[ 18F]-fluorid sodný autoradiografické zobrazení nefrokalcinózy u dárcovských ledvin a explantovaných ledvinových aloštěpů

ali.ma@wecistanche.com

Stan Benjamens 1,2*, Ines F.Antunes2, Jan‑Luuk Hillebrands3, Melanie Reijrink4, Marian LC Bulthuis3, Stefan P. Berger5, Cyril Moers1, Martin H. de Borst5, Riemer HJA Slart2,6 & RobertA. Pol1

Nefrokalcinózaje přítomen až ve 43 procentechledvinabiopsie štěpu jeden rok po transplantaci a je spojena s horší funkcí štěpu a špatným přežitím štěpu. Studovali jsme [18F]-fluorid sodný ([18F]-NaF) zobrazování mikrokalcifikací v ledvinách dárců (n= 7) a explantovaliledvinaaloštěpy (n= 13). Pro histologické hodnocení kalcifikace (Alizarin Red; Von Kossa barvení) a ex-vivo [18F]-NaF autoradiografii byly použity tři um sériové řezy zalité v parafínu. Obrázky byly sloučeny, aby se vyhodnotilo, zda oblasti mikrokalcifikace odpovídají oblastem příjmu [18F]-NaF. Na základě histologických analýz byly tubulointersticiální a glomerulární mikrokalcifikace přítomny v 19/20 a 7/20 vzorků. Pomocí autoradiografie bylo vychytávání [18F]-NaF zjištěno v 19/20 vzorcích, s významně vyšší aktivitou indikátoru vledvinaaloštěp ve srovnání se vzorky ledvin od zemřelého dárce (p {{0}}.019). Barvení aktivních mikrokalcifikací alizarinovou červení prokázalo dobrou korelaci (Spearmanovo rho 0,81, p < 0,001)="" a="" von="" kossa="" barvení="" konsolidovaných="" kalcifikací="" prokázalo="" významnou,="" ale="" slabou="" korelaci="" (0,62,="" p="0,003)" s="" aktivitou="" [18f]-naf.="" tato="" korelace="" mezi="" ex-vivo="" absorpcí="" [18f]-naf="" a="" histologicky="" ověřenými="" mikrokalcifikacemi="" je="" prvním="" krokem="" k="" zobrazovací="" metodě="" k="" identifikaci="" mikrokalcifikací="" v="">nefrokalcinóza. To může vést k lepšímu pochopení etiologie mikrokalcifikací a jejich vlivu na funkci transplantace ledvin.

Kliknutím zobrazíte výhody extraktu z cistanche při onemocnění ledvin

Nefrokalcinóza, definovaná jako parenchymální a tubulární depozice šťavelanu vápenatého (CaOx) nebo fosforečnanu vápenatého (CaPhos), je důležitým faktorem při poklesu funkce štěpu poledvinatransplantace1–3. Ukládání CaOx a CaPhos je připisováno vysokým hladinám sérového oxalátu, sérového vápníku a sérového fosfátu u pacientů s chronickouledvinaonemocnění a/nebo hyperparatyreóza4,5. Výskytnefrokalcinóza, na základě biopsií aloštěpu ledviny, je 6 procent po 6 měsících, 25–43 procent po jednom roce a až 79 procent po 10- letech poledvinatransplantace5–7. Studie zaměřené na biopsie aloštěpu ledviny během jednoho roku po transplantaci prokázaly souvislost mezi časnou přítomností depozice vápníku a horší funkcí grafu a špatným přežitím grafu4,8,9. Nicméně, zda tyto mikrokalcifikace hrají aktivní roli v dysfunkci aloštěpu nebo jsou pouze indikátory deregulovaného minerálního metabolismu, zůstává nejasné.

K datu,ledvinabiopsie aloštěpu jsou jedinou diagnostickou metodou pro hodnocení potransplantačních mikrokalcifikací. Neinvazivní a spolehlivý diagnostický přístup by umožnil opakovaná měření, usnadnil sledování kalcifikací v průběhu času a intervenční studie s potenciálním zlepšením výsledků funkce štěpu a přežití štěpu po transplantaci ledvin10.

Zobrazování pozitronovou emisní tomografií/počítačovou tomografií (PET/CT) s [18F]-fluoridem sodným ([18F]-NaF) se používá v klinické praxi a experimentálních studiích jako skeletální a vaskulární zobrazovací modalita11–15. Zatímco spolehlivou vizualizaci vaskulárních mikrokalcifikací CT zobrazení brání, výsledky ex-vivo [18F]-NaF microPET zobrazování dobře korelovaly s histologicky ověřenými mikrokalcifikacemi ve vzorcích lidských a zvířecích cév16,17. Výsledky několika prospektivních klinických studií navíc ukázaly, že časná vaskulární aktivita [18F]-NaF dobře souvisí jak s mikrokalcifikacemi detekovanými CT zobrazením, tak i se zvýšením velikosti těchto kalcifikací18–20.

