Vztah HPLC otisků prstů a spektra-protinádorového účinku pro diskriminaci mezi Mylabris Phalerata Pallas a Mylabris Cichorii Linnaeus

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Jian-Yong Zhang, Qi-Hong Chen, Xian Pei1, Rong Yan, Can-Can Duan, Yun Liu4, Xiao-Fei Li

1 Farmaceutická fakulta, Lékařská univerzita Zunyi, Zunyi, Čína,

2 Klíčová laboratoř základní farmakologie ministerstva školství a Společná mezinárodní výzkumná laboratoř etnomedicíny ministerstva školství, Zunyi Medical University, Zunyi, Guizhou, Čína.

3 School of Basic Medical Sciences, Zunyi Medical University, Zunyi, Čína, Klíčová laboratoř pro prevenci a léčbu nádorů pomocí speciálních léků se sídlem na 4Guizhou Provincial College, Zunyi Medical University, Zunyi, Čína.

Kliknutím sem získáte více informací o protinádorovém přípravku Cistanche

Zvýraznění

Tato studie poskytuje použitelnou, důvěryhodnou a účinnější metodu HPLC pro rozlišení dvou druhů Mylabris. A HPLC fingerprinting a spektrum-protinádorové účinkybyly integrovány a byly nalezeny tři důležité diferenciální markery pro nový marker Mylabris.

Abstraktní

Cíl: Vyhodnocení diskriminace mezi dvěma druhy Mylabris na základě HPLC fingerprintingu a spektra-protinádorový účinekvztah. Metody: V této studii byla použita jednoduchá a účinná metoda vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) integrující s chemometrickou analýzou a spektrálnímprotinádorový účinekvztah byl vyvinut pro rozlišení mezi dvěma druhy Mylabris: Mylabris phalerata Pallas (MP) a Mylabris cichorii Linnaeus (MC). Výsledky: Při analýze otisků prstů bylo vybráno 14 charakteristických píků pro posouzení rozdílů mezi MP a MC pomocí analýzy podobnosti a rozpoznávání vzorů pomocí PCA a OPLS-DA. HPLC chromatogramy vzorků z 10 oblastí Číny ukázaly rozdíly mezi MP a MC a bylo nalezeno 7 charakteristických chemických markerů. Ve spektru -protinádorový účinekanalýza vztahů, 4 markery aktivity hrály zásadní roli při snižování IC50 a mohly by být protinádorovými složkami Mylabris pomocí šedé relační analýzy a multivariační lineární regresní analýzy. Chemometrická analýza v kombinaci s výsledky vztahu spektrum-účinek ukázala, že píky 2 (cytosin), 4 (neznámý) a 14 (neznámý) byly důležitými diferenciálními markery pro rozlišení dvou druhů Mylabris.

Závěr: Metoda je použitelná, věrohodná a efektivnější pro rozlišení MP a MC a nabídne nový způsob, jak usnadnit kontrolu kvality léků proti hmyzu.

Klíčová slova: HPLC, Fingerprinting, Spectrum-protinádorový účinek, Mylabris, Diskriminace

Pozadí

Mylabris, v Číně nazývaný ban mao, se používá jako tradiční čínská medicína (TCM) k léčbě furuncle, hluboko zakořeněných vředů, břišní hmoty a je důležitýmprotinádorovéčinidlo. Kromě toho je v Evropě široce používán jako lidová medicína [1]. Hlavní aktivní složkou přípravku Mylabris je kantaridin, který je účinnýprotinádorovésloučenina [2]. Moderní farmakologické studie prokázaly, že Mylabris má mnohočetné aktivity a je vysoce ceněn pro léčbu nádorů, protože má dvojíprotirakovinnévlastnosti a schopnost zvýšit počet leukocytů [3-4]. V současné době je Mylabris široce používán v některých klinických protikarcinomových předpisech TCM v Číně, jako je injekce Aidi a kapsle Compound ban mao.

