Natalenamidy A–C, cyklické tripeptidy od společnosti Actinomadura Sp. RB99

Abstraktní:

V posledních letech se výzkum biochemie bakterií spojených s hmyzem zvýšil. V kombinaci s analytickými procesy dereplikace poskytují tyto studie účinnou strategii pro identifikaci strukturně a/nebo biologicky nových sloučenin. Neribozomálně syntetizované cyklické peptidy mají široké spektrum biologické aktivity s vysokým léčebným potenciálem.

Zde uvádíme objev tří nových cyklických tripeptidů: natalenamidy A–C (sloučeniny 1–3). Tyto sloučeniny byly identifikovány z kultivační půdy plísně rostoucích termitů asociovaných s Actinomadura sp. RB99 pomocí metody dereplikace založené na kapalinové chromatografii (LC)/ultrafialové (UV)/hmotnostní spektrometrii (MS). Chemické struktury nových sloučenin (1–3) byly stanoveny analýzou komplexních spektroskopických metod, včetně jednorozměrných (1H a 13C) a dvourozměrných (1H-1H-COSY, HSQC, HMBC) nukleárních magnetických rezonanční spektroskopie (NMR) společně s daty hmotnostní spektrometrie s ionizací elektrosprejem (HR-ESIMS) s vysokým rozlišením. Absolutní konfigurace nových sloučenin byly objasněny pomocí Marfeyovy analýzy. Prostřednictvím několika testů biologické aktivity pro tripeptidy jsme zjistili, že sloučenina 3 vykazuje významné inhibiční účinky na produkci melaninu vyvolanou 3-isobutyl-1-methylxanthinem (IBMX). Účinek sloučeniny 3 byl podobný účinku kyseliny kojové, sloučeniny široce používané jako kosmetický materiál s bělícím účinkem na kůži.

Světlá, hladká a jemná pleť byla vždy cílem orientálních žen. Výzkum a vývoj bělicích činidel pro produkty péče o pleť je založen především na inhibici aktivity tyrosinázy.

Sloučeniny obsahující benzenové kruhy nebo fenolické hydroxylové struktury mají potenciální bělící účinky, jako je v současnosti běžně používané bělící činidlo arbutin, které může vykazovat bělící účinky inhibicí aktivity tyrosinázy.

A zjistili jsme, že Cistanche deserticola má bělící účinek. Hlavní účinná látka Cistanche deserticola, fenylethanoidové glykosidy, je druh přírodní glykosidové sloučeniny. Studie zjistily, že fenylethanoidní glykosidy mohou inhibovat aktivitu tyrosinázy a produkci melaninu v lidských epidermálních melanocytech a mají bělící účinek. účinnost prostředku.

Click cistanche tubulosa extraktový prášek

Klíčová slova:

houba rostoucí termit; Actinomadura sp.; tripeptidy; natalenamidy A–C; účinky bělení pokožky.

1. Úvod

Chemická analýza ochranných bakteriálních symbiontů hospodářského hmyzu vzbudila v posledních letech mezi chemiky přírodních produktů velkou pozornost [1–5]. Pomocí nejmodernějších procesů dereplikace na bázi nukleární magnetické rezonance (NMR)/hmotnostní spektrometrie (MS) a ekologicky relevantních biologických testů bylo objeveno působivé množství strukturálně zajímavých přírodních produktů, včetně několika neribozomálně syntetizovaných cyklických peptidů. z mikrobiálních symbiontů [6]. Nejvýraznější příklady zahrnují antifungální dentigerumycin, cyklický depsipeptid izolovaný z houby Pseudonocardia sp. [7] a gerumyciny A–C, cyklické depsipeptidy nesoucí kyselinu piperazovou identifikované z Pseudonocardia sp. [8].

Ukázalo se, že cyklické peptidy vykazují širokou škálu biologických aktivit, což podporuje několik syntetických přístupů k těmto farmakologicky slibným strukturám [9–12]. V současné době je na trhu a široce používáno v klinickém prostředí více než 40 léčiv s cyklickými peptidy a v průměru každý rok vstupuje na trh přibližně jedno nové léčivo s cyklickými peptidy [13].

V rámci našeho pokračujícího úsilí o identifikaci strukturně nových a/nebo bioaktivních sekundárních metabolitů z mikrobů asociovaných s termity [14–17] jsme se zaměřili na termity asociované Actinomadura sp. RB99, izolovaný z termitu rostoucího na houbách, Macrotermes natalensis. Naše strategie dereplikace založená na kapalinové chromatografii (LC)/ultrafialové (UV)/hmotnostní spektrometrii (MS) poskytla potenciálně nové bioaktivní přírodní produkty. V této studii popisujeme izolaci a chemickou identifikaci tří nových cyklických tripeptidů, natalenamidu A–C (sloučeniny 1–3, obrázek 1), pomocí metody dereplikace založené na LC/UV/MS a také jejich biologická hodnocení na cytotoxické účinky. , protizánětlivé a bělící účinky na kůži.

2. Výsledky a diskuse

2.1. Izolace sloučenin 1–3 na bázi kapalinové chromatografie (LC)/ultrafialového záření (UV)/hmotnostní spektrometrie (MS)

Actinomadura sp. RB99 byl izolován z povrchu dělnice termitů (M. natalensis). Fylogenetická analýza téměř kompletní sekvence 16S ribozomální ribonukleové kyseliny (rRNA) naznačuje, že kmen RB99 patří do rodu Actinomadura, s nejbližším sousedem Actinomadura nitritigenes NBRC 15918T. Následná analýza obohacených extraktů kultur na bázi LC/UV/MS odhalila soubor charakteristických UV absorpcí s jedinečnými píky molekulárních iontů obsahujících atomy dusíku.

