Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Deficit mitochondriálního transkripčního faktoru A cílený na epiteliální ledviny má za následek progresivní mitochondriální depleci spojenou se závažným cystickým onemocněním--Část I

Ken Ishii^1,2,11 a kol

Abnormální mitochondriální funkce je dobře známým rysem akutní a chronickéledvina nemocí. Získat vhled do role mitochondrií vledvinahomeostázy a patogeneze jsme se zaměřili na mitochondriální transkripční faktor A (TFAM), protein nezbytný pro replikaci a transkripci mitochondriální DNA, který hraje kritickou roli při udržování hmoty a funkce mitochondrií. Zkoumat důsledky narušené mitochondriální funkce vledvinaepiteliálních buněk jsme inaktivovali TFAM v homeoboxu souvisejícím se sinusovým okulím 2-exprimujícímledvinaprogenitorové buňky. Deficit TFAM měl za následek signifikantně sníženou expresi mitochondriálních genů, mitochondriální depleci, inhibici zrání nefronů a rozvoj těžkého postnatálního cystického onemocnění, které mělo za následek předčasnou smrt. To bylo spojeno s abnormální mitochondriální morfologií, snížením spotřeby kyslíku a zvýšeným glykolytickým tokem. Dále jsme zjistili, že exprese TFAM byla snížena u myší a lidípolycystické ledviny, který byl doprovázen mitochondriální deplecí. Naše data tedy naznačují, že dysregulace exprese TFAM a mitochondriální deplece jsou molekulárními rysyledvinacystické onemocnění, které se může podílet na jeho patogenezi.

KLÍČOVÁ SLOVA: glykolýza; vývoj ledvin; mitochondrie;polycystické onemocnění ledvin; TFAM

cistancheje dobré propolycystické onemocnění ledvin

Překladové prohlášení

Myší genetiku jsme použili k pochopení role mitochondriální dysfunkce vledvinahomeostáze. Inaktivace mitochondriálního transkripčního faktoru A (TFAM) v epiteliálních progenitorových buňkách homeoboxu 2 souvisejících s sine oculis vedla kledvinovéselháníkvůli těžkýmpolycystická ledvina choroba. Naše zjištění ukazují, že progresivní mitochondriální dysfunkce je spojena s defektní diferenciací epitelu aledvinovécystogeneze. Dále jsme zjistili, že exprese TFAM a počet mitochondrií byly u člověka sníženypolycystická ledvinatkáň. Naše studie naznačují, že terapeutické strategie, jejichž cílem je zlepšení mitochondriálního zdraví, mohou být prospěšné při léčbě pacientů s autozomálně dominantnípolycystická ledvinachoroba.

Mitochondriální (mt) dysfunkce je dobře známým patologickým rysem společnéholedvina nemocía může vyvolat poškození buněk, zánět a fibrózu.1 Vledvinatubulární epiteliální buňky jsou vysoce závislé na adenosintrifosfátu (ATP) generovaném oxidativní fosforylací (OXPHOS), protože vykonávají více energeticky náročných epiteliálních transportních funkcí. Proto je udržení účinné produkce mt ATP nezbytné pro normální funkci ledvin a systémovou homeostázu elektrolytů. Nedávné důkazy navíc naznačují, že mitochondrie hrají hlavní roli v genové regulaci, buněčné signalizaci a diferenciaci buněk prostřednictvím tvorby intermediárních metabolitů a reaktivních forem kyslíku (ROS).2 Navzdory těmto pokrokům hraje roli mt signalizace v patogenezi běžnýchledvinanemocínení dobře pochopeno.

