Trombomodulin zlepšuje chronické onemocnění ledvin zprostředkované transformujícím růstovým faktorem b1 prostřednictvím signální dráhy receptoru spřaženého s G-proteinem 15/Akt

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8 , Taro Yasuma1,2,8 , Kota Nishihama1 , Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2 , Toshiaki Totoki4 , Yuko Okano1,2 , Akihiro Uchida1 , Ryo W5angi Qinie6 , Shuqangi Qinie Fridman D'Alessandro2 , Tetsu Kobayashi3 , Yoshiyuki Takei4 , Akira Mizoguchi5 , Yutaka Yano1,9 a Esteban C. Gabazza2,9

1 Ústav diabetu, metabolismu a endokrinologie, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 2 Department of Immunology, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 3 Ústav plicní a kritické medicíny, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 4 Ústav gastroenterologie a hepatologie, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 5 Oddělení neurální regenerace a buněčné komunikace, Mie University Graduate School of Medicine, Tsu-city, Mie, Japonsko; 6 Centrální institut pro experimentální zvířata, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japonsko; a 7 oddělení nefrologie, nemocnice Taizhou, lékařská univerzita Wenzhou, Lihai, provincie Zhejiang, Čínská lidová republika.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Copyright ª 2020, International Society of Nephrology. Vydalo Elsevier Inc. Toto je článek s otevřeným přístupem pod licencí CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korespondence: Esteban C. Gabazza, Ústav imunologie, Lékařská fakulta Univerzity Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonsko. E-mail: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; nebo Yutaka Yano, Diabetes, Metabolism and Endokrinology, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonsko. E-mail: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT a TY se na této práci podílely stejnou měrou. 9 YY a EKG jsou spoluautoři. Přijato 1. září 2019; revidováno 24. dubna 2020; přijato 7. května 2020

KLÍČOVÁ SLOVA: apoptóza; chronické onemocnění ledvin; receptor spojený s G-proteinem; rekombinantní lidský trombomodulin; transformující růstový faktor-b1

Fibróza ledvin je běžným důsledkem chronických onemocnění ledvin, které neúprosně progredují do konečného stádia onemocnění ledvin s orgánovým selháním léčitelným pouze substituční terapií. Protože transformující růstový faktor-b1 je hlavním hráčem v patogenezi fibrózy ledvin, předložili jsme hypotézu, že rekombinantní trombomodulin může zlepšit progresivní fibrózu a selhání ledvin zprostředkovanou transformujícím růstovým faktorem-b1. Abychom prozkoumali naši hypotézu, vytvořili jsme novou transgenní myš s lidským transformujícím růstovým faktorem b1 specifickou pro glomerulus, abychom vyhodnotili terapeutický účinek rekombinantního trombomodulinu. U této transgenní myši se vyvinula progresivní glomerulární skleróza a tubulointersticiální fibróza se selháním ledvin. Terapie rekombinantním trombomodulinem po dobu čtyř týdnů významně inhibovala fibrózu ledvin a zlepšila funkci orgánů ve srovnání s neléčenými transgenními myšmi. Léčba rekombinantním trombomodulinem významně inhibovala apoptózu a mezenchymální diferenciaci podocytů interakcí s receptorem 15 spojeným s G-proteinem pro aktivaci signální dráhy Akt a pro upregulaci exprese antiapoptotických proteinů včetně survivinu. Naše studie tedy silně naznačuje potenciální terapeutickou účinnost rekombinantního trombomodulinu pro léčbuchronické onemocnění ledvina následné selhání orgánů.

cistancheumětléčit onemocnění ledvinzlepšit funkci ledvin

Překladové prohlášení

Fibróza a dysfunkceledvinyjsou v současnosti celosvětově závažnými zdravotními problémy. V současné době není schváleno žádné antifibrotické léčivo pro léčbu fibrózy ledvin. Transformující růstový faktor-b1 je hlavní a běžnou hnací silou renální fibrogeneze u chronického onemocnění ledvin způsobeného mnoha poruchami. Zjistili jsme, že rekombinantní trombomodulin, lék schválený v Japonsku k léčbě diseminované intravaskulární koagulace, potlačuje progresi glomerulární sklerózy, tubulointersticiální fibrózy a selhání ledvin způsobené nadměrnou expresí lidského transformujícího růstového faktoru-b1, což naznačuje jeho potenciální terapeutickou hodnotu pro léčbu. zchronická onemocnění ledvin.

Chronické onemocnění ledvinje hlavním problémem veřejného zdraví spojeným s vysokou nemocností a úmrtností, který postihuje asi 13 procent dospělé populace ve vyspělých zemích.1 Světová zdravotnická organizace uvedla, žechronické onemocnění ledvin(CKD) byla příčinou 1,5 procenta úmrtí na celém světě v roce 2012.1 Nedávná epidemiologická data navíc naznačují celosvětový trvalý nárůst počtu pacientů s CKD.2,3 Ve většině případů se patologický proces postupně vyvíjí, což nakonec vede ke stadium selhání ledvin, které je léčitelné pouze doživotní dialýzou nebo transplantací ledviny.4,5 Diabetes mellitus (DM) a arteriální hypertenze jsou nejčastější příčinou CKD následované ischemií, glomerulosklerózou neznámé etiologie, urologickými obstrukcemi a chronickými infekcemi.6 Bez ohledu na základní poruchu je konečným a častým patologickým důsledkem CKD fibróza ledvin.7 Renální fibróza je aberantní hojení a remodelace parenchymálních struktur ledvin vystavených dlouhodobému nebo opakovanému poškození charakterizované přítomností tubulointersticiální fibrózy, glomeruloskleróza a tubulární atrofie.8 Hlavním hnacím motorem renální fifibrogeneze je transformující růstový fakt nebo (TGF)-b1.8,9 TGFb1 může podporovat fifibrózu stimulací sekrece proteinů extracelulární matrix a chemotaktických faktorů nebo proliferačních faktorů fibroblastů, inhibicí metaloproteináz a podporou epiteliálně-mezenchymálního přechodu.10 Kromě léčby základního onemocnění , schválený lék, který se zaměřuje specificky na fibrózu ledvin, je v současné době nedostupný.6

Trombomodulin (TM) je transmembránový glykoprotein s mnoha biologickými funkcemi včetně modulace srážecího systému, imunitní odpovědi, zánětlivých reakcí a přežití buněk.11 Molekulární struktura TM obsahuje doménu podobnou lektinu, 6 domén podobných epidermálnímu růstovému faktoru , doména bohatá na serin/threonin, transmembránová část a cytoplazmatický konec.12 Trombin, prokoagulační faktor generovaný během aktivace koagulačního systému, se po navázání na TM stává antikoagulačním a antifibrinolytickým faktorem.13 Komplex TM-trombinu zvyšuje tvorbu aktivovaného proteinu C (APC), antikoagulantu s protizánětlivou a cytoprotektivní aktivitou, aktivací proteinu C. Navíc samotná TM může přímo downregulovat zánětlivou odpověď inhibicí aktivity proteinu B skupiny s vysokou pohyblivostí-1 (HMGB1), potlačením imunogenních dendritických buněk, eozinofilů, žírných buněk a komplementového systému.13–18

Existují publikované výsledky ukazující preventivní účinky TM u diabetické renopatie a ischemicko-reperfuzního poškození ledvin.19-21 Žádná studie však nehodnotila účinek rekombinantní TM na progresivní fibrózu ledvin vyvolanou TGFb1, což je běžná příčina renální fibrózy v několik onemocnění způsobujících CKD. Předložili jsme hypotézu, že TM může zlepšit fibrózu ledvin a selhání ledvin zprostředkovanou TGFb1-. Abychom tuto hypotézu prozkoumali, hodnotili jsme terapeutický účinek rekombinantní TM u nově vyvinuté TGFb1 transgenní (TG) myši specifické pro glomeruly, u které se vyvíjí progresivnífibróza ledvin a selhání ledvin.

cistanche pro ledviny

VÝSLEDEK

Zvýšené cirkulující fragmenty TM korelují s renální dysfunkcí

TM, glykoprotein vázaný na membránu endoteliálních buněk, se štěpí na fragmenty a ztrácí své ochranné funkce během poškození endotelu.22 Diabetická nefropatie je spojena s poškozením endotelu.23,24 Pacienti s DM s nefropatií ve srovnání s pacienty bez nefropatie vykazovali signifikantně vysoké cirkulující hladiny TM (4,4 vs. 3,3 pg/ml) a aktivního TGFb1 (0,28 vs. 0,24 ng/ml) (doplňková tabulka S1, doplňkový obrázek S1A). TM významně koreluje s kreatininem, aktivním TGFb1 a rozpustným podocinem (doplňkový obrázek S1B). Tato pozorování naznačují, že ztráta funkční membránově vázané TM je spojena se zvýšeným uvolňováním aktivního TGFb1 a dysfunkcí ledvin.

