Přirozená imunitní odpověď na půst a krmení v ledvinách zebrafish

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Zongzhen Liao, Dihang Lin, Jirong Jia, Ran Cai, Yang Yu a Wensheng Li *

Státní klíčová laboratoř biokontroly, Klíčová laboratoř pro vodní hospodářská zvířata v provincii Guangdong, Technologické výzkumné centrum provincie Guangdong pro zdravý chov důležitých hospodářských ryb, School of Life Sciences, Univerzita Sun Yat-Sen, Guangzhou 510275, Čína;

liaozzh@mail2.sysu.edu.cn (ZL); lindihang2018@sibcb.ac.cn (DL); jiajr3@mail.sysu.edu.cn (JJ); Alan6382@163.com (RC); yuyang65@mail2.sysu.edu.cn (YY)

* Korespondence: lsslws@mail.sysu.edu.cn

Cistanche je velmi dobrá pro funkci ledvin

Abstraktní: Živiny a energii získávají zvířata krmením, aby dosáhla rovnováhy mezi růstem a zdravím organismu. Když dojde ke změně v získávání živin, změní se stav růstu a může také způsobit změny ve vnitřním imunitním systému. Kompenzační růst (CG), specifický růstový fenomén, zahrnuje otázku, zda změny v růstu mohou být doprovázeny změnami vrozené imunity. Jako vhodný model může posloužit zebrafish (Danio rerio), známý rybí modelový organismus. V této studii prodělala zebrafish 3 týdny hladovění a krmení po dobu 3 až 7 dnů. Bylo zjištěno, že CG lze dosáhnout u zebry. Citlivost zebřiček na Streptococcus agalactiae se zvýšila po hladovění. Kromě toho se počet melanomakrofágových center zvýšil po hladovění a podíl poraněných tubulů se zvýšil po dokrmování po 3 a 5 dnech. Kromě toho,ledvinyzebrafish trpících hladověním bylo pod oxidačním stresem a aktivita několika antioxidačních enzymů se po hladovění zvýšila, včetně katalázy, glutathionperoxidázy a superoxiddismutázy. Vrozené imunitní parametry byly ovlivněny hladověním. Kromě toho se po hladovění zvýšila aktivita alkalické fosfatázy a lysozymu. Exprese mRNA genů souvisejících s imunitou, jako je il-1, byla zvýšena v různé míře po lačnění s nebo bez lipopolysacharidů (LPS) čelenží. Tato studie ukázala, že funkce vrozeného imunitního systému u zebřiček může být ovlivněna stavem výživy.

Klíčová slova: vrozený imunitní systém; ledviny; oxidační stres; kompenzační růst; zebrafish

1. Úvod

Základní životní činnosti jsou závislé na energetickém zásobení organismu. Stav živin v těle zvířete může ovlivnit fungování imunitního systému [1,2]. Kompenzační růst (CG) je období rychlého růstu po fázi potlačení růstu, které může být způsobeno nedostatkem potravy a dalšími faktory prostředí [3,4]. Tento jev byl poprvé zaznamenán u savců a nakonec byl nalezen u ptáků [3] a teleostů [5]. CG se dělí na dvě fáze: fázi katabolickou a fázi hyperanabolickou [6]. Jedním ze základních vzorců CG je půst a dokrmování. Po dokrmení mohou ryby zažít částečnou, plnou, nadměrnou nebo žádnou kompenzaci [4]. Speciální režim krmení CG je považován za potenciální způsob, jak zlepšit efektivitu produkce u chovaných druhů [7].

Vrozená imunitní odpověď je první hranicí obrany hostitele, která chrání organismy před patogeny. U ryb patří mezi orgány imunitního systému brzlík,hlavaledvina, ocasní ledviny, žábry, játra,a střeva [8,9]. Na nespecifických buněčných obranných reakcích u ryb se podílí široká škála buněčných typů, včetně monocytů/makrofágů, nespecifických cytotoxických buněk a granulocytů (neutrofilů). Imunometabolismus je souhra mezi imunologickými a metabolickými procesy [10]. Metabolický stav ryb může ovlivnit jejich imunitní funkci. U lidí stav výživy ovlivňuje počty imunitních buněk – a jejich aktivitu [11]. Bylo zjištěno, že funkce imunitního systému u myší může být ovlivněna jejich metabolickým stavem [12–14]. Intermitentní půst u karasů (Carassius auratus) změnil střevní bakteriální komunity a zvýšil aktivitu superoxiddismutázy (SOD) a lysozymu [15]. Hladovění také mění genovou expresi vrozených imunitních odpovědí v játrech lososa [16]. Studie o vlivu metabolického stavu na imunitní systém lze navíc nalézt v dalších teleostech [17–19]. Vliv metabolického stavu na imunitní systém u teleostů je však stále špatně pochopen. Oxidační stres může omezit funkčnost vrozeného imunitního systému a indukovat složky, jako jsou toll-like receptory [20,21]. Mezitím může hladovění zvýšit produkci ROS a způsobit autofagii [22,23]. Stálo by za to prozkoumat, zda oxidační stres zprostředkovává vztah mezi hladověním a imunitou.