Podle lékopisu Čínské lidové republiky (verze z roku 2015) je Mylabris definována jako sušené tělo Mylabris phalerata Pallas (MP) a Mylabris cichorii Linnaeus (MC), které se liší svými botanickými vlastnostmi, populační dynamikou a ekologií [ 5-6]. Mylabris je také vysoce toxická droga. Vzhledem k tomu, že léky dostupné v Číně jsou obvykle směsí MP a MC, je nutné identifikovat chemické a účinné rozdíly mezi těmito dvěma druhy.

Vzhledem k tomu, že TCM obsahují mnoho známých i neznámých složek, kvantitativní profilová analýza jejich chemických složek představuje významnou výzvu. Otisky prstů pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) hrají důležitou roli v kontrole kvality (QC) TCM kvůli svým celkovým profilovým charakteristikám většiny sloučenin v komplexním systému. Kromě toho má analýza otisků prstů TCM dobrou reprodukovatelnost a stabilitu pro ověřování druhů a hodnocení kvality a je akceptována Světovou zdravotnickou organizací, Státním úřadem pro kontrolu potravin a léčiv v Číně (SFDA) a Evropskou agenturou pro hodnocení léčiv (EMEA). Nedávno byla pro QC vyvinuta chemometrická analýza kombinující HPLC fingerprinting a rozlišující různé komplexní přírodní zdroje [7]. Je však neúčinné rozlišovat rozdíly v TCM, protože nemůže odrážet rozdíly aktivních složek, což je pro klinické použití důležitější. Zatím spektrum-protinádorové účinekK úspěšné identifikaci bioaktivních složek TCM byly použity vztahové přístupy [8]. HPLC fingerprinting v kombinaci s chemometrickou analýzou a vztahem mezi spektrem a protinádorovým účinkem lépe objasní rozdíl mnoha zdrojů TCM.

Nedávno byly popsány některé metody pro stanovení obsahu kantaridinu, které lze použít ke stanovení kvality Mylabris [9]. Některé chromatografické otisky prstů byly také použity pro kontrolu kvality [10-11]. Pouze jedna studie využívala metodu zahrnující gradientovou eluci ve vodě rozpustných sloučenin Mylabris na základě HPLC. Mezitím bylo použito pouze deset vzorků a žádné vzorky MC [12]. Podle našich nejlepších znalostí nebylo rozlišení MP a MC na základě chemického složení a aktivity dosud studováno.

Cílem této studie bylo vyvinout jednoduchou a účinnou metodu pro rozlišení dvou druhů Mylabris pomocí HPLC fingerprintingu v kombinaci s chemometrickou analýzou a spektrálnímprotinádorovéúčinekvztah, který poskytne základ pro kontrolu kvality Mylabris. Tuto metodu lze také použít pro identifikaci QC markeru jiných TCM.

Materiály a metody

Celkem bylo odebráno 20 šarží Mylabris phalerata Pallas (MP) a Mylabris cichorii Linnaeus (MC) z různých provincií Číny (Tabulka 1) a identifikovány naším prof Xiao-Fei Li. Vzorky voucherů byly uloženy v našich laboratořích.

Referenční standardní cytosin, uridin, guanosin a adenosin byly zakoupeny od ChengduPush Biotechnology Co., Ltd. (Chengdu, Čína). Acetonitril a methanol čistoty pro HPLC byly zakoupeny od Thermofisher Scientific (Fairlawn, NJ, USA). Během studie byla použita Watsonova čistá voda. Ostatní chemikálie a rozpouštědla byly analytické čistoty a byly získány od Aladdin Reagent (Shanghai, Čína), Chengdu Kelong Reagent (Chengdu, Čína) a Sinopharm Chemical Reagent (Peking, Čína)

