Tuliposidy H–J a bioaktivní složky z cibule Amana Edulis
Mar 20, 2023
Abstraktní:
Tři nové strany tulipánů H–J (1–3) a 11 známých sloučenin byly poprvé získány z metanolových extraktů cibulí Amana edulis. Jejich struktury byly objasněny pomocí NMR, MS a IR spektroskopických dat, optické rotace a Mosherovy metody. Vlastnosti melanogeneze všech izolátů byly hodnoceny v buňkách melanomu B16. V důsledku toho měl tributylcitrát (9) antimelanogenní aktivitu, ale byl cytotoxický vůči B16. (plus)-kyselina pyroglutamová (4), (plus)-butyl 5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (6), (–)-3-hydroxy-2-methylbutyrolakton (10 ) a 5- (hydroxymethyl)furfural (12) měly zvýšenou produkci melaninu a tyrosinázové aktivity. Tyto aktivní složky by mohly být dále studovány jako kandidáti proti melanomu a vitiligu pro kožní onemocnění nebo bělení/hypopigmentaci vlasů.
Při výzkumu bělení jsme zjistili, že Cistanche má také bělící účinek
Za prvé, Cistanche je bohatý na polysacharidy a flavonoidy. Tyto sloučeniny působí jako antioxidanty a mohou pomoci tělu vychytávat volné radikály, zpomalovat stárnutí pokožky a tím zlepšovat pleť.
Za druhé, Cistanche také obsahuje různé aminokyseliny, minerály a vitamíny, které jsou velmi prospěšné pro opravu a regeneraci pokožky. Cistanche může podpořit metabolismus kožních buněk, zvýšit samoopravnou schopnost pokožky a obnovit zdravou barvu pokožky.
V neposlední řadě obsahuje Cistanche také některé organické kyseliny a zásadité látky a tyto složky mají také určitý vliv na úpravu a metabolismus kožní kutikuly. Tyto látky dokážou účinně vyrovnat hodnotu pH pokožky, zlepšit tloušťku zrohovatělé vrstvy pokožky a učinit pokožku průsvitnější a jemnější.
1. Úvod
Amana edulis (A. edulis; Miq.) Honda, syn. Tulipa edulis (Miq.) Baker patří do čeledi Liliaceae a je lidovou léčivou rostlinou používanou k léčbě nádorových onemocnění [1,2]. Fytochemických a biologických studií tohoto druhu však bylo dosud hlášeno jen málo.
Například 95% a 50% EtOH extrakty by mohly vyvolat apoptózu u buněk lidského karcinomu žaludku (SGC7901) [1] a hepatomu (BEL7404, HepG2 a Huh7) [2]. Polysacharidy připravené z A. edulis mají antioxidační vlastnosti, včetně DPPH, OH− a ABTS plus scavenging aktivit [3–5]. Při výzkumu nových látek z přírodních produktů pro kožní onemocnění jsme zjistili, že MeOH extrakty cibulek A. edulis vykazují potenciální regulaci melanogeneze, která dosud nebyla prozkoumána. Při vystavení ultrafialovému záření slunečního světla nebo škodlivým chemikáliím a patogenním faktorům může mírná melanogeneze chránit naši pokožku před tvorbou reaktivních forem kyslíku v keratinocytech a melanocytech [6]. Tyrosináza je důležitým enzymem v melanogenezi, který produkuje více melaninu, abychom se mohli bránit výše uvedeným nebezpečným podmínkám [7].
Aktivní složky A. edulis si proto zaslouží být uvolněny pro další lékařské aplikace. Při tomto výzkumu byly z A. edulis izolovány tři nové strany tulipánů H–J (1–3) a 11 známých sloučenin (4–14) (obrázek 1) a strukturně identifikovány pomocí NMR, MS a IR spektroskopických dat, optická rotace nebo Mosherova esterová reakce. Sloučenina 9 by mohla snižovat obsah melaninu, ale být cytotoxická vůči melanomovým buňkám B16. Sloučeniny 4, 6, 10 a 12 měly zvýšenou produkci melaninu a tyrosinázové aktivity. Celkově tato práce prokázala, že A. edulis a její aktivní složky by mohly být novými látkami pro onemocnění související s melaninem, jako je melanom a hypopigmentace (vitiligo kůže nebo bělení vlasů).
2. Výsledky a diskuse
2.1. Objasnění struktury izolátů 1–3
MeOH extrakt (TEM) z cibulí A. edulis byl rozdělen do frakcí rozpustných v EtOAc (TEE), v n-BuOH (TEB) a rozpustných v HO (TEW) odděleně. Zlomek. působením extraktů TEE a TEB vznikly nové isoprenoidní glykosidy 1-3 a známé sloučeniny 4-14 (obrázek 1). Kromě toho byly hlavními složkami extraktu TEW sacharidy.
