Močové exozomy identifikují zánětlivé cesty u akutního poškození ledvin spojeného s vankomycinem

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Linda Awdishu 1,*, Amy Le 1, Jordan Amato 1, Vidhyut Jani 1, Soma Bal 2, Robert H. Mills 1, Marvic Carrillo-Terrazas 1, David J. Gonzalez 1, Ashita Tolwani 3, Anjali Acharya 4, Jorge Cerda 5, Melanie S. Joy 6,7, Paola Nicoletti 8, Etienne Macedo 2, Sucheta Vaingankar 2, Ravindra Mehta 2, Satish P. Ramachandra Rao 9 a jménem přímých vyšetřovatelů †

1 Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, University of California, San Diego, CA 92093, USA;a6le@ucsd.edu (AL); jegilmor@ucsd.edu (JA); vgjani@ucsd.edu (VJ); rhmills@health.ucsd.edu (RHM);mac215@health.ucsd.edu (MC-T.); djgonzalez@ucsd.edu (DJG)

2 School of Medicine, University of California, San Diego, CA 92093, USA; sobal@ucsd.edu (SB);emacedo@ucsd.edu (EM); svaingankar@health.ucsd.edu (SV); rmehta@ucsd.edu (RM)

3 School of Medicine, University of Alabama, Birmingham, AL 35233, USA; atolwani@uab.edu

4 Albert Einstein College of Medicine, The Bronx, NY 10461, USA; anjali2526@gmail.com

5 Albany Medical College, Albany, NY 12208, USA; jorge.cerda82@gmail.com

6 Division of Renal Diseases and Hypertension, Skaggs School of Pharmacy and Pharmaceutical, Aurora, CO 80045, USA; MELANIE.JOY@cuanschutz.edu

7 Lékařská fakulta, University of Colorado, Aurora, CO 80045, USA

8 Mount Sinai School of Medicine, New York, NY 10029, USA; paola.nicoletti@mssm.edu

9 Ústav buněčné a molekulární medicíny, University of Michigan Medical System, Ann Arbor, MI 48109, USA; satishpr@med.umich.edu

* Korespondence: lawdishu@ucsd.edu; Tel.: plus 858-534-3919

† Členství v Přímých zkoušejících je uvedeno v Poděkování.

Abstraktní:

Pozadí:Vankomycin se běžně používá jako terapie první linie pro grampozitivní organismy, jako je methicilin-rezistentní Staphylococcus aureus. Akutní vyvolaná vankomycinemledvinazranění(V-AKI) byl hlášen až u 43 procent pacientů, zejména u těch s vyššími cílovými minimálními koncentracemi. Přesný mechanismus poškození u lidí zůstává nepolapitelný, s nedávnými důkazy zaměřenými na apoptózu buněk proximálního tubulu. V této studii jsme zkoumali obsah proteinů v močových exozomech u pacientů s V-AKI, abychom dále objasnili biomarkery mechanismů poranění a potenciálních reakcí. Metody: Do analýzy byly zahrnuty vzorky moči pacientů s V-AKI, kteří byli zařazeni do studie DIRECT, a zdravých kontrol z UAB-UCSD O'Brien CenterBiorepository. Exosomy byly extrahovány za použití principu vyloučení rozpouštědla a srážení vyvolaného polyethylenglykolem. Proteinová identita a kvantifikace byly stanoveny bezznačkovou kapalinovou chromatografií-hmotnostní spektrometrií (LC/MS). Průměrný vrchol sérového kreatininu byl 3,7 ± 1,4 mg/dl a doba doledvinazraněníbyla 4.{1}} ± 3.0 dnů. Při propuštění prokázalo 90 procent pacientů částečné uzdravení; 33 procent zaznamenalo úplné zotavení do 28. dne. Proteomické analýzy pěti V-AKI a 7 kontrolních vzorků odhalily 2009 proteinů ve všech vzorcích a 251 proteinů významně spojených s V-AKI (Pi-skóre > 1). Nejlepšími diskriminačními proteiny byly komplement C3, komplement C4, galektin -3-vazebný protein, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin těžký konstantní mu a serotransferin.

Závěr:Močové exozomy odhalují up-regulaci in-zánětlivých proteinů po nefrotoxickém poškození u V-AKI. K potvrzení těchto zjištění pro objasnění patofyziologických mechanismů a validaci potenciálních biomarkerů poranění jsou nutné další studie pro velký vzorek pacientů.

klíčová slova:vankomycin; AKI; nefrotoxicita; exosomy; zánět; doplněk; imunitní dráhy