Zebrafish (Danio rerio) oblast široce používaný model ve studiu imunity a nemocí. Vrozený imunitní systém zebřiček se začíná vyvíjet 1. den embryogeneze a adaptivní imunitní systém chybí do 4–6 týdnů po oplodnění. Díky tomu je zebrafish skvělým modelem pro studium vrozeného imunitního systému [9]. Ledviny jsou primárním lymfoidním orgánem u zebrafish [24]. Gen havcr1 kóduje transmembránový tubulární protein tzvmolekula poškození ledvin-1 (KIM-1) [25]. KIM-1 je indikátorem poškození tkáně v ledvinách a nadměrná exprese KIM-1 způsobuje poškození ledvin u zebry [26]. Bylo zjištěno, že půst může změnit metabolický stav u zebřiček [27]. Půst vedl ke snížení spotřeby kyslíku a obsahu jaterních lipidů a glykogenu. Také zvýšil aktivitu 8-oxidace a glukoneogeneze v játrech. Mezitím se reaktivní formy kyslíku (ROS) účastnily CG u zebry [28]. ROS, produkované v játrech, byly nezbytné pro CG u zebry, protože indukovaly dráhu AMPK. V této studii jsme přijali strategii půstu a opětovného krmení, abychom prozkoumali vzorec CG u zebry. Streptococcus agalactiae způsobil závažnou sepsi a meningitidu u zebry a mohl infikovat více než 30 druhů ryb [29]. Vybrali jsme Streptococcus agalactiae a lipopolysacharidy (LPS) pro injekci, abychom prozkoumali vliv CG na vrozený imunitní systém v kombinaci se změnami parametrů souvisejících s imunitou a genové exprese.

2. Materiály a metody

2.1. Zebrafish, krmné režimy a tělesná hmotnost

Dospělé zebřičky použité v experimentu byly zakoupeny z Yuehe Fish-Bird- Flower market (Guangzhou, Čína) a aklimatizovány po dobu dvou týdnů. Veškerý chov ryb byl prováděn na experimentální stanici pro chov ryb na Sun Yat-sen University, provincie Guangdong, Čína. Všechny pokusy na zvířatech byly provedeny v souladu s pokyny a schválením Výboru pro péči o zvířata a použití na univerzitě Sun Yat-Sen. Během experimentálního období se pH pohybovalo v rozmezí 7,8 až 7,9, rozpuštěný kyslík v rozmezí 6,95 až 7,23 mg/l a teplota vody se pohybovala v rozmezí 26,5 až 28 oC. Koncentrace amoniaku-N a dusičnanového dusíku byly udržovány nižší než 0,2 a 0.{{20}}05 mg/l, v daném pořadí. Slanost vody byla 0,2 ppt. Zebřička byla udržována v cyklu 12:{23} hodin světlo-tma. Aby bylo možné prozkoumat změny tělesné hmotnosti během půstu a krmení, byla tělesná hmotnost zaznamenávána jednou týdně. Počáteční tělesná hmotnost zebřiček v experimentu byla 0,35 ± 0,06 g a byly staré přibližně 3 měsíce. Zebřičky byly náhodně rozděleny do nádrží o objemu 24 litrů a každá nádrž obsahovala 30 ryb. Byla jim nabídnuta komerční strava dvakrát denně s krmením do sytosti. Krmné režimy pro každý experiment jsou uvedeny v tabulce 1. Po ošetření byly zebřičky anestetizovány předávkováním MS-222 (Sigma, Burlington, MA, USA) a usmrceny. Poté byla ledvina vyjmuta do Eppendorfovy zkumavky a ihned umístěna do kapalného dusíku. Vzorek byl přenesen z kapalného dusíku a skladován při -80 oC.