TG myš s glomerulus specifickou expresí úplného lidského genu TGFb1

Vyvinuli jsme TG myš nadměrně exprimující lidský gen TGFb1 plné délky v podocytech. Myš byla vytvořena umístěním lidského TGFb1 pod kontrolu podocinového promotoru na konstrukt bakteriálního umělého chromozomu (BAC) (doplňkový obrázek S2; doplňkový obrázek S3). Získali jsme 5 základních myší exprimujících 3 kopie a 3 základní myši exprimující 1 kopii lidského transgenu TGFb1. Exprese transgenu byla specifická pro ledviny a potomstvo zakladatelů bylo životaschopné (doplňkový obrázek S3). Myši měly donošenou březost a podestýlka měla normální velikost. Myši se narodily v očekávaném mendelovském poměru.

Abychom charakterizovali TG myši, změřili jsme několikrenální parametrykaždé 4 týdny po dobu 16 týdnů (doplňkový obrázek S4). Koncentrace TGFb1 v plazmě a moči byly významně zvýšeny u myší TGFb1- TG ve srovnání s myšmi divokého typu (WT) od prvních týdnů po narození a poté zůstaly stabilní na vysoké úrovni (obrázek 1a). TGFb1-TG myši vykazovaly významné zvýšení obsahu hydroxyprolinu v ledvinové tkáni ve 2. týdnu (190,5 vs. 96.0 mg/ledviny ), mezangiální expanze od 4. týdne (1,9 vs. 1,1 skóre) a v ukládání kolagenu od 12. týdne (0,9 procenta vs. 0,1 procenta) po narození ve srovnání s jejich protějšky WT (obrázek 1a–f ). Konvenční optická mikroskopie ukázala rozšíření bazální membrány Bowmanova pouzdra, ztluštění glomerulární bazální membrány, zvýšené ukládání kolagenu v mezangiálních a intersticiálních prostorech a tubulární atrofii (obrázek 1bd). Transmisní elektronová mikroskopie prokázala glomerulosklerózu včetně mikrovilózní transformace a vymýcení podocytů na chodidle, sníženou fenestraci endotelu glomerulárních kapilár, ztluštění bazální membrány glomerulů a zvýšenou depozici mezangiální matrix (obrázek 2a–i). Koncentrace časných markerů nefropatie v moči Protein vázající mastné kyseliny (185,1 vs. 87,0 pg/ml) aporanění ledvinmolekula 1 (441,9 vs. 256,9 pg/ml) byly významně zvýšeny u TGFb1-TG myší od 4. a 8. týdne věku, v tomto pořadí, ve srovnání s jejich věkově odpovídajícími WT myšmi (doplňkový obrázek S5). Celková proteinurie a poměr celkového proteinu a kreatininu v moči byly významně zvýšeny ve 4., 8., 12., 16. a 2. 0 týdnu u myší TGFb1-TG ve srovnání s jejich protějšky WT (obrázek 3a) . Plazmatická hladina dusíku močoviny v krvi byla významně zvýšena od 4. týdne (5,1 vs. 4,1 mg/dl) a koncentrace kreatininu od 8. týdne (1,1 vs. 0,4 mg/dl) u TGFb1-TG myší ve srovnání s jejich protějšky WT (obrázek 3b).

rhTM inhibuje glomerulosklerózu a tubulointersticiální fibrózu

Ve srovnání s TGFb{{0}}TG myšmi léčenými fyziologickým roztokem (SAL) a WT myšmi léčenými rekombinantním lidským (RH) TM nebo SAL, TGFb{1}}TG myši léčené rytmem vykazovaly významně snížený mezangiál expanze/celularita (1,3 vs. 3.{{30}} skóre) a významně nízké ukládání tubulointersticiálního kolagenu a glomeruloskleróza (121,3 procenta vs. 139,7 procenta) (obrázek 4a–e). V souladu s těmito pozorováními byl obsah hydroxyprolinu (11,7 vs. 19,9 mg/g), koncentrace kolagenu I v ledvinové tkáni (101,3 vs. 196,7 ng/mg proteinu) a periostinu (21,7 vs. 40,8 ng/g) mg proteinu) a relativní mRNA exprese kolagenu I byla významně snížena v ledvinových tkáních myší TGFb1-TG léčených rhTM ve srovnání s ledvinovými tkáněmi kontrolních myší (obrázek 4f, doplňkové tabulky S2 a S3). Transmisní elektronová mikroskopie ukázala signifikantní snížení procesu vymýcení podocytů nohou a ztluštění glomerulární bazální membrány u myší léčených rhTM ve srovnání s myšmi léčenými pouze SAL (doplňkový obrázek S6AB a B). Kromě toho koncentrace profibrotických cytokinů monocytárního chemoatraktantu proteinu -1 (45,0 vs. 76,1 pg/mg proteinu), interleukinu-13 (612,1 vs. 1002,0 pg/mg proteinu) a aktivního TGFb1 v tkáni ledvin (131,0 vs. 151,5 pg/mg proteinu) byly významně sníženy u TGFb1-TG myší léčených rhTM ve srovnání s kontrolními myšmi (doplňkový obrázek S7). Koncentrace HMGB1 v ledvinové tkáni byla také významně snížena v ledvinových tkáních myší TGFb1-TG léčených rhTM ve srovnání sledvinové tkáněz kontrolních myší (doplňkový obrázek S7). Plazmatická koncentrace trombin antitrombinového komplexu byla významně zvýšena ve skupině TGFb1-TG/SAL ve srovnání se skupinou WT/SAL, ale nebyl nalezen žádný rozdíl mezi skupinami TGFb1-TG/rhTM a WT/rhTM (Doplňkový obrázek S8A). Jak se očekávalo, v plazmě myší TGFb1-TG a WT léčených rhTM byla vysoká koncentrace TM. Plazmatická koncentrace komplexu APC/antitrypsin byla významně snížena ve skupině TGFb1-TG/SAL ve srovnání se skupinami WT/SAL a TGFb1-TG/rhTM (280,5 vs. 384,6 pg/ml) a nebyl zjištěn žádný významný rozdíl v hladině inhibitoru aktivátoru plazminogenu-1 (doplňkový obrázek S8A). Hladiny C5a v plazmě, moči aledvinová tkáň(630,1 vs. 1075,0 pg/mg proteinu) a podocin rozpustný v plazmě byly významně sníženy u TGFb1-TG myší léčených rhTM ve srovnání s TGFb1-TG myší léčených SAL (Doplňkový obrázek S8B). Hladina podocinu v moči byla vyšší ve skupině TGFb1-TG/SAL než ve skupinách WT/SAL a TGFb1-TG/rhTM (doplňkový obrázek S9A–C).