Zde uvádíme výsledky studie proof of concept autoradiografické studie pro ex-vivo použití [18F]-NaF zobrazenínefrokalcinózau dárcůledvinya transplantované ledvinové aloštěpy jako diagnostický přístup pro vizualizaci mikrokalcifikací.

Stůl 1.ledvinycharakteristiky příjemce transplantátu. Žádné případy hyperkalcémie v této kohortě; *klasifikace Banfovy klasifikace patologie aloštěpu—201828; FSGS=fokální segmentální glomeruloskleróza; IFTA=intersticiální fbróza a tubulární atrofie; odpovídající výsledky autoradiografie a histologie jsou uvedeny v doplňku S1.

Tabulka 2. Zesnulýledvinacharakteristiky dárce. *Kardiovaskulární onemocnění definované jako cerebrovaskulární příhoda, infarkt myokardu, cévní onemocnění vyžadující invazivní intervenci; **jak poznamenal tým pro zadávání zakázek; Odpovídající výsledky autoradiografie a histologie jsou uvedeny v doplňku S2; žádné dárce s diabetes mellitus.

Výsledek

Vzorová kohorta.

Třináctledvinavzorky byly získány po transplantektomii, s mediánem 33 [IQR 9–66] měsíců po transplantaci, od příjemců transplantátu s mediánem věku 51 [IQR 30–64] let. Transplantektomie byla provedena pro rejekci aloštěpu (Banf IIA a IIB) u sedmi pacientů, chronickou arteriopatii aloštěpu u dvou pacientů, infekci aloštěpu u dvou pacientů, primární nefunkčnost jednoho pacienta a intersticiální fbrózu a tubulární atrofii stupně III u jednoho pacienta. Osm ze 13 (61,5 procenta) pacientů mělo hyperparatyreózu, sedm (53,8 procenta) mělo hyperfosfatemii, pět (38,5 procenta) mělo diabetes mellitus a žádný z těchto pacientů neměl známkynefrokalcinózana klinickém ultrazvuku nebo anamnéze ledvinových kamenů (tab. 1). Bylo získáno sedm vzorků ledvin od zemřelých dárců od dárců s mediánem věku 65 [IQR 64–71] let. Čtyři ze sedmi (57,1 procenta) dárců měli v anamnéze kardiovaskulární onemocnění, žádný neměl diabetes mellitus a šest ze sedmi (85,7 procenta) mělo při vizuální kontrole aterosklerózu ledvinových cév, což jsou potenciální faktory pro úbytek těchto dárců.ledviny(Tabulka 2).

Obrázek 1. Autoradiografický snímek absorpce [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) (A), s překryvným snímkem absorpce [18F]-NaF s barvením mikrokalcifikací alizarinovou červení (B) a von Kossa barvením kalcifikací (C).

Autoradiografie a histologie.

With autoradiography, [ 18F]-NaF uptake was identified in 19 out of 20 samples, with a median tracer surface area of 0.81% [IQR 0.27–5.19%]. A tracer surface area of≤5% was seen in 15 (75%) and of>5 procent v 5 (25 procent) z 20 vzorků (obr. 1 a obr. 2A) (doplňkové S1 a doplňkové S2, zobrazující autoradiografii a překryvné snímky pro všechny vzorky). Počet oblastí [18F]-NaF byl výrazně vyššíledvinavzorky aloštěpu ve srovnání se zemřelým dárcemledvinavzorků s mediánem 7.{1}} [IQR 4.0–15,5] a 2.{7}} [IQR 1.0–6.0 ], respektive (p=0.019) (doplňkové S3).

Tubulointersticiální mikrokalcifikace, vizualizované barvením alizarinovou červení, byly přítomny v 19 ze 20 vzorků, s mediánem 5,5 [IQR 2–10.3] na vzorek, a glomerulární mikrokalcifikace byly pozorovány v sedmi ze 20 vzorků, s mediánem 1 [IQR 1–3] na vzorek (obr. 2B). U vzorků ledvinových aloštěpů byl pozorován významně vyšší počet mikrokalcifikací ve srovnání se vzorky ledvin od zemřelých dárců, s mediánem 9.0 [IQR 5.0–20,5] a 4,0 [IQR 1,0–4,0], respektive (p=0,046) (doplňkové S3). Při barvení Von Kossa byly tubulointersticiální kalcifikace pozorovány u 18 z 20 vzorků, s mediánem 2,5 [IQR 1–5] na vzorek, a glomerulární kalcifikace byly pozorovány v sedmi z 20 vzorků, s mediánem 1 [IQR 0–3 ] na vzorek (obr. 2C). Počet kalcifikací se mezi nimi významně nelišilledvinavzorky aloštěpu a vzorky ledvin od zemřelého dárce, s mediánem 4.0 [IQR 2.0–6.0] a 2.0 [IQR 2.{101} {9}}–7.0], respektive (p=0.311) (doplňkové S3). Reprodukovatelnost mezi pozorovateli byla identifikována mezi vizuální a poloautomatickou detekcí kalcifikací, s ICC 0,94 (95% CI 0,85–0,98) pro barvení alizarinovou červení a 0,77 (95 procent CI 0,42–0,91) pro barvení Von Kossa.