2.2. Výzva proti Streptococcus agalactiae

Zebřičky podstupující půst a krmení byly napadeny Streptococcus agalactiae. Kmen Streptococcus agalactiae laskavě poskytl profesor Anxing Li, School of Life Sciences, Sun Yat-sen University [30]. Zebřičky v každé skupině byly dále rozděleny do čtyř malých skupin, v každé malé skupině bylo 15 ryb. Zebrafish ve třech z těchto skupin byly anestetizovány 80 mg/l MS-222 a intraperitoneálně jim bylo injikováno 5 ul obsahujících 5 x 106 jednotek tvořících kolonie Streptococcus agalactiae. Zbývající zebřičky byly injikovány 5 ul PBS. Všechny zebřičky byly pozorovány 4 dny bez krmení. Byla zaznamenána úmrtnost.

2.3. Vstřikování LPS

Zebrafish podstupující půst a krmení (F24, S24 a F21R3) byly vystaveny LPS (Sigma, Burlington, MA, USA). LPS prášek byl rozpuštěn ve sterilní vodě na konečnou koncentraci 1 mg/ml. Před použitím byl 1 mg/ml LPS zředěn PBS a konečná koncentrace byla 20 ug/ml. Zebřičky v každé skupině byly rozděleny do dvou malých skupin a v každé malé skupině bylo 12 ryb. Rybám ve dvou skupinách byly injikovány LPS a PBS. Zebřičky byly anestetizovány MS-222 a intraperitoneálně jim bylo injikováno 5 ul 20 ug/ml LPS nebo PBS. Po 3 hodinách byly zebry anestetizovány a usmrceny. Poté byla ledvina vyjmuta a udržována při -80 oC.

2.4. Histopatologie

Zebřičky byly chovány s dokrmováním po dobu 14 dnů po hladovění po dobu 21 dnů. Vzorky byly odebrány ve dnech 21, 24, 28 a 35. Po obětování byly ledviny zebry vyjmuty a ponořeny do 4% formaldehydu. Poté ledviny podstoupily parafínové řezy. Řezy byly obarveny hematoxylinem-eosinem (HE) (Beyotime, Shanghai, Čína) a pozorovány světelným mikroskopem (Olympus, Tokio, Japonsko). Pro kvantifikaci změny poraněných tubulů a melanomakrofágových center (MMC) bylo zachyceno 5 nepřekrývajících se snímků z každého sklíčka. Plochy poraněných tubulů a celého vzorku byly měřeny pomocí softwaru Cellsens (Olympus, Tokio, Japonsko). Z každého obrázku byl vypočítán podíl poraněných tubulů vydělením plochy poraněných tubulů plochou celého vzorku. Množství MMC bylo spočítáno na každém obrázku a poté vyděleno plochou celého vzorku. Poté byly vypočteny násobné změny MMC se skupinou F21 jako standardem.

2.5. Test souvisejících biochemických parametrů

Obsah malondialdehydu (MDA) a oxidu dusnatého (NO) a enzymatické aktivity SOD, alkalické fosfatázy (ALP), katalázy (CAT), glutathionperoxidáz (GSH-Px) a lysozymu v ledvinách byly měřeny pomocí odpovídajících komerčních souprav. v souladu s protokoly výrobce. Stručně,ledvinyodebrané zebry byly umístěny do kapalného dusíku a skladovány při -80 oC. Před testováním byla každá ledvina vyjmuta a převedena na homogenát v předem vychlazeném PBS s tkáňovým disruptorem.Homogenát ledvinbyla centrifugována při 4 oC a 12,000× g po dobu 10 minut a supernatant byl odebrán jakoledvinaextrakt pro detekci. Obsah MDA byl detekován pomocí soupravy Lipid Peroxidation MDA Assay Kit (Beyotime, Shanghai, Čína) a detekce byla založena na barevné reakci mezi MDA a kyselinou thiobarbiturovou. Použitá vlnová délka byla 535 nm. Obsah NO byl měřen systémem činidel Griess (Promega, Madison, WI, USA). Systém Griessových činidel je založen na reakci dusitanů se sulfanilamidem a N-1-naftylethylendiamindihydrochloridem za kyselých podmínek. Obsah NO byl vypočten pomocí standardu dusitanu sodného a normalizován na obsah proteinu. Absorbance byla měřena pomocí filtru při 490 nm. Aktivita lysozymu byla detekována pomocí Lysozyme Assay Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) podle protokolu výrobce. Extrakt ledvin byl inkubován s buněčnou stěnou Micrococcus lysodeikticus konjugovanou s fluoresceinem. Fluorescence byla měřena po 45 minutách inkubace při 37 oC, při excitačních a emisních vlnových délkách 485 a 535 nm. Hodnota lysozymu byla vypočtena pomocí standardní křivky a normalizována na obsah proteinu. Enzymatické aktivity SOD, ALP, CAT a GSH-Px byly samostatně detekovány testovacími soupravami typu SOD, soupravami pro analýzu alkalické fosfatázy, soupravami pro analýzu katalázou a soupravou pro analýzu glutathionperoxidázy (Nanjing Jiancheng, Nanjing, Čína). Jednotka aktivity SOD byla definována jako množství SOD odpovídající 50% inhibici rychlosti redukce nitrotetrazoliové modři na mg proteinu v 1 ml systému. Použitá vlnová délka byla 570 nm. Jednotka aktivity ALP byla definována jako objem enzymu, který reagoval se substrátem za vzniku 1 mg fenolu za 30 minut při 37 oC a normalizoval se na obsah bílkovin. Použitá vlnová délka byla 490 nm. Aktivita CAT byla založena na spotřebě peroxidu vodíku. Použitá vlnová délka byla 405 nm. Aktivita GSH-Px byla měřena rychlostí katalyzující reakce mezi peroxidem vodíku a GSH. Odečtením neenzymatické reakce byla jednotka aktivity GSH-Px definována jako snížení koncentrace GSH o 1 mol/l v každém systému. Použitá vlnová délka byla 405 nm. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). Použitá vlnová délka byla 570 nm.