Aparatura a chromatografické podmínky

HPLC analýza byla provedena pomocí systému Agilent 1260 Infinity HPLC při 30 stupních na Phenomenex Synergy Polar-RP80 (4,6 mm x 250 mm, 5 μm) pro snímání otisků prstů. K separaci byla použita lineární gradientová eluce s eluenty A (voda/ledová kyselina octová, 100:1, obj./obj.) a B (methanol). Program gradientu byl vyvinut následovně: 0-1 min, 3.{12}}.6 procent B; 1-9 min, 4.{16}}.8 procent B; 9-25 min, 6.8-51.0 procent B; 25-30 min, 51.{24}} procent Průtok mobilní fáze byl 1,0 ml/min. Chromatogram byl monitorován při 254 nm. Po 15 minutové ekvilibrační periodě bylo 10 μl vzorků použito pro injekci.

příprava vzorků

Vysušené vzorky byly rozdrceny na prášek a 2,5 g každého práškového vzorku bylo extrahováno dvakrát 50 ml 75% ethanolu refluxem pokaždé po dobu 1,5 hodiny. Extrahovaný vzorek byl smíchán a zakoncentrován za sníženého tlaku na 20 ml. Směs byla poté srážena 80 ml vody po dobu 24 hodin při teplotě 4 °C. Následně byl extrakt centrifugován při 3000 g min-1 po dobu 10 min, aby se oddělil supernatant. Supernatant byl zahuštěn za sníženého tlaku na 25 ml. Nakonec byl supernatant před analýzou HPLC přefiltrován přes 0,22 um Millipore film.

Validace metodologie

Metoda HPLC byla validována na přesnost, reprodukovatelnost a stabilitu (0 h, 2 h, 4 h, 8 h, 12 h, 24 h). Validace byla odhadnuta na základě retenčního času (RT) a plochy píku (PA). Nakonec byly vytvořeny chemické otisky 20 šarží přípravku Mylabris, aby se identifikovaly integrované chemické vlastnosti více sloučenin. Pro analýzu chemického otisku byly zavedeny některé chemometrické techniky.

Analýza rozpoznávání vzorů

Rozdíly mezi dvěma druhy oblastí píku byly hodnoceny na statistickou významnost pomocí nepárového Studentova t-testu. P-hodnota menší než 0.05 byla považována za statisticky významnou. Jako klasická metoda bez dozoru se pro statistickou analýzu dat široce používá analýza hlavních komponent (PCA). Namísto použití mnoha proměnných zabere PCA malý počet počítačů bez ztráty mnoha informací a grafy skóre jsou pak vizualizovány pro volné oddělení pozorování. V této studii byla PCA provedena na normalizovaných plochách píku každé složky v otiscích HPLC pomocí softwaru SIMCA-P plus 14.0 (Umetrics, Umea, Švédsko), aby se našlo rozlišení mezi dvěma druhy Mylabris.

Pro výhodnější rozlišení mezi dvěma druhy Mylabris byla použita kontrolovaná metoda ortogonální parciální diskriminační analýzy nejmenších čtverců (OPLS-DA) k analýze rozdílů v normalizovaných plochách píku každé složky v otiscích HPLC. Hodnota VIP je vážený součet druhých mocnin vah OPLS, odrážející relativní příspěvek každé proměnné X k modelu. Proměnné s VIP > 1 spolu s S-grafem byly považovány za vlivné pro separaci vzorků v grafech skóre generovaných z OPLS-DA analýzy. Poté byly získány charakteristické chemické markery pro rozlišení.