Překryvné snímky výsledků autoradiografie a histologie ukázaly společnou lokalizaci vychytávání [18F]-NaF s barvením alizarinovou červení pro mikrokalcifikaci (obr. 1B). Pro srovnání, překryvné snímky vychytávání [18F]-NaF a Von Kossa barvení kalcifikací ukázaly vychytávání v oblastech bez histologicky prokázaných kalcifikací (obr. 1C). Falešně negativní absorpce [18F]-NaF, jako procento histologicky ověřených (mikro)kalcifikačních oblastí mimo překrytí, byla střední hodnota 0 procent [IQR 0–25 procent] pro červené oblasti alizarinu a medián 100 procent [65–100 procent ] pro oblasti Von Kossa. Barvení mikrokalcifikací alizarinovou červení prokázalo dobrou korelaci s absorpcí [18F]-NaF (Spearmanovo rho 0,81 (95% CI 0,57–0,92), p< 0.001),="" whereas="" von="" kossa="" staining="" demonstrated="" weak="" correlation="" with="" [="" 18f]-naf="" uptake="" (0.62="" (95%="" ci="" 0.24–0.84),="" p="0.003)" (fig.="" 3).="" significant="" differences="" in="" the="" number="" of="" (micro)="" calcifications,="" by="" alizarin="" red="" (median="" 4.0="" [iqr="" 3.0–8.0]="" versus="" 34.0="" [iqr="" 19.0–41.0],=""><0.001) and="" von="" kossa="" (median="" 2.0="" [iqr="" 2.0–4.0]="" versus="" 6.0="" [5.5–9.5],="" p="0.004)" staining,="" were="" observed="" between="" samples="" with="" ≤5%="" and="">5 procent vychytávání [18F]-NaF (obr. 4).

Obrázek 2. Překryvný obrázek příjmu [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) a mikrokalcifikace (Alizarinová červeň) (A), s barvením alizarinovou červení pro mikrokalcifikace (B) a von Kossovým barvením pro kalcifikace (C).

Charakteristika příjemce v době transplantektomie.

Nebyly mezi nimi pozorovány žádné rozdílyledvinavzorky alografu od pacientů s (n{{0}}) nebo bez hyperfosfatémie (n=6), pro počet oblastí [18F]-NaF (medián 5.0 [IQR 2.{11}}–11,8] versus 7.{13}} [7.{15}{15}}–23.0], p=0.170) , alizarinová červená (medián 7,5 [IQR 5.0–14.0] oproti 12.{29}} [3.0–34.0], p{{30}}.390) a Von Kossa (medián 5.{51}} [IQR 3,5–6,3] oproti 3.{53}} [2.{51} {59}}–5.0], p=0.247). Srovnání vzorků ledvinových alografů od pacientů s (n=8) nebo bez (n=5) hyperparatyreózou neukázalo rozdíly v počtu oblastí [18F]-NaF (medián 7.0 [IQR 4.{7} 79}} [IQR 6.0–11.0] versus 1{{103}}.{117}} [3,5–32,8], s{{76 }},769) a Von Kossa (medián 4.{119}} [IQR 1,5–5.{125}}] versus 4,5 [2.0–6,8], p{{9{{ 131}}}}.505). Mezi vzorky ledvinových alografů od pacientů s (n=5) nebo bez (n=8) diabetes mellitus nebyly identifikovány významné rozdíly v počtu oblastí [18F]-NaF (medián 5,5 [IQR 2,5– a Von Kossa (medián 3,0 [IQR 2,0–5,8] oproti 4,0 [3,5–8,5], p=0 0,284). V době mezi transplantací a transplantektomií (měsíce) nebyly pozorovány žádné významné korelace s počtem oblastí [18F]-NaF (p=0.586), alizarinovou červení (p=0.667) a Von Kossa (s=0.459). Pro věk v době transplantace nebyly pozorovány žádné významné korelace s počtem oblastí [18F]-NaF (p=0.902), alizarinovou červení (p=0.798) a von Kossa (p =0.334). Podobně nebyly pozorovány žádné významné korelace mezi délkou vytáčení (měsíce) pozdějiledvinaselhání allografu a počet oblastí [18F]-NaF (p=0.481), alizarinová červeň (p=0.565) a Von Kossa (p=0.174).

Obrázek 3. Korelace počtu oblastí [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) s mikrokalcifikacemi obarvenými alizarinovou červení (A) a kalcifikacemi obarvenými von Kossou (B).

Figure 4. Differences between two groups,≤5% and>5 procent plochy povrchu indikátoru [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF), pro počet mikrokalcifikací obarvených alizarinovou červení (A) a von Kossa, obarvených kalcifikací (B) (medián, mezikvartilní rozmezí).