Prozkoumat funkci mt vledvinovéhomeostázou a patogenezí jsme se zaměřili na mitochondriální transkripční faktor A (TFAM). TFAM je jaderně kódovaný faktor nezbytný pro funkci mt, udržení počtu kopií mt a strukturální stabilitu mt DNA, protože reguluje replikaci a transkripci mt genomu ohýbáním promotorové DNA.3,4 Savčí mt DNA obsahuje 37 genů, 13 z nichž kóduje proteinové podjednotky komplexu dýchacího řetězce, 22 kóduje přenosové RNA a 2 ribozomální RNA.3 TFAM se tedy přímo podílí na regulaci transportu elektronů mt a syntéze ATP prostřednictvím transkripce genů, jako je mitochondriálně kódovaný cytochrom b ( MT-CYB), mitochondriálně kódovaná cytochrom c oxidáza podjednotka 1 (MT-CO1) a mitochondriálně kódovaná ATP syntáza membránová podjednotka 6 (MTATP6).3,5Bez TFAM ztrácejí buňky schopnost produkovat ATP prostřednictvím OXPHOS, nemohou generovat významné množství mt ROS a postupně se zbavují mitochondrií.6–9 Genetické studie ukázaly, že TFAM je nezbytný pro normální embryogenezi, protože globální homozygotní inaktivace Tfam má za následek intrauterinní letalita do embryonálního dne 10,5, zatímco heterozygotní deficit, i když snížil počet kopií mt o ~40 procent a vedl k deficitu dýchacího řetězce, nevedl k embryonální letalitě.6 Genetické cílení TFAM je tedy užitečnou experimentální strategií pro zkoumání role progresivní mt dysfunkce v buněčné diferenciaci a tkáňové homeostáze. Podmíněná inaktivace Tfam specifická pro buněčný typ naznačuje, že tvorba OXPHOS a/nebo mt ROS je kritická pro buněčnou diferenciaci, funkci a normální fyziologii.6–10

Mohou se vyskytovat primární poruchy mt způsobené nukleárními nebo mt genovými mutacemiledvina chorobanejčastěji se projevuje jako tubulointersticiální poškození nebo izolovaná tubulární dysfunkce.11,12 Ačkoli se podílejí na patogenezi určitých lidských onemocnění, jako jsou neurodegenerativní poruchy,13 specifické mutace v TFAM způsobujíledvinovéonemocnění nebyly hlášeny. V poslední době byla snížená exprese TFAM spojena s chronickouledvinachoroba. Ztráta integrity mt v důsledku inaktivace Tfam způsobila tubulointersticiální onemocnění aledvinové selháníu myší, což bylo částečně způsobeno aktivací cyklické GMP-AMP syntázy (cGAS) – stimulátoru interferonových genů (STING) závislých zánětlivých reakcí vyvolaných stresem mt DNA.14

Zde uvádíme, že u myší s podmíněnou inaktivací Tfam v homeoboxu 2 (SIX2) souvisejícím s homeoboxem 2 (SIX2) exprimujícím nefronové progenitorové buňky15 se vyvine závažné cystické onemocnění a předčasně umírajíledvinovéselháníjako mladé nedospělé myši.Tfam^-/- myši byly charakterizovány defekty ve zrání nefronů, což bylo spojeno s deplecí mt, snížením OXPHOS a metabolickým posunem směrem ke glykolýze vTfam^-/- ledvinovéepitel. Vzhledem k závažnosti cystického onemocnění vTfam^-/- myší, analyzovali jsme 2 myší modelypolycystická ledvinachoroba(PKD), které jsou výsledkem mutací buď polycystinu-1 (PKD(polycystické onemocnění ledvin)1) nebo cystin-1 (Cys1), stejně jako lidské tkáně od pacientů s autosomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin (ADPKD). To stanovímeTfam^-/- je dysregulován v cystách z myší i lidské PKD(polycystické onemocnění ledvin), papírové kapesníky. Celkově vzato, naše studie naznačují, že dysregulace TFAM a vyčerpání mt jsou charakteristické rysyledvinovécystická onemocnění a mohou se podílet na jejich patogenezi.