Analýza vztahu spektrum-protinádorový účinek

Chcete-li prozkoumatprotinádorovéovlivnit plochu vrcholu pro vzorky Mylabris integrovanou s daty otisku prstu a porovnat rozdíly mezi těmito dvěma druhy, korelaci mezi vrcholem otisku prstu aproti-nádorúčinky byly studovány. SPSS19 použily dvě metody kombinující šedou relační analýzu a vícerozměrnou lineární regresní analýzu (MLRA).0 (IBM, USA) a GM6.0 soft (Grey Systems Theory Institution, NUAA, Čína). Theproti-nádorTest byl proveden námi publikovanými metodami [12], buňky HepG2 z buněčné linie lidského hepatocelulárního karcinomu byly udržovány v médiu RPMI1640 doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra. Buňky byly pěstovány ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2 při 37 °C. Pro hodnocení proliferace byla použita metoda SRBproti-nádorčinnostiPoté byla vypočtena IC50 buněk HepG2 a nakonec byly IC50 a normalizované plochy píku použity pro chemometrickou analýzu. Poté byly získány charakteristické markery aktivity Mylabris.

Výsledky a diskuse

Optimalizace extrakčních podmínek

Pro dostatečnou extrakci vodou rozpuštěných sloučenin z Mylabris byl optimalizován extrakční systém. Ultrazvuk a reflux ukázal, že tyto sloučeniny lze optimálně extrahovat refluxováním.

Optimalizace metody HPLC

Pro získání maximálních chromatografických píku pro popis celkového rysu byliny bylo zkoumáno složení chromatografické kolony, mobilní fáze a detekční vlnové délky (200, 254, 265 a 278 nm). Výsledky ukázaly, že kolona Phenimenex Synergy Polar-RP80, voda (obsahující 1 procento ledové kyseliny octové) a methanol a 254 nm byly nejlepšími podmínkami pro HPLC analýzu Mylabris (obrázek 1), struktura 4 standardních látek je znázorněna na obrázku 2 .

Validace metody

V této studii bylo 14 píku dobře odděleno a použito jako "společné píky". Přesnost, opakovatelnost a stabilita byly založeny na retenčním čase (RT) a ploše píku (PA). Hodnoty RSD RT a PA pro přesnost (n=6) nepřesáhly 0,2 a 4 procenta; Hodnoty RSD RA a PA pro opakovatelnost (n=6) byly pod 0,2 a 4 procenta a hodnoty RSD pro stabilitu (0-24 h) byly menší než { {10}},4 a 5 procent, což znamená, že vzorky byly stabilní do 24 hodin. Tyto výsledky ukázaly, že kvalita studovaných vzorků a metoda HPLC byly stabilní a dobře kontrolované.

Hodnocení podobnosti otisků prstů

The fingerprint similarity analysis was used to evaluate the similarity of HPLC peaks. The similarities of MP and MC were calculated by the reference HPLC fingerprint, respectively. As shown in Table 1, except for two MP samples (from Guizhou2 and Guizhou5) with lower similarities (0.880 and 0.920, respectively), other samples of MP were >0.930. The similarities of MC samples were >{{0}}.921 kromě vzorků MC (z Guizhou2 a Guizhou4), jejichž podobnosti byly 0.888 a 0.887, v tomto pořadí. Tyto údaje ukázaly, že kvalita Mylabris u jednoho druhu byla stabilní. Avšak podobnosti pouze tří vzorků MP ve srovnání s referenčním otiskem HPLC byly > 0,930; a podobnosti pouze dvou vzorků MC ve srovnání s referenčním otiskem HPLC byly > 0,921. Tyto výsledky ukázaly, že dva druhy Mylabris se v některých oblastech píku značně lišily.

Diskriminace MP a MC analýzou rozpoznávání vzorů

For global analysis of the difference, PCA was used to find the quality variation of the samples from the two species of Mylabris. Figure 3 shows that the two-dimensional PCA model was constructed by the first two PCs, which included approximately 61.8% of the original data. The score plot showed that the MP and MC samples could not be separated by PCA. To understand the differences between MP and MC, an OPLS-DA model was established. As shown in Figure 4, the Mylabris samples could be classified into two groups with R2X=0.502, R2Y=0.492, and Q2=0.0769 as compared to the PCA model. These results showed that the OPLS-DA model was more suitable than the PCA model for distinct separation of the test samples based on their different components. From the S-plot of OPLS-DA, peak markers including peaks 1, 2, 4, 7, 9, 12, and 14 between MP and MC could be found (Figure 5). Based on VIP>1, vrcholy 1, 2, 4, 7, 9, 12 a 14 mohou být nejvýznamnějšími proměnnými při rozlišování mezi těmito dvěma druhy (obrázek 6). Skupina píku (1, 2, 4, 7, 9, 12 a 14) může hrát zásadní roli při rozlišování mezi MP a MC jako charakteristickými chemickými markery.

