Část 2: Kalpastatin zabraňuje poškození podocytů zprostředkovaného angiotensinem II prostřednictvím udržování autofagie

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pls klikněte zde pro část 1

Pls klikněte sem pro část 3

Angel plus HSD aktivuje aktivitu calpainu v podocytech, která přispívá k autofagické blokádě

Protože bylo zjištěno, že aktivita calpainu (i) je aktivována Angelem v několika typech buněk a (ii) štěpí několik proteinů souvisejících s autofagií, zajímalo nás, zda lze AngII plus HSD zprostředkovanou autofagickou blokádu připsat zvýšené aktivitě calpainu indukované Angl. Nejprve jsme zjistili, že primární podocyty exprimují 3 všudypřítomné formy calpainů (obrázek 3a). Poté jsme ukázali, že AngII stimuloval aktivitu calpainu v primárních podocytech. Toto zvýšení aktivity calpainu bylo blokováno selektivním inhibitorem calpainu (obrázek 3b). Použili jsme knock-in myš s další expresí calpastatinového transgenu (vedoucí ke snížení aktivity calpainu) k posouzení role calpainů v AngII plus HSD zprostředkovanéledvinazraněnía autofagická blokáda. Primární podocyty z CST'g myší vykazovaly sníženou aktivitu calpainu v reakci na AngII ve srovnání s podocyty z kontrolních myší (obrázek 3c). Nadměrná exprese calpastatinu v podocytech tedy snížila aktivaci calpainu zprostředkovanou AngII.

Cistanchetubulosamá hodněefekty, klikněte sem a dozvíte se více

Dále jsme hodnotili hladiny autofagie v podocytech z myší CSTTg. Vytvořili jsme myši CST s transgenem GFP-LC3. Reportér LC3-GFP umožnil počítání autofagozomů jako GFP plus /P62 plus tečky. P62 se bude akumulovat v agregátech v buňkách, když je blokován autofagický tok. V bazálním stavu jsme napočítali méně GFP plus P62 plus tečky (obrázek 4a, b a e) a menší akumulaci P62 (obrázek 4c, d a f) v podocytech myší CST1g GFP-LC3 než v podocytech normálních

Obrázek 4|Vyhodnocení autofagického toku v podocytech calpastatinových transgenních (CST9) myší. (a,b) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese zeleného fluorescenčního proteinu (GFP) (zelená) a P62 (červená) v glomerulech od 12-týdenních myší GFP-LC3 a CST'GFP-LC3. Šipky označují GFP plus P62 plus autofagozomy. (c,d) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese P62 (zelená) a Podokalyxinu (PODXL; červená) v glomerulech od 12-týdenních myší GFP-LC3 a CST'9 GFP-LC3. Dílčí části obrázku s prvočíslem označují vyšší zvětšení. Jádra byla obarvena Hoechst （modrá）. Tyče=50 μm. （e） Kvantifikace počtu LC3 plus P62 plus teček na podocyt. Mann-Whitney test:**P=0.0065. (f) Kvantifikace P62 plus plocha na glomerulární řez. Mann-Whitney test:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 myší GFP-LC3 a n =8 myší CST'9 GFP-LC3. Hodnoty jsou uvedeny jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se prosím na online verzi tohoto článku na myších GFP-LC3, což naznačuje zvýšený autofagický tok v podocytech myší s vysokou abundancí calpastatinu.

Autofagický tok lze monitorovat měřením konverze cytoplazmatické formy LC3, LC3-I, na autofagozomálně štěpenou a fosfatidylethanolaminem navázanou formu LC3, LC3-II, na Western blotu . Podocyty z myší CST vykazovaly zvýšenou konverzi LC3-I na LC3-II a sníženou expresi P62, a to jak v přítomnosti, tak v nepřítomnosti bafilomycinu A, (obrázek 5a a b), což naznačuje zvýšený autofagický tok v podocytech s nadměrnou expresí kalpastatinu. Nakonec akumulace GFP plus P62 plus tečky v podocytech po podání chlorochinu byla důležitější u myší CST'g GFP-LC3 než u myší GFP-LC3, což potvrzuje, že nadměrná exprese calpastatinu indukuje autofagický tok v podocytech in vivo (obrázek 5c -E). Celkově naše data naznačují, že AngII stimuluje aktivitu calpainu v podocytech, že autofagie je inhibována calpainem v podocytech a že inhibice endogenní aktivity calpainu nadměrnou expresí calpastatinu je dostatečná ke stimulaci autofagického toku v podocytech.