2.6. Výroba ROS

Obsah ROS vledvinabyla stanovena fluorescenční sondou 2/,7/-dichlorfluorescein diacetát (DCF-DA) (Sigma, Burlington, MA, USA), jak bylo popsáno dříve [28]. Stručně řečeno, ledvina odebraná zebrafish byla umístěna do předem vychlazeného 100 ul PBS a převedena na homogenát s tkáňovým disruptorem. Po odstředění po dobu 10 minut s 10,000 × g při 4 oC, 20 ulledvinavýpisbylo přidáno do 96-jamkových černých mikrodestiček a do každé jamky bylo přidáno 25 uM DCF-DA. Mikrotitrační destička byla inkubována při 37 oC po dobu 30 minut. Fluorescence byla měřena v multilabel plate reader (PerkinElmer Victor X5, Waltham, MA, USA) s excitačními a emisními filtry nastavenými na 485 a 535 nm. Obsah proteinu v ledvinovém extraktu byl měřen pomocí BCA Protein Assay Kit. Obsah ROS pro každý vzorek byl vypočten normalizací hodnoty fluorescence k obsahu proteinu. Koncentrace proteinu byla měřena pomocí BCA Protein Assay Kit (Beyotime, Shanghai, China). Použitá vlnová délka byla 570 nm.

2.7. Respiratory Burst Assay

Zebřičky podstupující hladovění a krmení (F24, S24 a F21R3) byly použity k měření aktivity respiračního výbuchu. Protokol pro test respiračního vzplanutí byl proveden podle dříve publikované metody [31,32]. Stručně řečeno,ledvinybyly odděleny od anestetizované zebřičky a umístěny do {{0}}jamkových mikrodestiček se 100 ul Dulbeccova modifikovaného Eagleova média (DMEM)/F-12. Po inkubaci destičky po dobu 30 minut při 28 oC bylo 100 ul DMEM/F-12 obsahující DCF-DA, dimethylsulfoxid (DMSO) a forbolmyristát acetát (PMA) (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA). přidány do každé detekované jamky. Mezitím bylo do každé kontrolní jamky přidáno 100 ul DMEM/F-12 obsahujícího DMSO. Konečné koncentrace různých roztoků byly následující: 500 ng/ml DCF-DA, 0,2 procenta DMSO a 200 ng/ml PMA. Fluorescence byla měřena v multilabel plate reader s excitačními a emisními filtry nastavenými na 485 a 535 nm. Fluorescence každé jamky

byla měřena ihned po přidání roztoků do jamky a poté každých 15 minut po dobu 150 minut. Časový bod pro porovnání hodnot fluorescence byl 150 minut. Hodnoty fluorescence neindukované kontrolní skupiny byly odečteny od fluorescence.

hodnoty jednotlivých skupin indukovaných PMA. Byly vypočteny normalizované hodnoty fluorescence. Tyto normalizované hodnoty fluorescence byly seřazeny do tří sloupců.