HRESIMS (hmotová spektrometrie s elektrosprejovou ionizací s vysokým rozlišením) 1 ukázala (M - H- ion při m/z 351,1652, což ukazuje na molekulový vzorec CsH2gOg (vypočteno pro C;5HoOg; 351,1655) a dva stupně nenasycení. IR spektrum prokázaly absorpce pro hydroxylové (3376 cm-l) a karbonylové (1725 cm-l) funkční skupiny Patnáct uhlíkových signálů, včetně dvou methylů, pěti methylenů, sedmi methinů a jednoho kvartérního uhlíku, bylo pozorováno v jednorozměrné (1D) NMR spektra 1 (tabulka 1). Kvartérní uhlík byl identifikován jako karbonylový uhlík na základě chemického posunu 6c 176,6. 1D a HSOC (heteronukleární jednoduchá kvantová koherence) NMR spektra vykazovala jednu anomerii (0/8c: 4,27 (d, J=8.0 Hz)/1{{30}}4,9), pět oxymetholonů (0h/8c: 3,21(t, J { {34}}.0 Hz)/75,1, 3,28 (překrytí)/71,6, 3,28 (překrytí)/78.0, 3,35 (t, J=8.{{67} } Hz)/77,9 a 3,89 (td, I=7.0, 2,5 Hz)/73,6) a tři oxymethylenové (6,/6c: 3,57 (dd, J {{64} },5, 7.0 Hz)4.01 (dd, I {{70}},5, 2,5 Hz)/73,1, 3,66 (dd, I { {78}},0, 5,0 Hz), 3,85 (brd, I=12,0 Hz)/62,7 a 4,10 (2H, t, J=7,5 Hz)/65,5). Korelace HMBC (heteronuclear multiple bond correlation) (obrázek 2) sloučeniny 1 na protonech methinu H-2 (8 2.67, kvint s C-1 (6 176). 6)/C{103}} (6 73.6)/C{106}} (6 73.1)/C{109}} (6 13.9) , H-3 (6 3.89, td) s C-1/C-2(6 44.6)/C-4/C -5, H-1' (6 4,27, d) s C-4 a methylovými protony H-5 (8 1,14 , d) s C-1/C-2/C-3 naznačuje, že methylové a hydroxylové skupiny byly umístěny na C-2 a C{132}}, v tomto pořadí. methylenové protony na H,-1" (8 4.10, t) a H-4 (6 3.57dd; 4.01, dd) vykazovaly 3 interakce s C{{ 142}} a C-1' (8 104.9), v tomto pořadí, ve spektru HMBC (obrázek 2), které podporovalo přiřazení n-butylové skupiny na C-1 a jednu beta -glukóza (H-1', 8 4,27, d, J=8,0 Hz) při C-4 8].
Obrázek 2 ukazuje klíčové korelace COSY a HMBC pozorované pro 1. Relativní konfigurace na C-2 a C-3 (3-hydroxy-2-methylová část) 1 mohly být určeny proti -forma podle hodnoty 3 JH2-H3 7.0 Hz (anti-form: 7.0 Hz; syn-form: 4.0 Hz) [ 9]. Pro stanovení absolutní konfigurace byla sloučenina 1 zpracována odděleně s (R)- a (S)- -methoxy- -(trifluormethyl)-fenylacetylchloridem [(R)- a (S)-MTPA- Cl] v přítomnosti pyridinu-d5 za získání (S)- a (R)-MTPA esterů (la a lb). Estery MTPA byly úspěšně generovány při C-3 a C-20/C-30/C-40, jak je zřejmé z 1H NMR a 1H-1H COSY spektra (la, H-3, 5 5,82, m; H-20, 5 5,70, t, J=9,5 Hz; H-30, 5 4,39, t, J=9,5 Hz; H-40, 5 5,76, t, J=9,5 Hz; 1b, H-3, 5 5,81, m; H{{64 }}, 5 5,56, t, J=9,5 Hz; H-30, 5 4,12, t, J=9,5 Hz; H-40, 5 5,66, t, J=9,5 Hz). Rozdíly mezi 1H NMR chemickými posuny pro la a lb (hodnoty ∆ zobrazené na obrázku 3) vedly k přiřazení S- a R-konfigurací na C-3 a C-2, v daném pořadí. V důsledku toho byla sloučenina 1 objasněna jako butyl 4- -D-glukopyranóza-(S)-3-hydroxy-(R)-2-methylbutanoát a pojmenována tulipánová strana H.
Sloučenina 2, strana I tulipánu, poskytla molekulární vzorec, C15H28O8, stanovený HRESIMS (m/z 359,1686 [M plus Na] plus, vypočteno pro 359,1682). 1D NMR spektra 2 byla také podobná těm 1, kromě skutečnosti, že chemické posuny methylenového signálu 5H 1,65 (sext, J=7.0 Hz) a 1,96 (sext, J=7.0 Hz)/δC 34,6 byly identifikovány místo jednoho methinu na C-3 z 1 (tabulka 1). Na základě dat COZY a HMBC (obrázek 2) bylo předpokládáno, že sloučenina 2 je složena z isoprenoidu, jedné glukosy a také n-butylových skupin. HMBC 3J korelace H2-1“ (δ 4.04, 2H, t, J=7,5 Hz/δC 65,4) s C-1 (δ 178,5) a H-10 (δ 4,19, d, J=8,0 Hz/δC 104,4) s C-4 (δ 68,4) naznačovaly, že n-butylová skupina a jedna -glukóza skupina [8] byla připojena na C-1 a C-4, v tomto pořadí (obrázek 2). Klíčové korelace HMBC a COSY jsou znázorněny na obrázku 2. R-konfigurace H3-5 na C-2 z 2 byl stanoven kyselou hydrolýzou 2 za poskytnutí odpovídající tulipalinové sloučeniny, 3-methyldihydrofuran-2(3H)-onu (obrázek S28) [8] s pozitivní optickou rotací hodnota ([ ] 23 D plus 18,7, CH2CI2) (R: [] 25 D plus 14,7, CHCl3) [10]. Struktura sloučeniny 2 byla identifikována jako butyl 4- -D-glukopyranóza-(R){{ 81}}methyl butanoát.
Molekulární vzorec 3 byl odvozen jako C11H2008 díky výskytu [M plus Na] plus iontu při m/z 30}3,1049 (vypočteno pro 303,1050) v HRESIMS. Jedenáct uhlíkových signálů, včetně jednoho methylu (5 17,6), tří methylenů (5 34,7, 62,8 a 68,6), šesti methinů (5 37,6, 71,6, 75,1, 77,9, 78,0 a 104,4) a jednoho kvartérního uhlíku (8,06) byly pozorovány v 1D NMR spektrech 3 (tabulka 1). Kvartérní uhlík byl identifikován jako karbonylový uhlík na základě chemického posunu uhlíku při 5 180,6. Kromě toho sloučenina 3 vykazovala podobná spektroskopická data jako sloučenina 2, s výjimkou n-butylových signálů. Ve spektru HMBC (obrázek S15) anomerní proton při 5 4,23 (d, J=8,0 Hz) vykazoval 3J interakci s C-4 (δ 68,6) vedoucí k -glukóze umístěné na C-4. Klíčová spojení HMBC a COZY jsou znázorněna na obrázku 2. Sloučenina 3 nebyla izolována v dostatečném množství pro určení absolutní konfigurace na C-2. Nakonec byla identifikována strana tulipánu J (3), kyselina 4- -D-glukopyranóza-(R)-2-methylbutanová, kvůli výše uvedeným strukturním objasněním 1 a 2 v této studii.