Myši CSTT9 jsou chráněny před poškozením podocytů vyvolaným Angel plus HSD

CSTT: myši nevykazovaly žádnéledvinazměna do věku alespoň 12 měsíců (doplňkový obrázek S5). Analyzovali jsme poškození podocytů u myší CST'号 během léčby AngII plus HSD. Ačkoli se u WT myší vyvinula mírná glomeruloskleróza a poškození podocytů po 4 týdnech hypertenze, jak ukazuje abnormální exprese podokalyxinu a nefrinu, myši CSTTg vykazovaly méně sklerotických glomerulárních lézí (obrázek 6a

Obrázek 5|Blokování autofagozomální degradace potvrdilo zvýšený autofagický tok podocytů u calpastatinových transgenních (CSTT) myší. (a) Western blot analýza exprese LC3. Sekvestozom 1 (SOSTM1)/P62 a ATG5 v primárních podocytech od myší divokého typu (W nebo CST'9. Exprese tubulinu slouží jako normalizace. Podocyty byly nebo nebyly ošetřeny bafilomycinem A1 (BafA1; 100 nM) po dobu 4 hodin před kultivací zatčení. (b) Kvantifikace poměrů LC3-ll/'tubulin a P62/tubulin.n=10 myší WT a n =8 myší CST'9. Hodnoty jsou uvedeny jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM. Obousměrná analýza rozptylu spárovaného pro léčbu: pro LC3-ll/tubulin: genotyp, P= 0.0008;léčba, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">ledvina-international.org.

Obrázek 6| Nadměrná exprese kalpastatinu zabraňuje poškození podocytů zprostředkovanému angiotensinem II (Angel) plus dietou s vysokým obsahem soli (HSD). (a,b)

Cistanchemůže ulevitnemoc ledvin

Reprezentativní snímky Massonových trichromem obarvených řezů glomerulů z myší divokého typu (WT a calpastatin transgenní (CST'9) myši po 6 týdnech Angll plus HSD.Bars=50 um.(c,d,f,g) Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese (c,d) podokalyxinu (PODXL) a (f,g)nefrinu (NPHS1) u myší WT a CST'9 po 6 týdnech Angel plus HSD a související kvantifikace (e,h). {8}} um. (ii)

cistancheumí léčitakutní renální selhání

Reprezentativní imunofluorescenční snímky exprese Wilmova nádoru 1 (WT1; zelená) a PODXL (červená) v glomerulech od myší WT a CST' po 6 týdnech Angel plus HSD a (k) související kvantifikace počtu WT1 plus buněk na glomerulární sekce. Jádra byla obarvena Hoechst (modrá). Tyče =50 um. V (e,h,k) jsou hodnoty prezentovány jako jednotlivé grafy a průměr ± SEM,n =9 WT myší a n=7 CSTTg myší. Nepárový t-test se stejnou SD:**P =0,0095 in (e),*P=0,0249 in (h), P=0,7891 in (k).

a b) a zachovalou expresi podokalyxinu a nefrinu (obrázek 6c-h). Takové rozdíly ve fenotypu podocytů byly pozorovány ve fázi, kdy se hustota podocytových jader nelišila mezi WT a hypertenzními CST'g myšmi (obrázek 6i-k).

Podobně po 6 týdnech hypertenze vykazovaly myši GFP-LC3 a CST'1 GFP-LC3 poškození podocytů, ale léze byly výraznější u myší GFP-LC3 (obrázek 7). Poměr albuminu a kreatininu v moči byl vyšší u myší GFP-LC3 po 4 týdnech AngLI plus HSD (obrázek 7a). Počet podocytů se mezi těmito 2 genotypy nelišil, ale exprese nefrinu byla významně více snížena u GFP-LC3 (kontrolní) myší (obrázek 7b-e). V korelaci s ochranou zprostředkovanou calpastatinem ukázala ultrastrukturální analýza mírné a fokální vymazání výběžku podocytů u myší GFP-LC3 léčených Angl plus HSD s lepším zachováním výbrusu chodidla u myší CST'g, ačkoli globální kvantifikace počtu výběžky chodidel na délku glomerulární bazální membrány (GBM) nebyly statisticky odlišné, s největší pravděpodobností proto, že poškození podocytů je v našem modelu fokální a segmentální (obrázek 7f-h). Za zmínku stojí makrofágy a infiltrace T-lymfocytů vledvinyse mezi skupinami nelišily (doplňkový obrázek S6). Celkově vzato tyto výsledky prokázaly, že calpastatin zabránil poškození podocytů indukovanému AngII plus HSD.

Nadměrná exprese calpastatinu obnovuje autofagický tok v podocytech z myší po léčbě Angel plus HSD

Nakonec nás zajímalo, zda glomerulární ochrana zprostředkovaná calpastatinem v modelu AngII plus HSD implikuje udržování autofagie v podocytech. Je zajímavé, že akumulaci P62 v podocytech indukovanou AngLI plus HSD bylo zabráněno u myší CSTTg a GFP-LC3 CST'g (obrázek 8a-d), což naznačuje, že calpastatin zabránil blokádě autofagie podocytů. Je třeba poznamenat, že počet značení autofagozomů GFP plus P62 plus byl podobný u podocytů z hypertenzních myší GFP-LC3 a GFP-LC3 CST, což naznačuje, že AngLI plus HSD vyvolalo zpomalení autofagického toku podocytů spíše než úplné zastavení (Obrázek 8e-g).