Diskuse

V tomto důkazu koncepční studie ex-vivo vychytávání [18F]-NaF u člověkaledvinavzorky parenchymu prokázaly dobrou korelaci s histologicky ověřenými mikrokalcifikacemi. Příjem [18F]-NaF koreloval silněji s barvením alizarinovou červení u aktivních mikrokalcifikací ve srovnání s Von Kossovým barvením konsolidovaných kalcifikací, což naznačuje roli zobrazování [18F]-NaF při identifikaci oblastí raného stadia nefrokalcinózy.

Prezentované vzorky představují směs dárcovských ledvin a explantovaných ledvinových aloštěpů. Tyto dva typy vzorků se lišily, pokud jde o vazbu indikátoru, s větším vychytáváním [18F]-NaF pozorovaným ve vzorcích aloštěpu explantovaných ledvin. To je v souladu s předchozími publikacemi, které uvádějí nárůst mikrokalcifikací po transplantaci ledvin5–7. Sdružení znefrokalcinózas horší funkcí štěpu v době biopsie a jeden rok po transplantaci je hlášena ve dvou studiích biopsie aloštěpu ledviny s 258 a 149ledvinapříjemců transplantátu, respektive8,9. Navíc v longitudinální kohortě s 97 příjemci transplantované ledviny je výrazně horší 1-roční a 12-roční přežití štěpu u pacientů s ukládáním kalcium-oxalátu (tj. přežití štěpu 98,6 % oproti 72,5 % a 79,3 procenta oproti 49,7 procenta). V multivariační logistické regresní analýze byla přítomnost kalcium-oxalátových depozit nezávisle spojena se ztrátou grafu, v modelu zahrnujícím mimo jiné kreatinin v době biopsie a typ dárce4. Specifická úloha mikrokalcifikací v této kaskáděledvinapokles funkce aloštěpu zůstává nejasný. V klinickém prostředí před transplantací jsou depozice CaOx připisovány vysokým hladinám sérového oxalátu, což je molekula, která není účinně odstraněna během dialýzy4. Zatímco depozice CaPhos jsou nejčastěji pozorovány u pacientů s hyperparatyreózou a vysokými hladinami sérového vápníku v důsledku poruchy metabolismu minerálů před a po transplantaci5. Nezjistili jsme žádné rozdíly ve výsledcích histologie a autoradiografie pro hyperfosfatemii, hyperparatyreózu, diabetes mellitus, dobu mezi transplantací a transplantektomií a délku dialýzy po selhání aloštěpu ledviny.

Pro vývoj nových léčebných strategií pro aktivní mikrokalcifikace vnefrokalcinózajeho klinický význam s ohledem na (chronické) selhání transplantace je třeba chápat komplexněji. S identifikací cílové populace s vysokým rizikemledvinapříjemcům transplantací mohou být navrženy klinické studie s cílem prozkoumat léčebné strategie21. Možné zaměření lze nalézt v up-regulaci endogenních inhibitorů kalcifikace se specifickým důrazem na osteopontin3.

Vzhledem k vysokému výskytunefrokalcinózaa jeho spojení s funkcí aloštěpu ledviny, je zaručeno lepší pochopení etiologie mikrokalcifikací. Neinvazivní a spolehlivý diagnostický přístup k identifikaci a kvantifikaci mikrokalcifikací u časné nefrokalcinózy by mohl umožnit studie vlivu nefrokalcinózy na funkci transplantace ledvin. Zobrazování [18F]-NaF je zajímavé, protože absorpce [18F]-NaF v lidských a zvířecích vaskulárních vzorcích je zvýšena v biologicky aktivních oblastech kalcifikace předtím, než mohou být tyto oblasti vizualizovány pomocí mikropočítačové tomografie16,17,22. V nedávných klinických studiích PET/CT bylo prokázáno, že vychytávání [18F]-NaF souvisí s progresí vaskulární kalcifikace, což poskytuje klinický důkaz pro použití [18F]-NaF k detekci oblastí s biologicky aktivní kalcifikací18–20. Pozorování v této studii jsou v souladu s těmito předchozími zjištěními v oblasti vaskulárního zobrazování. Byla prokázána dobrá korelace mezi vychytáváním [18F]-NaF a histologicky ověřenými mikrokalcifikacemi, zatímco korelace s konsolidovanými kalcifikacemi byla jasně slabší.