K identifikaci příslušných metabolitů a prozkoumání jejich aktivity byla provedena velkoobjemová fermentace za použití optimalizovaných růstových podmínek (100 agarových ploten z 2 1 ISP2 agaru, pH 6, 10 dní při 30 ◦C) a zavedený postup zpracování a předčištění. aplikováno [17]. Následná frakcionace řízená LC-UV/MS a opakovaná semipreparativní vysokoúčinná kapalinová chromatografie (HPLC) vedly k izolaci tří metabolitů s unikátním NMR/MS vzorem. Provedli jsme růstové a mediální studie s použitím různých solí (NaCl, KBr 1–3 procenta) a složení médií (ISP1-6 média), abychom napodobili přirozené prostředí a stimulovali produkci metabolitů, což také vedlo k přítomnosti tří nových metabolity (viz doplňkový obrázek S19).

2.2. Strukturní objasnění sloučenin

Natalenamid A (1) byl získán jako amorfní prášek. Molekulární vzorec 1 byl určen jako C19H25N3O5 z molekulárního iontu adičního sodíku při m/z 398,1691 [M plus Na] plus (vypočteno pro C19H25N3O5Na, 398,1692) za použití elektrosprejové elektrospreje s vysokým rozlišením v módu kladných iontů (HR-ionizační hmotnostní spektrometrie ESIMS) data. Infračervené (IR) spektrum ukázalo silný absorpční pás při 1670 cm-1, což naznačuje přítomnost amidových skupin v molekule. Podrobná analýza 1H NMR dat 1 (tabulka 1) ukázala typické signály peptidového skeletu, zobrazující dva methylové signály (δH 0,91 (3H, d, J=7).{29 }} Hz, H-3) a 0,92 (3H, d, J=7.0 Hz, H-4)), tři methylenové signály (5H 1,95 (1H, m, H-7a), 2,27 (1H, m, H-8a), 2,36 (1H, m, H-8b), 2,48 (1H , m, H{{50}}b), 2,97 (1H, dd, J=14.0, 8{65}} Hz, H{{58} }a) a 3,2 0 (1H, dd, J=14.0, 5,0 Hz, H-12b)), čtyři methinové signály (δH 2,02 (1H , m, H-2), 4,16 (1H, d, J=7,5 Hz, H-1), 4,20 (1H, dd, J=8,5, 4,5 Hz, H-6) a 4,63 (1H, dd, J=8,0, 5,0 Hz, H-11)) a pět překrývajících se aromatických protonů (δH 7,18 (1H, m, H{96}}), 7,23 (2H, m, H{100}}/18) a 7,24 (2H, m, H{105}}/17)).

Spektrum 13C NMR (tabulka 1) s pomocí spekter HSQC a HMBC ukázalo celkem 19 uhlíkových rezonancí odpovědných za dva methylové signály (δC 18,9 a 19,9), tři methylenové signály (δC 27.0, 30,6 a 38,8), devět methinových signálů (δC 32,1, 55,6, 58,0, 60,4, 127,8, 129,5 (×2) a 130,6 (×2)), včetně pěti aromatických uhlíků, jednoho olefinického uhlíku signál (5C 138,8) a čtyři signály karbonylového uhlíku (5C 173,2, 173,3, 174,8 a 181,3). V kombinaci s výše uvedenými spektroskopickými údaji podrobná kontrola dvourozměrné (2D) NMR (experimenty 1H-1H COSY, HSQC a HMBC) odhalila přítomnost tří aminokyselin v 1: glutamátu (Glu), fenylalaninu ( Phe) a valin (Val) (obrázek 2). Konektivita těchto aminokyselin byla určena HMBC korelacemi H-1/C-5 a C-19, H-11/C-10 a C{ {50}} a H-6/C-5 a C-10 (obrázek 2).

K identifikaci absolutní konfigurace 1 byla použita Marfeyova metoda ke stanovení stereochemie -H násobků (C-1, C-6 a C-11). Kyselé hydrolyzáty 1 a standardních aminokyselin (L/D-Glu, Phe a Val) byly derivatizovány 1-fluor-2,4-dinitrofenyl-5-L-alaninem amid (L-FDAA). Následně byla derivatizovaná směs 1 a standardních aminokyselin analyzována pomocí LC/MS pro zjištění jejich retenčního času. Absolutní konfigurace skupin Glu, Phe a Val byly všechny určeny jako L-formy na základě retenčních časů derivátů L-FDAA 1 ve srovnání s časy standardních aminokyselin. Struktura 1 byla tedy objasněna jako cyklický tripeptid znázorněný na obrázku 1.