Sloučeniny 1–3 jsou strany tulipánů, druh specializovaného produktu sestávajícího z 4-hydroxy2-kyseliny methylenbutanové (HMBA) a/nebo (3S)-3,4-dihydroxy Skupiny -2-methylenbutanové kyseliny (DHMBA) acylované na pozicích C-1 a/nebo C-6 -D-glukózy (Glc) vyskytující se hlavně v rodu Tulipa [8,11] . Zatím analogy tulipánové strany, včetně 1-strany tulipánu A, 6-strany tulipánu A, 1-strany tulipánu B, 6-strany tulipánu B a tulipánových stran D–G , byly izolovány z Tulipa [8,11]. Struktura strany C tulipánu však nebyla popsána a mohla by v předchozí literatuře chybět [11]. Tulipaliny, jako je tulipalin A a (–)-tulipalin B, jsou aglykonové části stran tulipánů, které spontánně laktonují po uvolnění skupin HMBA a/nebo DHMBA enzymy přeměňujícími stranu tulipánů [8,11]. V této studii patří sloučeniny 1–3 nazvané strany tulipánů H–J ke stranám tulipánů, ale jejich dvojné vazby na C-2 byly redukovány a -D-glukózové skupiny byly připojeny k C-4 (oxymethylen ), namísto C-1 (O-acylová funkčnost) v HMBA nebo DHMBA (obrázek 1). Navíc sloučenina 10 (2S,3S) je tulipalin, ale nemohla být metabolizována z 1 (2R,3S) kvůli různým konfiguracím na C-2. Možné biosyntézy stran tulipánů 1–3 jsou znázorněny na obrázku S29 [8,11].
Kromě toho bylo 11 známých sloučenin včetně tří analogů kyseliny pyroglutamové (4–6), tří derivátů kyseliny citrónové (7–9), dvou furanonů (10–11), jednoho furanu (12) a dvou steroidů (13–14). izolován z A. edulis poprvé. Sloučeniny 1–9 a 10–14 byly získány ze surových frakcí TEB a TEE. Byly identifikovány jako (plus)-pyroglutamová kyselina (4) [12], (plus)-methyl 5-oxopyrrolidin-2-karboxylát (5) [12], (plus)-butyl {{23 }}oxopyrrolidin-2-karboxylát (6) [12], 1-butylcitrát (7) [13], 1,10 -dibutyl 5-methylcitrát (8) [ 13], tributylcitrát (9) [13], (–)-3-hydroxy-2-methylbutyrolakton (10) [14–16], (–)-methyl 3-hydroxy{{ 44}}oxotetrahydrofuran-3-karboxylát (11) [17], 5-(hydroxymethyl)furfural (12) [18], sitosterol (13) [19] a sitosterol-3- -D -glukóza (14) [20] ze spektroskopických dat a porovnána s literaturou.
2.2. Chemické složky Objasnění TEW
1H a 13C NMR spektra TEW, ve vodě rozpustné surové frakce z extraktu TEM, ukázala velmi podobná spektru sacharidů (obrázky S16 a S17). Polysacharidy připravené z tohoto druhu po analýze monosacharidů obsahují rhamnózu, xylózu, arabinózu, galaktózu, manózu, glukózu a fruktózu [3,8]. NMR spektroskopická data a TLC (tenkovrstvá chromatografie) retenční faktor TEW ve srovnání s těmi cukernými standardy (obrázky S18–S23) naznačují, že hlavními složkami extraktů TEW jsou D-glukóza a D-fruktóza.
2.3. Účinky extraktů a izolátů na melanogenezi
MeOH extrakt (TEM) tohoto druhu byl rozdělen na surové frakce TEE, TEB a TEW a výše uvedené čtyři extrakty byly hodnoceny z hlediska cytotoxicity a melanogenetických účinků v melanomových buňkách B16 v koncentracích od 12,5 do 200 ug/ml (obrázek S24). . TEE vykazoval zjevnou cytotoxicitu vůči B16 při 200 µg/ml a TEB i TEW měly cytotoxické aktivity v koncentracích od 12,5 do 200 µg/ml (obrázek S24A-1, B-1, C{{13} }, D-1). V biologickém testu byl -melanocyty stimulující hormon (-MSH) použit k aktivaci buněk B16, aby syntetizovaly více melaninu, a TEM mohl mírně stimulovat melanogenezi (obrázek S24A-2).
Většina všech izolátů (obrázek 1), s výjimkou 13 a 14, byla dále testována na regulaci účinků melanogeneze v koncentracích od 10 do 40 uM, s arbutinem použitým jako pozitivní kontrola (obrázek 4). Jak je znázorněno na obrázku 4, sloučenina 9 zjevně a v závislosti na dávce inhibovala produkci melaninu, která byla důsledkem cytotoxicity vůči buňkám B16 s hodnotou IC50 (polovina maximální inhibiční koncentrace) 81,9 uM (obrázek S25). Izoláty 4, 6, 10 a 12 zvýšily obsah melaninu v závislosti na dávce až do maximálních procent 11,9 procenta, 29,8 procenta, 27,2 procenta a 17,6 procenta, v daném pořadí, při 40 uM bez buněčné toxicity. Tyrosináza hraje klíčovou roli v prvních dvou krocích melanogeneze [6]; proto byly dále hodnoceny účinky sloučenin 4, 6, 10 a 12 na intracelulární tyrosinázu. -MSH zvýšil aktivitu tyrosinázy až na 254,3–305,5 procenta ve srovnání s kontrolní skupinou (100 procent) (obrázek 5 a tabulka S1).