Jak bylo uvedeno, byla identifikována společná lokalizace mezi vychytáváním [18F]-NaF a mikrokalcifikacemi pozitivními na alizarinovou červeň, zatímco oblasti vychytávání [18F]-NaF se nelokalizovaly společně s Von Kossovým barvením konsolidovaných kalcifikací. Tyto kalcifikované oblasti s konsolidovanými kalcifikacemi a bez odpovídající absorpce [18F]-NaF lze považovat za oblasti neaktivní kalcifikace, kde neprobíhá žádný proces mineralizace, jak dříve popsal Irkle et al. v ex-vivo studii kalcifikace karotid16. I když validováno pouze pro vaskulární kalcifikace a ne proledvinakalcifikace parenchymu, je podporována vazebnými vlastnostmi [18F]-NaF k vnějšímu povrchu kalcifikací a omezenou penetrací v pevných kalcifikacích. Proto bude příjem [18F]-NaF vyšší u mikrokalcifikací, s velkým povrchem, ve srovnání s mikrokalcifikacemi, s velkým objemem, ale relativně malým povrchem13,16.

Tento proof of concept study má také určitá omezení. Za prvé, neodmyslitelně patří k designu studie, výsledky představují jediný časový bod bez klinického sledování progrese kalcifikace. Zadruhé, tato studie „proof of concept“ sestává z relativně nízkého počtu vzorků ledvin, protože transplantektomie po pozdním selhání transplantace se provádí pouze na základě klinické indikace a dostupnosti odmítnutého dárce.ledvinypro výzkumné použití je omezeno23. Proto by měla být zvážena komplexní analýza etiologie ukládání vápníku nad rámec tohoto projektu. Za třetí, klinickému překladu výsledků brání nedostatek znalostí o in vivo distribuci [18F]-NaF v ledvinách a vlivu clearance ledvinového indikátoru, tj. nízká aktivita mezi cíli a pozadím by mohla omezit vizualizaci kalcifikací. K vyřešení tohoto problému by měl být posouzen optimální okamžik [18F]-NaF PET zobrazování, tj. kdy je [18F]-NaF skutečně vylučován a zbývající aktivita pochází z vazby na kalcifikované oblasti. Toho lze případně dosáhnout zpožděným zobrazením přesahujícím tři hodiny, jak se provádí pro hodnocení koronárních kalcifikací24. Snížená rychlost glomerulární filtrace zjištěná u příjemců transplantátu by mohla vést k prodloužené vylučovací fázi vyžadující delší období mezi injekcí indikátoru a zobrazením PET, ale současné pokyny nenaznačují potenciální nefrotoxicitu indikátoru [18F]-NaF11,25. Potenciálním krokem mezi zde prezentovaným proof of concept study a in-vivo zobrazením může být ex-vivo [18F]-NaF PET zobrazení normotermních perfundovaných ledvin nebo in vivo [18F]-NaF microPET studie na zvířatech26,27. Za čtvrté, klinická aplikace této techniky by mohla být ztížena náklady na provedení [18F]-NaF PET/CT procedury a inherentní radiační expozicí. Nové digitální PET kamerové systémy s vyšší citlivostí však mohou snížit obojí, a to v důsledku kratší doby skenování a nižší injikované aktivity.

Síla tohoto důkazu koncepční studie spočívá v podrobném individuálním srovnání mikrokalcifikací identifikovaných autoradiografií a histologií [18F]-NaF. Příjem [18F]-NaF v různých vzorcích mohl být porovnán bez potřeby dalších úprav, protože všechny vzorky byly inkubovány ve stejném roztoku [18F]-NaF. Navíc tato studie poskytuje první data ukazující vizuální a statistickou shodu mezi absorpcí [18F]-NaF a histologicky ověřenými mikrokalcifikacemi ve vzorcích ledvin.

Cistanche-funkce ledvin

Na závěr poskytujeme první data pro použití [18F]-NaF v autoradiografické studii k identifikaci mikrokalcifikací v aktivnímnefrokalcinózapoledvinatransplantace. Tato ex-vivo [18F]-NaF proof of concept studie je prvním krokem k potenciální aplikaci klinického [18F]-NaF PET/CT u příjemců transplantátu ledviny.

Metody

ČlověkledvinaVzorky.

Tkáň ledvin byla získána po transplantektomii (n=13) a z vyřazených ledvin od zemřelých dárců (n=7) v případě poklesu ledviny dárce přidruženými transplantačními centry. Klinická data od příjemců transplantovaných ledvin a dárců byla získána z lékařských záznamů pacientů, včetně přítomnosti hyperparatyreózy, hyperfosfatemie a diabetes mellitus před transplantektomií, a klinického patologického hodnocení vzorků ledvinových aloštěpů hlášených pomocí Banfovy klasifikace renální aloštěpové patologie28. Výzkumné aktivity byly prováděny v souladu s deklarací Helsinských etických principů pro lékařský výzkum zahrnující lidské subjekty a Institucionální kontrolní komise tuto studii schválila (Medical Ethical Committee University Medical Center Groningen 2015/501). Od všech příjemců transplantátu byl získán informovaný souhlas a byl dán souhlas před darováním pro použití vyřazených ledvin od zemřelých dárců pro výzkumné účely. Klinické a výzkumné aktivity byly v souladu se zásadami Istanbulské deklarace, jak je uvedeno v Istanbulské deklaraci o obchodování s orgány a transplantační turistice.

