Swertiajaponin inhibuje pigmentaci kůže pomocí dvou mechanismů k potlačení tyrosinázy, část 2

Cistancheje obyčejná bylina, která je známá jako "zázračná bylina, která prodlužuje život". Jeho hlavní složkou je cistanosid, který má různé účinky, jako je antioxidační, protizánětlivý a podpora imunitních funkcí. Mechanismus mezi cistanche a bělením kůže spočívá v antioxidačním účinku cistanchových glykosidů.

Melanin v lidské kůži vzniká oxidací tyrosinu katalyzovanou tyrosinázou a oxidační reakce vyžaduje účast kyslíku, takže se volné radikály v těle stávají důležitým faktorem ovlivňujícím produkci melaninu.Cistancheobsahuje cistanosid, který je antioxidantem a může snížit tvorbu volných radikálů v těle, čímž inhibuje produkci melaninu.

Klikněte na Cistanche Tubulosa pro zlepšení bělení pleti

Požádat o víc:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

navíccistanchemá také funkci podpory produkce kolagenu, který může zvýšit elasticitu a lesk pokožky a pomoci opravit poškozené kožní buňky.

CistancheFenylethanolové glykosidy mají významný down-regulační účinek na aktivitu tyrosinázy a účinek na tyrosinázu se ukazuje jako kompetitivní a reverzibilní inhibice, která může poskytnout vědecký základ pro vývoj a použití bělicích složek v Cistanche.

Proto,cistanchemá klíčovou roli vbělení kůže. Může inhibovat produkci melaninu, aby se snížilo zabarvení a matnost; a podporují produkci kolagenu pro zlepšení pružnosti a zářivosti pokožky. Vzhledem k širokému uznání těchto účinků cistanche začalo mnoho produktů na bělení pokožky obsahovat bylinné přísady, jako je Cistanche, aby uspokojily poptávku spotřebitelů, čímž se zvýšila komerční hodnota Cistanche v produktech pro bělení kůže.

Stručně řečeno, role cistanche při bělení kůže je zásadní. Jeho antioxidační účinek a účinek na produkci kolagenu může snížit zabarvení a matnost, zlepšit elasticitu a lesk pokožky, a tak dosáhnoutbělící efekt. Široké použití Cistanche v produktech pro bělení pokožky také ukazuje, že jeho roli v komerční hodnotě nelze podceňovat.

Swertiajaponin inhibuje aktivaci MAPK indukovanou UVB

Bylo prokázáno, že oxidační stres stimuluje melanogenezi upregulací transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF), transkripčního faktoru, který indukuje expresi genu tyrosinázy [4, 14]. Studovali jsme, zda antioxidační účinek swertiajaponinu může regulovat aktivitu MITF. Data Western blotting ukázala, že expozice UVB zvýšila fosforylovaný MITF, aktivní formu MITF, zatímco ošetření swertiajaponinem v 10 μM ji snížilo (obrázek 6A). V souladu s tím bylo zvýšení hladiny tyrosinázového proteinu zprostředkované UVB sníženo ošetřením swertiajaponinem (obrázek 6A). Protože bylo prokázáno, že oxidační stres aktivuje MITF prostřednictvím mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK) [15, 16], bylo zkoumáno, zda swertiajaponin může řídit signalizaci MAPK. Expozice UVB dramaticky zvýšila fosforylaci ERK, JNK a p38 (obrázek 6B), která je spojena s produkcí ROS a ONOO indukovanou UVB v buňkách B16F10 (obrázek 5C- 5}D). Ošetření swertiajaponinem pouze v 10 uM snížilo hladiny proteinů MAPK (obrázek 6B). Tento výsledek je v souladu s antioxidační aktivitou swertiajaponinu, protože pokles buněčného oxidačního stresu indukovaného UVB byl jasný pouze při 10 μM swertiajaponinu (obrázek 5C-5D).