cistancheje dobré propolycystické onemocnění ledvin

VÝSLEDEK

Inaktivace Tfam v buňkách linie SIX2 způsobuje závažné cystické onemocnění, které má za následekledvinovéselháníAby bylo možné prozkoumat funkci mt vledvinovéepitelu jsme inaktivovali Tfam v ŠESTI2-exprimujících progenitorových buňkách, které dávají vzniknout všem segmentům nefronů kromě sběrného kanálku (CD).15 Za tímto účelem jsme zkřížili alelu Tfam s bakteriálními umělými chromozomovými transgenními myšmi, které exprimují fúzní protein zesílený zelený fluorescenční protein/Cre rekombináza (eGFP/Cre) pod transkripční kontrolou promotoru Six2 (obrázek 1a).16 Myši homozygotní pro floxovanou alelu Tfam a heterozygotní pro transgen eGFP/Cre (Šest2-eGFP/Cretg/^{tg plus}; Tfam^fl/fl) se odsud nazývá šest2-Tfam^-/- mutanti. Šest2-Tfam^-/- myši se narodily v očekávaných mendelovských poměrech a vizuální kontrolou při narození nebyly rozlišitelné od kontrolních sourozenců Cre. Rozdíly v tělesné hmotnosti mezi šesti2-Tfam^-/- mutanti a kontroly Cre sourozenci se projevili 14. den po narození (P) (5,7 plus -0,3 g pro mutanty vs. 7,5 plus -0,3 g pro kontroly, n=4 každá, P =0.004; Doplňková tabulka S1). Šest2-Tfam^-/- mutantní myši byly charakterizovány zvětšenýmiledvinyve srovnání s kontrolami (ledvina/poměr tělesné hmotnosti 1,45 procenta plus -0,19 procenta pro mutanty vs. 0,60 procent plus - 0,02 procenta pro kontrolu, n {{8} } každý, P < 0,001;="" obrázek="" 1b,="" doplňková="" tabulka="" s1)="" a="" zemřeli="" ve="" věku="" p20="" a="" p30="" (obrázek="" 1b).="" juvenilní="" letalita="" v="" kohortě="" mutantů="" byla="" spojena="">ledvinovéselháníod těžkého cystického onemocnění s hladinami močovinového dusíku v krvi 68,40 plus -5,32 mg/dl pro mutantní myši oproti 16.8 2.0 mg/dl pro kontroly ( n= 6 a 7; P < 0.0001;="" obrázek="" 1b="" a="" c).="" kromě="" toho="" se="" u="" six2-tfam="" mutantů="" vyvinula="" významná="" albuminurie="" (poměr="" albumin/kreatinin="" v="" moči="" 43,58="" plus="" -362,475,18="" mg/g="" u="" six2-tfam="" mutanti="" vs.="" 3,39="" mg/g="" u="" kontrol="" při="" p14,="" n="6" a="" 10,="" v="" tomto="" pořadí;="" p="">< 0,0001).="" to="" je="" v="" souladu="" s="" expresním="" vzorem="" cre="" rekombinázy="" v="" six2="" progenitorových="" buňkách="" nefronů,="" které="" vedou="" ke="" vzniku="" mezenchymu="" odvozeného="" od="">ledvinovétubuly a podocyty.15 Na rozdíl od Six2-Tfam^-/- mutanty, myši s heterozygotním deficitem Tfam v progenitorových buňkách SIX2 se vyvíjely normálně, byly plodné a nevyvinuly se zjevněledvinachoroba(Doplňkový obrázek S1).