V důsledku toho 4 (14,1–21,9 procenta), 6 (15,8–21,9 procenta), 10 (8,5–13,1 procenta) a 12 (7,5–11,8 procenta) mírně zvýšily aktivitu enzymu, tyrosinázy, v závislosti na dávce v koncentracích 10 až 40 uM, zatímco ve srovnání se skupinou -MSH (obrázek 5 a tabulka SI). Korelační graf mezi obsahem buněčného melaninu a účinky sloučenin 4, 6, 10 a 12 na tyrosinázu je znázorněn na obrázku S26. Kromě toho, aby se potvrdily účinky 4, 6, 10 a 12 indukující melanogenezi, byla každá sloučenina přidána do buněk B16 bez společně ošetřeného -MSH, který byl použit jako pozitivní kontrola v tomto testu (obrázek S27). V důsledku toho jedinci 4, 6, 10 a 12 nezvýšili produkci samotného melaninu (obrázek S27) podobně jako na obrázku 4. Bylo navrženo, že výše uvedené čtyři sloučeniny mohou pouze zvýšit melanogenezní účinky -MSH. V souladu s tím další signální dráhy v melanogenezi, jako je protein související s tyrosinázou-1 (TRP-1), TRP-2, transkripční faktor spojený s mikroftalmií, receptor melanokortinu 1, cyklický adenosinmonofosfát, protein kináza A, cAMPresponse element-binding protein, c-Jun N-terminální kinázy, extracelulární signálem regulovaná kináza, p38 a fosfoinositid 3-kináza/proteinkináza B [7,21] by měly být dále testovány a potvrzeny na ty aktivní složky.
3. Materiály a metody
3.1. Obecné experimentální postupy
NMR spektra byla měřena na zařízení Bruker Avance Ill 500 MHz (BrukerBillerica, America) pro 1H a 125 MHz pro 13C-NMR. Hodnoty chemického posunu (0) byly v ppm a vazebné konstanty () byly v Hz s CD; OD, CDCI a/nebo D,O byly použity jako rozpouštědla. Optické rotace byly získány na polarimetru JASCO-P-2000 (JASCO, Tokio,Japonsko) (délka buňky 10 mm). IR spektra byla zaznamenána na spektrometru PerkinElmer Spectrum TwoFT-IR (PerkinElmer, Waltham, MA, USA). Hmotnostní spektrometrie s ionizací ESIMSelectrospray s nízkým a vysokým rozlišením) byly měřeny na hmotnostním spektrometru Bruker Daltonics EsquireHCT s ultravysokou kapacitou a hmotnostním spektrometru Orbitrap (LIOOrbitrap XL, Thermo Fisher Scientific). TLC byla provedena na Kieselgel60 F254 (0,25 mm; Merck) a/nebo RP-18 F254S (0,25 mm; Merck), potažených destičkách a poté obarvena postřikem 5% (o/u) sírovou kyseliny v roztoku MeOH a zahříváním na plotně. Silikagel (Silicycle: 70 230 a 230 400 síťka), RP-18 (LiChroprepe 4063 um: Merck. Sephadexn C20 CE epizoda 0 otevřená s Bre aplikovaným foSupelcoTM, Bellefonte) a MCI CHP20P (Sloupcová chromatografie SupelcoT. Pumpa Shimadzu LC-20AT a detektor indexu lomu Shimadzu RID-10A (Shimadzu Inc, Kyoto, Japonsko) spolu s Cosmosil 5C18-MS-II ( Pro HPLC byla použita kolona 250 x 10 mm id, 5 um) při průtoku 2,0 ml/min Cukerná činidla včetně D-glukózy (MP Biomedicals, LLC, Illkirch, Francie) a D-fruktózy (TCI, Tokioapan). používá se pro analýzu surové frakce rozpustné ve vodě (TEW).
3.2. Přírodní materiál
Suché cibule A. edulis (dříve T. edulis) byly zakoupeny v lékárně tradiční čínské medicíny v Taichung na Tchaj-wanu v září 2018 a identifikovány autorem Prof. Changem. Vzorek voucheru (TE201809) byl uložen ve Výzkumném a vývojovém centru čínské medicíny, CMUH Taiwan.
3.3. Extrakce a izolace
Hlízy A. edulis (5, {1}} kg) byly osmkrát extrahovány MeOH (8, {3}} 1 každý) při teplotě místnosti, aby se získal surový extrakt. MeOH extrakt (TEM, 525{5}} g) byl třikrát rozdělen mezi ethylacetát (EtOAc) a H2O (1500:1500, obj./obj.), čímž byl získán EtOAc -rozpustná frakce (TEE, 45,0 g) a vodná fáze, která byla dále rozdělena pomocí n-BuOH/H20 (1500:1500, obj./obj. x 3), a poté rozdělena na rozpustnou v n-BuOH (TEB, 53,6 g ) a frakce rozpustné ve vodě (TEW, 410,0 g).
TEE byl podroben chromatografii na otevřené koloně na silikagelu ({{0}}.063–0,200 mm, kolona: 7 × 26 cm, průměr × délka), za použití gradientů hexan–EtOAc–MeOH (3{{20}}}:1:0; 1:1:0; { {67}}:0:1, v/v/v) a poskytl 14 podfrakcí (TEE1–TEE14). Sraženina 14 (249.0 mg; výtěžek izolace: 0.{{100}}0498 procent) získaná z podfrakce TEE12 (2,2 g) byla odfiltrována a promyta MeOH. TEE9 (3,6 g) byl frakcionován do sedmi subfrakcí (TEE9-1 až 9-7) pomocí silikagelu (kolona: 5 × 24 cm; CH2Cl2-MeOH, 7:1; 1:1; 0:1 , obj./obj.), s podfrakcí TEE9-4 (1,1 g), a poté podrobena sloupcové chromatografii Sephadex LH-20 (kolona: 5 × 54 cm; CH2Cl2–MeOH, 1:1 až 0: 1, v/v), čímž se získá sedm podfrakcí (TEE9-4-1 až 9-4-7). TEE9- 4-5 a TEE9-4-6 byly spojeny (celkem 551,7 mg) a opakovaně čištěny pomocí RP-HPLC (MeOH-H20, 45:55; 20:80, obj./obj.), čímž byla získána sloučenina 12 (21,0 mg ; tR=13 min; výtěžek izolace: 0,00042 procenta) a matečný louh (131,2 mg), který byl dále podroben RP-HPLC (MeOH-H2O; 10:90, obj./obj.), čímž byly získány sloučeniny 10 ( 35,5 mg; tR=13 min; výtěžek izolace: 0,00071 procenta) a 11 (1,2 mg; tR=15 min; výtěžek izolace: 0,000024 procent). Frakce TEE6 (2,7 g) byla izolována pomocí Sephadexu LH-20 (kolona: 2,5 x 45 cm; CH2Cl2-MeOH, 1:1; 0:1, obj./obj.), čímž byla získána sloučenina 13 (6,8 mg; výtěžek izolace: 0,000136 procenta).