Ačkoli je swertiajaponin hlavní sloučeninou celé byliny Swertia japonica, která se používá jako japonský lék, naše studie neprokázala přesvědčivé důkazy o bezpečnosti swertiajaponinu pro jeho aplikaci na lidskou pokožku. V našem experimentálním prostředí však swertiajaponin nevykazoval cytotoxicitu v buněčných liniích Hs27 (lidský fibroblast), HaCat (lidský keratinocyt) a B16F10 (myší melanom). Navíc nebyly na základě mikroskopického pozorování zjištěny žádné viditelné známky cytotoxicity včetně tvorby úlomků buněk nebo odlučování buněk, když byl swertiajaponin ošetřen na modelu lidské kůže v koncentracích, které nevykazovaly cytotoxicitu v buněčných liniích. Vzhledem k tomu, že hlavními obavami sloučenin na bělení kůže, které jsou v současné době k dispozici, jsou otázky bezpečnosti, jsou zapotřebí další studie in vivo, aby se prověřila jejich bezpečnost ve fyziologii.

Společně swertiajaponin inhiboval akumulaci melaninu až do uspokojivého limitu jak v buněčných, tak v modelech lidské kůže duálními mechanismy k potlačení tyrosinázy prostřednictvím přímé vazby na tyrosinázu a kompetitivní inhibice tyrosinázy a potlačení signalizace MAPK/MITF zprostředkované oxidativním stresem (obrázek 7). Vzhledem k nepříznivým účinkům a nedostatku dlouhodobé účinnosti známých činidel pro bělení kůže, jako je kyselina kojová a arbutin [17], lze swertiajaponin bezpečněji aplikovat k potlačení pigmentace kůže a byl by novým doplňkem pro bělící kosmetiku.

MATERIÁLY A METODY

Test tyrosinázové aktivity pomocí houbové tyrosinázy

Swertiajaponin a kyselina kojová (50 μM) byly vloženy do 96-jamkové mikrodestičky (Nunc, Dánsko) v tyrosinázovém pufru (200 μl) obsahujícím houbovou tyrosinázu (1000 U), 1 mM roztok L-tyrosinu a 50 mM fosfát pufr (pH 6,5) [5]. Destička byla inkubována při 37 stupních po dobu 15 minut a dopachinon byl hodnocen spektrofotometrií (450 nm). Na základě měření byla vypočtena IC50 pomocí log-lineárních křivek a jejich rovnic.

Simulace dokování swertiajaponinu a tyrosinázy

AutoDock Vina byl použit pro simulaci dokování protein-ligand in silico. Trojrozměrná struktura tyrosinázy byla použita v krystalové struktuře Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). Předdefinované vazebné místo tyrosinu bylo aplikováno jako dokovací kapsa. Poté, co byly provedeny dokovací simulace mezi tyrosinázou a swertiajaponinem nebo kyselinou kojovou, byl k predikci vazebných zbytků mezi různými sloučeninami a tyrosinázou použit software LigandScout 3.0.

Kinetická analýza inhibice tyrosinázy swertiajaponinem

L-DOPA byl připraven v koncentracích 4, 2, 1, 0,5, 0,25, 0,125 a 0,0625 mM a swertiajaponin byl připraven při 20, 40 a 80 uM. Roztok reakční směsi byl připraven v 96-jamkové destičce, ve které bylo 20 μl tyrosinázového substrátu (L-DOPA), 10 μl vodného roztoku houbové tyrosinázy (200 U) a 50 mM pufru fosforečnanu draselného (pH 6.5) byly přidány. Rychlost produkce dopacromu reakční směsi byla měřena při vlnové délce 450 nm pomocí čtečky mikrodestiček. Rychlost inhibice tyrosinázy swertiajaponinu byla poté vypočtena pomocí analýzy Lineweaver-Burk graf. Michaelisova konstanta (Km) a maximální rychlost (Vmax) byly také vypočteny pomocí Lineweaver-Burkových grafů s různými koncentracemi substrátu L-DOPA [3].