2.8. Extrakce RNA a PCR v reálném čase

Zmraženýledvinybyly rozemlety v TRIzolu (Omega, Norcross, GA, USA) a celková RNA byla separována podle protokolu [33]. Po štěpení DNase1 (NEB, Ipswich, MA, USA) byla cDNA produkována pomocí RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Fisher, Waltham, MA, USA) s Random Hexamer Primer. qRT-PCR byla připravena v 10 ul reakčních směsích obsahujících 5 ul 2x SYBR Green qPCR Master Mix (Bike, Houston, TX, USA). Všechny vzorky byly analyzovány v duplikátech a normalizovány na expresi eEF1a1a. Sekvence oligonukleotidových primerů použitých v této studii jsou popsány v doplňkové tabulce SI. Relativní kvantifikace mRNA cíle vůči referenci byla stanovena pomocí 2-metody AACT [34].

2.9. Statistická analýza

Kvantitativní údaje jsou uvedeny jako střední hodnota ± SD. Statistické analýzy byly provedeny pomocí SPSS verze 24 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Statistická srovnání mezi dvěma skupinami byla provedena pomocí Studentova t-testu nebo neparametrického testu v závislosti na výsledku testu normality. Analýzy pro více skupin s normální distribucí byly provedeny pomocí jednocestné ANOVA a zbytek byl proveden pomocí neparametrických testů. Všechny statistické údaje a metody lze zkontrolovat v tabulce S2.

3. Výsledky

3.1. Změny tělesné hmotnosti a antibakteriální vlastnosti zebrafish během půstu a krmení

U zebřiček byl realizován plný kompenzační růst. Po 7 až 14 dnech půstu zhubla zebřička nejméně o 15 procent tělesné hmotnosti. Po 14 dnech krmení se tělesná hmotnost zebřiček ve skupině nalačno vyrovnala hmotnosti kontrolní skupiny (obrázek 1A–C). Po půstu a opětovném krmení jim byl za účelem prozkoumání odolnosti zebřiček vůči patogenům intraperitoneálně injikován Streptococcus agalactiae. Zebřička ve skupině nalačno měla ve srovnání s kontrolní skupinou zvýšenou úmrtnost. S prodloužením krmení se úmrtnost dále snižovala (obrázek 1D).

Obrázek 1. Model kompenzačního růstu u zebřiček. A až C: změna tělesné hmotnosti zebrafish během půstu a krmení. (A) Zebřičky byly 7 dní nalačno a 28 dní byly krmeny. (B) Zebřičky byly 14 dní lačněny a 21 dní vyživovány. (C) Zebřičky se 21 dní hladověly a 14 dní krmily. n=21–22. (D) Míra přežití zebřiček, kterým byla intraperitoneálně podána S. agalactiae; F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. n=3, *: p < {{10}}.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.2. Morfologické změny ledvin zebrafish během půstu a krmení

Theledvinaje hlavní imunitní tkáň u zebřiček. Hladovění způsobilo morfologické změny vledviny. Po 21 dnech hladovění ledvina vykazovala zjevné morfologické změny. Zjistili jsme, že více poraněných tubulů s hyalinními kapičkami se objevilo po dokrmování po dobu 3 a 5 dnů. Tato situace se zlepšila po 7 dnech. Kromě toho bylo pozorováno, že počet melanomakrofágových center (MMC) vledvinazvýšená po hladovění (obrázek 2A–C). Spolu s dokrmováním byl tento symptom zachráněn. Exprese mRNA havcr1 se po půstu zvýšila (obrázek 2D), což ukazuje, že hladovění může způsobitledvinazranění.

Obrázek 2. Morfologické změny vledvinyzebrafish během půstu a krmení. (A) HE-barveníledvinau zebry během půstu a krmení. Černý trojúhelník označuje poškozené tubuly. Červená šipka označuje MMC. Červená hvězda označuje hyalinní kapičky. (B) Statistická analýza podílu poškozených tubulů vledvina. (C) Statistická analýza MMC v ledvinách. n=3–4. (D) mRNA relativní exprese genu havcr1 vledvinazebrafish během půstu a krmení. n {{0}}–10. F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. *: p <>

3.3. Oxidační stres byl spuštěn během půstu a krmení

Obsah MDA byl významně zvýšen po hladovění po dobu 21 a 24 dnů a snížen po 3 dnech opětovného krmení (obrázek 3A). Obsah ROS se však po 24 dnech hladovění snižoval a obnovil se krmením po dobu 7 dnů (obrázek 3B). Obsah NO se zvýšil po 21 dnech hladovění (obrázek 3C). Aktivita antioxidačních enzymů, včetně SOD, GSH-Px a CAT, se po hladovění zvýšila. Aktivity GSH-Px a CAT rychle poklesly a obnovily se 3. den po krmení. Přestože aktivita SOD s dokrmováním klesala, byla stále vyšší než u kontroly (obrázek 4).