Obrázek 1|Inaktivace Tfam v buňkách linie SIX2 má za následek závažné cystické onemocnění a selhání ledvin. (a) Schéma ilustrující experimentální přístup a umístění cílených sekvencí v rámci alely Tfam floxed. Analýza polymerázové řetězové reakce celkové genomové ledvinové DNA izolované z kontroly sourozenců (Cre) a Six2-Tfam^-/-myši ve věku postnatální den (P) 7; nerekombinující floxovaná alela Tfam je označena 2-lox (2); rekombinovaná alela podle 1-lox, alela divokého typu podle wt; þ nebo - označují přítomnost nebo nepřítomnost transgenu Six2-eGFP/Cre. (b) Levé panely, fotografie ledvin z Cre control a Six2-Tfam^-/- myši ve věku P20. Hmotnost ledvin (KW) je vyjádřena jako procento tělesné hmotnosti (BW) (n= 4–14). Pravé panely, hladiny močovinového dusíku v krvi (BUN) v kontrolní skupině Cre (co) a Six2-Tfam^-/-myši ve věku P7 (n=7 a 6, v tomto pořadí) a Kaplan-Meierovy křivky přežití pro kontrolu Cre a šest2-Tfam^-/- myši ve srovnání s log-rank testem (n=10–13). (c) Reprezentativní snímky řezů ledvin fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu z kontroly Cre a Six2-Tfam^-/-myši ve věku P7 a P29 barvené hematoxylinem a eosinem (H&E) a analyzované imunohistochemicky na a-aktin hladkého svalstva (ACTA2) a antigen klastrové diferenciace (CD) 31. Číselné znaky znázorňují cystické struktury a hvězdičky znázorňují glomeruly. Pruhy ¼ 1 mm pro průřezy celých ledvin, 10}0 mm pro vysoce výkonné H&E snímky a 50 mm pro IHC snímky. Data jsou vyjádřena jako průměr plus - SEM a byla analyzována 2-sledovaným Studentovým t-testem. ***P < 0,001.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Analýza šesti2-Tfam^-/- myši, které také exprimovaly reportérovou alelu ROSA26-ACTB-tdTomato,-eGFP Cre, zde označovanou jako Six2-mT/mG;Tfam^-/- myší, což naznačuje, že naprostá většina cystických struktur vTfam^-/- ledviny byly odvozeny z buněk s historií exprese Six{0}}eGFP/Cre (doplňkový obrázek S2). Cysty v šesti2-Tfam^-/- ledvinyvykazovaly známky proliferace, jak bylo prokázáno přítomností Ki67-pozitivních epiteliálních buněk výstelky cyst (v průměru 40 procent všech epiteliálních buněk výstelky cyst), zatímco buňky pozitivní na štěpenou kaspázu 3 nebyly v cystách detekovány (doplňkový obrázek S3 ). Tyto nálezy jsou v souladu se zvýšenými hladinami fosforylované extracelulární kinázy regulované signálem (p-ERK) a b-kateninu u Six2-Tfam^-/- ledvinová tkáň (doplňkový obrázek S3). Naše údaje dohromady ukazují, že šest2-Tfam^-/- ledviny vykazují molekulární vlastnosti, které jsou často spojovány sledvinovécystická onemocnění.

Obrázek 3 |Tfam^-/-cysty neexprimují běžné markery specifické pro segment nefronů. (a) Reprezentativní snímky řezů ledvin fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu ze šesti2-mT/mG;Tfam^-/-mice at age postnatal day (P) 14 stained for enhanced green fluorescent protein (eGFP), megalin, uromodulin, thiazide-sensitive sodium chloride cotransporter (NCC), and aquaporin 2 (AQP2) by immunofluorescence (IF). 4',6-diamidino-2-phenylindole was used for nuclear staining (blue fluorescence). Arrows depict tubular structures expressing respective nephron segment-specific markers. Nephron segment marker expression was assessed in cysts with a maximal diameter of >50 mm. (b) Reprezentativní snímky řezů ledvin fixovaných ve formalínu a zalitých v parafínu ze šesti2-mT/mG;Tfam^-/-myši ve věku P14 barvené na eGFP a uromodulin pomocí IF. Hvězdičky znázorňují cysty s intraluminálním uromodulinem. Přítomnost intraluminálního uromodulinu byla vyšetřována u cyst o maximálním průměru 50–100μm nebo u cyst větších než 100 mm v maximálním průměru. Tyče=(a,b) 100 mm. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na adresewww.kidney-international.org.

