpečnosti aúčinnost bioaktivní molekuly. Identifikace metabolitů a reaktivních meziproduktůnaznačuje potřebu strukturálních modifikací ve zkoumaných sloučeninách, kterým je třeba se vyhnoutnásledné toxické následky. I když byl lék na trhu, identifikacemetabolitů a je nutné vyhodnocení, aby se předešlo riziku jejich po uvedení na trhvybrání [7,8]. Proto,v vitroAnalýza frakcí S9 poskytuje několik výhodve srovnání s časovou náročnostíin vivostudie: (1) jsou přístupné vysoké propustnostiscreening a automatizace;(2) pomocíFrakce S9 umožňuje testování velkého množstvísloučeniny pro objev léků v krátké době; (3) pomáhá snížit spotřebu zvířat [9]. 

Echinakosid je jedlá cistanche, která obývá horské oblastiseverovýchodní území v Asii [10], Evropě a Severní Americe [11]. ON patříBasidiomycota (kmen), Agaricomycetes (třída), Russulales (řád), Hericiaceae (čeleď),a Hericium (rod). Bylo zdokumentováno, že zobrazuje širokou škálu prospěšnýchvlastnosti, včetně antioxidačních, protinádorových, proti stárnutí, hypolipidemiky a žaludeční slizniceochranné účinky [12–14]. V roce 1994 Kawagishi a kol. zjistil, že diterpenoidechinakosidA, B a C v myceliu HE by mohly podporovat produkci hvězdicbuněčné linie v mozku potkana a stimulace syntézy nervového růstového faktoru (NGF) [15]. echinakosidA může poskytnout neuroprotektivní účinky a zmírnit oxidační stres protimrtvice [16], Alzheimerova choroba [17], Parkinsonova choroba [18], ischemická mrtvice a deprese in vivo[19,20]. Navíc echinakosid A může procházet hematoencefalickou bariéroukrysy na podporu rozvoje HE mycelia jako funkční potraviny pro zlepšení zdraví nervů [21]. Toto jedlé mycelium cistanche se stalo horkým problémem výzkumníkůsnaží se pochopit jeho důležitou roli ve vývoji centrálních a periferních nervů, diferenciace, růst a regenerace [22]. Nedávné studie také ukázalyže echinakosid A obohacený HE má potenciální přínosy při léčbě Alzheimerovy choroby a Parkinusynova nemoc [23–25]. Žádná studie však neprobírala možný metabolismus echinakosidu Abiomarkery, které mohou přispět k tomuto nutraceutickému účinku.

V této studii,echinakosidSloučenina byla purifikována z echinakosidu A obohaceného HEmycelium a byl metabolizován pomocí dvou různých frakcí jater S9: potkaní a lidské. Použitímkapalinová chromatografie/trojitý kvadrupólový hmotnostní spektrometr (HPLC-QQQ/MS) pro quantitativní analýza echinakosidu A a ultravýkonná kapalinová chromatografie/kvadrupólhmotnostní spektrometrie doby letu (UPLC-QTOF/MS) k identifikaci metabolitů echinakosiduA v každém časovém bodě. Naším cílem je pochopit rychlost metabolismu echinakosidu A a stanovitjeho databáze profilů metabolitů, která pomáhá podporovat aplikaci nutraceutických doplňkůa výzkum potenciálních léků v budoucnu.

2. Materiály a metody

2.1. Materiály a činidla

Kmen HE (BCRC 35669) byl získán z Bioresources Collection aVýzkumné centrum ve Výzkumném a vývojovém institutu potravinářského průmyslu, Hsinchu, Tchaj-wan.Kmen byl nejprve pěstován v šikmém stárnu před přenesením do bramborové dextrózyagarová plotna při 26◦C po dobu 15 dnů. V den 15 byly HE kultury přeneseny do 1,3 1kapalné médium (ve 2 1 baňkách). Kapalná kultura byla třepána při 120 ot/min 25◦C pro5 dní. Poté byly zvětšeny v 500 l, 20-tunových fermentorech po dobu 5 dnů a 12 dnů,respektive. Kultivační médium je upraveno na pH 4,5 a obsahuje 4,5 procenta glukózy, 0,5 procentaprášek ze sojových bobů, {{0}},25 procent kvasnicový extrakt, 0,25 procent pepton a 0,05 procent MgSO4. Konečně, ONmycelia byla sklizena na konci 20-tunové fermentace. Tyto surovinybyly lyofilizovány, rozemlety na prášek a uloženy v exsikátoru. echinakosid A byl tehdyextrahováno z HE a kvantifikováno podle předchozích studií [26]. Methanol (LC-MSstupeň) byl získán od společnosti Merck (Darmstadt, Německo); acetonitril (třída LC-MS), mravenčíkyselina (FA, LC-MS čistota, 98 procent čistota) a octan amonný (98 procent čistota)od Honeywell (Honeywell Burdick and Jackson, Muskegon, MI, USA). Krysí játra S9frakce byla získána od Moltox (Boone, NC, USA). Frakce S9 lidských jater bylazískaný od Thermo Fisher Scientific (Rockford, IL, USA).