Obrázek 1|U transgenní (TG) myši lidského transformujícího růstového faktoru b1 (TGFb1) se vyvíjí progresivní fibróza ledvin. (a) Koncentrace proteinu TGFb1 v plazmě a moči byly měřeny enzymovým imunitním testem a obsah tkáňového hydroxyprolinu kolorimetrickým testem. (b–d) Řezy ledvinové tkáně byly obarveny (b) kyselinou jodistou – Schiff (sloupce ¼ 20 mm) a (c,d) Massonovým trichromem (sloupce ¼ 10{{ 40}} mm) a poté (e,f) kvantifikovány pomocí bodovacího systému nebo zobrazovacího softwaru WinROOF (Mitani Corporation, Tokio, Japonsko). Počet myší pro hodnocení ledvinové tkáně: pro myši divokého typu (WT) n=4 ve 4, 12 a 20 týdnech; pro TG myši n ¼ 7 ve 4 týdnech, n ¼ 8 ve 16. týdnu a n ¼ 9 ve věku 20 týdnů. Počet myší pro hodnocení plazmy a moči: pro WT myši n ¼ 12 ve 4 týdnech, n ¼ 8 v 8 týdnech, n ¼ 7 ve 12 týdnech a n ¼ 4 v 16 a 20 týdnech; pro TG myši n=24 ve 4 týdnech, n=17 v 8. a 12. týdnu a n=9 v 16. a 20. týdnu. Data jsou vyjádřena jako střední mezikvartilní rozmezí. Statistická analýza Mann-Whitney U testem. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****p="">< 0,0001.="" ns,="" nevýznamné.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Obrázek 2|Nálezy transmisního elektronového mikroskopu v modelu fibrózy ledvin indukované transformujícím růstovým faktorem b1. Fixace, manipulace a odstranění ledvin z myší byly provedeny tak, jak je popsáno v metodách. (a,b) Mikrovilózní transformace a (a,b,d,e,g) vymazání výběžků chodidla (bílé šipky) podocytů, (c–e) snížená fenestrace glomerulární kapiláry endotelu (žluté šipky), f) ztluštění glomerulární bazální membrána (hvězdičky) a (h,i) zvýšená depozice mezangiální matrix (bílé šipky). CL, kapilární lumen. Chcete-li optimalizovat zobrazení tohoto obrázku, podívejte se na online verzi tohoto článku na www.kidney-international.org.

rhTM zlepšuje funkci ledvin

hladiny proteinu vázajícího L-mastné kyseliny (197.0 vs. 313,4 pg/ml),molekula poškození ledvin1 (299,9 vs. 596,2 pg/ml), dusík močoviny v krvi (12,9 vs 34,8 mg/dl), kreatinin (0,5 vs. 1,4 mg/dl) a poměr albumin-kreatinin byly významně sníženy v TGFb1-TG myši s renální fibrózou léčené rhTM ve srovnání s jejich neléčenými TG protějšky (obrázek 5). Celkový protein v moči a poměr celkového proteinu kreatininu byly také sníženy u myší TGFb1-TG léčených rhTM ve srovnání s jejich neléčenými protějšky (obrázek 5).

rhTM snižuje apoptózu glomerulárních buněk

Terminální deoxynukleotidyltransferázou zprostředkované dUTP nick end-labelging značení ukázalo významně snížený počet apoptotických buněk v glomerulech z TGFb1-TG myší léčených rhTM ve srovnání s glomeruly z TGFb1- TG myší léčených SAL (doplňkové Obrázek S10A a B). Štěpení kaspázy-3 bylo také významně sníženo v ledvinových tkáních od TGFb1-TG myší léčených rhTM ve srovnání s ledvinovými tkáněmi od TGFb1-TG myší léčených SAL (doplňkový obrázek S10C). Theledvinové tkáněz TGFb1-TG myší léčených rhTM ve srovnání s TGFb1-TG léčenými SAL vykazovaly významné zvýšení hladin mRNA B-buněčného lymfomu 2 (Bcl-2), B - extra velký buněčný lymfom (Bcl-XL), bakulovirový inhibitor repetice apoptózy obsahující 5 (BIRC5, také známý jako survivin) a BIRC6 (Apollon) se zvýšeným poměrem Bcl-2-Bax (doplňkový obrázek S11 ).

Obrázek 3|Transgenní (TG) myš lidského transformujícího růstového faktoru b1 (TGFb1) má renální dysfunkci. (a) Celkový protein a (b) dusík močoviny v krvi (BUN) byly měřeny kolorimetrickými metodami a kreatinin enzymatickou metodou. Počet myší pro hodnocení plazmy a moči: pro myši divokého typu (WT) n ¼ 12 ve 4 týdnech, n=7 v 8. a 12. týdnu a n=4 v 16. a 2. {21}} týdnů; pro TG myši n =24 ve 4 týdnech, n=17 v 8. a 12. týdnu a n=9 ve 16. a 2. 0 týdnech. Data jsou vyjádřena jako medián ± mezikvartilní rozmezí. Statistická analýza Mann-Whitney U testem. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

rhTM inhibuje apoptózu podocytů

Předběžné ošetření podocytů pomocí rhTM významně snížilo apoptózu podocytů kultivovaných v přítomnosti TGFb1, jak bylo hodnoceno počtem buněk ve fázi subG1 (3,2 procenta vs. 5,2 procenta), terminálních deoxynukleotidyltransferázou zprostředkovaných dUTP nick end-labeling-pozitivních buněk ( 1.0 vs. 5,4 buněk/Fifield) a stupeň štěpení kaspázou-3 (poměry 0,9 vs. 1,1) (obrázek 6a–e). Screening antiapoptotických faktorů v kultivovaných podocytech ukázal, že rhTM významně zvyšuje expresi mRNA antiapoptotického faktoru Bcl-2 ve srovnání s expresí v neošetřených buňkách (doplňkový obrázek S12). Exprese mRNA antiapoptotického faktoru BIRC5 se také zvýšila v buňkách ošetřených rhTM ve srovnání s expresí v neošetřených buňkách (doplňkový obrázek S12). Exprese mRNA proapoptotického faktoru Bax byla významně snížena léčbou rhTM ve srovnání s žádnou léčbou (doplňkový obrázek S12). Léčba rhTM také významně inhibovala expresi annexinu V a barvení koncového značení dUTP zprostředkovaného deoxynukleotidyltransferázou v podocytech kultivovaných v přítomnosti peroxidu vodíku (doplňkový obrázek S13A–E) a za podmínek vysoké hladiny glukózy (doplňkový obrázek S14A–E ) dále potvrzující antiapoptotické vlastnosti rhTM na podocytech. Průzkum dráhy antiapoptotické protein kinázy B (Akt)25 ukázal, že rhTM zvýšil fosforylaci Akt v lidských primárních podocytech kultivovaných v přítomnosti peroxidu vodíku nebo TGFb1 (doplňkový obrázek S15A a B). Poté jsme izolovali podocyty z každé skupiny myší a hodnotili Akt fosforylaci pomocí Western blotu. V podocytech izolovaných ze skupiny TGFb{{3{33}}}}TG/rhTM byla významně zvýšená fosforylace Akt ve srovnání s podocyty z neošetřené skupiny (poměry 1,1 vs. 0,7) (doplňkový obrázek S16A a B).

Zprostředkování GPR15

Předchozí studie uváděly, že TM aktivuje intracelulární dráhy interakcí s receptorem fibroblastového růstového faktoru 1 (FGFR1) areceptor spojený s G-proteinem15 (GPR15).26,27 Podocyty exprimují FGFR128, ale není jasné, zda exprimují GPR15. Zde jsme izolovali podocyty z každé skupiny myší a ukázali jsme, že podocyty také exprimují GPR15 (doplňkový obrázek S17A–E). Zjistili jsme, že podocyty ze zdravé kontroly a pacienta s glomerulosklerózou také exprimují GPR15 (doplňkový obrázek S18). Abychom objasnili, zda FGFR1 nebo GPR15 zprostředkovává inhibiční aktivitu rhTM na apoptózu podocytů, hodnotili jsme antiapoptotický účinek rhTM v podocytech ošetřených TGFb1- v přítomnosti inhibitoru FGFR1 nebo po transfekci buněk malou interferující RNA (siRNA) proti FGFR1 nebo GPR15. Předběžné ošetření podocytů inhibitorem FGFR1 (doplňkový obrázek S19A a B) nebo siRNA FGFR1 (13,2 procenta vs. 7,9 procenta) (obrázek 7a a b) nebylo schopné zrušit inhibiční aktivitu rhTM na apoptózu podocytů. Transfekce buněk siRNA GPR15 však zcela zrušila inhibiční aktivitu rhTM (14,6 procenta vs. 13,8 procenta) naapoptóza podocytů(Obrázek 7a–c).