Cistanche herbamůže léčit poškození ledvin

Chengdu Wecistanche mácistancheprodukty pro léčbu poškození ledvin

1. Úvod

Vankomycin je glykopeptidové antibiotikum používané k léčbě methicilin-rezistentních infekcí Staphylococcus aureus u kriticky nemocných pacientů. Nefrotoxicita je závažná nežádoucí příhoda postihující 10–20 procent léčených pacientů a je spojena se zvýšenou délkou hospitalizace, 30-četností opětovného přijetí do nemocnice a 30-denní mortalitou ze všech příčin [1]. Akutní onemocnění související s vankomycinemledvinazranění(V-AKI) je závislá na dávce as počátkem zahájení terapie 4–17 dní. Ačkoli byl V-AKI dlouho uznáván jako hlavní vedlejší účinek vankomycinu, mechanismy nefrotoxicity zůstaly špatně pochopeny. Pochopení buněčných a molekulárních odpovědí spouštěných vankomycinem má klíčový význam pro pochopení mechanismů a vývoj strategií pro minimalizaci rizika V AKI a souvisejících nákladů při maximalizaci jeho účinnosti při léčbě infekcí. Zdá se, že toxická renální odpověď je způsobena přímým účinkem vankomycinu na epitel proximálních tubulů [2]. Doposud byly ke studiu V-AKI na myších modelech aplikovány standardní toxikogenomické přístupy, ale studie u člověka chybí [3–5]. Zvířecí modely ukazují, že podávání vankomycinu vyvolává oxidační stres, který může přispívat k poškození ledvin [6,7]. Jedním z možných mechanismů poškození je zachycení léčiva v proximálních tubulárních buňkách, protože je transportováno transportéry organických kationtů (OCT) přes bazolaterální membránu a do buňky proximálního tubulu, ale nebyly identifikovány žádné aktivní efluxní transportní mechanismy [6] –8].

Exozomy jsou mikrocytové vezikuly odvozené z membrány, které hrají klíčovou roli v mezibuněčné komunikaci a dodávání proteinů/nukleových kyselin a poskytují potenciál pro objev nových biomarkerů, které pomohou při klinické diagnosticeledvinazranění[9]. Bylo navrženo, že exozomy mají větší specificitu a citlivost pro objevování biomarkerů, což je připisováno stabilitě vzorků ve srovnání s transkriptomickými a proteomickými přístupy využívajícími konvenční vzorky séra a moči [9]. V této studii jsme testovali hypotézu, že změna močových exosomových proteinů v reakci na V-AKI pomáhá objasnit mechanismy poškození a identifikovat nové biomarkery u pacientů s potvrzeným poškozením ledvin vyvolaným léky. K tomu jsme využili subjekty ze studie Drug-Induced Renal Injury Consortium (DIRECT), což je mezinárodní multicentrická kohorta klinicky posuzovaných případů akutních akutních onemocnění způsobených léky.ledvinazraněnía kontroly založené na populaci pro zkoumání farmakogenomických prediktorů pomocí asociace v celém genomu. Podrobnosti studie DIRECT jsou popsány v části Metody a nedávné publikaci z naší laboratoře [10].

2. Výsledky

Do analýz byly zahrnuty vzorky moči od 22 subjektů, 10 případů V-AKI a 12 kontrol. Demografie pacientů byla podobná mezi případy V-AKI a kontrolami a jsou shrnuty v tabulce 1. Jak se očekávalo, prevalence hypertenze, diabetu a srdečního selhání byla vyšší u případů V-AKI ve srovnání s kontrolami (tabulka 1).

U všech případů V-AKI se vyvinula AKI stádia 2 nebo vyšší, jak je definováno kritérii KDIGO (Kidney Disease Improving Global Outcomes) (obrázek 1) [11]. Nástup V-AKI nastal 4.0 ± 3.0 dny po zahájení vankomycinu. Časový průběh změn sérového kreatininu (Scr) po přijetí do nemocnice po propuštění z nemocnice a poté je znázorněn na obrázku 1.

Obrázek 1. Změny sérového kreatininu v průběhu V-AKI kurzu. Tento obrázek znázorňuje změny sérového kreatininu v 10 případech v průběhu akutního onemocnění souvisejícího s vankomycinem.ledvinazraněníod přijetí do nemocnice do 90. dne po zranění. Časové body odpovídají časovým bodům studie Drug-Induced Renal InjuryConsortium (DIRECT). Zkratky: SCr=sérový kreatinin, hospitalizace=hospitalizace, předléčivo=před expozicí léku, DIRI=splněna definice poškození ledvin vyvolaného léky, DrugDC {{8} } vysazení léku nebo snížení dávky, Nadir Scr=nejnižší sérum po V-AKI, Hospital Disch= propuštění z nemocnice

Základní rizikové faktory v případech V-AKI zahrnovaly sepsi (30 procent), srdeční onemocnění (30 procent), diabetes Mellitus (30 procent), anémii (20 procent), expozici radiokontrastu (10 procent), onemocnění jater (10 procent) a hypoalbuminémie (10 procent) (obrázek 2).

Nanejvýš případy V-AKI dostávaly epizody tří dávek vankomycinu. Denní dávky vankomycinu se pohybovaly od 1000 do 4000 mg. Průměrný (interkvartilní rozsah (IQR)) počet dní strávených v každé dávkovači epizodě je znázorněn na obrázku 3. Průměrné (směrodatná odchylka (SD)) minimální plazmatické koncentrace vankomycinu spojené s dávkovacími epizodami 1–3 byly zvýšeny na 20,6 ± 8,1, 29,6 ± 16,3, respektive 38,0 ± 13 mg/l. Rozdíl v koncentracích mezi jednotlivými epizodami však nebyl statisticky významný (epizoda 1 vs. 2 p=0,5, epizoda 2 vs. 3 p=0,41)

Údaje o dalších výsledcích jsou shrnuty v tabulce 2. Vzhledem k závažnosti poranění vyžadovalo 20 procent pacientů renální substituční terapii. Úmrtnost v nemocnici byla 10 procent. Po propuštění z nemocnice se 90 procent pacientů z V-AKI nezotavilo. Šest pacientů mělo Scr naměřeno v den 28 po poranění a čtyři v den 90. V den 28 měli dva ze šesti (33 procent) pacientů AKD, ale žádný ze čtyř zbývajících pacientů neměl AKD do 90. dne.ledvinybiopsie byly provedeny u 20 procent případů V-AKI (tabulka 2).