cistancheje dobré proledvina

Zrání nefronu je u Six2-Tfam vadné^-/-myši

Protože u myší s tkáňově specifickou inaktivací Tfam může trvat až několik týdnů, než se vyvine patologie,17 jsme dále zkoumali časový průběhledvinovévývoj onemocnění v šesti2-Tfam^-/-myši. Odebrali jsme ledviny od kontrolních a mutantních myší ve věku P0, P7 a P14 a použili jsme histologické metody, imunofluorescenční (IF) barvení a analýzu genové exprese jako celkuledvinavýpisy k posouzení. Barvení IF na SIX2 a E-cadherin ve věku P0 prokázalo, že ledviny z kontroly a Six2-Tfam^-/-byly histologicky podobné. Tvorba struktur kortikálních nefrogenních zón, jako je mezenchym SIX2þ cap, E-cadherin – exprimující ureterické hroty a vznikající struktury nefronů, jako je např.ledvinovévezikuly a těla ve tvaru čárky a S nebyla v Six blokována2-Tfam^-/-ledviny (obrázek 2a). Tyto histologické nálezy byly v souladu s úrovněmi exprese genů kódujících nefrogenní markery. Hladiny mRNA Six2, párového boxu 2 (Pax2), LIM homeobox proteinu 1 (Lhx1) a spalt-like transkripčního faktoru 1 (Sall1) se mezi kontrolou a Six významně nelišily2-Tfam^-/- myši celkemledvinahomogenizuje z P0ledviny(Obrázek 2b). To naznačuje, že inaktivace TFAM v progenitorech nefronu SIX2 významně neovlivnila tvorbu nefrogenních struktur.

Přestože tvorba struktury rodícího se nefronu nebyla inhibována, barvení alciánovou modří/kyselinou jodistou – Schiffovým a lotosovým tetragonolobusovým lektinem indikovalo defektní zrání terminálních nefronů v šesti2-Tfam^-/-myši ve věku P{{0}}. Alciánská modř/kyselina jodistá-Schiff, která barví tubulární bazální membrány a kartáčový lem, a lotosový tetragonolobus lektin, který identifikuje specifické oligosacharidy v kartáčovém lemu buněk proximálního tubulu, byly u mutantních ledvin sníženy. Obrázek 2c ukazuje alcianová modř/kyselina jodistá – Schiffovo barvení v časových bodech P0, P7 a P14. Histochemie lektinu Lotus tetragonolobus a barvení IF pro protein Wilmsova tumoru 1 v časových bodech P{{10}}, P7 a P14 jsou uvedeny na doplňkovém obrázku S4. Ve věku P0 byla relativní plocha pozitivně obarvená lektinem lotosového tetragonolobusu 2,10 procent, 0,51 procenta a {{30}},39 procenta 0,1 procenta ve věku P7 oproti 6,25 procenta 0,28 procenta a 6,2 procenta 1,1 procenta u kontrol (n ¼ 3–4, P ¼ 0,0004 a 0,0007, v tomto pořadí; doplňkový obrázek S4). V souladu s těmito histologickými nálezy je významný pokles exprese genů kódujících markery specifické pro glomerulární a nefronový segment podocin, nefrin, aquaporin 1 (Aqp1), kotransportér fosforečnanu sodného 2a (NaPi2a), uromodulin, kotransportér chloridu sodno-draselného 2 ( Nkcc2) a kotransportér chloridu sodného citlivý na thiazidy (Ncc) v šesti2-Tfam^-/-myši (obrázek 2b). Dohromady tyto údaje naznačují, že Six2-Tfam^-/- ledvinyvykazují progresivní redukci počtu zralých proximálních nefronových segmentů a glomerulů.