Obrázek 4|Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) inhibuje glomerulosklerózu a tubulointersticiální fibrózu. Řezy renální tkáně byly obarveny (a,b) kyselinou jodistou – Schiff a (c,d) Massonovým trichromem a (e) poté kvantifikovány pomocí skórovacího systému nebo zobrazovacího softwaru WinROOF. (e) Průměrná hodnota skupiny divokého typu (WT)/fyziologického roztoku (SAL) byla vzata jako 100 procento. Statistická analýza Mann-Whitney U testem. (f) Obsah tkáňového hydroxyprolinu byl měřen kolorimetrickou metodou, koncentrace kolagenu I-al (Col1a1) a periostinu enzymovým imunotestem a exprese mRNA pomocí reverzní transkriptázy-polymerázové řetězové reakce. Statistická analýza Kruskal Wallis analýza rozptylu a korigovaný Dunn test. n=8 v každé skupině. Tyče {{10}} (a,c) 50 mm a (d) 20 mm. Data jsou vyjádřena jako medián ± mezikvartilní rozmezí. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****p="">< 0,0001.="" tg,="" transgenní;="" tgfb1,="" transformující="" růstový="" faktor="" b1.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

rhTM inhibuje EMT podocytů

U myší TGFb1-TG/SAL byla ve srovnání s TGFb1-TG významně zvětšena oblast s pozitivním barvením na podocin a a-aktin hladkého svalstva (a-SMA) (1,4 procenta vs. 11,2 procenta). / rhTM myši (obrázek 8a a b). Poté jsme kultivovali in vitro primární lidské podocyty, předem ošetřené rhTM před přidáním proteinu TGFb1 do kultivačního média. Morfologie podobná fibroblastům a zvýšená exprese a-SMA byly potlačeny v podocytech ošetřených rhTM ve srovnání s neošetřenými buňkami (doplňkový obrázek S20A). Kromě toho rhTM inhiboval expresi mRNA fibronektinu a vimentinu, i když zvýšil expresi mRNA E-cadherinu v podocytech ve srovnání s expresí v neošetřených buňkách (doplňkový obrázek S20B). Členové rodiny SMAD 2 (Smad2) a Smad3 hrají kritickou roli v TGFb1-zprostředkovaném epiteliálně-mezenchymálním přechodu (EMT).29 Léčba pomocí rhTM významně potlačila aktivaci Smad2 a Smad3 u TGFb1-TG myší ve srovnání s neléčenými TG myšmi (obrázek 8c) a v lidských podocytech kultivovaných v přítomnosti TGFb1 (doplňkový obrázek S20C).29 TG myši ošetřené rhTM (TGFb1-TG/rhTM) také vykazují nižší expresi a-SMA (3,7 procenta vs. 17,2 procenta) v tubulárních epiteliálních buňkách ve srovnání s jejich neošetřenými protějšky (doplňkový obrázek S21A a B).

Obrázek 5|Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) zlepšuje poškození ledvin a renální dysfunkci. Kreatinin byl měřen enzymatickou metodou; celkový protein kolorimetrickou metodou; a krevní močovinový dusík (BUN) a albumin, molekula 1 poškození ledvin (KIM-1), protein vázající L-mastné kyseliny (L-FABP) a celkový transformující růstový faktor b1 (TGFb1) enzymovým imunitním testem. n=8 v každé skupině. Data jsou vyjádřena jako medián ± interkvartilní rozmezí. Statistická analýza pomocí Kruskal-Wallisovy analýzy rozptylu a nekorigovaného Dunn testu. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" nevýznamné;="" sal,="" fyziologický="" roztok;="" tg,="" transgenní;="" wt,="" divoký="">

GPR15 zprostředkovává inhibiční aktivitu rhTM na EMT

Transfekce podocytů siRNA FGFR1 nebyla schopna zrušit inhibiční aktivitu rhTM na relativní mRNA exprese kolagenu I-al a a-SMA v podocytech ošetřených TGFb 1- (doplňkový obrázek S22). Transfekce buněk pomocí GPR15 siRNA však významně zrušila inhibiční aktivitu rhTM na relativní mRNA exprese kolagenu I-al a a-SMA v podocytech ošetřených TGFb{10}} (doplňkový obrázek S22).

DISKUSE

TGFb1 a poškození glomerulárních buněk

Společným důsledkem poruch způsobujících CKD je renální fibróza.8,30,31 TGFb1 je společným hnacím motorem fibrogeneze v ledvinách související s CKD způsobenou nemocemi včetně DM, arteriální hypertenze a autoimunitních poruch.10 Buňky z glomerulu a tubulointersticiálních prostor může vylučovat latentní formy TGFb1, které při nadměrné aktivaci během poškození tkáně mohou vést k renálnímu zjizvení.32 Jelikož TGFb1 může stimulovat svou vlastní sekreci, fibrotický proces se obecně stává začarovaným kruhem.8 Časná událost v patogenním procesu TGFb 1- zprostředkovanéfibróza ledvinje poranění podocytů a glomerulárních endoteliálních buněk.33–35 Plazmatická hladina solubilní TM je markerem poškození endotelu. V souladu s úlohou TGFb1 při poškození ledvinových buněk jsme zde našli významnou korelaci aktivního TGFb1 s rozpustným TM, solubilním podocinem a kreatininem v plazmě pacientů s DM. Přeslechy mezi glomerulárními endoteliálními buňkami a podocyty během apoškození ledvinvede k lokální expresi proteáz způsobujících degradaci bazální membrány glomerulů.34–36 To může vysvětlit detekci solubilního podocinu a jeho významnou korelaci se solubilním TM u našich pacientů s DM.

Obrázek 6|Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) potlačuje apoptózu podocytů indukovanou transformujícím růstovým faktorem b1 (TGFb1). (a) rhTM byl přidán do kultivačního média podocytů 1 hodinu před indukcí apoptózy pomocí 10 ng/ml TGFb1 po dobu 48 hodin. (b) Procento buněk ve fázi subG1 bylo detekováno jinou cytometrií. (a,b) n=3 v každé skupině. (c,d) Počet buněk s fragmentací DNA byl měřen pomocí terminální deoxynukleotidyltransferázou zprostředkované dUTP nick end-labeling analýzou (TUNEL) (n=3 ve fyziologickém roztoku [SAL]/SAL a skupiny rhTM/SAL; n=6 ve skupinách SAL/TGFb1 a rhTM/TGFb1) a (e) stupeň štěpení kaspázou-3 byl měřen Western blotem (n=4 v každé skupině). Pruhy=100 mm. Data jsou vyjádřena jako medián ± mezikvartilní rozmezí. Statistická analýza Mann-Whitney U testem. *P < 0,05.="" dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenylindol;="" hpf,="" vysoce="" výkonné="" pole;="" ns,="" nevýznamné.="" histogramy="" jsou="" zobrazeny="" jako="" procento="" max="" (procento="" maximální="" hodnoty),="" měřítko="" každé="" křivky="" do="" režimu="100" procent.="" chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

Fibróza ledvin spojená s nadměrnou expresí TGFb1 specifická pro podocyty

Lék, který může působit proti účinku TGFb1, by byl ideální k blokování fibrózy ledvin. Zde jsme vytvořili TG myš nadměrně exprimující lidský gen TGFb1 v glomerulu, u kterého se rozvine spontánní a progresivní glomerulární skleróza a tubulointersticiální fibróza se selháním ledvin již 4 týdny po narození. Model ukazuje pokročilou glomerulopatii s poškozením podocytů a glomerulárních endoteliálních buněk; ztluštění glomerulární bazální membrány a mezangiální expanze s intersticiálním jizvením; zvýšené markery poškození ledvinové tkáně a renální dysfunkce; a zvýšený TGFb1 v plazmě,ledvinové tkáněa moč. Zvýšení vylučování proteinů, TGFb1 močí a aktivace systému komplementu mohou vysvětlit souběžný vývoj intersticiálních jizev v našem současném modelu.37–40 Další experimenty odhalily zvýšený výskyt apoptotických buněk a aktivaci proteinů Smad v ledvinové tkáni z neléčeného TGFb{ {3}}TG myši ve srovnání s WT myšmi. Celkově tato zjištění ukazují na tuto novou myš TGFb1-TG jako vhodný model pro objevování lékůfibróza ledvin.