Obrázek 3. Oxidační stres v ledvinách zebrafish během půstu a krmení. (A) Obsah MDA v ledvinách. (B) Změna ROS v ledvinách. (C) Obsah NO v ledvinách. F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Obrázek 4. Aktivita enzymů v antioxidačních systémech vledvinyzebrafish během půstu a krmení. (A) Aktivita SOD v ledvinách. (B) Aktivita GSH-Px v ledvinách. (C) Aktivita CAT v ledvinách. F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. n=6–10. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

3.4. Vrozený imunitní systém ledvin zebřičky byl ovlivněn půstem a krmením

Aktivita ALP se zvýšila v ledvinách po hladovění a snížila se po opětovném krmení (obrázek 5A). Při dokrmování po dobu 7 dnů nebyl mezi dokrmovanou skupinou a kontrolou žádný významný rozdíl. Aktivita lysozymu v ledvinách vykazovala podobný trend jako ALP, který se zvyšoval s hladověním (obrázek 5B). Po dokrmování rychle klesal. Reakce na respirační vzplanutí v ledvinách nevykazovala žádné významné změny v různých skupinách, ale odpověď byla vyšší ve skupině nalačno a znovu krmení (obrázek 5C). Exprese mRNA prozánětlivého cytokinu il-1 vykazovala pozoruhodný nárůst ve všech skupinách nalačno, ale po opětovném krmení rychle poklesla (obrázek 6A). Exprese mRNA tgfb1a a tgfb1b vykazovala stejný trend jako il-1 (obrázek 6E,F). Exprese mRNA nfkb1 se však pouze výrazně zvýšila po hladovění po dobu 24 dnů a snížila se po opětovném krmení po dobu 3 dnů. Exprese mRNA nfkb2 vykazovala trend podobný trendu nfkb1 (obrázek 6B, C). Gen arg2 kóduje arginázu II, která souvisí s prozánětlivou odpovědí. Kromě toho se exprese mRNA arg2 výrazně zvýšila ve všech hladových skupinách a byla snížena po opětovném krmení (obrázek 6D). Po zpochybnění zebřičky, která prošla půstem a krmením, byla reakce silnější ve skupině, která se postila. Exprese mRNA il-1 a mmp9 ve skupině léčené LPS nalačno byla signifikantně vyšší než v kontrolní skupině léčené LPS nebo skupině s opakovaným krmením (obrázek 7).

Obrázek 5. Parametry vrozeného imunitního systému vledvinyzebrafish během půstu a krmení. (A) Aktivita ALP v ledvinách zebrafish během půstu a krmení. (B) Aktivita lysozymu vledvinazebrafish během půstu a krmení. (C) Respirační reakce ledvin u zebřiček po lačnění a krmení. (C1) Hodnota fluorescence/proteinu ledvin v různých časech. (C2) Hodnoty fluorescence/proteinuledvinav 150 min. (C3) Normalizace hodnoty fluorescence/proteinu ledvin při 150 min. F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. n=12. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Obrázek 6. Relativní exprese mRNA genů souvisejících s imunitou v ledvinách zebřiček během půstu a krmení. (A–F):il-1, nfkb1, nfkb2, arg2, tgfb1a a tgfb1b. F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. n=8–1{{10}}. *: p < 0,05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

Obrázek 7. Relativní exprese mRNA genů souvisejících s imunitou vledvinyzebrafish vystavených 5 ul 20 ug/ml LPS po půstu a opětovném krmení. (A–C) il-1, mmp9 a nfkb1. F: krmení; S: hladovění; R: dokrmování. n=8–12. *: p < 0.05,="" **:="" p="">< 0,01;="" ***:="" p=""><>

4. Diskuze

V této studii jsme zjistili, že plné CG by mohlo být realizováno u zebřiček po různé době trvání hladovění. Dokonce i po 3 týdnech hladovění dosáhla tělesná hmotnost zebřiček tělesné hmotnosti kontrolní skupiny po dvou týdnech. Tento výsledek byl v souladu s předchozí prací [28]. Studie ukázaly, že hladovění a krmení ovlivňují metabolický stav zebřiček [27,28]. U chovaných druhů je význam CG v tom, že zlepšuje efektivitu produkce. Pro chované druhy je důležité zachovat antibakteriální vlastnosti během půstu a krmení. Během tohoto procesu má zebrafish potenciál trpět patogeny. Bylo hlášeno, že hladovění neovlivňuje imunitní odpověď u infikovaných Piaractus mesopotamicus [18]. Bohužel půst zvýšil náchylnost zebry k S. agalactiae. Hladověním byly současně ovlivněny biochemické parametry a exprese mRNA vrozeného imunitního systému.