12 vzorků, které byly kvalifikovány pro analýzy po zavedení filtru pro porovnání peptidů s jejich příbuznými spektry, obsahovalo celkem 2009 proteinů Tyto proteiny byly dále analyzovány. Nejprve byla provedena analýza hlavních souřadnic (PCoA), aby se porovnal celkový proteom každého vzorku. Tato analýza odhalila významnou separaci (P-hodnota PERMANOVA=0.037) mezi AKI a kontrolními vzorky (obrázek 4), rekapituluje fenotyp na systémové úrovni také na úrovni proteinu exosomu, čímž se zvýšila naše spolehlivost v těchto souborech dat. . Síla asociace mezi každým proteinem a stavem V-AKI byla hodnocena pomocí metriky pí-hodnoty, která kombinuje významnost p-hodnoty s násobnou změnou [12].

Obrázek 4. Složení proteomu rozlišuje močové exozomy pacientů s V-AKI a kontrol. (A) Analýza hlavních souřadnic vzorků proteomů. Metrika vzdálenosti Bray-Curtis byla použita k výpočtu rozdílů mezi proteomem vzorku a je znázorněn graf hlavních souřadnic. Separace podél os 1 a 3 byla pozorována mezi vzorky AKI (červená) a kontrolními vzorky (modrá). (B) Boxplot shrnující Bray-Curtisovu vzdálenost mezi kontrolními a AKI vzorky. Statistická separace mezi AKI a kontrolními vzorky ukázaná v (A) byla testována pomocí permutační analýzy variačního testu (PERMANOVA). Jsou zobrazeny boxplots shrnující výsledky při porovnávání vzdáleností kontrolních nebo AKI vzorků s kontrolními vzorky.

Dále, binární srovnání mezi V-AKI a kontrolními vzorky poskytlo 42 proteinů významně asociovaných s AKI fenotypem a 26 proteinů asociovaných s kontrolním fenotypem (Pi skóre > 1) (doplňková tabulka S1). Graf vulkánu ilustrující významnost a násobnou změnu spojenou s každým proteinem je ukázán na obrázku 5A. Nejlepšími diskriminačními proteiny pro případy V-AKI byly fibrinogen, komplement C3, komplement C4, galektin -3-vazebný protein, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin těžký konstantní mu a serotransferin (obrázek 5B). Mezi významnými proteiny byla provedena analýza obohacení genové sady pro identifikaci kategorií proteinů změněných u pacientů s V-AKI a výsledky jsou shrnuty v doplňkové tabulce S1. Ukázalo se, že několik proteinů, které byly spojeny s AKI-fenotypem, má funkce spojené se zánětem a/nebo zprostředkovávající zánětlivý fenotyp. Aby se otestovalo, zda tyto změny proteinů mohou souviset se změnami v základní cytokinové signalizaci, byla provedena cytokinová inference, která ukázala silný vztah mezi proteiny asociovanými s AKI a cytokiny IL10, IL6 a TNF. Tyto cytokiny obsahovaly 2,8, 2,3 a 2.{24}}krát více spojení s AKI-asociovanými proteiny než kontrolní-asociované proteiny, v tomto pořadí, jak je shrnuto na obrázku 5C. Interakční sítě protein-protein proteinů asociovaných s AKI a odvozených cytokinů vykazovaly převážně prozánětlivá spojení mezi proteiny asociovanými s AKI, jak je shrnuto na obrázku 5D.

Obrázek 5. Asociace na úrovni proteinu k V-AKI. (A) Graf sopky zobrazující násobek změny a významnost t-testu každého proteinu na stav V-AKI. Top 10 proteinů spojených s AKI a kontrolním stavem je zobrazeno modře a červeně. Další asociované proteiny založené na Pi skóre > 1 jsou zobrazeny žlutě. (B) Pro každý protein bylo vypočteno skóre Pi, které odpovídá jak násobku změny, tak významnosti t-testu a proteiny s nejsilnějšími asociacemi jsou vyneseny do grafu. (C) Topcytokiny spojené s AKI nebo kontrolními proteiny. Byl použit přístup založený na síti cytokinů a jsou ukázány cytokiny vykazující nejsilnější skóre obohacení buď vůči AKI nebo kontrolním proteinům. Červené sloupce představují cytokiny související s proteiny spojenými s AKI, modré sloupce představují cytokiny související s proteiny spojenými s kontrolou. (D) Interakční síť protein-protein proteinů asociovaných s AKI a odvozených cytokinů obohacených o AKI. Vnější okraj proteinových uzlin je zbarven v závislosti na asociacích s pro nebo protizánětlivými cytokiny. Velikost každého uzlu představuje sílu statistické asociace každého proteinu se stavem AKI.