Standardní operační postup (SOP) pro odběr vzorků tkáně byl následující: Vzorky byly odebrány na chirurgickém sále, bezprostředně po extrakci ledviny (pro transplantektomii) nebo při příjezdu vyřazeného dárce.ledvinav našem transplantačním centru. Vzorky použité pro tento experiment byly odebrány v příčné rovině horního pólu, včetně kortikální a medulární ledvinové tkáně, o velikosti mezi 25 mm × 15 mm a 20 mm × 40 mm. Tyto vzorky byly fixovány ve formalínu a zality v parafinu. Pomocí mikrotomového přesného řezacího nástroje byly vyrobeny tři um řezy zalité v parafínu. Tyto řezy byly upevněny na sklo adhezního mikroskopu (TOMO, Matsunami Glass, USA). Sériové sekce, tj. sousední sekce, které odhalují sekvenční vrstvyledvinavzorky tkáně, byly použity pro autoradiografii a histologickou analýzu. Před inkubací indikátoru a histologickým barvením byly řezy zbaveny parafínu, rehydratovány v demineralizované vodě a dočasně uloženy ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS).

[18F]-NaF inkubace a autoradiografie.

Experiment ex vivo byl založen na protokolu použitém v předchozích studiích Hop et al. a Reijrink a kol.22,29. První studií je autoradiografická studie vychytávání [18F]-NaF v karotických plátech pacientů po cévní mozkové příhodě podstupujících chirurgický zákrok, s porovnáním indikací kalcifikace na základě CT. Druhá studie je autoradiografická studie vychytávání [18F]-FDG ve vzorcích tukové tkáně s imunohistochemií sériových řezů jako srovnáním. Jeden ze tří sériových řezů byl 30 minut koupán v roztoku [18F]-NaF o koncentraci 618 milibecquerel (MBq) ve 300 ml PBS při teplotě místnosti. Promytí bylo provedeno třikrát propláchnutím studeným PBS a dvakrát studenou vodou. Vzorky byly vysušeny na vzduchu a přes vzorky byla umístěna zaslepená fosforová obrazovka. Expozice byla prováděna přes noc, po dobu 24 hodin a 30 minut. Stanovení distribuce a intenzity tkáňové aktivity bylo provedeno na fosforovém stínítku za použití Amersham Typhoon Biomolecular Imager (GE Healthcare, Marlborough, USA).

Alizarinová červeň a von Kossa barvení.

Barvení alizarinovou červení bylo provedeno pro vizualizaci akumulace vápníku v raném stádiu kalcifikace. Vzorky byly inkubovány ve 2% w/v roztoku alizarinové červeně (rozpuštěné v demineralizované vodě), pH 4,2 po dobu 5 minut30. Promývání bylo prováděno 20x mácháním v 1:1 aceton/xylen a 20x mácháním ve 100% xylenu. Barvení von Kossa bylo provedeno za účelem vizualizace přítomnosti molekul anorganického fosfátu v konsolidovaných kalcifikacích. Stručně řečeno, vzorky byly inkubovány v 1% roztoku dusičnanu stříbrného (AgNO3) po dobu 1 hodiny, přičemž byly vystaveny slunečnímu záření30. Střídavě s trojnásobným propláchnutím v demineralizované vodě byla provedena inkubace s thiosíranem sodným po dobu 5 minut, poté následovala inkubace v jaderné rychlé červeni po dobu 3 minut.

Zpracování a analýzy obrazu.

Obarvené tkáňové řezy byly digitalizovány pomocí Hamamatsu Nanozoomer 2.0HT (Hamamatsu Photonics, Hamamatsu, Japonsko) a snímky byly kontrolovány pomocí softwaru Aperio ImageScope verze 12.1.0.5029 (Leica Microsystems CMS GmbH, Wetzlar, Německo). Autoradiografie a kvantitativní počítačové analýzy obrazu byly provedeny pomocí softwaru ImageJ, verze 1.51 (NIH, Bethesda, Maryland, http://fji.sc).

Odečítání pozadí bylo použito pro všechny histologické snímky a vložilo se obrys na hranici histologického vzorku. Poloautomatická detekce kalcifikací v barvení Alizarinovou červení a Von Kossa byla provedena pomocí ImageJ—BioVoxxel Toolbox31. Pro všechny vzorky byly aplikovány prahové hodnoty a detekované oblasti kalcifikace byly rozšířeny v 6 iteracích, aby se optimalizovala vizualizace. U autoradiografických snímků byla provedena rotace a změna velikosti na základě původních histologických vzorků. Prahové hodnoty byly aplikovány na všechny vzorky, což vedlo k oblastem absorpce traceru, podle přístupu popsaného Irkle et al.: snímky byly prahovány pomocí metody Otsu, poté následovalo gaussovské rozmazání a prahování pomocí metody Li16. Překryvné snímky byly získány porovnáním obrysů ze sousedních histologických snímků s následným porovnáním výsledků histologie a autoradiografie (obr. 1). Kvantifikace kalcifikace a indikační plochy na základě pixelů (jako procento plochy vzorku) byla provedena pomocí nástroje ImageJ—Analyze Particles.