Natalenamid B (2) byl izolován jako amorfní prášek. Jeho molekulární vzorec (C20H27N3O5) byl odvozen z píku molekulárního iontu adukovaného vodíkem a sodíkem při 390,2032 [M plus H] plus (vypočteno pro C20H28N3O5, 390,2029) a 412,1849 [M plus Na] plus (vypočteno pro C8. Ve srovnání s molekulárním vzorcem a NMR spektrálními daty 1 se zdá, že sloučenina 2 má v peptidové kostře další skupinu CH2. Komplexní zkoumání jednorozměrných (1D) (1H a 13C NMR) a 2D NMR (1H–1H COSY, TOCSY, HSQC a HMBC) spekter 2 odhalilo existenci tří aminokyselinových zbytků: Glu, Phe a Leu (leucin). Sekvence těchto aminokyselin byla zkonstruována na základě HMBC korelací H-1/C-6 a C-20, H-12/C-11 a C -20 a H-7/C-6 a C-11 (obrázek 2). Pro stanovení absolutní konfigurace 2 byla provedena derivatizace zbytků Glu, Phe a Leu pomocí L-FDAA a poté analyzována pomocí LC/MS. V datech LC/MS byly L-Glu, L-Phe a L-Leu detekovány porovnáním retenčních časů pro L-FDAA deriváty 2 s retenčními časy standardních aminokyselin. Chemická struktura 2 byla tedy stanovena jako cyklický tripeptid znázorněný na obrázku 1.

Data HR-ESIMS v pozitivním módu natalenamidu C (3) ukázala molekulární ionty adukované vodíkem a sodíkem při 424,1870 [M plus H] plus (vypočteno pro C23H26N3O5, 424,1872) a 446,1694 [M plus Na] plus (vypočteno pro C23N5O5 424,1692). To naznačuje, že jeho molekulární vzorec byl C23H25N3O5. Podrobná analýza 1D a 2D NMR spekter 3 ukázala, že jeho chemická struktura byla podobná struktuře 2, kromě toho, že Leu byl nahrazen Phe v 3. Konektivita tří identifikovaných aminokyselin v 3 byla ověřena pomocí HMBC korelací H-1/C-9 a C-23, H-15/C-14 a C-23 a H-10/ C-9 a C-14 (obrázek 2). Aplikací Marfeyovy metody na sloučeninu 3 byly objasněny absolutní konfigurace násobků -H (C-1, C-10 a C-15) jako jeden L-Glu a dva L -Phe skupiny. V souladu s tím byla určena kompletní struktura 3, jak je znázorněno na obrázku 1.

Natalenamidy A–C jsou tricyklické peptidy, pravděpodobně neribozomálního původu. V současnosti bylo několik bioaktivních cyklických tripeptidů charakterizováno jako přírodní produkty: cytotoxické 17-členné cyklické tripeptidy (např. OF4949 I–IV) izolované z Penicillium rugulose [18]; antifungální sklerotomie A−K, identifikované z fermentační půdy halotolerantních bakterií [10]; a antiproliferativní psychrofilní E, izolované ze smíšené kultury dvou kmenů plísní pocházejících z mořských řas rodu Aspergillus [19].

2.3. Biologické aktivity sloučenin 1-3

Protože se uvádí, že cyklické peptidy vykazují širokou škálu biologických aktivit, biologické účinky izolovaných cyklických tripeptidů ({{0}}) byly hodnoceny pomocí tří biologických aktivit. Cytotoxicita sloučenin 1-3 byla zkoumána proti čtyřem rakovinovým buněčným liniím (buňky rakoviny prsu MCE7, buňky rakoviny děložního čípku HeLa, buňky lidské rakoviny plic A549 a buňky rakoviny jater HepG2) v různých koncentracích (0, 6,25 12,5, 25, 50 a 100 uM). Sloučenina 1 neovlivnila životaschopnost buněk MCF-7, HeLa nebo A549. Avšak ošetření buněk HepG2 100 uM sloučeniny 1 snížilo životaschopnost buněk na 78,5 plus 3,2 procenta (obrázek 3). Sloučenina 2 snížila životaschopnost buněk HeLa a A549 na 82.{27}},1 procenta a 73.5=3,0 procenta, ale neovlivnila životaschopnost buněk MCF-7 nebo HepG2 buňky (obrázek 3). Sloučenina 3 neovlivnila životaschopnost žádné z buněčných linií (obrázek 3).

Dále byly makrofágy RAW264.7 použity ke zkoumání protizánětlivých účinků izolovaných sloučenin. Aby se eliminovaly chyby v produkci NO způsobené změnou míry přežití buněk, byly zkoumány netoxické koncentrace každé sloučeniny. Jak je znázorněno na obrázku 4, sloučeniny 1–3 měly málo cytotoxických účinků v buňkách RAW264.7 (obrázek 4A–C) a nevykazovaly žádné inhibiční účinky na produkci NO v buňkách RAW264.7 stimulovaných lipopolysacharidem (LPS) (obrázek 4D–F) .

Inhibiční účinky sloučenin 1–3 na obsah melaninu v buňkách B16F10 byly zkoumány jako důkaz jejich aktivit bělení kůže (obrázek 5). Protože změny v životaschopnosti buněk způsobují chyby v produkci a měření melaninu, nejprve jsme zkoumali účinky sloučenin 1–3 na přežití buněk B16F10. Sloučeniny 1–3 nevykazovaly žádné cytotoxické účinky na buňky B16F10 v žádné z použitých koncentrací (obrázek 5A–C). Poté jsme hodnotili inhibiční účinky sloučenin na produkci melaninu indukovanou 3-isobutyl-1-methylxanthinem (IBMX) v buňkách B16F10 (obrázek 5D–F). IBMX, dobře známý stimulátor melanogeneze, indukuje významné zvýšení produkce melaninu po jediném ošetření v melanomových buňkách. Mezi hodnocenými sloučeninami sloučenina 3 (při 5–100 uM) vykazovala významné inhibiční účinky na syntézu melaninu zprostředkovanou IBMX v závislosti na dávce. Kyselina kojová, naše pozitivní kontrola, byla široce používána jako kosmetický materiál s účinky bělení kůže [20]. Inhibiční účinek sloučeniny 3 na produkci melaninu indukovanou IBMX byl podobný jako u kyseliny kojové (obrázek 5F), což naznačuje, že sloučenina 3 funguje jako silný inhibitor produkce melaninu indukované IBMX v buňkách melanomu B16F10.