Obrázek 7|Receptor spojený s G-proteinem (GPR15) zprostředkovává inhibici apoptózy rekombinantního lidského trombomodulinu (rhTM) v podocytech. Lidské primární podocytové buňky byly transfekovány fibroblastovým receptorem růstového faktoru 1 (FGFR1), malou interferující RNA (siRNA), GPR15 siRNA nebo míchanou siRNA po dobu 48 hodin, a poté byl k buněčné kultuře přidán rhTM 1 hodinu před ošetřením transformujícím růstovým faktorem b1. (TGFb1). Apoptotické buňky byly (a) hodnoceny další cytometrií a (b) poté kvantifikovány. (c) Buněčné lyzáty byly připraveny pro Western blot. n{{10}} v každé skupině. Data jsou vyjádřena jako medián ± mezikvartilní rozmezí. Statistická analýza Mann-Whitney U testem. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" fyziologický="">

Obrázek 8|Inhibice epiteliálně-mezenchymálního přechodu rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM). (a) Podocin a a-aktin hladkého svalstva (a-SMA) byly obarveny, jak je popsáno v metodách. (b) Plocha pozitivní pro barvení a-SMA byla kvantifikována softwarem pro zpracování obrazu WinROOF. n=3 ve skupinách divokého typu (WT)/fyziologický roztok (SAL) a WT/rhTM a n=5 ve skupináchtransformující růstový faktor-b1-transgenní(skupiny TGFb{{0}}TG)/SAL a TGFb1-TG/rhTM. (c) Celkové (t) a fosforylované (p) proteiny členů rodiny SMAD (Smad) byly hodnoceny pomocí Western blottingu. n=8 v každé skupině. Data jsou vyjádřena jako medián ± mezikvartilní rozmezí. Statistická analýza pomocí Kruskal-Wallisovy analýzy rozptylu a korigovaného Dunn testu. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0,08." chcete-li="" optimalizovat="" zobrazení="" tohoto="" obrázku,="" podívejte="" se="" na="" online="" verzi="" tohoto="" článku="" na="">

rhTM zlepšuje fibrózu ledvin

Ukázali jsme, že rhTM zlepšuje plicní fibrózu vyvinutou u myší nadměrně exprimujících lidský TGFb1 v plicích potlačením apoptózy alveolárních epiteliálních buněk.41 Klinické studie také prokázaly zlepšení idiopatické plicní fibrózy po léčbě rhTM.42,43 Tato předchozí pozorování naznačují potenciál pro terapii orgánové fibrózy. Předpokládali jsme, že rhTM by byl účinný u fibrózy ledvin související s TGFb1-. Abychom tuto hypotézu otestovali, ošetřili jsme TGFb1-TG myši specifické pro ledviny pomocí rhTM.44 Podávání rhTM po dobu 4 týdnů významně zmírnilo poranění, dysfunkci a fibrózu ledvin. Myši ošetřené rhTM vykazovaly nízké hladiny celkového proteinu, albuminu, TGFb1, C5a v moči a snížené renální hladiny profibrotických cytokinů, C5a a HMGB1.45. Terapie rhTM také inhibovala jak apoptózu, tak EMT podocytů. rhTM však nevykazoval žádný účinek na trombinový antitrombinový komplex, marker aktivace koagulace, i když zvýšil tvorbu APC, antikoagulačního faktoru s protizánětlivou a antiapoptotickou aktivitou.23 Stojí za zmínku, že trombin, prokoagulační enzym, může paradoxně podporují antikoagulaci za nízkého stupně protrombotických stavů tvorbou komplexu TM/trombin, který zvyšuje tvorbu antikoagulačního APC. Trombin však funguje hlavně jako prokoagulant při nadměrných protrombotických stavech (např. sepse).46 Tento dvojí a paradoxní účinek trombinu může vysvětlit zjevnou neúčinnost rhTM inhibovat aktivaci koagulace v našem modelu, který je v protrombotickém stavu nízkého stupně . Celkově tato pozorování naznačují, že rhTM amelio-rychluje progresivní fibrózu a dysfunkciledvinyprodloužením přežití nebo prevencí EMT glomerulárních buněk a potlačením zánětu, aktivace komplementu a aktivity růstového faktoru přímo nebo nepřímo prostřednictvím aktivace dráhy proteinu C a snížení exprese HMGB1. Zlepšení diabetické nefropatie u myší se zvýšenou cirkulující doménou podobnou lektinu TM a zhoršení onemocnění u myší postrádajících doménu podobnou lektinu podporují příznivý účinek rhTM na fibrózu ledvin.20,21

Inhibice apoptózy podocytů

Podocyty hrají kritickou roli při udržování glomerulární filtrační bariéry a vytváření štěrbinové bránice, aby se zabránilo ztrátě esenciálních cirkulujících proteinů.47Poranění ledvinzpůsobená reaktivními formami kyslíku, vysokou hladinou glukózy nebo zánětlivými mediátory včetně TGFb1, indukuje apoptózu podocytů vedoucí k depleci podocytů, která může nakonec způsobit renální dysfunkci.47 Po navázání a aktivaci transmembránového heteromerního komplexu receptorů typu I a typu II serin/threonin TGFb1 vysílá intracelulární signály prostřednictvím rodiny transkripčních faktorů Smad nebo prostřednictvím signálních drah nezávislých na Smad.48 K aktivaci dráhy závislé na Smad dochází, když aktivovaný receptor TGFb1 fosforyluje Smad2 a Smad3, které se Smad4 translokují do jádra.49 Smad2/ Komplex Smad3/Smad4 stimuluje transkripci proapoptotických faktorů a snižuje transkripci antiapoptotických faktorů vedoucích k buněčné apoptóze.49 V souladu s tím jsme zjistili vysokou renální hladinu proapoptotického faktoru Bax a nízkou hladinu antiapoptotických faktorů Bcl2 a Bcl-XL u TGFb1- TG myší. TM může inhibovat apoptózu různých typů buněk.21,41,49 V souladu s tím jsme zde zjistili, že rhTM inhibuje apoptózu podocytů indukovanou peroxidem vodíku, vysokým obsahem glukózy nebo TGFb1 a toto zjištění může vysvětlit příznivý účinek rhTM na CKD . Kromě toho rhTM naklonil rovnováhu směrem k inhibici apoptózy snížením exprese Bax, zvýšením exprese Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 a BIRC6 a zvýšením aktivace Akt dráhy vledvinové tkáně. Celkově tato pozorování naznačují, že rhTM stimuluje přežití podocytů tím, že podporuje aktivaci Akt a expresi antiapoptotického faktoru.

cistanche pro chronické onemocnění ledvin

Inhibice EMT

EMT podocytů také přispívá k renální fibróze. Podocyty podstupující EMT uvolňují proteiny extracelulární matrix, které se hromadí a ukládají během renální fifibrogeneze spojené s TGFb1-.50 TGFb1 podporuje EMT prostřednictvím receptorem zprostředkované aktivace komplexu Smad2/Smad3/Smad4. Fosforylovaný Smad3 podporuje EMT stimulací transkripce matrixových proteinů a snížením exprese epiteliálních markerů.51 V souladu s tím jsme zjistili zvýšenou EMT podocytů u TGFb1-TG myší a podocytů kultivovaných v přítomnosti TGFb1 nebo pod oxidační podmínky nebo podmínky s vysokým obsahem glukózy. Předchozí zprávy naznačovaly, že rhTM potlačuje EMT.52,53 Zde jsme zjistili, že rhTM inhibuje EMT podocytů a tubulointersticiálních epiteliálních buněk u TGFb1-TG myší. Inhibice aktivace proteinu Smad se zdá být mechanismem příznivého účinku rhTM na EMT, protože myši TGFb1-TG a primární podocyty ošetřené rhTM vykazovaly významně sníženou fosforylaci Smad2 a Smad3 ve srovnání s neléčenými stavy. Tato zjištění podporují inhibiční aktivitu TM na EMT.