TEB byl chromatografován na koloně Diaion HP{{0}} (6 × 60 cm; H2O–MeOH–aceton, 100:{{15} }:0; 25:75:0; 50:5{{20}}:0; 75:25:{{41 }}; 0:10{{70}}:{{90}}; {{1{{105} }0}}:0:100, v/v/v), čímž získáte šest podfrakcí (TEB1–TEB6). Subfrakce TEB5 (502.0 mg) byla purifikována pomocí RP-HPLC (MeOH-H20, 85:15, obj./obj.), čímž byly získány sloučeniny 8 (9,3 mg; tR {{34} } min; výtěžek izolace: 0.000186 procent ) a 9 (144,2 mg; tR {{4{{2{{2{218}) }9}}3}}}} min; výtěžek izolace: 0,002884 procenta). Frakce TEB3 (5,5 g) byla podrobena RP-18 chromatografii (kolona: 7 × 25 cm; MeOH–H2O, 1:1; 1:0, v/v) a subfrakci TEB3-6 ( 1,0 g) byl dále izolován pomocí Sephadexu LH-20 (kolona: 5 x 54 cm; MeOH) za získání sedmi subfrakcí (TEB3-6-1 až 3-6-7). TEB3-6-4 (377,1 mg) byl separován MCI gelovou chromatografií (kolona: 2,5 x 23 cm; H20-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 40:60; 20:80; 0: 100, obj./obj.), čímž se získá sedm podfrakcí (TEB3-6-4-1 až 3-6-4-7). TEB3-6-4-4 (38,1 mg) byl přečištěn pomocí RP-HPLC (MeOH-H20, 45:55 v 0,1% kyselině mravenčí, obj./obj.), čímž byla získána čistá sloučenina 1 (12,2 mg; tR=17 min; výtěžek izolace: 0,000244 procent). Dále byla provedena TEB3-6-4-6 (31,0 mg) pomocí RP-HPLC (MeOH–H20, 40:60 v 0,1% kyselině mravenčí, obj./obj.), čímž byla získána sloučenina 6 (7,1 mg; tR=28 min výtěžek izolace: 0,000142 procent). TEB3-6-5 (410,7 mg) byl izolován MCI gelovou chromatografií (kolona: 2,5 x 23 cm; H20-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30: 70; 20:80; 0:100, obj./obj.), čímž získáte osm podfrakcí (TEB3-6-5-1 až 3-6-5-8). TEB3-6-5-3 (75,1 mg) byl čištěn MCI gelovou chromatografií (kolona: 1 x 20 cm; H20-MeOH, 80:20; 70:30; 0:100, obj./obj.), čímž byly získány sloučeniny 4 (59,3 mg, výtěžek izolace: 0,001186 procent) a 5 (10,2 mg; výtěžek izolace: 0,000204 procent). Subfrakce TEB3-6-5-4 (97,0 mg) byla purifikována pomocí RP-HPLC (MeOH-H20, 40:60 v 0,1% kyselině mravenčí, obj./obj.), čímž byla získána sloučenina 7 (46,4 mg; tR=18 min; výtěžek izolace: 0,000928 procenta). TEB3-10 (925,4 mg) byl chromatografován na MCI gelové chromatografii (kolona: 2,5 x 28 cm; H20-MeOH, 100:0; 80:20; 60:40; 50:50; 40:60; 30 :70; 10:90; 0:100, obj./obj.), čímž se získá osm podfrakcí (TEB3-10-1 až 3-10-8) a čistá 2 (393,4 mg; výtěžek izolace: 0,007868 procent). Sloučenina 3 (6,3 mg; tR=8 min; výtěžek izolace: 0,000126 procent) byla získána z TEB3-10-2 (20,9 mg) čištěním RP-HPLC (MeOH-H20, 30:70 v 0,1% mravenčím kyselina, v/v).
3.3.1. tuliposid H (1)
[]23D -23,1 (c 0,12, MeOH); IR (čistý) vmax 3376 (OH), 2960, 2934, 2875 (CH), 1725 (C=O), 1640, 1589, 1459, 1382, 1259, 1167, 10415, C 1000 C), 926, 900, 632, 521 cm-1; 1H a13C NMR spektroskopická data, viz tabulka 1; HRESIMS m/z 351,1652 [M - H] - (vypočteno pro C15H27O9, 351,1655).
3.3.2. Tuliposid I (2)
[]23D -25,8 (c 0,2, MeOH); IR (čistý) vmax 3404 (OH), 2961, 2934, 2876 (CH), 1729 (C=O), 1638, 1461, 1378, 1277, 1185, 1165, 10377-C 100 C), 897, 736, 625, 517 cm-1; 1H a13C NMR spektroskopická data, viz tabulka 1; HRESIMS m/z 359,1686 [M plus Na] plus (vypočteno pro C15H28O8Na, 359,1682).
3.3.3. tuliposid J (3)
[ ] 23 D plus 9.0 (c 0,1, MeOH); IR (čistý) vmax 3424 (OH), 2953, 2924, 2853 (CH), 1740 (C=O), 1632, 1441, 1401 (C–O–C), 1284, 1205, 1202, 11 , 1078, 1039, 893, 768, 721 cm-1; 1H a13C NMR spektroskopická data, viz tabulka 1; HRESIMS m/z 303,1049 [M plus Na] plus (vypočteno pro C11H20O8Na, 303,1050).