Kromě toho byla sloučenina 3 kontaminována malým počtem nečistot, které byly interpretací NMR spektroskopických dat a LC/MS analýzy určeny jako analogy mastných kyselin (doplňkové materiály, obrázky S11–S15 a S23). K identifikaci aktivity nečistot byly provedeny další experimenty s analogy mastných kyselin pro jejich inhibiční účinky na produkci melaninu indukovanou IBMX v buňkách B16F10, které odhalily, že testované sloučeniny neměly žádný bělící účinek (doplňkové materiály, obrázek S24). I když tedy nemůžeme vyloučit, že nečistoty ve sloučenině 3 jsou zodpovědné za inhibiční účinek na produkci melaninu indukovanou IBMX, zdá se to nepravděpodobné.

3. Materiály a metody

3.1. Obecné experimentální postupy

Infračervená spektra byla získána na spektrometru Bruker IFS{0}}/S FT-IR (Bruker, Billerica, MA, USA). Elektrosprejová ionizace a spektra HR-ESIMS byla měřena na SI-2/LCQ DecaXP kapalinové chromatografii (LC)-hmotnostním spektrometru (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). NMR spektra, včetně experimentů 1H–1H COSY, HSQC a HMBC, byla provedena pomocí NMR spektrometru Varian UNITY INOVA 800 (Varian, Palo Alto, CA, USA) pracujícího na 800 MHz (1H) a 200 MHz (13C), s chemické posuny udávané v ppm (5). Preparativní HPLC využívala pumpu Waters 1525 Binary HPLC s detektorem Waters 996 Photodiode Array Detector (Waters Corporation, Milford, CT, USA). Pro sloupcovou chromatografii byl použit silikagel 60 (230–400 mesh, Merck, Kenilworth, NJ, USA) a silikagel RP-C18 (230–400 mesh, Merck. Semipreparativní HPLC používal Shimadzu Prominence HPLC System s SPD{ {22}}A/20AV Series Prominence HPLC ultrafialové – viditelné (UV–Vis) detektory (Shimadzu, Tokio, Japonsko). LC/MS analýzy byly provedeny na systému Agilent 1200 Series HPLC (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) vybavené detektorem diodového pole a hmotnostním spektrometrem řady 6130 ESI s analytickým Kinetexem (4,6 × 100 mm, 3,5 µm). Pro tenké -vrstvá chromatografie (TLC) Skvrny byly detekovány na TLC pod UV světlem nebo zahříváním po postřiku roztokem anisaldehyd-kyselina sírová.

3.2. Mikrobiální materiál

Actinomadura sp. RB99 byl izolován z povrchu dělnice termitů rodu M. natalensis (kolonie Mn103, GPS S25 43 45.9 E28 14 08.9) 2. ledna{ {13}}10. Biomateriál byl umístěn do čistých plastových sáčků a zpracován do jednoho dne od odběru. Termiti se promyli ve sterilní deionizované vodě a bakterie se izolovaly nanesením výsledné suspenze na médium s nízkým obsahem živin s chitinem (na litr: 4 g chitinu, 0,7 g K2HPO4, 0,3 g KH2P04, 0,5 g MgS04.5H2O, 0,01 g FeSO4.7H2O, 0,001 g ZnSO4, 0,001 g MnCl2 a 20 g agaru) [21]. Izoláty s morfologií podobnou Actinobacteria byly přeneseny na ISP2 agar (na litr: 10 g sladového extraktu, 4 g kvasinkového extraktu, 4 g glukózy a 20 g agaru) a subkultivovány, dokud nebyly získány čisté izoláty.

3.3. Extrakce DNA a amplifikace polymerázovou řetězovou reakcí

Actinomadura sp. RB99 byl pěstován v tekutém médiu bohatém na živiny ISP2 po dobu pěti až sedmi dnů při 30 ◦C. Buňky byly sklizeny a genomová DNA byla extrahována pomocí GenJet genomické DNA purifikační sady (#K0721, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA) podle pokynů výrobce s následujícími změnami: (a) ošetření lysozymem bylo prodlouženo na 40 minut a (b) ošetření proteinázou K bylo prodlouženo na 40 minut. DNA byla kvantifikována fotometricky pomocí spektrometru Nanodrop Lite (Thermo Scientific).

Pro fylogenetické studie byl gen 16S rRNA amplifikován pomocí sady primerů 1492R/27F. Každá amplifikační reakce byla připravena v konečném reakčním objemu 25 ul obsahujícím 7,25 ul destilované vody, 5 ul HF pufru, 5 ul každého primeru (2,5 uM), {{10}},5 ul dNTPs (10 uM), 0,25 ul Phusion High-Fidelity DNA polymerázy (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA) a 2 ul extrahované DNA (šablona). Polymerázová řetězová reakce (PCR) byla provedena za následujících podmínek: 98 ◦C po dobu 38 s; 32 cyklů 98 ◦ po dobu 30 s, 52 ◦C po dobu 45 s, 72 ◦C po dobu 1 min 20 s; a konečné prodloužení 72 ◦C na 8 min. PCR produkt byl vizualizován elektroforézou na agarózovém gelu a PCR reakce byly purifikovány pomocí PCR purifikační soupravy (Thermo Scientific). Fragmenty DNA byly sekvenovány v GATC (Konstanz, Německo).