Cistanche tubulosamůže léčit poškození ledvin

3. Diskuse

Uvádíme nový přístup k využití močových exozomů k informování o patofyziologických mechanismech zapojených do drogové indukceledvinazraněnípoužití vankomycinu jako prototypického renálního toxického činidla. Jednou ze silných stránek této studie je začlenění dobře charakterizovaných dat na úrovni pacientů ze studie DIRECT [10] vyvinuté k objasnění mechanismů včetně genomiky léků vyvolanýchledvinazranění. Subjekty se stádiem 2 nebo vyšším AKI byly na počátku vystaveny konvenčním rizikovým faktorům. Všechny subjekty studie měly signifikantně zvýšené minimální plazmatické koncentrace vankomycinu, přestože dostávaly denní dávky nižší než obecně přijímaný práh nefrotoxicity 4 g denně [13]. Mnoho subjektů se zcela nezotavilo z V-AKI při propuštění z nemocnice a mělo akutní onemocnění ledvin měsíc po zranění. Jak se dalo očekávat, jen málo pacientů dostalo biopsii ledviny.

Proteomika močového exozomu/extracelulárního vezikula (EV) prokázala, že cílené diskriminační proteiny pro případy V-AKI zahrnovaly komplement C3, komplement C4, galektin-3-vazebný protein, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin těžký konstantní mu a serotransferin. Tyto exosomové nálezy informují o mechanismech poškození na subcelulární/supramolekulární úrovni pro V-AKI a potenciálně slouží jako biomarkery podél kontinua procesu onemocnění vyvolaného léky.

Exozomy, přítomné v krvi a moči, mají důležitou roli v mezibuněčné komunikaci, koagulaci a nakládání s odpady [14]. Po akutním stavu souvisejícím s toxinemledvinazraněníexozomy uvolněné z tubulárních epiteliálních buněk mohou předávat signály poranění, aby navodily infiltraci makrofágů a podpořily tubulointersticiální zánět [15]. Usoudili jsme, že obsah proteinů v exozomech se bude lišit mezi případy V-AKI a zdravými kontrolami. Dvě stě padesát jedna proteinů bylo ve V-AKI dysregulováno a zdálo se, že se převážně podílejí na zánětlivých a koagulačních drahách. Mezi těmito 251 proteiny naše analýza prokázala, že komplement C3, komplement C4, protein vázající galektin{7}}, fibrinogen, alfa-2 makroglobulin, imunoglobulin těžký konstantní mu a serotransferin byly významně spojeny s případy V-AKI.

Na základě našich výsledků, že C3 a C4 patřily mezi nejlépe rozlišující V-AKI exosomové proteiny, navrhujeme, aby se aktivace komplementového systému podílela na vankomycinem indukovaném renálním tubulárním poškození. To je také v dobré shodě s publikovanou literaturou, že aktivace systému komplementu hraje roli v imunitním komplexu glomerulonefritidy a rozmanité řadě onemocnění ledvin [16]. Poškození ledvin zprostředkované aktivací komplementu u AKI v důsledku ischemie nebo expozice nefrotoxinu bylo spojeno se systémovými zánětlivými příhodami, které spouštějí a přispívají k poranění vzdálených orgánů a mortalitě pacientů [17]. V modelech ischemicko-reperfuzního (IR) poškození vede hypoxie, deplece ATP a mitochondriální poškození k tvorbě volných kyslíkových radikálů po reperfuzi [18]. Cytokiny, chemokiny a aktivace komplementu zesilují zánět, což vede k akutnímu tubulárnímu poranění. Kromě toho jsou myši s deficitem receptoru C3a a C5a chráněny před poškozením IR [19,20]. Ukázalo se, že IR poškození zvyšuje lokální produkci složek komplementuledvinaendoteliální a tubulární buňky [16,21]. Několik studií na zvířecích modelech a lidských subjektech identifikovalo zvýšené ukládání produktů komplementových proteinů, jako jsou C3 a C4, podél tubulární bazální membrány po traumatu nebo poranění vledvina. Nebylo zjištěno, že by tyto zvýšené hladiny depozit byly významně přítomny v peritubulární oblasti nebo oblasti glomerulů, ale byly silně koncentrovány v tubulární membráně, jak je vidět v biopsiích lidských a zvířecích modelových ledvin [17]. Exozomy a EV mohou transportovat složky komplementu v oběhu, když je aktivace komplementu dysregulována [22,23]. Několik buněčných experimentů a klinických pozorování potvrdilo, že uvolněné EV nesou a modulují proteiny komplementu a současně jejich produkce za zánětlivých podmínek je také schopna ovlivnit počet oběhových váčků [23]. Tato vzájemná závislost těchto dvou procesů vede k závěru, že EV vykazují potenciál být zdroji biomarkerů, cíli a terapeutickými prostředky pro komplement a imunomodulační sloučeniny, které jsou vysoce relevantní v rozsahu zánětlivých mechanismů AKI. Naše zjištění, že vzorky V-AKI ve srovnání se zdravými kontrolami, prokazuje roli imunitních odpovědí na přímou toxicitu vankomycinu v tubulárních buňkách ledvin. Kromě výše uvedeného obsahu proteinů představují exozomy/EV pocházející z moči také potenciální neinvazivní biomarkery jako alternativy k biopsii ledvin k detekci a informování o úloze komplementového systému v medikamentóznímledvinazranění.