Receptorové zprostředkování v ochranné aktivitě rhTM

Předchozí studie ukázaly, že GPR15 nebo FGFR1 zprostředkovává cytoprotektivní aktivitu TM.26,27,54 Testovali jsme, zda tyto receptory zprostředkovávají ochrannou aktivitu rhTM proti apoptóze a EMT. Zatímco downregulace proteinu GPR15 pomocí siRNA úplně zrušila supresivní aktivitu rhTM na apoptózu podocytů zprostředkovanou TGFb1-, ani FGFR1 siRNA ani její inhibitor ji nezrušily, což naznačuje, že GPR15 zprostředkovává ochrannou aktivitu rhTM. V kultivovaných podocytech a podocytech izolovaných z myší TGFb1-TG po léčbě rhTM byla zvýšená fosforylace Akt, což naznačuje zapojení intracelulární dráhy Akt. Práce ukazující, že rhTM aktivuje dráhu Akt v endoteliálních buňkách, podporuje toto zjištění.55 Aktivace signální dráhy Akt může dále potencovat účinek rhTM zvýšením povrchové exprese GPR15.56 Tato pozorování naznačují, že rhTM chrání podocyty před apoptózou v našem TGFb{ {13}} TG myši aktivací osy GPR15/Akt, což vede ke zvýšené expresi antiapoptotických faktorů a snížené expresi proapoptotických faktorů.57 Na druhou stranu předchozí studie prokázaly, že anafylatoxiny C3a a C5a prostřednictvím jejich GPR mohou přispívat k CKD poškozením podocytů a že APC může inhibovat apoptózu podocytů a fibrózu ledvin prostřednictvím svého endoteliálního receptoru proteinu C a receptoru aktivovaného proteázou 1.23,58–61 Zde jsme zjistili, že rhTM inhibuje systém komplementu a zvyšuje tvorbu APC. Proto kromě aktivace dráhy GPR15/Akt může inhibice faktorů komplementu a zvýšená aktivace proteinu C a jeho receptorů také vysvětlit příznivé účinky rhTM v našem TGFb1-sdruženémmodel ledvinové fibrózy.

Kromě toho downregulace GPR15, ale nikoli FGFR1, blokovala inhibiční účinek rhTM na EMT, což naznačuje, že GPR15 také zprostředkovává tuto ochrannou aktivitu rhTM. Inhibice proteinů Smad se podílí na supresi EMT, protože léčba pomocí rhTM inhibovala fosforylaci Smad2 i Smad3 u TGFb1-TG myší a kultivovaných podocytů. Přesný mechanismus inhibice proteinu Smad prostřednictvím GPR15 však není jasný. Některé důkazy ukazují, že dráha Akt může přeslechnout a regulovat signální dráhu Smad62–64 a že Akt může zabránit fosforylaci látky Smad3 přímou interakcí s nefosforylovaným Smad3, aby ji sekvestroval mimo jádro, což vede k inhibici transkripce a EMT.62– 64 Na základě těchto zpráv je možné si představit, že Akt aktivovaný po vazbě rhTM na GPR15 sekvestruje nefosforylovaný Smad3, což vede k inhibici EMT podocytů. Stojí za zmínku, že tento příznivý účinek zprostředkovaný Akt je pozorován pouze u nemaligních buněk.65–67 U maligních buněk může interakce TGFb1 s jeho receptory přímo aktivovat fosfoinositidovou 3-kinázovou/Akt/Snail dráhu a způsobit EMT.65–67 Celkově výsledky naší studie podporují úlohu GPR15 jako receptoru zprostředkujícího příznivé účinky rhTM na podocyty.

Závěr

V souhrnu zde poprvé uvádíme novou transgenní myš TG nadměrně exprimující celý lidský gen TGFb1 specificky v glomerulech, u kterých se rozvine spontánní a progresivní glomerulární skleróza, tubulointersticiální fibróza aselhání ledvina zlepšení prokázané fibrózy ledvin/selhání ledvin interakcí rhTM s GPR15, která inhibuje apoptózu a mezenchymální přechod podocytů.

METODY

Generování myši TGFb1 BAC TG

Myš TGFb1-BAC-TG exprimující lidský gen TGFb1 plné délky pod kontrolou myšího podocinového promotoru byla vytvořena pronukleární injekcí do 392 myších embryí C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Tokio, Japonsko). Hodnotili jsme zakladatele TG a přenos zárodečné linie konstruktu BAC TG pomocí Southern blotting (doplňkové materiály a metody).

Pokusná zvířata

Myši TGFb{0}}TG byly před použitím v experimentech chovány po více než 10 generací na pozadí C57BL/6. Jako kontrolní zvířata byla použita WT sourozenci. Všechna zvířata byla chována ve specifickém prostředí bez patogenů a vystavena 12-hodinovému cyklu světlo-tma při okolní teplotě a vlhkosti v rozmezí od 22 stupňů do 26 stupňů a 40 procent a 70 procent a s přístupem ad libitum na jídlo a vodu ve zvířecím domě Mie University (doplňkové materiály a metody).

Etické prohlášení

Výbor pro bezpečnost experimentů s rekombinantní DNA (schválení č. I-629; datum: 19. září 2013) a Výbor pro vyšetřování zvířat Mie University (č. schválení 27-4; datum: 19. srpna 2015) schválil protokoly studie. Všechny postupy na zvířatech byly provedeny v souladu s institucionálními směrnicemi Mie University a podle mezinárodně schválených zásad péče o laboratorní zvířata publikovaných Národním zdravotním ústavem (https://olaw.nih.gov/).

Pro klinickou zkoušku dali všichni pacienti a zdraví jedinci písemný informovaný souhlas a protokol studie byl schválen Etickou komisí pro klinické vyšetřování Mie University (schválení č. 1043 a 2194).

Experimentální design

Pro charakterizaciledvinamodel fibrózy, rozdělili jsme samce myší TGFb{{0}}TG myší (n=24) a samce myší WT (n=12) ve věku 4 týdnů a s hmotností 20 až 23 g do 3 skupiny s 8 TGF b1-TG myšmi a 4 WT myšmi v každé skupině. Myši z každé skupiny WT a TGFb1-TG byly usmrceny v týdnech 0, 8 nebo 16, aby byly odebrány vzorky moči, krve a ledvin pro posouzení změn parametrů fibrózy a renálních funkcí v průběhu času.

K vyhodnocení terapeutické účinnosti rhTM (rhTM laskavě poskytla společnost Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokio, Japonsko) u renální fibrózy, TGFb1-TG myší (n= 8) nebo WT sourozenců (n {{2 }}) byli léčeni rhTM (3 mg/kg) ip injekcí, 3krát týdně během 4 týdnů před usmrcením myší. Jako negativní kontrolní myši byly použity TGFb1-TG myši (n =8) nebo WT sourozenci (n= 8), kterým bylo podáváno stejné množství fyziologického SAL ip injekcí.