U zebrafishů chybí lymfatické uzliny a primární lymfoidní orgán je ekvivalentní kostní dřeni savců ledviny [24]. U dospělých zebřiček jsou ledviny hlavním místem hematopoézy [35]. Populace v ledvinové dřeni obsahují mnoho typů hematopoetických buněk, včetně makrofágů, neutrofilů a lymfocytů [36,37]. Správná funkce ledvin je u zebřiček důležitá pro vrozený imunitní systém. V této studii jsme pozorovali některé morfologické změny v ledvinách zebřiček vystavených hladovění. Ukládání MMC v ledvinách se po hladovění významně zvýšilo. Již dříve bylo zjištěno, že hladovění může způsobit ukládání melanomakrofágů (MM) v ledvinách a slezině u ryb [38]. MMC se objevují hlavně v ledvinách, játrech a slezině a jsou difuzní a méně strukturované v ledvinách [39]. Předpokládá se, že MMC fungují jak v imunitní obraně, tak v normálních, neimunologických, fyziologických procesech. Primární funkcí MMC je fagocytóza. Předpokládá se, že MMC se mohou účastnit jak vrozených, tak adaptivních imunitních reakcí. Přidání MMC po hladovění může být způsobeno hemofagocytózou a odstraněním buněčných zbytků. Navíc v prvních dnech dokrmování byla pozorována struktura hyalinních kapiček. Předpokládá se, že přítomnost hyalinních kapiček svědčí především pro alfa2u-globulin v tubulárních epiteliálních buňkách [40]. V modelu histiocytárního sarkomu navíc neoplastické histiocyty produkovaly lysozym a lysozym se akumuloval v buňkách tubulárního epitelu [41]. Stručně řečeno, k tvorbě hyalinních kapiček dochází, protože ledviny nemohou strávit protein, který se hromadí v buňkách tubulárního epitelu. Úroveň KIM-1 (kódovaná havcr1) může indikovat strukturální poškození tubulů [42]. Po hladovění se exprese mRNA havcr1 výrazně zvýšila a snižovala s dokrmováním. Můžeme předvídat, že funkce ledvin je půstem narušena a s dokrmováním se funkce ledvin obnoví. Požadavky jsou však na začátku dokrmování zatěžující.

Fagocytóza je důležitým procesem obrany ve vrozeném imunitním systému ryb. Oxidační stres omezí imunitní odpověď [20]. Antioxidační obrana závisí především na enzymech. SOD, GPx a kataláza jsou důležitými složkami antioxidačních systémů [43]. SOD zprostředkovává přeměnu superoxidového aniontu a H2O2. Kataláza se podílí na detoxikaci H2O2 na vodu. GPx katalyzuje hydroperoxidy (např. H2O2 a lipidové hydroperoxidy) na H2O oxidací glutathionu (GSH) na glutathion disulfid (GSSH) [43–45]. MDA je jedním z hlavních produktů oxidace lipidů a vyrábí se z polynenasycených mastných kyselin (PUFA) chemickými reakcemi a reakcemi katalyzovanými enzymy. ROS může peroxidovat PUFA za vzniku MDA. Obsah MDA je biomarker běžně používaný k hodnocení oxidačního stresu [46]. V předkládané práci, i když se obsah ROS snížil, obsah MDA v ledvinách se výrazně zvýšil a také byla zvýšena aktivita všech enzymů patřících do antioxidačního systému. Detekce ROS je přechodná odezva. Změna aktivity antioxidačního enzymu byla důsledkem dlouhodobého hladovění. Opačné trendy mezi ROS a antioxidačními enzymy mohou být způsobeny tím, že normální procesy buněčné aktivity produkují ROS, zatímco dlouhodobé hladovění vede ke snížení buněčné aktivity. Tento výsledek ukázal, že hladovění způsobuje oxidační stres v ledvinách chronickým způsobem. Přetrvávající oxidační stres může způsobit poškození látek v buňkách, jako jsou lipidy a proteiny, a nakonec vést k apoptóze a akumulaci oxidovaných molekulárních agregátů [20]. U teleostů bylo hlášeno, že hladovění vyvolalo obsah MDA v játrech a střevech a zvýšilo aktivitu antioxidačních enzymů [47–49]. Tyto výsledky naznačovaly, že i když byl antioxidační systém aktivován, nebyl dostatečný k odstranění škod způsobených hladověním. Mezitím může oxidační stres aktivovat širokou škálu transkripčních faktorů, jako jsou NF-kB, Nrf2 a HIF-1a. Následně tyto transkripční faktory indukují expresi mnoha cytokinů a chemokinů. Oxidační stres tedy může vést k chronickému zánětu [44].