Protože aktivita Six2-eGFP/Cre vede k segmentům nefronu odvozeným z mezenchymu s nedostatkem TFAM, předpověděli jsme, že dozrávání epiteliálních buněk CD, které jsou odvozeny z ureterických pupenů, nebude u Six ovlivněno{{2} }Tfam^-/-ledviny. V souladu s touto představou je, že barvení aglutininem Dolichos biflorus, který reaguje s N-acetyl-D-galaktózou v distálním tubulu a CD, indikovalo relativní nadměrné zastoupení aglutinin-pozitivních struktur Dolichos biflorus v šesti2-Tfam^-/-ledviny. Ve věku P7 tvořily pozitivně obarvené oblasti pro aglutinin Dolichos biflorus 13,91 procenta 0,9 procenta z celkové plochy pro mutanty oproti 1,93 procenta 0,1 procenta pro kontrolu (n ¼ 3, P ¼ { {10}}.0002; Doplňkový obrázek S4). Exprese mRNA epitelu sodíkového kanálu 1 alfa podjednotky (Scnn1a) nebo akvaporinu 2 (Aqp2), které jsou oba exprimovány v CD epiteliálních buňkách, nebyla významně snížena ve srovnání s kontrolou (obrázek 2b). Na rozdíl od Six2-Tfam^-/-ledvin, inaktivace Tfam v progenitorových buňkách homeoboxu B7 (HOXB7), které vedou ke vzniku CD epiteliálních buněk, což vede ke ztrátě exprese CD nefronového markeru a mírné tubulární dilataci, ale ne cystogenezi (doplňkový obrázek S5). Celkově vzato naše data naznačují, že ztráta funkce TFAM v progenitorových buňkách SIX2 neblokuje vývoj nascentních nefronových struktur, ale inhibuje zrání terminálních nefronů.

Tfam^-/-cysty jsou deficitní v běžných markerech segmentu nefronů

Charakterizovat histogenetický původTfam^-/- ledvinovécyst, provedli jsme IF analýzyTfam^-/- ledvinyat age P14 and examined the expression of nephron segment markers megalin (proximal tubule), uromodulin (medullary thick ascending limb of Henle), thiazide sensitive sodium chloride cotransporter (distal tubule), and aquaporin 2 (CD). The majority of cysts with a maximal diameter of >50 mm did not express these segment-specific markers, indicating a lack of cellular differentiation (Figure 3a, Supplementary Figure S6). Furthermore, approximately 50% of cysts with a maximal diameter of >50 mm byly charakterizovány intraluminálními depozity uromodulinu, které naznačovaly původ ze segmentů nefronu distálně od proximálního tubulu a sestupné Henleovy kličky (obrázek 3b).

Progresivní abnormality ve funkci a morfologii mt vTfam^-/- epitelové buňky

Abychom charakterizovali časový průběh metabolických důsledků delece Tfam, nejprve jsme zkoumali hladiny mRNA Tfam a TFAM-regulovaných mt-Co1, mt-Cyb a mt-Atp6 vTfam^-/- ledvinyve věku P0, P7 a P14. Jak se očekávalo, hladiny mRNA Tfam, mt-Co1, mt-Cyb a mt-Atp6 byly významně sníženy (obrázek 4a).Tfam^-/-epiteliální buňky označené eGFP (šest {{0}} mT/mG; Tfam / myši) vykazovaly významné snížení exprese proteinu MT-CO1 (doplňkový obrázek S7). Počet kopií mt DNA se snížil o 63 procent, což je v souladu s deplecí mt, charakteristickým znakem nedostatku TFAM (obrázek 4a). Naproti tomu exprese jaderných genů kódujících nikotinamid adenindinukleotid: jádrová podjednotka 3 ubichinon oxidoreduktázy (Ndufs3) a flavoproteinová podjednotka A sukcinátdehydrogenázového komplexu (Sdha) nebyla ovlivněna ve věku P0, ale byla snížena ve věku P7 a P14 (obrázek 4a). Tato zjištění z analýzy genu mt a proteinu jsou v souladu s progresivní ztrátou počtu kopií mt v Tfam / epitelu.