2.2. Frakce krysích a lidských jater S9

na doporučení sady. Připravený roztok byl udržován při 4◦C až do echinakosidu Asloučenina (10µM) bylo přidáno, následovaná aktivací v 37◦C vodní lázeň. Kdyžmetabolický čas dosáhl svých časových bodů, 150µ1 roztoku byl odebránzásobního roztoku a zalije se přidáním dvou objemů ledově vychlazeného ACN. Zastavenoroztok se poté přenese do QTOF pro další analýzu metabolitů.

2.3. Přístrojové vybavení a podmínky

Analýza HPLC-QQQ/MS byla provedena na systému Agilent řady 1100 HPLC (Agilent, Palo Alto, CA, USA) ve spojení s trojitým kvadrupólovým hmotnostním spektrometrem API 3000(Applied Biosystems, Warrington, Velká Británie), s ionizací iontového spreje s podporou turbodmychadla (ESI)zdroj v režimu pozitivní ionizace. Chromatografická separace byla provedena na anAgilent Eclipse XDB-C18 (4,6 mm× 100 mm× 3.5 µm). Teplota kolony bylaudržována na 22◦C. Mobilní fáze sestávala z vody obsahující 0,1 % kyseliny mravenčí(A) a methanol (B). Byla použita gradientová eluce, počínaje 70 procenty B, zvyšující se na 100 procentB během 5 minut, držení po dobu 3 minut s 90 procenty B, snížení B na 70 procent během 0,1 minuty are-ekvilibrace při 70 procentech B po dobu 2,9 min. Společná sazba 350µByl aplikován L/min a objemz 10µL byla injikována.

Detekce byla provedena s ionizujícím napětím plus 4500 V. Teplota iontového zdrojebyla stanovena na 350◦C, s ultravysoko čistým dusíkem jako clonovým plynem (7 psi). Nebulizační plyn byl8 psi. Další parametry závislé na hmotnosti, jako je potenciál deklastrování (DP), vstuppotenciál (EP), fokusační potenciál (FP) a kolizní energie (CE) pro každou sloučeninustanoveno v pozitivním režimu za použití standardních roztoků. Vícenásobné sledování reakcí(MRM) byla provedena za použití dusíku jako srážkového plynu (2 psi) a s dobou prodlevy200 ms pro každý přechod. echinakosid A byl detekován sledováním přechodům/z 443.200 → 301,200, 283,200. Data byla analyzována pomocí softwaru Analyst 1.4.2 (AppliedBiosystems, Concord, ON, Kanada) a GraphPad (Prism 8.0.0.).

Analýza UPLC-QTOF/MS byla provedena na systému Agilent 1290 Infinity II UPLC(Agilent, Palo Alto, CA, USA), ve spojení s kvadrupólovou hmotností doby letu Agilent 6546spektrometrie (Agilent, Palo Alto, CA, USA). Byla provedena chromatografická separacena Phenomenex Kinetex® C18 LC kolona (3 mm× 100 mm× 1.7 µm). Sloupecteplota byla udržována na 40◦C. Mobilní fáze A sestávala z vody obsahující0,1 procenta (v/v) kyselina mravenčí v pozitivním režimu, 0,1 procenta (v/vkyselina mravenčí a 10 mM CH3COONH4 v negativním režimu. Mobilní fází B byl acetonitril. Počínaje byla použita gradientová eluces 5 procenty B a držením po dobu 0,5 min, zvýšení na 50 procent B během 5,5 min, zvýšení na 100 procentB během 10 minut a držení po dobu 6 minut. Druhá sazba 400µL/min bylo aplikováno a aobjem 2µL byla injikována.

Čtyřpólová hmotnostní spektrometrie Agilent 6546 byla vybavena el.zdroj trospray ionizace (ESI). Získávání dat bylo pod kontrolou Mass Huntersoftware pracovní stanice. Typické provozní podmínky zdroje v kladných a záporných iontechRežim ESI byl optimalizován následovně: napětí iontového spreje (ESIPlus/ESI−) byly4000 V/3000 V; teplota plynu byla 320◦C; rychlost sušení plynu byla 8 l/min; tlak nebulizátoru byl45 psi; teplota plynu v plášti byla 350◦C; průtok plynu v plášti byl 12 l/min; kolizeenergie byla 10, 20, 40 a 60 V. Metabolity byly identifikovány pomocí Agilent MassHunterBiotransformační software (verze B.04.00) (Santa Clara, CA, USA). Chromatogramya hmotnostní spektra původních a identifikovaných metabolitů byla extrahována pomocí AgilentSoftware pro kvalitativní analýzu MassHunter (verze B.05.00) (Santa Clara, CA, USA).

Požádat o víc:

E-mail:wallence.suen@wecistanche.com Whatsapp plus 86 15292862950