Ačkoli se mnoho předchozích studií (konkrétní odkazy viz několik následujících vět) zaměřilo na roli galektinu-3 (Gal-3) vledvinazraněníexistuje jen málo údajů o proteinu vázajícím galektin-3 (Gal-3-bp). Gal-3 je exprimován ve sběrných tubulech ledvin a funguje tak, že podporuje nefrogenezi, moduluje interakce buňka-buňka a buňka-matrix a reguluje zánět [24–26]. Henderson a kol. přezkoumali roli Gal-3 při zánětu a zjistili, že Gal-3 je klíčovou složkou chronického zánětu a pokud se poranění tkáně opakuje. Usnadňuje „zazdění“ tkáňového poranění a oddaluje šíření poranění [27]. Kromě toho, Nishiyama a kol. prokázali u potkanů ​​s ischemickou AKI, že Gal-3 mRNA byla upregulována, a následující reperfuze, imunohistochemie odhalila zvýšení Gal-3 napříč segmenty nefronů [25]. Tsuchiyama a kol. zjistili, že podávání Gal-3 u potkanů ​​s nefrotoxickou sérovou nefritidou vedlo ke snížení vylučování bílkovin močí, tvorbě srpku a snížené infiltraci makrofágů do glomerulů [28]. To naznačuje, že po ischemickém nebo imunitně zprostředkovaném poranění hraje Gal-3 roli v regeneraci. Jakožto příbuzný partner Gal-3 by se základní role Gal-3-bp a důvod jeho upregulace při nefrotoxickém poškození způsobeném vankomycinem a dalšími látkami měly v budoucích výzkumech naléhavě zaměřovat.

Naše studie také zjistila, že všechny tři podjednotky fibrinogenu jsou dysregulované, což je v dobré shodě s dříve publikovanými údaji. Fibrinogen je rozpustná dimerní molekula plazmy a každý dimer se skládá ze tří polypeptidů: alfa, beta a gama [29]. Hraje klíčovou roli při hemostáze a koagulaci, ale také se ukázalo, že je důležitý při regulaci zánětlivých stavů [30–32]. Ajay a kol. prokázali, že dostupnost fibrinogenu je důležitá pro funkci ledvin, zánět a přežití [33]. Dále může mít fibrinogen antiadhezivní účinek na epiteliální buňky ledvin, což může být prospěšné tím, že pomáhá předcházet tubulární obstrukci [34]. Fibrinogen je v AKI významně zvýšen a upregulován a byl již dříve hodnocen jako potenciální biomarker pro časnou detekci AKI [29]. Hoffman et al. studovali změnu fibrinogenu po ischemii/reperfuzi a podání cisplatiny u potkanů ​​a mRNA byla upregulována 30 minut po bilaterálním poškození IR a dosáhla vrcholu za 48–72 hodin, zatímco při podání cisplatiny byla exprese fibrinogenu mRNA zjištěno za 24 h [29]. Fibrinogen v moči byl detekován již 3 hodiny po ischemicko-reperfuzním poškození a 24 hodin po podání cisplatiny, což odpovídá velkému nárůstuledvinazraněnímolekula 1 (KIM-1) [29].

Výhody Cistanche: umí léčitporanění ledvin

Historicky byly obecně přijímány dva různé patofyziologické mechanismy pro V-AKI, akutní tubulární nekróza z přímých toxických účinků a akutní intersticiální nefritida. Renální proximální tubulární epitel podléhá ztrátě cytoskeletální integrity, nekróze a apoptóze při akutní tubulární nekróze [35]. Nekrotické buňky uvolňují molekuly, které upregulují vrozený imunitní systém, čímž indukují zánět a urychlují tubulární poškození [35]. V současné studii jsme prokázali zánětlivé markery v močových EV pacientů s V-AKI. Navíc jsme našli prozánětlivý vztah mezi cytokiny IL10, IL6 a TNF a našimi špičkovými AKI rozlišujícími proteiny. Celkově tato data naznačují, že patofyziologie V-AKI je tubulární toxicita s upregulací zánětu během období 24–72 hodin po poranění.

Naše studie má několik omezení. Malá velikost vzorku 22 pacientů, kteří byli muži a převážně bělochy, omezuje zobecnitelnost našich zjištění na jiná pohlaví, rasy a etnické skupiny. Druhým omezením naší studie bylo, že vzorek exosomu moči každého pacienta obsahoval různé množství celkového proteinu, což ztěžovalo měření specifických proteinů, zejména u těch s nižšími absolutními množstvími. I když to není nutně omezení této studie jako takové, protože schopnost každého jednotlivce nabalit proteiny na exozomy moči je přirozeně proměnná, nižší množství proteinů u některých jednotlivců omezuje naši schopnost dalších analýz a vyvozování smysluplných závěrů, které lze zobecnit. větší populace. Třetím omezením je vzorek v jediném časovém bodě, který omezuje naše chápání buněčných změn vyskytujících se v různých fázích kontinua AKI, např. fáze okamžitého poranění, fáze opravy atd. Sekvenční odběr vzorků prohloubí naše chápání časového průběhu obsahu exozomů. změny, oxidační stres vyvolaný akumulací léčiva a upregulace imunitních drah v opravě. Současná studie zahrnovala pacienty definované prahovými hodnotami Scr. Sérový kreatinin je nedokonalým funkčním biomarkerem ledvin, protože zvýšení Scr často zaostává za poraněním [36]. To omezuje citlivost a specificitu Scr pro včasnou detekciledvinazranění[36] a objevily se studie identifikujícíledvinazraněníbiomarkery jako napřledvina zraněnímolekula 1 (KIM1) a neutrofilní gelatinase-associated lipocalin (NGAL) pro včasnou detekci nefrotoxicity [37,38]. Jak bylo uvedeno dříve, biomarkery mají potenciál pro detekci jak zjevných, tak subklinických hladin vyvolaných léčivemledvinazranění[39,40].