3.4. (R)- a (S)-MTPA deriváty 1
Příprava (S)-MTPA esterového derivátu 1 byla provedena běžným postupem Mosher esteru [22,23]. Sloučenina 1 (3,4 mg, 0.01 mmol) byla přenesena do čisté NMR zkumavky a poté zcela vysušena ve vakuu předtím, než byla naplněna dusíkem. Dále C5D5N ({{20}}},5 ml) a (R)-(−)- -methoxy- -(trifluormethyl)-fenyl-acetylchlorid (MTPA chlorid, 12,2 mg, 0,05 mmol) byly okamžitě přidány do utěsněné NMR zkumavky, která byla dále opatrně třepána, aby se vzorek a MTPA chlorid smíchaly. Byla zaznamenána1H NMR a 1H-1H COZY směsi po reakci po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. (R)-MTPA ester 1 byl také připraven podobně výše uvedeným způsobem. Sloučenina 1: 'H NMR (C5D5N, 500 MHz) 5 0,78 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,28 (H3-5, d), 1,52 ( H-200, kvint), 3,08 (H-2, kvint), 3,95 (H-50, m), 4,03 (H-4a, dd), 4,05 (H -20, překrytí), 4,15 (H-100, t), 4,23 (H-30, překrytí), 4,23 (H-40, překrytí), 4,36 (H{{ 68}}a, dd), 4,39 (H-3, překrytí), 4,43 (H-4b, dd), 4,53 (H-60b, d) a 4,95 (H -10, d).
3.4.1. (S)-MTPA ester 1 (1a)
1H NMR (C5D5N, 500 MHz) 5 0,77 (H-400, t), 1,17 (H-300, sext), 1,21 (H3-5, d) , 1,37 (H-200, kvint), 3,18 (H-2, kvint), 3,92 (H-100, t), 3,97 (H-4a, dd), 4,33 (H-50, m), 4,39 (H-30, t), 4,49 (H-4b, brd), 4,64 (H-60a, dd), 4,96 (H-10, d), 5,05 (H-60b, d), 5,70 (H-20, t), 5,76 (H-40, t) a 5,82 (H-3, m).
3.4.2. (R)-MTPA ester 1 (1b)
1H NMR (C5D5N, 500 MHz) 5 0,79 (H-400, t), 1,26 (H-300, sext), 1,30 (H3-5, d) , 1,50 (H-200, kvint), 3,33 (H-2, kvint), 3,60 (H-50, m), 3,94 (H-4a, dd), 4,11 (H-100, t), 4,12 (H-30, t), 4,13 (H-60a, dd), 4,50 (H-4b, brd), 4,70 (H-10, d), 4,85 (H-60b, d), 5,56 (H-20, t), 5,66 (H-40, t) a 5,81 (H -3, m).
3.5. Kyselá hydrolýza tuliposidu I (2)
Izolát 2 (78,6 mg) byl hydrolyzován v 1 M HCl (1,5 ml) při 100 ◦C po dobu 2 hodin [8]. Po ochlazení byla reakční směs extrahována CH2CI2 (2,0 ml x 3), čímž byl získán analog tulipalinu, 3-methyldihydrofuran-2(3H)-on (11,1 mg). []23D plus 18,7 (c 1,1, CH2CI2); 'H NMR (CDCI3, 400 MHz) 5 1,30 (3H, d, J=7,0 Hz), 1,94 (m), 2,45 (m), 2,61 (m), 4,20 (ddd, J {{43} },8, 6,8, 6,4 Hz), 4,33 (ddd, J=8,8, 8,8, 2,8 Hz). 13C NMR (CDCI3, 100 MHz) 5 15,2, 30,7, 34,1, 66,2, 180,1 (obrázek S28); ESIMS m/z 101,06 [M plus H] plus.
3.6. Buněčná kultura
Myší melanomové buňky B16 byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu (DMEM; GIBCO Invitrogen corporation, New York, NY, USA) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu při ◦C v inkubátoru s 5% CO2.
3.7. Měření životaschopnosti buněk B16
Cytotoxicita buněk B16 pro testované sloučeniny byla měřena pomocí MTT s dříve popsaným protokolem s mírnými modifikacemi [6]. Buňky byly nasazeny na 96-jamkové destičky (1 x 103 buňky/jamka) a kultivovány po dobu 24 hodin, než byly ošetřeny sloučeninami po dobu dalších 72 hodin. Poté bylo médium odstraněno, do každé jamky bylo přidáno 100 ul MTT činidla (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) (v konečné koncentraci 0,5 mg/ml) a poté inkubováno při 37 °C po dobu 1 hodiny. Krystal formazanu byl rozpuštěn ve 100 ul DMSO a optická hustota byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček (SPECTORstar® Nano, BMG LABTECH, Ortenberg, Německo) při 570 nm.
3.8. Měření obsahu melaninu v buňkách B16
Obsah melaninu v buňkách B16 byl testován podle dříve popsané metody s mírnými modifikacemi [6]. Buňky byly nasazeny v hustotě 5 × 103 buněk/jamku na 24-jamkové destičky po dobu 24 hodin. Médium bylo nahrazeno 500 ul čerstvého kultivačního média obsahujícího 0,5 uM -MSH se sloučeninami nebo bez nich po dobu 72 hodin. Arbutin (1 mM) byl použit jako pozitivní kontrola. Poté bylo médium odstraněno a dvakrát promyto PBS (pH 6,8). Buňky byly sklizeny pomocí NaOH (200 ul, 2 N) a poté zahřívány na 85 °C po dobu 30 minut. Po ochlazení na teplotu místnosti a odstředění byla měřena absorbance při 405 nm pomocí čtečky mikrodestiček.
3.9. Intracelulární tyrosinázová aktivita
Test intracelulární tyrosinázové aktivity byl proveden mírně modifikovanou metodou, která byla popsána dříve [6]. Buňky byly nasazeny na 24-jamkové destičky v hustotě 5 x 103 buněk/jamku po dobu 24 hodin. Buňky byly ošetřeny v DMEM obsahujícím 0,5 uM -MSH se sloučeninami nebo bez nich po dobu 72 hodin. Po odstranění média byly buňky dvakrát promyty studeným PBS (pH 6,8). Buňky byly lyžovány 100 ul lyzačního pufru (1 procento triton X-100 v PBS) a zmraženy při -80 °C po dobu 15 minut.