Protokol této studie se řídil pokyny Animal Research: Reporting of In vivo Experiments (ARRIVE) pro výzkum na zvířatech. Myši byly randomizovány a výzkumníci, kteří měřili parametry, byli zaslepeni vůči léčebným skupinám.

Biochemická analýza

Koncentrace celkového proteinu (BCA proteinový test; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), monocytární chemoatraktant protein-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombinový antitrombinový komplex (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) byly měřeny za použití komerčních enzymových imunoanalytických souprav podle pokynů výrobce (doplňkové materiály a metody).

Buněčná kultura

Primární buňky lidských podocytů byly zakoupeny od CELPR OGEN (Torrance, CA). Primární buňky lidských podocytů byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagle médiu ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2 při 37 stupních. Médium bylo doplněno 10 procenty tepelně inaktivovaného fetálního hovězího séra (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 IU/ml penicilinu, 100 mg/ml streptomycinu a L-glutaminu (doplňkové materiály a metody).

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako medián ± interkvartilní rozmezí. Statistický rozdíl mezi proměnnými byl vypočten Kruskal-Wallisovou analýzou rozptylu s post hoc analýzou pomocí Dunn testu. Pro hodnocení rozdílů mezi 2 skupinami byl použit Mann-Whitney U test. Statistické analýzy byly provedeny pomocí GraphPad Prism verze 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Statistická významnost byla považována za P <>

ZVEŘEJNĚNÍ

EKG, CND-G a YY mají patent na myš TGFb1-TGrenální fibrózapoužité v této studii. CND-G a YY získaly na tuto studii grant od Ministerstva školství, kultury, sportu, vědy a technologie Japonska. ECG, TY, CND-G a MT získaly grant od Shionogi Pharmaceuticals. Všichni ostatní autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.

PODĚKOVÁNÍ

Tento výzkum byl částečně podpořen granty Ministerstva školství, kultury, sportu, vědy a technologie Japonska (Kakenhi č. 17K09824 pro YY; Kakenhi č. 17K08442 pro CND-G) a částečně grantem od Shionogi & Co, Ltd., Japonsko. Investoři nehráli žádnou roli v návrhu studie, analýze dat, rozhodování o publikování nebo přípravě rukopisu.

Část této práce byla publikována v abstraktní formě.

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

AT připravil model nemoci a napsal první návrh rukopisu. TY, KN, TT, RI a CND-G připravily modely onemocnění a měřené parametry. AM a SW provedli transmisní mikroskopickou studii. MT, YO a AU měřily parametry a prováděly experimenty in vitro. YT, LQ, TK a VFD poskytly intelektuální příspěvky. YY a EKG opravily návrh rukopisu a navrhly studii.

cistanche pro příznaky selhání ledvin

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF) Doplňkové materiály a metody.

Tabulka S1. Charakteristika předmětů.

Tabulka S2. Primery pro RT-PCR myších tkání.

Tabulka S3. Primery pro RT-PCR lidských podocytů.

Obrázek S1. Rozpustné fragmenty trombomodulinu u pacientů s DM korelují s TGFb1 a kreatininem.

Obrázek S2. Lidský TGFb1 – bakteriální umělý chromozom (BAC) konstrukt. Obrázek S3. Myši zakladatele exprimující celou délku lidského genu TGFb1.

Obrázek S4. Charakterizace glomerulus-specifického transformačního růstového faktoru b1 transgenní myši.

Obrázek S5. Lidská transgenní myš TGFb1 má zvýšené markery poškození ledvin.

Obrázek S6. Terapie rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) omezuje proces vymývání podocytů na nohou a ztluštění bazální membrány glomerulů.

Obrázek S7. TGFb1 transgenní myši léčené rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) mají nízkou koncentraci profibrotických faktorů a HMGB1 v renální tkáni. Obrázek S8. Terapie rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) zvyšuje tvorbu aktivovaného proteinu C, inhibuje systém komplementu, snižuje cirkulující rozpustný podocin, i když nemá žádný vliv na koagulační systém u TGFb1 transgenních myší.

Obrázek S9. Terapie rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) snižuje koncentraci podocinu v moči.

Obrázek S10. Terapie rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) snižuje apoptózu glomerulárních buněk.

Obrázek S11. Léčba fibrózy ledvin související s nadměrnou expresí TGFb{1}} pomocí rekombinantního lidského trombomodulinu (rhTM) inhibuje apoptózu v renální tkáni.

Obrázek S12. Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) zvyšuje expresi antiapoptotických faktorů v podocytech.

Obrázek S13. Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) potlačuje apoptózu podocytů indukovanou peroxidem vodíku.

Obrázek S14. Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) potlačuje apoptózu podocytů vyvolanou vysokými hladinami glukózy.

Obrázek S15. Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) zvyšuje aktivaci Akt drah v podocytech.

Obrázek S16. Terapie rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) zvyšuje fosforylaci Akt v podocytech myší TGFb1-TG.

Obrázek S17. Podocyty z každé léčené skupiny myší exprimují GPR15 mRNA.

Obrázek S18. Barvení GPR15 v podocytech od zdravého jedince a pacienta s fokální segmentální glomerulosklerózou.

Obrázek S19. Receptor fibroblastového růstového faktoru-1 se nepodílí na inhibiční aktivitě rekombinantního lidského trombomodulinu (rhTM) v podocytech.

Obrázek S20. Rekombinantní lidský trombomodulin (rhTM) inhibuje epiteliálně-mezenchymální přechod podocytů.

Obrázek S21. Terapie rekombinantním lidským trombomodulinem (rhTM) inhibuje expresi a-aktinu hladkého svalstva v renálních tubulech.

Obrázek S22. Receptor spojený s G-proteinem (GPR15) zprostředkovává inhibiční aktivitu rekombinantního lidského trombomodulinu (rhTM) na epiteliálně-mezenchymální přechod podocytů.

Doplňkové reference.

REFERENCE

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Chronické onemocnění ledvin. Lanceta. 2017;389:1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Hodnocení globálního stavu zdravotní péče o ledviny. JAMA. 2017;317:1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Globální zdraví ledvin 2017 a dále: plán pro odstranění mezer v péči, výzkumu a politice. Lanceta. 2017;390:1888–1917.

4. Ackland P. Prevalence, detekce, hodnocení a léčba chronického onemocnění ledvin. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Léčba chronického onemocnění ledvin. Kidney Int. 2012;81:351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Příští generace terapeutik pro chronické onemocnění ledvin. Nat Rev Drug Discov. 2016;15:568–588.

7. Liu Y. Renální fibróza: nové pohledy na patogenezi a terapeutika. Kidney Int. 2006;69:213–217.

8. Liu Y. Buněčné a molekulární mechanismy renální fibrózy. Nat Rev Nephrol. 2011;7:684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Omezení endoteliální signalizace TGF-beta je dostatečné ke snížení endoteliálně-mezenchymálního přechodu a fifibrózy u CKD. J Am Soc Nephrol. 2015;26:817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, a kol. Signalizace TGF-beta1/p53 v renální fifibrogenezi. Cell Signál. 2018;43:1–10.