Příznaky onemocnění ledvin Cistanche

Statistické analýzy.

Statistiky byly provedeny pomocí Statistical Package for the Social Sciences verze 23 (IBM Corporation, Armonk NY, USA), grafy byly vytvořeny pomocí GraphPad Prism 7.02 pro Windows (Graph Pad Sofware, San Diego, USA) a obrázky byly vytvořeny pomocí Adobe Illustrator CS6 (Adobe Systems, San Jose, USA). Výsledky byly prezentovány jako medián a interkvartilní rozsah (IQR) pro zkreslená data a jako frekvence a procento, pokud byla data kategorická. Skupiny jsme porovnávali pomocí Mann–Whitney U testů (dvoustranná pvalue<0.05=signifcant) and="" correlation="" analyses="" were="" performed="" using="" the="" spearman="" rank="" test="" (two-tailed="" p-value="" and="" spearman's="" rho).="" true="" and="" false-positive="" rates="" were="" based="" on="" the="" pixel-based="" quantification="" of="" tracer="" and="" histology="" findings.="" to="" assess="" the="" interobserver="" reproducibility="" for="" semi-automated="" detection="" of="" calcifications,="" the="" intraclass="" correlation="" coefficient="" (icc)="" with="" 95%="" confidence="" intervals="" (ci)="" were="">

Dostupnost dat

Zemřelý dárce ledvin aledvinaAutoradiografické snímky příjemců transplantátu vychytávání [18F]-fluoridu sodného ([18F]-NaF) s překryvnými snímky vychytávání [18F]-NaF s barvením mikrokalcifikací Alizarinovou červení a barvením kalcifikací Von Kossou jsou online dostupné jako doplňkové informace. Všechny další údaje budou na vyžádání k dispozici v souladu s předpisy IRB University Medical Center Groningen.

Reference

1. Gwinner, W. a kol. Časná kalcifikace renálních aloštěpů detekovaná protokolárními biopsiemi: příčiny a klinické důsledky. Dopoledne. J. Transplant. 5, 1934–1941 (2005).

2. Shavit, L., Jaeger, P. & Unwin, RJ Co jenefrokalcinóza? Kidney Int. 88, 35–43 (2015).

3. Paloian, NJ, Leaf, EM & Giachelli, CM Osteopontin chrání před vysokým obsahem fosfátůnefrokalcinózaa vaskulární kalcifikace. Kidney Int. 89, 1027–1036 (2016).

4. Pinheiro, HS, Camara, NOS, Osaki, KS, De Moura, LAR & Pacheco-Silva, A. Časná přítomnost ukládání šťavelanu vápenatého vledvinabiopsie štěpu je spojena se špatným dlouhodobým přežitím štěpu. Dopoledne. J. Transplant. 5, 323-329 (2005).

5. Evenepoel, P. a kol. Lokalizace, etiologie a dopad kalciumfosfátových depozit v renálních aloštěpech. Dopoledne. J. Transplant. 9, 2470–2478 (2009).

6. Nankivell, BJ a kol. Přirozená historie chronické aloštěpové nefropatie. N. Engl. J. Med. 349, 2326–2333 (2003).

7. Schwarz, A. a kol. Rizikové faktory pro chronickou aloštěpovou nefropatii po transplantaci ledvin: studie protokolové biopsie. Kidney Int. 67, 341–348 (2005).

8. Bagnasco, SM a kol. Depozita oxalátu v biopsiích z nativních a transplantovaných ledvin a dopad na funkci štěpu. Nephrol. Vytáčení. Transplantace. 24, 1319–1325 (2009).

9. Snijders, MLH, Hesselink, DA, Clahsen-Van Groningen, MC & Roodnat, JI Ukládání oxalátu v biopsiích renálního aloštěpu do 3 měsíců po transplantaci je spojeno s dysfunkcí aloštěpu. PLoS ONE 14, e0214940 (2019).

10. Benjamins, S., Glaudemans, AWJM, Berger, SP, Start, RHJA & Pol, RA Zapomněli jsme na zobrazování před a po transplantaci ledvin?. Eur. Radiol. 28, 3263–3267 (2018).

11. Beheshti, M. a kol. 18F-NaF PET/CT: Pokyny pro postup EANM pro zobrazování kostí. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 42, 1767–1777 (2015).

12. Dweck, MR a kol. Koronární arteriální příjem 18F-fluoridu sodného. J. Am. Kol. Cardiol. 59, 1539–1548 (2012).

13. Dweck, MR a kol. Absorpce 18F-fluoridu sodného je markerem aktivní kalcifikace a progrese onemocnění u pacientů s aortální stenózou. Circ. Cardiovasc. Imaging 7, 371–378 (2014).