3.4. Sekvenování a identifikace druhů

Sekvence byly hodnoceny na čistotu a neshody pomocí BioEdit [22]. Dopředné a reverzní sekvence získané pro každý kmen byly sestaveny pomocí BioEdit a testovány na chiméry pomocí DECIPHER (http://decipher.cee.wisc.edu/FindChimerasOutputs.html). Výsledné sekvence byly uloženy v GenBank (přístupové číslo: KY558684). Blast analýzy s téměř kompletními sekvencemi 16S rRNA (1368 bp) byly provedeny pomocí databáze National Center for Biotechnology Information (NCBI) (referenční sekvence RNA). Výsledky ukázaly, že kmen RB99 je členem rodu Actinomadura. Sekvence prvních 10 zásahů byly staženy z databáze NCBI a porovnány se sekvencí 16S rRNA Actinomadura sp. RB99 pomocí služby zarovnání sekvencí Sina [23]. Pomocí softwaru MEGA verze 7.0.26 byly rekonstruovány dva různé fylogenetické stromy pomocí algoritmu sousedícího spojování nebo algoritmu s maximální pravděpodobností [24–26]. Model evoluční vzdálenosti Tamura a Nei byl použit ke generování matic evolučních vzdáleností pro algoritmy maximální věrohodnosti a algoritmy pro spojování sousedů s odstraněním úplných mezer a chybějících dat [27]. Pro algoritmus maximální věrohodnosti byla použita diskrétní gama distribuce (plus G) a model změny rychlosti umožňoval, aby některá místa byla evolučně neměnná (plus I). Pro algoritmus sousedícího spojování byla variace rychlosti mezi místy modelována pomocí gama distribuce (plus G). Hodnoty spolehlivosti uzlů byly vyhodnoceny bootstrapovou analýzou založenou na 1000 krocích převzorkování [28].

3.5. Extrakce a izolace

Actinomadura sp. RB99 byl pěstován v 50 ml ISP2 bujónu po dobu sedmi dnů při 30 ◦C (předkultivace) a použit k naočkování 100 ISP2 agarových misek. Destičky byly inkubovány po dobu 10 dnů při 30 °C, nakrájeny na malé kousky, konsolidovány a ponořeny přes noc do MeOH. MeOH fáze byla zfiltrována a odpařena za sníženého tlaku. MeOH extrakt (20 g) byl rozpuštěn v destilované vodě (700 ml) a poté třikrát rozděleno rozpouštědlo s EtOAc (700 ml), čímž bylo získáno 1,1 g zbytku. Frakce rozpustná v EtOAc (1,1 g) z MeOH extraktu byla nanesena na sloupec silikagelu (230–400 mesh) pro chromatografii a eluována gradientovým rozpouštědlovým systémem CH2Cl2-MeOH (100:1 až 1: 1, v/v). To poskytlo šest frakcí (A–F), které byly podrobeny analýze na bázi LC-UV/MS. Dereplikační analýza za použití vlastní UV spektrální knihovny naznačila existenci minoritních peptidových analogů ve frakci E. Ty vykazovaly jednoduchý UV vzor při přibližně 220 nm a jedinečné iontové píky molekulárního vzorce obsahující atomy dusíku. Polární frakce E (233 mg) byla frakcionována preparativní HPLC s reverzní fází (Phenomenex Luna C18, 250 x 21,2 mm vnitřní průměr, 5 um, Torrance, CA, USA) za použití CH3CN/H20 (1:9 až 9:1, v /v, gradientový systém, průtok: 5 ml/min), čímž se získá pět dílčích frakcí (E1–E5). Subfrakce E2 (27 mg) byla purifikována pomocí semipreparativní HPLC s reverzní fází (Phenomenex Luna C18, 250 x 10,0 mm vnitřní průměr, 5 um) s 33 procenty MeOH/H20 (izokratický systém, průtok: 2 ml/min. Získá se sloučenina 1 (5,8 mg, tR=57,0 min). Sloučeniny 2 (1,6 mg, tR=42,0 min) a 3 (1,5 mg, tR=55,0 min) byly izolovány z podfrakce E3 (15 mg) semipreparativní reverzní fází HPLC s elucí 43 procent MeOH/H20 (izokratický systém, průtok: 2 ml/min).

3.5.1. Natalenamid A (1)

3.5.2. Natalenamid B (2)

3.5.3. Natalenamid C (3)

3.6. Kyselá hydrolýza sloučenin 1–3

Celkové množství 0,4 mg každé sloučeniny (1–3) bylo hydrolyzováno 6N HCl (500 ul) po dobu 1 hodiny při 110 ◦C. Po ochlazení na pokojovou teplotu byly hydrolyzáty 1–3 odpařeny, aby se odstranily stopy HCl. K hydrolyzátovým směsím byla přidána destilovaná voda (500 ul) a poté odpařena, aby byly odstraněny stopy HC1; tento proces byl proveden třikrát.