Vztah spektra a efektu pomocí šedé relační analýzy

To further evaluate the relationship between the variations of normalized peak area and IC50, grey relational analysis (GRA) was performed. The influence rank by normalized peak area was P13>P14>P3>P2>P12>P4>P9>P1>P10>P7>P6>P8>P5> P11 as shown in Table 2. The results indicated that the top-6 peak including peaks 13, 14, 12, 2, 3, and 4 were the main influencing factors for the antitumor effect based on the standard of Relative Grey correlative degree (RGCE) >0.75.

Vztah spektra a účinku podle MLRA

Model MLRA je nejběžnější modelovací metodou pro odvození složitosti vztahu mezi dvěma nebo více proměnnými a odezvou, která byla vytvořena podle následujícího vzorce

kde Y je odhadovaná hodnota a představuje odezvu; Xn je nezávislá proměnná, b{{0}} je průsečík a bn je regresní koeficient pro Xn. V této studii byla použita metoda MLRA ke stanovení vztahu účinnosti otisku prstu mezi hodnotami ploch píku v otiscích HPLC a IC50 anti-HepG2 a poté nalezení možných protinádorových složek. Kolineace dat byla nalezena pomocí běžného modelu MLRA, který není vhodný pro zkoumání korelace mezi Y (IC50) a X (PA). Ke studiu vztahu otisků prstů a účinku byl použit model PCA MLRA a pro analýzu bylo vybráno prvních šest počítačů s podílem kumulativní variance: 91,068 procenta. Nakonec byla stanovena následující rovnice podle výstupu SPSS a počítačů: IC50=1.115864 plus （ 1,87268PA1- 699.722PA2 plus 25,7138PA3 - 24.1528PA4 plus 7,22878PA{{ 23}}.2114PA6 plus 2,95283PA7- 15,5305PA8 plus 13,0297PA9 plus 22,5683PA10 - 10,3462PA11 plus 123,762PA12 plus 31,0428}×4)7}PA4{7}{01}{44} (R bylo 0,682, P <>

Integrace analýzy dvou druhů Mylabris

Experiment ukázal, že HPLC fingerprinting by mohl být použit pro vyjádření chemických vlastností Mylabris. K nalezení rozdílu mezi MC a MP byly použity algoritmy podobnosti, PCA a OPLS-DA. Skupina píku (1, 2, 4, 7, 9, 12 a 14) byla definována jako charakteristické chemické markery.

Navíc se GRA i MLRA ukázaly jako uspokojivé metody pro další rozlišování. Po integraci výsledků analýzy GRA a MLRA by vrcholy 2, 4 a 14 jako markery aktivity přípravku Mylabris měly být zodpovědné za protinádorový účinek, což může být farmakodynamický materiálový základ přípravku Mylabris.

Důležité diferenciální markery byly definovány pro pík s charakteristickými chemickými vlastnostmi a vlastnostmi aktivity markerů. Takže mezi MC a MP na otiscích HPLC po analýze vztahu mezi spektrem a účinkem byly píky 2 (cytosin), 4 (neznámý) a 14 (neznámý) důležitými diferenciálními markery pro rozdíly mezi MP a MC, jak je znázorněno na obrázku 7.