11. Conway EM. Trombomodulin a jeho role při zánětech. Semin Immunopathol. 2012;34:107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomodulin a vaskulární endotel: pohledy na funkční, regulační a terapeutické aspekty. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Trombomodulin spojuje koagulaci se zánětem a imunitou. Curr drogové cíle. 2012;13:421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Trombomodulin inhibuje aktivaci eozinofilů a žírných buněk. Cell Immunol. 2015;293:34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Inhibice alergického bronchiálního astmatu trombomodulinem je zprostředkována dendritickými buňkami. Am J Respir Crit Care Med. 2011;183:31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Duální modulační funkce trombomodulinu v alternativní dráze komplementu. Biosci Trends. 2016;10:231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, a kol. Trombomodulin moduluje dendritické buňky jak prostřednictvím antagonismů proteinu B1 skupiny s vysokou mobilitou, tak prostřednictvím nezávislého mechanismu. Allergol Int. 2014;63:57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Doména trombomodulinu podobná lektinu interferuje s aktivací komplementu a chrání před artritidou. J Thromb Haemost. 2006;4:1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT a kol. Rozpustný trombomodulin chrání ischemické ledviny. J Am Soc Nephrol. 2009;20:524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Lektinu podobná doména trombomodulinu zlepšuje diabetickou glomerulopatii prostřednictvím inhibice komplementu. Thromb Haemost. 2012;108:1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL a kol. Trombomodulinová doména 1 zlepšuje diabetickou nefropatii u myší prostřednictvím zánětu zprostředkovaného anti-NF-kappaB/NLRP3 zánětem, zvýšením antioxidační aktivity NRF2 a inhibicí apoptózy. Diabetologie. 2014;57:424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Aktivita rozpustného trombomodulinu a rozpustný antigen trombomodulinu v plazmě. J Thromb Haemost. 2005;3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Exogenní aktivovaný protein C inhibuje progresi diabetické nefropatie. J Thromb Haemost. 2012;10:337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Zlepšení diabetu proteinem S. Diabetes. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptóza a akutní poškození ledvin. Kidney Int. 2011;80:29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK a kol. FGFR1 zprostředkovává angiogenezi indukovanou rekombinantní trombomodulinovou doménou. Cardiovasc Res. 2015;105:107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, a kol. Pátá oblast trombomodulinu podobná epidermálnímu růstovému faktoru zmírňuje sepsi indukovanou LPS prostřednictvím interakce s GPR15. Thromb Haemost. 2017;117:570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, a kol. Celogenomová identifikace genů nezbytných pro cytoskelety podocytů na základě jednobuněčného sekvenování RNA. Kidney Int. 2017;92:1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, a kol. Kanonická signalizace BMP v tubulárních buňkách zprostředkovává zotavení po akutním poškození ledvin. Kidney Int. 2019;95:108–122.

30. Nangaku M. Chronická hypoxie a tubulointersticiální poranění: poslední společná cesta k terminálnímu selhání ledvin. J Am Soc Nephrol. 2006;17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Chronické onemocnění ledvin a jeho komplikace. Prim Care. 2008;35:329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA a kol. Renální exprese proteinů fibrotické matrice a izoforem transformujícího růstového faktoru-beta (TGF-beta) u TGF-beta transgenních myší. J Am Soc Nephrol. 1999;10:271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Motorický protein Myo1c reguluje signalizaci transformačního růstového faktoru beta a fibrózu v podocytech. Kidney Int. 2019;96:139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, a kol. Endotelinový receptor-A zprostředkovává degradaci glomerulární endoteliální povrchové vrstvy prostřednictvím patologického přeslechu mezi aktivovanými podocyty a glomerulárními endoteliálními buňkami. Kidney Int. 2019;96:957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY a kol. Glomerulární poškození endoteliálních buněk a cross talk u diabetického onemocnění ledvin. Am J Physiol Renální Physiol. 2015;308:F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA a kol. Modifikovaná rastrovací elektronová mikroskopie odhaluje patologické přeslechy mezi endoteliálními buňkami a podocyty na myším modelu membranoproliferativní glomerulonefritidy. Sci Rep. 2018;8:10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Proximální tubulární buňky podporují fifibrogenezi indukcí peritubulárních myofifibroblastů zprostředkovanou TGF-beta1-. Kidney Int. 2002;61:2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL a kol. Poškození ledvinových tubulů: hnací síla směrem k chronickému onemocnění ledvin. Kidney Int. 2018;93:568–579.

39. Loefflfler I, Wolf G. Transformující růstový faktor-beta a progrese onemocnění ledvin. Transplantace nefrolového číselníku. 2014;29(suppl 1):i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Močový transformující růstový faktor-beta u pacientů s glomerulárními chorobami. Pediatr Nephrol. 1997;11:334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Inhibice buněčné apoptózy a zlepšení plicní fibrózy trombomodulinem. Am J Pathol. 2017;187:2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Rekombinantní lidský trombomodulin při akutní exacerbaci idiopatické plicní fibrózy. Hruď. 2015;148:436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Trombomodulin pro akutní exacerbace idiopatické plicní fibrózy: důkaz studie konceptu. Pulm Pharmacol Ther. 2014;29:233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimální výběr pacientů pro antikoagulační terapii u sepse: návrh z Japonska založený na důkazech. J Thromb Haemost. 2018;16:462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, a kol. Úloha skupiny 1 s vysokou mobilitou (HMGB1) v patogenezi onemocnění ledvin. Acta Pharm Sin B. 2016;6:183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, a kol. Rozdílné účinky trombinu u alergického bronchiálního astmatu závislé na dávce. J Thromb Haemost. 2013;11:1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Nové poznatky o biologii podocytů v glomerulárním zdraví a onemocnění. J Am Soc Nephrol. 2017;28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Dráhy závislé na Smad a nezávislé na Smad v signalizaci rodiny TGF-beta. Příroda. 2003;425:577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mechanismy apoptózy zprostředkované TGF-beta. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Buněčná biologie a patologie podocytů. Annu Rev Physiol. 2012;74:299–323.

51. Isaka Y. Cílení na signalizaci TGF-beta při fibróze ledvin. Int J Mol Sci. 2018;19:2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, a kol. Trombomodulin ovlivňuje přežití pacientů s nemetastatickým kolorektálním karcinomem prostřednictvím epiteliálního-mezenchymálního přechodu (EMT). PLoS One. 2016;11:e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B a kol. Trombomodulin snižuje tumorigenní a metastatický potenciál buněk rakoviny plic up-regulací E-cadherinu a down-regulací exprese N-cadherinu. Biochem Biophys Res Commun. 2016;476:252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, a kol. Receptor 15 spojený s G-proteinem zprostředkovává angiogenezi a cytoprotektivní funkci trombomodulinu. Sci Rep. 2017;7:692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH a kol. Rekombinantní trombomodulin vykazuje anti-autofagický účinek v endoteliálních buňkách a poskytuje antiaterosklerózní účinek u myší s deficitem apolipoproteinu E. Sci Rep. 2017;7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B a kol. Povrchová exprese proteinu zprostředkovaná signalizací PI3K/Akt snímaná interagujícím motivem 14-3-3. FEB J. 2009;276:5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Dvojí úloha TGF-beta1 v apoptóze. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16:15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovič BV, Mosnier LO. Aktivovaný protein C, proteázou aktivovaný receptor 1 a neuroprotekce. Krev. 2018;132:159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. Aktivovaný protein C chrání před diabetickou nefropatií inhibicí apoptózy endotelu a podocytů. Nat Med. 2007;13:1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Role anafylatoxinů ve zdraví a nemoci. Mol Immunol. 2009;46:2753–2766.

61. Morigi M., Perico L., Corna D. a kol. Blokáda C3a receptoru chrání podocyty před poškozením při diabetické nefropatii. JCI Insight. 2020;5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, a kol. Akt interaguje přímo se Smad3 a reguluje citlivost na apoptózu indukovanou TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004;6:366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Spolupráce signální dráhy při TGF-beta-indukovaném epiteliálně-mezenchymálním přechodu. Curr Opin Cell Biol. 2014;31:56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt moduluje signalizaci TGF-beta prostřednictvím přímé interakce se Smad3. Nat Cell Biol. 2004;6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-beta podporuje signalizaci PI3K-AKT a migraci buněk rakoviny prostaty prostřednictvím ubikvitylace p85alfa zprostředkované TRAF6-. Sci Signál. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z a kol. Dichotomické účinky signalizace Akt u rakoviny prsu. Mol Cancer. 2012;11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, a kol. Signalizace FAM83A indukuje epiteliální mezenchymální přechod cestou PI3K/AKT/Snail u NSCLC. Stárnutí (Albany NY). 2019;11:6069–6088.