Dále jsme zkoumali metabolické účinky inaktivace Tfam v primárních epiteliálních buňkách proximálních tubulů (PTEC) izolovaných ve věku P7.Tfam^-/- PTEC vykazovaly významné snížení bazální spotřeby kyslíku (40.77 4,10 pro mutanty oproti 61.75 50,18 pmol/min/104 buněk pro kontroly, n=3 každý, P =0.034), dýchání vázané na ATP (33.11 3.91 pro mutanty vs. 46.92 40.91 pmol/min/104 buněk pro kontroly, n{{18} } každý, P=0.093), maximální dýchání (116.8 14.19 pro mutanty vs. 225.5 13.55 pmol/min/104 buněk pro kontroly, n{{ 28}} každý, P=0,005) a náhradní respirační kapacita (76.05 10.18 pro mutanty vs. 163.7 80,61 pmol/min/104 buněk pro kontroly , n =3 každého, P=0,003; Obrázek 4b).

Abychom dále charakterizovali stupeň vyčerpání a poškození mt, zkoumali jsmeTfam^-/- ledvinytransmisní elektronovou mikroskopií a {{0}}dimenzionální strukturovanou iluminační mikroskopií (3D SIM). Ve věku P7 vykazovaly mitochondrie nepravidelné tvary a balónky, které jsou v souladu s předchozími nálezy u myší s knockoutem Tfam. Analýza transmisního elektronového mikroskopu ukázala, že strukturální abnormality mitochondrií, jako je zvětšená velikost a abnormální kristy, progredovaly postnatálně, protože morfologické rozdíly mezi mutanty a kontrolou byly méně patrné ve věku P0 a s věkem se staly závažnějšími (obrázek 4c ). 3D SIM byla použita ke zkoumání objemu mt a velikosti sítě v šesti2-mT/mG; Tfam / mutanty ve srovnání se šesti2-mT/mG kontrolními myšmi ve věku P7; Objem mt byl měřen v příčných řezech 5 až 8 tubulů na řez, přičemž se zkoumalo 25 až 4 0 eGFP-pozitivních kortikálních epiteliálních buněk barvených na napěťově závislý aniontově selektivní kanál 1 barvením IF. Zjistili jsme, že celkový objem mt na eGFP pozitivní buňku byl významně snížen (62.66 16,46 mm3/buňka pro mutanty vs. 177.4 300,17 mm3/buňka pro kontroly, n ¼ 3 každá , P ¼ 0.0289) a byla spojena se změnou poměru celkového objemu mt na celkový objem buněk z 0.230 0.01 v ovládacích prvcích na 0.{{{101} 33}}.016 v šesti2-Tfam / mutanty (n ¼ 3 každý, P ¼ 0,0017; obrázek 4c). Maximální velikost sítě mt, která měří největší síť mt zaznamenanou ve všech zkoumaných eGFP-pozitivních buňkách, byla snížena v šesti2-Tfam^-/- ledviny(143.2 23.2 mm3 pro mutanty vs. 318.3 49.45 mm3 pro kontroly, n ¼ 3 každý, P ¼ 0.0327). Celkově vzato, ultrastrukturální nálezy a nálezy SIM a nálezy z analýzy genu mt a proteinů jsou v souladu s progresivní ztrátou počtu kopií mt vTfam^-/- epitel.

Cistancheje dobré propolycystické onemocnění ledvin

Nedostatek TFAM posouvá renální epiteliální metabolismus směrem ke glykolýze

PTEC vledvinapoužívají b-oxidaci mastných kyselin a OXPHOS pro tvorbu ATP a jsou glukoneogenetické.18 Abychom získali další pohled na metabolické změny spojené s inaktivací Tfam, provedli jsme analýzu sekvenování RNAledvinyod šesti2-Tfam^-/-a Cre kontrolní myši ze stejného vrhu ve věku P7. Zjistili jsme, že klíčové regulační geny zapojené do glykolýzy, jako je hexokináza 2 (Hk2) a enoláza 2 (Eno2), byly upregulovány. Naproti tomu exprese většiny genů zapojených do cyklu trikarboxylových kyselin byla snížena (např. isocitrátdehydrogenáza 1 [Idh1]), stejně jako exprese genů zapojených do b-oxidace mastných kyselin, jako je acetyl-koenzym A acyltransferáza 1B ( Acaa1b), acyl-koenzym A dehydrogenáza se středně dlouhým řetězcem (Acadm) (obrázek 5a a b, doplňkový obrázek S8). V souladu se sníženou expresí genů zapojených do cyklu oxidace trikarboxylových kyselin byla akumulace neutrálních lipidů, jak bylo zjištěno barvením olejovou červení O ve zmrazeném stavu.ledvinasekce ve věku P14 (obrázek 5c).