Poté byly buněčné lyzáty centrifugovány při 13 200 x g při 4 °C po dobu 30 minut, aby se získal supernatant. Celkový obsah proteinu v supernatantu byl kvantifikován pomocí BCA proteinového testu. Dále byl každý kvantifikovaný lyzát (30 ug/90 ul) smíchán s 10 ul L-DOPA (15 mM) v 96-jamkové destičce a poté inkubován při 37 °C po dobu 1 hodiny a byla měřena absorbance při 405 nm za použití čtečky mikrodestiček.
4. závěr
Celkově bylo z A. edulis izolováno 14 čistých sloučenin, včetně tří nových isoprenoidních glykosidů a tulipánových stran H–J (1–3). Derivát kyseliny citronové 9, tributylcitrát, měl významnou antimelanogenní aktivitu, ale vykazoval cytotoxicitu vůči melanomovým buňkám B16, což by mohlo být dále zkoumáno pro antimelanomová léčiva. Zatímco analogy kyseliny pyroglutamové 4 a 6, furanon 10 a furan 12 měly v závislosti na dávce zvýšený obsah melaninu a aktivovanou tyrosinázu, které mohly být dále studovány na kožní onemocnění vitiligo nebo činidla proti bělení a hypopigmentaci vlasů. Je však třeba podrobněji prozkoumat mechanismy in vitro a/nebo studie in vivo, aby se ověřila účinnost aktivních složek.
Doplňkové materiály:
Následující jsou dostupné online, Obrázky S1–S5: NMR spektrální data sloučeniny 1, Obrázky S6–S10: NMR spektrální data sloučeniny 2, Obrázky S11–S15: NMR spektrální data sloučeniny 3, Obrázky S16–S22: NMR spektrální data of TEW, Obrázek S23: TLC analýza TEW, Obrázek S24: Cytotoxicita a regulace melanogenetických účinků TEM, TEE, TEB a TEW, Obrázek S25: Údaje o cytotoxicitě sloučenin 1–12, Obrázek S26: Korelační graf mezi obsah buněčného melaninu a účinky sloučenin 4, 6, 10 a 12 na tyrosinázu, Obrázek S27: Melanogenezní účinky sloučenin 4, 6, 10 a 12 samotných bez -MSH, Obrázek S28: NMR spektrální a optická rotační data produkt získaný kyselou hydrolýzou sloučeniny 2, Obrázek S29: Možná biosyntéza sloučenin 1–3, Tabulka S1: Účinky tyrosinázové aktivity sloučenin 4, 6, 10 a 12.
Příspěvky autora:
Konceptualizace, C.-LL; identifikace rostlinného materiálu, Y.-SC; provádění izolace a čištění, C.-LL a Z.-AG; provádění biologických testů, Y.-LJ; všechny spektrální analýzy a určování struktury, C.-LL a C.-JC; sepsání původního návrhu přípravy, C.-LL Všichni autoři si přečetli a souhlasí s publikovanou verzí rukopisu.
Financování:
Tento výzkum byl financován Ministerstvem vědy a technologie (MOST 108-2320-B039-035-) a Čínskou lékařskou univerzitou (CMU108-MF-84), Tchaj-wan. APC bylo financováno „Chinese Medicine Research Center, China Medical University“ z programu The Featured Areas Research Center Program v rámci Higher Education Sprout Project Ministerstva školství (MOE) na Tchaj-wanu (CMRC-CHM{{5}). }).
Prohlášení institucionální revizní komise:
Nelze použít.
Prohlášení o informovaném souhlasu:
Nelze použít.
Prohlášení o dostupnosti dat:
Nelze použít.
Poděkování:
Tuto práci finančně podpořilo Ministerstvo vědy a technologie (MOST 108-2320-B-039-035-) a Čínská lékařská univerzita (CMU108-MF-84), Tchaj-wan a také „Výzkumné centrum čínské medicíny, Čínská lékařská univerzita“ z programu The Featured Areas Research Center v rámci projektu Higher Education Sprout Ministerstva školství (MOE) na Tchaj-wanu (CMRC-CHM-1) uděleného C .-LL
Střet zájmů:
Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Vzorová dostupnost:
Vzorky sloučenin 1–14 jsou k dispozici u autorů.