4. Materiály a metody

4.1. Výběr pacienta

Do analýzy byly zahrnuty vzorky moči od 10 pacientů s V-AKI, kteří byli zařazeni do studie DIRECT [10], a 12 zdravých kontrolních vzorků moči z biorepozitáře UAB-UCSD O'Brien Center. Kontrolní subjekty byly podle pohlaví, rasy a dekády věku shodné se subjekty studie a neměly žádnou expozici vankomycinu neboledvinazranění. Studie DIRECT je mezinárodní studie zkoumající farmakogenetické prediktory drogově indukovanýchledvinazraněnípomocí celogenomové asociační studie případů a populačních kontrol [10]. Studie DIRECT byla schválena institucionální výzkumnou radou (IRB č. 121651) a před zařazením do studie byl od všech účastníků získán písemný informovaný souhlas, který zahrnoval zajištění využití uložených vzorků pro budoucí analýzy. AKI byla definována v DIRECT jako náhlé snížení funkce ledvin prokázané kterýmkoli z následujících kritérií: (1) absolutní zvýšení sérového kreatininu (Scr) (Větší nebo rovno 0,3 mg/dl nebo Vyšší nebo rovné 26,4 µmol/ L) (v rámci 48-h časového okna) od referenční hodnoty Scr, (2) procentuální zvýšení Scr větší nebo rovné 50 procentům (1,5 násobek oproti referenční hodnotě) během sedmi dnů, (3) snížení moči výstup (zdokumentovaná oligurie<0.5 ml/kg/h="" for="">6 h) navzdory adekvátní resuscitaci tekutinami, je-li to možné, (4) absolutní pokles Scr větší nebo rovný 0,3 mg/dl nebo větší nebo rovný 26,4 µmol/l (v rámci 48- h časové okno) od referenčního Scr, a (5) relativní pokles v Scr větší než nebo rovný 50 procentům (1,5 násobek oproti referenční hodnotě) během sedmi dnů. Do studie byli zařazeni pacienti s AKI ve stádiu 2 nebo vyšším po expozici vankomycinu. Klinická data, včetně demografických údajů, lékařské anamnézy, nálezů fyzikálních vyšetření, vitálních funkcí, chemického složení krve a moči, výsledků biopsie a údajů o dávkování léků, byla shromážděna v následujících časových bodech: (1) přijetí do nemocnice, (2) zahájení léčby vankomycinem, ( 3) vrchol zranění, (4) vysazení léku nebo snížení dávky, (5) vyřešení zranění, (6) propuštění z nemocnice, (7) 28 dní a (8) 90 dní po zranění. Epizoda dávkování vankomycinu byla definována jako změna v dávce nebo frekvenci. Akutní onemocnění ledvin (AKD) je definováno jako přetrvávání AKI stadia 1 nebo vyššího většího nebo rovného 7 dnům po expozici [41]. Pacienti byli kategorizováni s AKD při propuštění z nemocnice, pokud AKI stádium 1 nebo vyšší přetrvávalo a doba od expozice do propuštění z nemocnice byla delší než sedm dní. Od všech účastníků byly odebrány vzorky moči a plné krve. Všechny případy V-AKI byly posuzovány dvěma nezávislými nefrology (EM, JC, RL) ke stanovení kauzality. Úplný popis metod byl již dříve publikován [10].

4.2. Příprava exosomů a sběr proteomických dat

Vzorky moči a krve byly odebrány účastníkům studie DIRECT a vzorky byly před přípravou exosomu zmraženy na -80 ◦C. Vzorky moči použité v této analýze byly vybrány z časového období nejbližšího poškození ledvin v rozmezí od 24 do 72 hodin poledvinazranění. Exosomy byly extrahovány ze zmrazených vzorků moči AKI za použití vlastního protokolu vyvinutého na principu vyloučení rozpouštědla za použití srážení vyvolaného polyethylenglykolem (PEG), jak je popsáno v Rao et al. nedávná publikace [42] strana exosomálních proteinů byla provedena před gelovou trypsinizací pomocí NuPAGE bisTris10% akrylamidových 12jamkových gelů k rozlišení 40 µl proteinu z exozomů kontrolních vzorků moči a vzorků moči AKI.