Snížená exprese TFAM v myších a lidských tkáních PKD je spojena s deplecí mt

Protože šest2-Tfam^-/- ledvinyse silně podobal PKD(polycystické onemocnění ledvin) ledviny, dále jsme hodnotili, zda byl TFAM dysregulován v PKD(polycystické onemocnění ledvin)papírové kapesníky. Nejprve jsme zkoumali genovou expresi regulovanou TFAM a TFAM na 2 dobře zavedených genetických myších modelech PKD. Hladiny mRNA Tfam byly významně sníženy v homogenátech celých ledvin z Pkd^-/- a Cys^cpk/cpkmyši, které nesou mutace v obou PKD1(polycystické onemocnění ledvin)nebo Cys1. To bylo spojeno se snížením exprese mitochondriálně a nukleárně kódovaných mt genů a také dysregulovanou expresí glykolytického genu. Podobné jako Six2-Tfam^-/-ledviny, PKD(polycystické onemocnění ledvin)^-/- a Cys^cpk/cpk ledvinybyly charakterizovány zvýšenými hladinami Eno2 a Hk2 a významně sníženými hladinami transkriptů fosfoglycerátkinázy (Pgk) 1, pyruvátdehydrogenázy kinázy (Pdk) 1 a Pdk4 (obrázek 6a). Exprese proteinu TFAM, jak bylo hodnoceno barvením IF, byla snížena v epiteliálních buňkách výstelky cyst ve srovnání s epiteliálními buňkami ze sousedních necystických tubulů (obrázek 6b). To bylo spojeno se sníženou expresí mt-Co1 a mt-Atp6 fluorescenční RNA hybridizací in situ (obrázek 6b, doplňkový obrázek S9); Objem mt, stanovený pomocí 3D SIM, byl snížen o 55 procent ve srovnání s epiteliálními buňkami ze sousedních necystických tubulů nebo PTEC z normální kontrolyledviny. Rozdíly v objemu mt mezi normálními kontrolními PTEC a PTEC z necystických tubulů nebyly nalezeny (obrázek 6c).

Zkoumat, zda ztráta exprese TFAM je společným molekulárním rysem lidské PKD(polycystické onemocnění ledvin)analyzovali jsme nefrektomické vzorky od 5 pacientů s ADPKD imunohistochemicky, IF barvením, RNA fluorescenční in situ hybridizací a 3D SIM. Snížená exprese TFAM byla pozorována u 75,2 procenta plus -7,5 procentaledvinovécysty analyzované imunohistochemicky. To bylo spojeno se sníženou expresí MT-CO1 a MT-ATP6 fluorescenční RNA hybridizací in situ (obrázek 7a, doplňkový obrázek S10); Objem mt v epiteliálních buňkách výstelky cyst se zmenšil přibližně o 70 procent, jak bylo hodnoceno pomocí 3D SIM (obrázek 7b). Celkem vzato analýza 2 PKD(polycystické onemocnění ledvin)myší modely a lidské tkáně ADPKD naznačovaly, že nedostatek TFAM a deplece mt jsou běžnými nálezy u PKD(polycystické onemocnění ledvin)tkání a pravděpodobně ovlivní patogeneziledvinovécystické onemocnění.

cistanche je dobrýpolycystické onemocnění ledvin

Diskuse

Kliknutím sem zobrazíte informace o části II (Diskuse) tohoto článku.

Výňatek z: 'ledvinyNedostatek mitochondriálního transkripčního faktoru A cílený na epitel má za následek progresivní mitochondriální depleci spojenou s těžkým cystickým onemocněním, Ken Ishii1,2,11 et al.

---ledvinyMezinárodní (2021) 99, 657–670