Reference
1. Lin, R.; Li, Z.; Lin, J.; Ye, J.; Cai, Q.; Chen, L.; Peng, J. Etanolický extrakt z Tulipa edulis Bak indukuje apoptózu v buňkách SGC-7901 lidského karcinomu žaludku prostřednictvím mitochondriální signální dráhy. Oncol. Lett. 2015, 10, 2371–2377. [CrossRef] [PubMed]
2. Fan, Y.; Hou, X.; Guo, P.; Lv, X.; Zhao, L.; Wang, H.; Zhou, L.; Feng, Y. Extrakce Amana edulis indukuje apoptózu rakoviny jater. Doplněk založený na důkazech. Alternativní. Med. 2018, 2018, 3927075. [CrossRef] [PubMed]
3. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Fyzikálně-chemický a antioxidační potenciál polysacharidů sekvenčně extrahovaných z Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 131, 453–460. [CrossRef]
4. Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Wei, ZJ Reologické vlastnosti a emulgační chování polysacharidů sekvenčně extrahovaných z Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2019, 137, 160–168. [CrossRef]
5. Cao, YY; Ji, YH; Liao, AM; Huang, JH; Thakur, K.; Li, XL; Hu, F.; Zhang, JG; Wei, ZJ Účinky sulfatovaných, fosforylovaných a karboxymethylovaných modifikací na antioxidační aktivity in-vitro polysacharidů sekvenčně extrahovaných z Amana edulis. Int. J. Biol. Macromol. 2020, 146, 887–896. [CrossRef]
6. Lai, KY; Hu, HC; Chiang, HM; Liu, YJ; Yang, JC; Lin, YA; Chen, CJ; Chang, YS; Lee, CL Nové diterpeny leojaponiny G−L z Leonurus japonicus. Fitoterapie 2018, 130, 125−133. [CrossRef]
7. Ullah, S.; Chung, YC; Hyun, CG Indukce melanogeneze fosfomycinem v buňkách B16F10 prostřednictvím upregulace signálních drah P-JNK a P-p38. Antibiotika 2020, 9, 172. [CrossRef] [PubMed]
8. Christensen, LP; Kristiansen, K. Izolace a kvantifikace stran tulipánů a tulipalinů v tulipánech (Tulipa) pomocí vysokoúčinné kapalinové chromatografie. Kontaktujte Dermat. 1999, 40, 300-309. [CrossRef]
9. Tripathi, A.; Puddick, J.; Prinsep, MR; Lee, PPF; Tan, LT Hantupeptiny B a C, cytotoxické cyklodepsipeptidy z mořské sinice Lyngbya majuscula. Fytochemie 2010, 71, 307−311. [CrossRef]
10. Qabaja, G.; Wilent, JE; Benavides, AR; Bullard, GE; Petersen, KS Snadná syntéza všestranných enantio-obohacených-substituovaných hydroxyesterů prostřednictvím kinetického rozlišení katalyzovaného Brønstedovou kyselinou. Org. Lett. 2013, 15, 1266−1269. [CrossRef]
11. Nomura, T.; Kato, Y. Identifikace tuliposidu G, nového tuliposidu esterového typu glukosidu, a jeho distribuce v tulipánu. Z. Naturforsch. CJ Biosci. 2020, 75, 75-86. [CrossRef]
12. Gang, FL; Zhu, F.; Li, XT; Wei, JL; Wu, WJ; Zhang, JW Syntéza a hodnocení bioaktivity analogů kyseliny L-pyroglutamové z přírodního produktu olova. Bioorg. Med. Chem. 2018, 26, 4644–4649. [CrossRef]
13. Vereščagin, AL; Anikina, EV; Syrchina, AI; Lapin, MF; Azin, LA; Semenov, AA Chemický výzkum hořkých látek plodů Lonicera caerulea. Chem. Nat. Compd. 1989, 25, 289-292. [CrossRef]
14. Jaime, C.; Ortuño, RM; Font, J. Di- a trisubstituované -laktony. Konformační studie výpočtů molekulové mechaniky a analýzy vazebných konstant. J. Org. Chem. 1986, 51, 3946-3951. [CrossRef]
15. Larchevêque, M.; Henrot, S. Enantiomerně čisté , -epoxyestery z -hydroxylaktonů: Syntéza -hydroxyesterů a (-)-GABOB. Tetrahedron 1990, 46, 4277-4282. [CrossRef]
16. Jaime, C.; Segura, C.; Dinarés, I.; Font, J. Substituované -laktony s vicinálními atomy vodíku. Studium konformace pomocí výpočtů MM2 a analýzy vazebných konstant. J. Org. Chem. 1993, 58, 154-158. [CrossRef]
17. Mori, K.; Fukamatsu, K. Syntéza (1R,5S)-(plus)-frontalinu z kyseliny (S)-(-)-2-hydroxyparakonové. Liebigs Ann. Chem. 1992, 11, 1191-1193.
18. Miyazawa, M.; Anzai, J.; Fujioka, J.; Ishikawa, Y. Insekticidní sloučeniny proti Drosophila melanogaster z Cornus officinalis Sieb. et Zucc. Nat. Prod. Res. 2003, 17, 337-339. [CrossRef] [PubMed]
19. Lee, CL; Wang, CM; Hu, HC; Yen, HR; Song, YC; Yu, SJ; Chen, CJ; Li, WC; Wu, YC Indolové alkaloidy indigo-doly A–C ze vzdušných částí kuchyně Strobilanthes v tradiční čínské medicíně Qing Dai mají anti-IL-17 vlastnosti. Fytochemie 2019, 162, 39−46. [CrossRef] [PubMed]
20. Faizi, S.; Ali, M.; Saleem, R.; Irfanullah; Bibi, S. Kompletní 1H- a 13C-NMR přiřazení stigma-5-en-3-O- -glukosidu a jeho acetylového derivátu. Magn. Reson. Chem. 2001, 39, 399-405. [CrossRef]
21. Kuo, YH; Chen, CC; Wu, PY; Wu, CS; Sung, PJ; Lin, CY; Chiang, HM Mechanismy inhibice melanogeneze indukované N-(4-methoxyfenyl)kafeamidem. Doplněk BMC. Alternativní. Med. 2017, 17, 71. [CrossRef] [PubMed]
22. Ohtani, I.; Kusumi, T.; Kashman, Y.; Kakisawa, H. High-field FT NMR aplikace Mosherovy metody. Absolutní konfigurace mořských terpenoidů. J. Am. Chem. Soc. 1991, 113, 4092-4096. [CrossRef]
23. Lee, CL; Chang, FR; Hsieh, PW; Chiang, MY; Wu, CC; Huang, ZY; Lan, YH; Chen, M.; Lee, KH; Yen, HF; a kol. Cytotoxické ent-abietanové diterpeny z Gelonium aequoreum. Fytochemie 2008, 69, 276−287. [CrossRef] [PubMed]
1 Department of Cosmeceutics, China Medical University, Taichung 406040, Taiwan.
2 Centrum pro výzkum a vývoj čínské medicíny, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Tchaj-wan.
3 Výzkumné centrum čínské medicíny, Čínská lékařská univerzita, Taichung 40402, Tchaj-wan.
4 Oddělení čínských farmaceutických věd a zdrojů čínské medicíny, Čínská lékařská univerzita, Taichung 40402, Tchaj-wan.
5 Graduate Institute of Integrated Medicine, China Medical University, Taichung 40402, Tchaj-wan.
6 Proteomics Core Laboratory, Department of Medical Research, China Medical University Hospital, Taichung 40402, Taiwan.
For more information:1950477648nn@gmail.com