Buněčná kultura a test životaschopnosti

Melanomové buňky B16F10 byly zakoupeny od Korea Cell Line Bank. Buňky byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) s 5 procenty fetálního bovinního séra (FBS) a 1 procentem penicilinu, streptomycinu, L-glutaminu a pyruvátu sodného. Buňky byly udržovány při 37 stupních ve zvlhčené atmosféře 95 procent vzduchu/5 procent CO2. Pro test buněčné životaschopnosti byly buňky nasazeny na 96-jamkové destičky. Melanomové buňky B16F10 byly ošetřeny swertiajaponinem v různých koncentracích po dobu 48 hodin. Do každé jamky byl přidán Ez-Cytox (10 ul) a inkubován po dobu 2 hodin. Vytvořené krystaly formazanu byly měřeny spektrofotometrií při 450 nm. Životaschopnost buněk byla vypočtena za použití buněk bez ošetření swertiajaponinem jako kontrolní skupiny.

Obsah melaninu v buňkách B16F10

Hladina melaninu byla měřena metodou popsanou dříve s mírnými úpravami [18••]. Buňky B16F10 byly ponechány růst do 70-80 procenta konfluence v 6-jamkových destičkách. Buňky byly předem ošetřeny swertiajaponinem nebo kyselinou kojovou po dobu 2 hodin. Poté byly MSH nebo UVB ošetřeny médiem obsahujícím swertiajaponin nebo kyselinu kojovou a inkubovány dalších 48 hodin. Po promytí PBS byly buňky odděleny pomocí trypsinu a rozpuštěny v 90 ul 1N roztoku NaOH obsahujícího DMSO (5 procent). Po inkubaci při 60 stupních po dobu 1 hodiny byl obsah melaninu stanoven měřením absorbance při 405 nm. Pro expozici buněk B16F10 UVB záření byla použita komerčně dostupná UV komora (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Korea).

Western blotting

Vzorky proteinu izolované z buněk B16F10 (30 ug) byly separovány elektroforézou na dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu s použitím 10-12 procent akrylamidových gelů a přeneseny na polyvinylidenfluoridové membrány, které byly poté okamžitě umístěny do blokovacího pufru ( 5 procent odtučněného mléka) v 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl a 0,1 procenta Tween 20. Membrána byla promyta v pufru TBS-Tween po dobu 30 minut a poté inkubována se specifickými primárními protilátkami (1:1{ {24}} ředění) uvedené v legendách obrázku při 4 stupních přes noc. Po promytí pufrem TBS-Tween byla membrána inkubována s anti-myší protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou (Santa Cruz, 1:10,000), anti-králičí protilátkou (Santa Cruz, 1:10, 000), nebo anti-kozí protilátka (Santa Cruz, 1:10 000) při 25 stupních po dobu 1 hodiny. Imunobloty byly vizualizovány pomocí roztoku Western Bright Peroxide (Advansta, CA, USA) a zobrazovacího systému ChemiDoc Touch (Bio-Rad, USA) podle pokynů výrobce. Protilátky použité v této studii jsou následující: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tyrosináza (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{{40 }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Cell Signaling-921L), p38 (Cell Signaling-9212S), pERK (Cell Signaling-4370L ), ERK (Cell Signaling-9201L), pJNK (Cell Signaling-9251L), JNK (Cell Signaling-9252S) a -actin (Santa Cruz-47778) .

Měření hladin ROS a ONOO-

Antioxidační aktivita swertiajaponinu byla zkoumána pomocí fluorescenčního 2,7-dichlordihydrofluorescein diacetátu (DCFDA) pro ROS a dihydrorhodaminu (DHR) 123 pro ONOO-. Stručně řečeno, pro stanovení hladiny ROS byl k buněčným homogenátům přidán DCFDA (25 uM) na konečný objem 250 ul. Pro měření hladiny ONOO- bylo 10 ul buněčných homogenátů přidáno k roztoku rhodaminu (50 mM pufr fosforečnanu sodného, ​​90 mM chlorid sodný, 5 mM kyselina diethylentriaminpentaoctová [DTPA] a DHR123). Pro oba testy byla fluorescence měřena každých 5 minut po dobu 30 minut na čtečce fluorescenčních destiček, s excitační a emisní vlnovou délkou nastavenou na 485 a 530 nm, v daném pořadí.