Závěr

Závěrem lze říci, že v tomto výzkumu byla navržena metoda HPLC pro chemický fingerprinting MP a MC. Kombinací HPLC fingerprintingu, PCA a analýzy vztahu mezi spektrem a účinkem, jako je GAS a MLRA, lze rozlišit chemické a farmakologické vlastnosti dvou blízkých druhů Mylabris. To ukazuje, že sloučeniny z píku 2 (cytosin), 4 (neznámý) a 14 (neznámý) jako důležité rozdílové markery hrají dominantní roli při rozlišování mezi MP a MC. Struktura píku 4 a 14 by měla být identifikována jinou technologií. Ukázalo se, že metoda HPLC fingerprintingu kombinovaná se statistickou, chemometrickou analýzou a analýzou vztahu mezi spektrem a účinkem je účinná při objevování složek markerů nebo při podpoře kontroly kvalitybylinné léky.

Reference

1 Wang GS. Lékařské využití Mylabris ve starověké Číně a nedávné studie. J Ethnopharmacol 1989, 26(2): 147-162.

2. Lin YS, Lia YH, Peng ZP a kol. Stanovení obsahu kantaridinu a jeho inhibiční účinek na buňky lidského hepatomu HepG2. Biomed Res-India 2016, 27(2): 533-536.

3. Xu MZ, Lee WS, Kim MJ a kol. Acyl-CoA: inhibiční aktivity amidů mastných kyselin na cholesterol acyltransferázu izolovaných z Mylabris phalerate Pallas. Bioorg Med Chem Lett 2004, 14(16): 4277-4280.

4. Day RM, Harbord M, Forbes A, et al. Kantaridinové puchýře: technika pro vyšetřování přenosu leukocytů a produkce cytokinů v místech zánětu u lidí. J Immunol Methods 2001, 257(1-2): 213-220.

5. Mo RY, Sun NX, Peng R. Studie preferované potravy dospělých Mylabris phalerata v různých geografických populacích. Zhongguo Zhong Yao Za Zhi 2014, 39(22): 4293-4296.

6. Wang XM, Cheng XS, Li XF. Biologická charakteristika Meloidae a její umělé krmení. Guizhou Agricultural Sciences (Chin) 2007, 35(2): 140-142.

7. Yang Y, Zhang J, Jin H a kol. Kvantitativní analýza v kombinaci s technologií otisků prstů a chemometrickou analýzou použitá pro hodnocení šesti druhů divoké Paříže pomocí UHPLC-UV-MS. J Anal Methods Chem 2016: e3182796.

8. Liu Y, Liu Z, Sun G, a kol. Sledování a hodnocení konzistence kvality tablet hlinitanu vizmutnatého jednoduchou metodou kvantifikovaných poměrových otisků v kombinaci se současným stanovením pěti sloučenin a korelací s antioxidačními aktivitami. Plos One 2015; 10: e0118223.

9. Mehdinia A, Asiabi M, Jabbari A, et al. Analýza kantaridinu u falešných puchýřovitých brouků (Coleoptera: Oedemeridae) pomocí headspace mikroextrakce na pevné fázi a plynové chromatografie-hmotnostní spektrometrie. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2011, 879(27): 2897-2901.

10. Li XM, Xiao JS. Studie GC otisků prstů Mylabris phalerata. China Journal of Hospital Pharmacy (Chin) 2010; 30(2): 116-119.

11. Luo CX, Sun, GX a Shi XF. Digitalizované otisky prstů Mylabris od HPCE. Lékárna Central South (Chin) 2008; 6(2): 230-235.

12. Sun GX, Luo CX a Wang, Z. Studie digitalizovaných HPLC otisků prstů Mylabris. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis (Chin) 2008;28(7): 1031-1036.

13. Guo K, Li XF, Yan R, a kol. Aktivita kantaridinu proti lidskému hepatocelulárnímu karcinomu HepG 2 buněk pocházejícího z provincie Guizhou a okolních oblastí. Journal of Modern Medicine & Health (Chin) 2016; 32(5): 648-650.