Zebry ve skupině nalačno, vystavené Streptococcus agalactiae, trpěly vyšší úmrtností než v kontrolní skupině. Mezitím se aktivita ALP a lysozymu zlepšila hladověním. Lysozym je důležitou součástí vrozeného imunitního systému ryb a účastní se procesu fagocytózy [50]. Podle výsledků hladovění způsobilo expresi mRNA il-1, nfkb1, tgfb1a, tgfb1b a arg2. Tyto změny mohou být způsobeny oxidačním stresem. TGFB1 je cytokin, který má prozánětlivé i protizánětlivé účinky [51]. Rekombinantní TGFB1 vykazoval imunosupresivní aktivitu a downreguloval expresi prozánětlivých cytokinů v leukocytech teleostů. U zebřiček exprese tgfb1a způsobila zánět v játrech [52]. Chronická indukce tgfb1a aktivovala zánět a jeho exprese indukovala jaterní fibrózu u časného hepatocelulárního karcinomu u zebry. Argináza je primordiální enzym a je zodpovědná za přeměnu L-argininu na L-ornitin a močovinu. Argináza má dva izoenzymy (argináza I a argináza II) [53,54]. Argináza II je gen související s imunitou a bylo zjištěno, že souvisí s prozánětlivými odpověďmi v makrofázích prostřednictvím mitochondriálních ROS. Tyto údaje ukázaly, že hladovění může vyvolat imunitní odpověď v ledvinách. U myší hladovění snížilo citlivost na LPS a neovlivnilo expresi il{20}} [55]. Zebřičky stimulované LPS však vykazovaly hrubou odezvu na LPS a exprese il-1 a mmp9 byla významně vyšší než v ostatních skupinách. Na rozdíl od myší se zebřičky staly citlivějšími na LPS po hladovění, takže hladovění může zhoršit jejich schopnost odstraňovat patogeny.

5. Závěry

V této studii jsme předběžně prozkoumali vliv půstu a krmení na vrozený imunitní systém zebry. U zebřiček byl realizován kompenzační růst doprovázený zvýšenou náchylností k patogenům po hladovění. Oxidační stres – způsobený hladověním a molekulárními vzory souvisejícími s nebezpečím produkovanými poraněnými ledvinovými tubuly – mohl přispět k zánětu. Je zapotřebí další studie, aby se prozkoumalo, jak hladovění zvyšuje náchylnost a jak metabolický stav ovlivňuje různé druhy imunitních buněk.

Doplňkové materiály: Následující materiály jsou dostupné online na https://www.mdpi.com/article/10 .3390/biom11060825/s1, Tabulka S1: Seznam primerů použitých v této studii; Tabulka S2: Statistický výsledek experimentu.

Autorské příspěvky: Konceptualizace, ZL a WL; Správa dat, JJ; Formální analýza, ZL a DL; Akvizice financování, WL; Investigation, ZL, DL, RC a YY; Metodika, ŽL; Dohled, WL; Psaní — původní návrh, ZL; Psaní – recenze a úpravy, WL Všichni autoři si přečetli publikovanou verzi rukopisu a souhlasí s ní.

Financování: Tato práce byla financována Národním klíčovým programem výzkumu a vývoje Číny (2018YFD0900101), Čínským zemědělským výzkumným systémem MOF a MARA (CARS-46) a Programem pro čínské výjimečné talenty v zemědělském vědeckém výzkumu ({{3 }}) Wensheng Li.

Prohlášení Institutional Review Board: Studie byla provedena v souladu s pokyny Helsinské deklarace a schválena Výborem pro péči a použití zvířat Sun Yat-Sen University.

Prohlášení o informovaném souhlasu: Neuplatňuje se.

Prohlášení o dostupnosti dat: Nelze použít.

Konflikt zájmů: Autoři prohlašují, že nemají žádný střet zájmů.