3.7. Stanovení absolutní konfigurace aminokyselin v 1.–3

Směsi hydrolyzátů (1–3), stejně jako standardní aminokyseliny (L/D-Leu, Glu, Phe a Val), byly rozpuštěny v 1N NaHC03 (10}0 µL) a poté zpracovány s 50 ul L-FDAA (10 mg/ml v acetonu). Následně byl každý hydrolyzát zahříván po dobu 10 minut na 80 °C. Každá směs se zalije 2N HC1 (50 ul) a koncentruje se ve vakuu. Zbytek byl rozpuštěn ve 300 ul MeOH. Každý alikvot (5 ul) získaný ze směsí hydrolyzátu byl přímo injikován na LC/MS (Phenomenex Luna C18, 4,6 × 100 mm, 3,5 um, průtok 0,3 ml/min) a celý sken v pozitivním a negativním iontové módy (rozsah skenování od m/z 100 do 1000) byly použity k identifikaci retenčních časů L-FDAA-derivatizovaných aminokyselin.

Mobilní fáze, sestávající z kyseliny mravenčí v destilované vodě ({{0}},1 procenta v/v) (A) a acetonitrilu (B), byla nesena gradientovým rozpouštědlovým systémem takto: 20–40 procent (B) po dobu 10 minut, 100 procent (B) izokratické po dobu 5 minut a poté 20 procent (B) izokratické po dobu 5 minut, aby se provedla procedura promývání kolony po běhu. Retenční časy aminokyselin derivatizovaných L-FDAA použitých jako standardy byly 16,7 min (L-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 18,2 min (D-Glu, m/z 400 [M plus H] plus), 22,1 min (L-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,1 min (D-Val, m/z 370 [M plus H] plus), 25,6 min (L-Phe, m/ z 418 [M plus H] plus), 27,0 min (D-Phe, m/z 418 [M plus H] plus), 25,5 min (L-Leu, m/z 384 [M plus H] plus) a 28,2 min (D-Leu, m/z 384 [M plus H] plus). Retenční časy derivatizovaných hydrolyzátů 1–3 byly L-Glu (16,9 min), L-Phe (25,7 min) a L-Val (22,5 min) od 1; L-Glu (16,7 min), L-Phe (25,7 min) a L-Leu (25,6 min) od 2; a L-Glu (16,9 min) a L-Phe (25,7 min) z 3.

3.8. Cytotoxické testy s použitím rakovinných buněk

Buňky MCF7, HeLa a A549 byly zakoupeny od American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Buňky HepG2 byly zakoupeny od Korean Cell Line Bank (Seoul, Korea). Buňky MCF7 byly kultivovány v médiu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra. Buňky HeLa a A549 byly kultivovány v Dulbeccově minimálním základním médiu (DMEM, Cellgro, Manassas, VA, USA) doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra. Buňky HepG2 byly kultivovány v minimálním základním médiu doplněném 10 procenty fetálního hovězího séra. Kultivační podmínky byly udržovány při 37 ◦C ve zvlhčené atmosféře obsahující 5 procent CO2. Cytotoxicita byla testována na těchto čtyřech lidských buněčných liniích (MCF7, HeLa, A549 a HepG2) za použití soupravy pro stanovení viability buněk EZ-CyTox (Dojindo Laboratories, Kumamoto, Japonsko). Stručně, 5 x 103 buněk/jamka bylo nasazeno na 96-jamkové destičky. Po 24 hodinách byly buňky ošetřeny sloučeninami v uvedených koncentracích. Po 72 hodinách inkubace byla použita souprava pro stanovení viability buněk EZ-CyTox. Po 2 hodinách inkubace byla měřena absorbance při 450 nm s referenční při 620 nm. Životaschopnost buněk byla vypočtena jako procento kontroly.

3.9. Protizánětlivá aktivita

Buněčná linie myších makrofágů RAW264.7 byla zakoupena od American Type Culture Collection. Buňky byly kultivovány v DMEM doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS), 100 jednotkami/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu a inkubovány při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2. Životaschopnost buněk byla měřena pomocí soupravy pro detekci viability buněk Ez-Cytox. Buňky byly inkubovány v 96-jamkových destičkách v koncentraci 2500 buněk na jamku po dobu 24 hodin a ošetřeny uvedenými koncentracemi sloučenin 1–3 po dobu 24 hodin. Dále byla do každé jamky přidána činidla Ez-Cytox. Optická hustota při 450 nm byla měřena po 1 hodině pomocí čtečky mikrodestiček (PowerWave XS; Bio-Tek Instruments, Winooski, VT, USA) k odhadu životaschopnosti buněk. V samostatném experimentu byly buňky RAW264.7 inkubovány v 96-jamkových destičkách v koncentraci 30,{23}} buněk na jamku po dobu 24 hodin. Po sérovém hladovění po dobu 12 hodin byly buňky předem ošetřeny sloučeninami 1–3 po dobu 1 hodiny a poté stimulovány 1 ug/ml LPS po dobu 24 hodin. Absorbance kultivačního média v Griessově reakci byla měřena při 540 nm pomocí čtečky mikrodestiček PowerWave XS pro odhad hladiny NO.