Gelové extrakty byly kombinovány s pufrem, aby se zabránilo proteolýze, který obsahoval 75 mM NaCl (Sigma, St. Louis, MO, USA), 3 procenta dodecylsulfátu sodného (SDS, Fischer, Arnold AFB, Tullahoma, TN, USA), 1 mM NaF (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM beta glycerofosfát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM beta-glycerofosfát (Sigma, Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM sodík orthovanadát (Sigma, St. Louis, MO, USA), 10 mM pyrofosfát sodný (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 mM fenylmethylsulfonylfluorid (PMSF, Sigma) a 1× Complete Mini EDTA volná tableta inhibitoru proteázy vše v 50 mM HEPES (Sigma, St. Louis, MO, USA), pH 8,5. K denaturaci proteinů se přidal stejný objem 8 M močoviny v 50 mM HEPES, pH 8,5 a provedla se sonikace sondy pomocí dvou 10-s intervalů při 25% amplitudě. Proteiny byly redukovány, alkylovány a zhášeny pomocí dithiothreitolu a jodacetamidu, jak bylo popsáno dříve [43]. Proteiny byly vysráženy přidáním kyseliny trichloroctové (Sigma, St. Louis, MO, USA) ke vzorkům na ledu a peletováním proteinů centrifugací při 4 °C. Proteinové pelety byly dvakrát promyty ledově studeným acetonem. Proteinové pelety byly sušeny při 56 °C po dobu 30 minut, poté resuspendovány v 1 M močovině v 50 mM HEPES, poté štěpeny přes noc při teplotě místnosti 6 ug LysC (Wako, Richmond, Commonwealth of Virginia, USA) a následně {{27} }h štěpení trypsinem stupně sekvenování (Promega, Fitchburg, WI, USA) při 37 ◦C. Vzorky byly odsoleny pomocí C18 Sep-Pak a proteiny byly kvantifikovány [44]. Celkem 1,0 ug proteinu na vzorek bylo analyzováno kapalinovou chromatografií-tandemovou hmotnostní spektrometrií (LC-MS [2]) s použitím 85minutového gradientu kapalinové chromatografie na Easy-nLC 1000 (Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA, USA) připojený v řadě k hmotnostnímu spektrometru Orbitrap Fusion (Thermo Fischer Scientific).

Chromatografie byla prováděna na doma tažené a plněné 30 cm koloně, která byla třikrát naplněna 0,5 cm, 0,5 cm a 30 cm 5 µm C4, 3 µm C18, respektive 1,8 µm C18 a zahřátý na 60 ◦C. Peptidy byly nejprve naneseny při tlaku 500 bar, po čemž následoval chromatografický gradient v rozsahu od 6 do 25 procent acetonitrilu během 70 minut a poté 5-min gradient na 100 procent acetonitrilu, který byl udržován po dobu 10 minut. Elektrosprejová ionizace byla provedena aplikací 2000 V přes T-spojku z nerezové oceli spojující analytickou kolonu a systém Easy-nLC. Po každém vzorku následovala dvě promytí počínaje gradientem od 3 do 100 procent acetonitrilu během 15 minut s dalšími 10 minutami při 100 procentech acetonitrilu. Rozsah hmotnosti k nabití (m/z) 375–1500 byl skenován pro peptidy se stavy nabití mezi 2–6. Centroidovaná data byla použita pro kvantifikaci píku. Akvizice probíhala v režimu kladných iontů závislém na datech. Nezpracovaná spektra byla prohledávána v Proteome Discoverer verze 2.1 proti referenční databázi UniProt (www.uniprot.org (přístup 5. listopadu 2017)) pro Homo sapiens pomocí algoritmu Sequest [18] spolu s reverzním databázovým přístupem používaným ke kontrole peptidů a falešných objevů. sazby (FDR) na 1 procento [17]. Digesce in silico trypsinem, jak je specifikováno v parametrech vyhledávání spolu s minimální délkou peptidu šesti aminokyselin. Nastavení vyhledávání také zahrnovalo dynamickou modifikaci pro oxidaci methioninů a statickou modifikaci karbamidomethylace cysteinů. Tolerance hmotnosti prekurzoru byla nastavena na 50 ppm a tolerance hmotnosti fragmentu na 0,6 Da.

Kromě spektrálních shod a proteinů jsou omezeny na<1% fdr,="" peptide="" matches="" were="" further="" screened="" to="" only="" include="" peptide="" spectral="" matches="" (psms)="" identified="" with="" high="" confidence.="" the="" summed="" abundance="" of="" the="" area="" under="" the="" curve="" of="" ms1="" peaks="" associated="" with="" psms="" was="" used="" to="" represent="" protein="" abundances.="" to="" help="" account="" for="" run-to-run="" variation="" in="" lc-ms2="" experiments,="" the="" raw="" protein="" abundances="" were="" next="" normalized="" by="" a="" two-step="" process.="" in="" the="" first="" step,="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" average="" abundance="" of="" a="" given="" protein="" throughout="" the="" experiment="" divided="" by="" the="" median="" of="" the="" protein="" averages="" observed="" throughout="" the="" experiment.="" in="" the="" second="" step,="" the="" adjusted="" protein="" abundances="" were="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundances="" observed="" within="" their="" respective="" samples="" divided="" by="" the="" median="" protein="" abundance="" observed="" in="" the="" entire="" experiment.="" records="" of="" the="" normalization="" and="" analysis="" of="" proteomics="" data="" are="" available="" in="" a="" jupyter="" notebook="" form="" at="">