In silico predikce místa štěpení kalpainu v podocytových proteinech

Použili jsme několik nástrojů in silico k predikci potenciálních cílů calpainu v podocytech (doplňkové tabulky S1 a S2). Byly porovnány tři online databáze: GPS-CCD, 4CaMPDB,5 a DeepCalpain. stupně In silico analýza identifikovala několik podocytových proteinů, mezi nimi nefrin a podocin, které by mohly být štěpeny kalpainy. Kalpastatinem zprostředkovaná glomerulární ochrana by tedy mohla být spojena se snížením enzymatické aktivity calpainu, což by vedlo ke snížené degradaci některých podocytových proteinů.

Kromě toho jsou alespoň 3 proteiny související s autofagií přímými cíli calpainů. ATG5 je štěpen calpainy, což vede k narušení tvorby komplexu ATG12-ATG5.57 Podávání inhibitorů calpainu in vivo také zabránilo štěpení autofagického proteinu Beclin-1.5"In silico analýza domnělé místo štěpení na proteinech souvisejících s autofagií podporuje hypotézu, že calpain by mohl regulovat autofagii prostřednictvím enzymatického štěpení autofagií proteinů.

mRNA exprese endoplazmatického retikula (ER) a markerů oxidačního stresu v glomerulech z myší léčených Angll plus HSD

Hodnotili jsme stres endoplazmatického retikula (ER) a oxidační stres pomocí kvantitativní PCR v glomerulech během léčby AngII plus HSD (tabulka 1). Na začátku jsme nepozorovali žádnou změnu v expresi mRNA analyzovaných genů u glomeruli5loxlox myší (doplněk z WT a Nphs2.cre Atg5 obrázek S7). Po 6 týdnech hypertenze glomeruly z Nphs2. Myši cre Atg5loxlox vykazovaly různé profily mRNA genů drah ER stresu a oxidačního stresu se zvýšenou expresí Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl a Hsp90b1 ve srovnání s glomeruly WT, což naznačuje, že autofagická deplece v podocytech upřednostňovala AngII plus HSD indukované ER stres a oxidační stres. Naopak glomeruly z CST myší vykazovaly downregulaci několika genů drah ER stresu a oxidačního stresu, stejně jako sníženou expresi některých proapoptotických genů (obrázek 9).

Dohromady tyto výsledky naznačují, že nadměrná exprese calpastatinu by mohla zabránit glomerulárnímu poškození snížením AngII plus HSD-indukovaného ER a oxidačního stresu.

DISKUSE

V této studii jsme prokázali, že u AngII plus HSD-indukované hypertenze je autofagie podocytů výrazně downregulována. Navíc myši s podocytově specifickou delecí Atg5 byly náchylnější k Angl plus HSD-indukované glomeruloskleróze a ztrátě podocytů, což ukazuje, že autofagie v podocytech zabraňuje rozvoji hypertenzní nefropatie, což zdůrazňuje kritickou roli autofagie v podocytech indukovaných Angl plus HSD zranění. Málo je známo o extracelulárních stimulech, které regulují buněčnou autofagii, a tyto výsledky vrhají světlo na patofyziologickou regulaci autofagie podocytů pomocí AngII.

U většiny lidských glomerulopatií je vymazání podocytového výběžku charakteristickým znakem glomerulárního poškození vedoucího k proteinurii. Autofagie pravděpodobně hraje zásadní roli při udržování funkce podocytů, protože tyto terminálně diferencované buňky vykazují vysokou míru autofagie i v nepřítomnosti stresu. Předchozí studie ukázala, že Angi podporuje autofagii prostřednictvím generování reaktivních forem kyslíku v podmíněně imortalizované buněčné linii myších podocytů.5 Produkce reaktivních forem kyslíku je skutečně obecným induktorem autofagie u mnoha typů buněk a důvody pro takový rozpor s našimi nálezy jsou nejasné. Na rozdíl od této poslední studie jsme použili myší primárně kultivované podocyty zachovávající expresi podocinu a nefrinu a in vivo přístupy a nikoli myší buněčné linie. Potvrzujeme předchozí zprávy, že postmitotické podocyty vykazují neobvykle vysokou úroveň konstitutivní autofagie. Měření zvýšeného množství LC3-II po stimulaci AngII v přítomnosti nebo nepřítomnosti lysozomálních inhibitorů je nezbytné pro stanovení

zda je autofagický tok zvýšený nebo blokovaný. Předchozí studie tento fenomén opomíjely.

Zde jsme použili hypertenzní model založený na AngLI perfuzi a HSD. Podocyty vykazují ATI receptory a jsou vystaveny volným filtrovaným peptidům, jako je AngII1,6,26,61-6 Předpokládá se, že pozorované renoprotektivní účinky inhibice RAAS by mohly být – alespoň částečně – způsobeny blokádou tohoto podocytu -specifický RAAS. Stejně tak studie in vivo

Cistanchemůže ulevitnemoc ledvin