3.10. Měření obsahu melaninu

Myší melanomová buněčná linie, B16F10, byla zakoupena od American Type Culture Collection. Buňky byly kultivovány v DMEM doplněném 10 procenty FBS, 100 jednotek/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu a inkubovány při 37 °C ve zvlhčené atmosféře s 5 procenty CO2. Buňky B16F10 byly inkubovány v 6 cm kultivačních miskách při 250 000 buněk na jamku v DMEM doplněném 10 procenty FBS, 100 ug/ml streptomycinu a 100 U/ml penicilinu po dobu 24 hodin. Buňky byly dvakrát promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a poté stimulovány pomocí IBMX a inkubovány s různými koncentracemi sloučenin 1–3 nebo kyselinou kojovou (pozitivní kontrola) v médiu RPMI bez fenolové červeně doplněném 10 procenty FBS, 100 jednotek /ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu po dobu 24 hodin a 48 hodin. Absorbance kultivačního média byla měřena při 405 nm pomocí čtečky mikrodestiček PowerWave XS pro odhad obsahu melaninu. Výsledky jsou vyjádřeny jako násobek změny ve srovnání s kontrolou (buňky nestimulované IBMX).

3.11. Statistická analýza

Všechna data včetně životaschopnosti buněk, produkce NO a melaninu byla prezentována jako průměrná hodnota a standardní odchylka (SD). Všechny testy byly provedeny trojmo a byly opakovány alespoň třikrát. V této studii bylo zahrnuto pouze několik opakování každého buněčného experimentu, proto byla pro statistickou analýzu přijata metoda neparametrické analýzy. Pro statistickou analýzu každé proměnné byl použit Kruskall-Wallisův test. Pro všechny analýzy byl použit statistický balík SPSS (International Business Machines Corporation (IBM) Statistika SPSS verze 21, Boston, MA, USA). Statistická významnost byla uvažována při p-hodnotě nižší než 0,05.

4. závěr

Naše zpráva poskytuje chemickou analýzu mikrobiálních izolátů z termitu rostoucího na houbách. Tři nové cyklické tripeptidy, natalenamidy A–C (1–3), byly izolovány a strukturně charakterizovány z kultivační půdy plísní Actinomadura sp. RB99 pomocí metody dereplikace založené na LC-UV/MS. Všechny izolované sloučeniny byly hodnoceny na biologické aktivity pomocí testů na bázi buněk. Sloučeniny 1 a 2 vykazovaly slabou cytotoxicitu vůči buňkám HepG2 a HeLa/A549, v daném pořadí. Žádná z izolovaných sloučenin nevykazovala významné inhibiční účinky na produkci NO v buňkách RAW264.7 stimulovaných LPS. Sloučenina 3 vykazovala významné inhibiční účinky na syntézu melaninu zprostředkovanou IBMX způsobem závislým na dávce. Účinek byl podobný jako u kyseliny kojové, která se používá jako kosmetický materiál s bělícími účinky.

Poděkování:

Jsme hluboce vděční Michaelu Thomas-Poulsenovi (Department of Biology, University of Copenhagen, Dánsko) za podporu naší práce v terénu.

Střet zájmů:

Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.

Reference

1. Newman, DJ; Cragg, GM Přírodní produkty jako zdroje nových léků od roku 1981 do roku 2014. J. Nat. Prod. 2016, 79, 629–661. [CrossRef] [PubMed]

2. Mishra, BB; Tiwari, VK Přírodní produkty: Vyvíjející se role v budoucím objevování léků. Eur. J. Med. Chem. 2011, 46, 4769–4807. [CrossRef] [PubMed]

3. Beemelmanns, C.; Guo, H.; Rischer, M.; Poulsen, M. Přírodní produkty z mikrobů spojených s hmyzem. Beilstein J. Org. Chem. 2016, 12, 314–327. [CrossRef] [PubMed]

4. Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Currie, ČR; Clardy, J. Bakteriální symbionti v zemědělských systémech poskytují strategický zdroj pro objev antibiotik. J. Antibiot. 2014, 67, 53–58. [CrossRef] [PubMed]

5. Harvey, AL; Edrada-Ebel, R.; Quinn, RJ Znovuobjevení přírodních produktů pro objevování léků v éře genomiky. Nat. Rev. Drug Discov. 2015, 14, 111–129. [CrossRef] [PubMed]

6. Sattely, ES; Fischbachb, MA; Walsh, CT Celková biosyntéza: In vitro rekonstituce polyketidových a neribozomálních peptidových drah. Nat. Prod. Rep. 2008, 25, 757–793. [CrossRef] [PubMed]

7. Oh, D.; Scott, JJ; Currie, ČR; Clardy, J. Mycangimycin, polyen peroxid ze vzájemného Streptomyces sp. Org. Lett. 2009, 11, 633–636. [CrossRef] [PubMed]

8. Sedni, CS; Ruzzini, AC; Van Arnam, EB; Ramadhar, TR; Currie, ČR; Clardy, J. Variabilní genetické architektury produkují prakticky identické molekuly v bakteriálních symbiontech mravenců pěstujících houby. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2015, 112, 13150–13154. [CrossRef] [PubMed]

9. Nízká, KE; Ler, S.; Chen, KJ; Campbell, RL; Hickey, JL; Tan, J.; Scully, CCG; Davies, RL; Yudin, AK; Zaretsky, S. Racionální návrh inhibitorů calpainu na bázi calpastatinových peptidomimetik. J. Med. Chem. 2016, 59, 5403–5415. [CrossRef] [PubMed]

10. Zheng, J.; Xu, Z.; Wang, Y.; Hong, K.; Liu, P.; Zhu, W. Cyklické tripeptidy z halotolerantní houby Aspergillus sclerotiorum PT06-1. J. Nat. Prod. 2010, 73, 1133–1137. [CrossRef] [PubMed]