4.3. Analýza dat proteomiky

Záznamy analýzy proteomických dat byly nahrány ve formátu jupyter notebooku do úložiště Github (přístup 3. března 2021)). Analýza principů souřadnic (PCoA) byla provedena pomocí Qiime2 (verze 2019-7) [45]. Příkaz časové diverzity core-metrics byl použit k výpočtu vzdáleností mezi vzorky pomocí Bray-Curtis metriky a vizualizace pomocí PCoA. Statistická analýza vzdáleností mezi kontrolními a V-AKI vzorky byla provedena pomocí párového PERMANOVA testu pomocí příkazu "qiime diverzita beta-skupinový význam". Prostřednictvím balíčku seaborn (přístup 3. března 2021) byl vytvořen boxplot vizualizace těchto výsledků. Binární srovnání případů V-AKI a kontrolních subjektů byla provedena pomocí balíčku scipy ((přístup 3. března 2021)) pomocí nezávislého t-testu s nestejným rozptylem. Síla asociace mezi každým proteinem a stavem V-AKI byla hodnocena pomocí metriky pí, která kombinuje významnost p-hodnoty s násobnou změnou [12]. Jak již bylo popsáno výše [46], významné asociace byly definovány jako mající hodnotu pí > |1|. Každá asociace proteinu se stavem V-AKI byla vynesena do sopečného grafu, aby bylo dále zvýrazněno umístění nejvýše -10 hodnocených proteinů. Analýza obohacení genové sady byla provedena pomocí serveru DAVID [47], porovnávající významné proteiny (hodnota pí > |1|) s pozadím všech proteinů identifikovaných v souboru dat. Shluky souvisejících funkčních obohacení jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1.

To test for a relationship between V-AKI-associated proteins and inflflammatory cytokines, a recently developed network-based cytokine inference approach was utilized [48]. Briefly, a list of cytokines (TGFb, TNF, IFN, IL1-40, CXCL1-16, CCL1-27) was submitted alongside signifificantly altered proteins (pi-value > |1|) to the STRING-db tool [49]. Connections between proteins were determined using all interaction sources and a minimum interaction score >0.4. Cytokiny byly nejprve filtrovány, aby měly alespoň pět spojení s významně změněnými proteiny. Poté byl poměr spojení mezi každým cytokinem a proteiny spojenými s V-AKI nebo s kontrolou porovnán s celkovým počtem spojení mezi proteiny V-AKI nebo proteiny spojenými s kontrolou. Aby se zohlednily rozdíly v počtu spojení každého cytokinu s jinými proteiny, byla tato hodnota dále porovnána s počtem spojení každého cytokinu se všemi významně změněnými proteiny. Skóre obohacení pro vybrané cytokiny byly vyneseny do grafu pro jejich asociace buď s proteiny asociovanými s V-AKI nebo s kontrolou. Nakonec bylo pomocí Cytoscape verze 3.5.1 vizualizováno rafinované vyhledávání proteinů asociovaných s V-AKI a cytokinů s obohacenými spojeními s proteiny asociovanými s V-AKI z hlediska jejich interakcí [50]. Interakční sítě protein-protein byly zdobeny stanovením velikosti každého proteinu asociovaného s V-AKI podle jejich pí-skóre asociace se stavem V-AKI a obarveny tím, že mají odvozenou vazbu na obohacené cytokiny s pro nebo protizánětlivými účinky.

dračí byliny cistancheumí léčitporanění ledvin

5. Závěry

Snažili jsme se lépe porozumět mechanismu poškození V-AKI z klinicky posuzovaných případů a je zajímavé, že jsme zjistili, že komplement, galektin-3 vazebný protein a fibrinogen jsou významně spojeny s V-AKI. Výsledky předchozích i našich studií naznačují roli komplementového systému a zánětlivých cest u V-AKI. Zatímco k ověření molekulárních procesů při poškození indukovaném vankomycinem a následných opravných drahách jsou zapotřebí větší studie, výsledky naznačují, že močové exozomy mohou přispívat důležitou informací o patofyziologických mechanismech a mohou sloužit jako biomarkery pro léky indukovanéledvinazranění.

Příspěvky autora:

Konceptualizace, LA a SPR, metodika, SV, SPR, DJG, RM; software, DJG, RHM, formální analýza, LA, AL, RHM; vyšetřování, AL, JA, VJ, SB, MC-T., PN; psaní – příprava původního návrhu, AL, JA, VJ, LA; psaní—recenze a úpravy, RHM, DJG, MC-T., AT, AA, JC, MSJ, EM, RM, PN; dozor, SV, SPR; administrace projektu, LA; získání finančních prostředků, LA Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasili s ní.

Financování:

Tento výzkum financovalo International Serious Adverse Events Consortium. MCT bylo podpořeno grantem T32 Training Grant DK007202.

Prohlášení Institutional Review Board: Studie byla provedena v souladu s pokyny Helsinské deklarace a schválena Institutional Review Board (nebo Ethics Committee) University of California, San Diego Human Subjects Research Protections Programs (IRB#121651).

Prohlášení o informovaném souhlasu: Informovaný souhlas byl získán od všech subjektů zapojených do studie

Poděkování:

Rádi bychom ocenili příspěvky PŘÍMÝCH vyšetřovatelů: Dinna Cruz, Stuart Goldstein, Patrick Murray, Andrew Davenport, Andrew Lewington, DavidSelewski, Michael Zappitelli, Marlies Ostermann, Li Yang, Bhavna Pandya, Patrick Brophy, DanielaPonce, Julia Steinke, Josee Bouchard, Carlos Irarrazabal, David Askenazi, Nitin Kolhe, RolandoClaure-Del Granado, Nadine Benador, Clare Castledine, Jonathan Barratt, Sunil Bhandari, AlyssaRiley, Ayse Akcan-Arikan, TK Davis, Christopher Farmer, Mark Thomas, Fred Pang, Kar Hui Ng , Hansjoerg Rothe.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Z: „Močové exosomy identifikují zánětlivé cesty u akutního poškození ledvin spojeného s vankomycinem“ od Lindy Awdishu

---Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 2784