Akumulace melaninu v modelu lidské kůže

Pro zkoumání antimelanogenního účinku swertiajaponinu na modelu lidské kůže byla použita životaschopná, rekonstituovaná, trojrozměrná lidská epidermis (Neoderm-ME, Tego Science). Model lidské kůže byl předem ošetřen DMSO (vehikulum) nebo swertiajaponinem po dobu 1 hodiny a kultivován v udržovacím médiu poskytnutém společností po dobu 5 dnů s ošetřením DMSO nebo swertiajaponinem. Mikroskopická analýza byla prováděna ode dne 1 do dne 5, aby byla pozorována pigmentace kůže. Mikroskopické snímky byly analyzovány softwarem Image J pro semikvantifikaci ztmavnutí kůže. Pro barvení podle Fontana-Massona byly vzorky kůže fixovány ve 4% paraformaldehydu přes noc při pokojové teplotě a vzorky byly analyzovány komerčně dostupnou společností (Garam Meditech, Jižní Korea).

Statistická analýza

Všechna data jsou prezentována jako průměr ± SEM. Různé skupiny byly porovnány pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované Dunnettovým post-testem. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné.

STŘET ZÁJMŮ

Neexistují žádné prohlášení o střetu zájmů.

FINANCOVÁNÍ

Tato práce byla podpořena Grantem K17281 z Korea Institute of Oriental Medicine, Ministerstvo školství, vědy a technologie (MEST), Korejská republika.

REFERENCE

1. Bradford PT. Rakovina kůže v barvě kůže. Dermatol Nurs. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Chemické a instrumentální přístupy k léčbě hyperpigmentace. Pigment Cell Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]thiazol-2-ylamino)-5- (substituovaný benzyliden)thiazol-4(5H)-onové deriváty jako nové inhibitory tyrosinázy. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P a kol. (Z)-5-(2,4-dihydroxybenzyliden)thiazolidin- 2,4-dion zabraňuje melanogenezi vyvolané UVB zářením a tvorbě vrásek prostřednictvím potlačení oxidačního stresu v HRM{{7} } bezsrsté myši. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR a kol. Kyselina (2R/S,4R)-2-(2,4-dihydroxyfenyl)thiazolidin- 4-karboxylová zabraňuje tvorbě vrásek vyvolaných UV zářením prostřednictvím inhibice zánětu zprostředkovaného NF-kappaB. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonoly od Heterotheca zahrnují: inhibiční aktivitu tyrosinázy a strukturální kritéria. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikace zbytků aktivního místa zapojených do vazby kovového kofaktoru a stereospecifického rozpoznávání substrátu u savčí tyrosinázy. Důsledky pro katalytický cyklus. Biochemie. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoidy jako inhibitory tyrosinázy hub: studie zhášení fluorescence. J Agric Food Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoidní deriváty jako silné inhibitory tyrosinázy – přehled nedávných zjištění mezi 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Studie o složkách Swertia japonica. II. Izolace a struktura nového flavonoidu, swertiajaponinu. Chem Pharm Bull (Tokio). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Účinky extraktu Swertia japonica a jeho hlavní sloučeniny swertiamarinu na vyprazdňování žaludku a gastrointestinální motilitu u myší. Fitoterapie. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Inhibiční účinek 2-methyl-nafto[1,2,3-de]chinolinu-8-one na transport melanozomů a pigmentaci kůže. Sci Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Role flavonoidů v oxidativním stresu. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Mladé listy rákosu (Phragmites communis) potlačují melanogenezi a oxidační stres v buňkách melanomu B16F10. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signální dráhy v melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihydromyricetin z Ampelopsis grossedentata inhibuje melanogenezi prostřednictvím down-regulace signálních drah MAPK, PKA a PKC. Chem Biol Interact. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Extrakt z Ganoderma formosanum mycelium jako vysoce účinný inhibitor tyrozinázy. Sci Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimuluje expresi genu tyrosinázy a melanogenezi v diferencovaných melanocytech. Pigment Cell Res. 2001; 14: 328-36.