11. Weerakkody, D.; Moshniková, A.; El-Sayed, NS; Adochit, RC; Slaybaugh, G.; Golijanin, J.; Tiwari, RK; Andreev, OA; Parang, K.; Reshetnyak, YK Novel pH-senzitivní cyklické peptidy. Sci. Rep. 2016, 6, 31322. [CrossRef] [PubMed]

12. Zhao, M.; Lin, HC; Tang, Y. Biosyntéza -nitro-obsahujícího cyklického tripeptidu psychrofilního. J. Antibiot. 2016, 69, 571–573. [CrossRef] [PubMed]

13. Zorzi, A.; Deyle, K.; Heinis, C. Cyklická peptidová terapeutika: Minulost, přítomnost a budoucnost. Curr. Opin. Chem. Biol. 2017, 38, 24–29. [CrossRef] [PubMed]

14. Kim, KH; Ramadhar, TR; Beemelmanns, C.; Cao, S.; Poulsen, M.; Currie, ČR; Clardy, J. Natalamycin A, ansamycin z termitů asociovaných Streptomyces sp. Chem. Sci. 2014, 5, 4333–4338. [CrossRef] [PubMed]

15. Kang, HR; Lee, D.; Benndorf, R.; Jung, WH; Beemelmanns, C.; Kang, KS; Kim, KH Termisoflavony A–C, isoflavonoidní glykosidy z termitů asociovaných Streptomyces sp. RB1. J. Nat. Prod. 2016, 79, 3072–3078. [CrossRef] [PubMed]

16. Beemelmanns, C.; Ramadhar, TR; Kim, KH; Klassen, JL; Cao, S.; Wyche, TP; Hou, Y.; Poulsen, M.; Bugni, TS; Currie, ČR; a kol. Makrotermyciny A–D, glykosylované makrolaktamy z termitů asociovaných Amycolatopsis sp. M39. Org. Lett. 2017, 19, 1000–1003. [CrossRef] [PubMed]

17. Guo, H.; Benndorf, R.; Leichnitz, D.; Klassen, JL; Vollmers, J.; Görls, H.; Steinacker, M.; Weigel, C.; Dahse, HM; Kaster, AK; de Beer, ZW; a kol. Izolace, biosyntéza a chemické modifikace rubterolonů A–F: Vzácné tropolonové alkaloidy z Actinomadura sp. 5–2. Chem. Eur. J. 2017, 23, 9338–9345. [CrossRef] [PubMed]

18. Sano, S.; Ikai, K.; Katayama, K.; Takesako, K.; Nakamura, T.; Obayashi, A.; Ezure, Y.; Enomoto, H. OF4949, nové inhibitory aminopeptidázy B. II. Objasnění struktury. J. Antibiot. 1986, 39, 1685–1696. [CrossRef] [PubMed]

19. Ciasullo, L.; Casapullo, A.; Cutignano, A.; Bifulco, G.; Debitus, C.; Hooper, J.; Gomez-Paloma, L.; Riccio, R. Renieramid, cyklický tripeptid z vanuatské houby Reniera n. l. sp. J. Nat. Prod. 2002, 65, 407–410. [CrossRef] [PubMed]

20. Solano, F.; Briganti, S.; Picardo, M.; Ghanem, GH Hypopigmentační činidla: Aktualizovaný přehled biologických, chemických a klinických aspektů. Pigm. Cell Melanoma Res. 2006, 19, 550–571. [CrossRef] [PubMed]

21. Visser, AA; Nobre, T.; Currie, ČR; Aanen, DK; Poulsen, M. Zkoumání potenciálu aktinobakterií jako obranných symbiontů u termitů rostoucích na houbách. Microb. Ecol. 2012, 63, 975–985. [CrossRef] [PubMed]

22. Hall, TA BioEdit: Uživatelsky přívětivý editor pro zarovnání biologických sekvencí a program pro analýzu pro Windows 95/98/NT. Nucleic Acids Symp. Ser. 1999, 41, 95–98.

23. Pruesse, E.; Peplies, J.; Glöckner, FO SINA: Přesné vysoce výkonné zarovnání více sekvencí genů ribozomální RNA. Bioinformatika 2012, 28, 1823–1829. [CrossRef] [PubMed].

24. Saitou, N.; Nei, M. Metoda sousedského spojení: Nová metoda pro rekonstrukci fylogenetických stromů. Mol. Biol. Evol. 1987, 4, 406–425. [PubMed]

25. Felsenstein, J. Evoluční stromy ze sekvencí DNA: Přístup maximální věrohodnosti. J. Mol. Evol. 1981, 17, 368–376. [CrossRef] [PubMed]

26. Kumar, S.; Stecher, G.; Tamura, K. MEGA7: Analýza molekulární evoluční genetiky verze 7.0 pro větší soubory dat. Mol. Biol. Evol. 2016, 33, 1870–1874. [CrossRef] [PubMed]

27. Tamura, K.; Nei, M. Odhad počtu nukleotidových substitucí v kontrolní oblasti mitochondriální DNA u lidí a šimpanzů. Mol. Biol. Evol. 1993, 10, 512–526. [PubMed]

28. Felsenstein, J. Meze spolehlivosti fylogenezí: Přístup využívající bootstrap. Evoluce 1985, 39, 783–791. [CrossRef] [PubMed]

Vzorová dostupnost:

Vzorky sloučenin nejsou u autorů k dispozici.

For more information:1950477648nn@gmail.com