14. Derlin, T. a kol. Proveditelnost 18F-fluoridu sodného PET/CT pro zobrazení aterosklerotického plátu. J. Nucl. Med. 51, 862–865 (2010).

15. Bucerius, J., Dijkgraaf, I., Mottaghy, FM & Schurgers, LJ Identifikace cíle pro diagnostiku a intervenci vulnerabilních aterosklerotických plátů za zobrazením 18F-fluorodeoxyglukózou pozitronovou emisní tomografií: slibné indikátory na obzoru. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 46, 251–265 (2019).

16. Irkle, A. a kol. Identifikace aktivní vaskulární mikrokalcifikace pomocí pozitronové emisní tomografie s fluoridem sodným 18F. Nat. Commun.6, 7495 (2015).

17. Creager, MD a kol. 18 Amplifikace F-fluoridového signálu identifikuje mikrokalcifikace spojené s nestabilitou aterosklerotického plátu v obrazech pozitronové emisní tomografie/počítačové tomografie. Circ. Cardiovasc. Imaging 12, e007835 (2019).18. den Harder, AM a kol. Vaskulární absorpce na 18F-fluoridové pozitronové emisní tomografii: prekurzor vaskulární kalcifikace? J. Nucl. Cardiol. (2020).

19. Derlin, T. a kol. Korelace zánětu hodnocená pomocí18F-FDG PET, aktivní ukládání minerálů hodnocené pomocí18F-fluoridové PET a vaskulární kalcifikace v aterosklerotickém plátu: studie PET/CT s duálním indikátorem. J. Nucl. Med. 52, 1020–1027 (2011).

20. Kitagawa, T. a kol. Prediktivní hodnota 18F-fluoridové pozitronové emisní tomografie při detekci vysoce rizikového onemocnění koronárních tepen v kombinaci s počítačovou tomografií. J. Am. Heart Assoc. 7, e010224 (2018).

21. Bäck, M. a kol. Endogenní inhibitory kalcifikace v prevenci vaskulární kalcifikace: konsensus z akce COST EuroSofCalcNet. Přední. Cardiovasc. Med. 5, (2019).

22. Hop, H. a kol. 18F-fluorid sodný pozitronová emisní tomografie hodnotila mikrokalcifikace v lidských karotických plakech viníka a neviníka. J. Nucl. Cardiol. 26, 1064–1075 (2019).

23. Johnston, O., Rose, C., Landsberg, D., Gourlay, WA & Gill, JS Nefrektomie po selhání transplantace: současná praxe a výsledky. Dopoledne. J. Transplant. 7, 1961–1967 (2007).

24. Kwiecinski, J. a kol. Tříhodinové zpožděné zobrazení zlepšuje hodnocení koronárního 18F-fluoridu sodného PET. J. Nucl. Med. 60, 530–535 (2019).

25. Bucerius, J. a kol. Stanovisko Kardiovaskulárního výboru Evropské asociace nukleární medicíny (EANM) k PET zobrazování aterosklerózy. Eur. J. Nucl. Med. Mol. Imaging 43, 780–792 (2016).

26. Buchs, J.-B. a kol. Ledviny prasat DCD byly analyzovány pomocí MRI pro posouzení ex vivo jejich životaschopnosti. Transplantace 97, 148–153 (2014).

27. Pool, M. a kol. Infuze mezenchymálních stromálních buněk do praseteledvinyběhem normotermní strojní perfuze: intaktní MSC lze vysledovat a lokalizovat do glomerulů. Int. J. Mol. Sci. 20, 3607 (2019).

28. Roufosse, C. a kol. Referenční příručka pro Banfovu klasifikaci patologie renálního aloštěpu z roku 2018. Transplantace 102, 1795–1814 (2018).

29. Reijrink, M. a kol. Vychytávání [18F]FDG v tukové tkáni nesouvisí se zánětem u diabetes mellitus 2. typu. Mol. Imaging Biol.23, 117–126 (2020).

30. Shao, J.-S. a kol. Cévní kalcifikace a aortální fbróza bifunkční role osteopontinu u diabetické arteriosklerózy. Arter. TrombVascBiol 31, 1821–1833 (2011).

31. Brocher, J. Kvalitativní a kvantitativní hodnocení dvou nových binarizačních algoritmů limitujících histogram. Int. J. Obrazový proces. 8, 30–48 (2014).

Poděkování

Tento výzkumný projekt je podporován grantem nadace De Cock-Hadders Foundation (kód projektu 2018-03).

Autorské příspěvky

SB přispěl k návrhu, akvizici a analýze a navrhl rukopis. IFA, MR a MLCB přispěly k návrhu, akvizici a analýze a podstatně revidovaly rukopis. SPB, CM a MHdB přispěly ke koncepci a obsahově přepracovaly rukopis. JLH, RHJAS a RAP přispěly ke koncepci, designu a analýze a podstatně revidovaly rukopis.

Konkurenční zájmy

Autoři neuvádějí žádné konkurenční zájmy.