Tyrosinkináza C-Abl zesiluje interferonem zprostředkovanou antivirovou imunitu pomocí fosforylace STAT1

SOUHRN

Interferonem (IFN) indukovaná aktivace signálního přenašeče a aktivátoru transkripční (STAT) rodiny je důležitou událostí v antivirové imunitě. Zde ukazujeme, že nereceptorové kinázy c-Abl a Arg přímo interagují s STAT1 a potencují fosforylaci STAT1 na Y701. c-Abl/Arg by mohl zprostředkovat fosforylaci STAT1 nezávislou na Janus kinázách v nepřítomnosti IFNg a potencovat fosforylaci STAT1 zprostředkovanou IFNg. Navíc STAT1 dimerizace, jaderná translokace a downstream genová transkripce jsou regulovány c-Abl/Arg. Deficit c-Abl/Arg (abl1/abl2) významně potlačuje antivirové reakce v buňkách infikovaných virem vezikulární stomatitidy. Ve srovnání s vehikulem vedlo podávání c-Abl/Arg selektivního inhibitoru AMN107 k významně zvýšené úmrtnosti u myší infikovaných virem lidské chřipky. Naše studie ukazuje, že c-Abl hraje zásadní roli v signální dráze aktivace STAT1 a poskytuje důležitý přístup k regulaci antivirové imunity.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

ÚVOD

Interferony (IFN) hrají klíčovou roli ve vrozené imunitě proti virové infekci a imunitním dozoru tím, že regulují aktivaci Janusových kináz (JAK) a přenašeče signálu a aktivátoru transkripce (STAT) a přeprogramují buněčnou genovou expresi (Stark a Darnell, 2012). Vazba IFN na jejich příslušné receptory má za následek zkříženou fosforylaci tří asociovaných JAK (JAK1, JAK2 a TYK2) a nábor STAT, což umožňuje fosforylaci jednotlivých tyrosinových zbytků v blízkosti C-terminálních konců těchto STAT pomocí JAK. (Platanias, 2005). Aktivované STAT pak dimerizují, migrují do jádra a vážou se na promotory IFN-responzivních genů, aby indukovaly jejich transkripci. Fosforylace tyrosinu STAT je základním krokem v JAK-STAT dráze IFN signalizace a je zapojena do dimerizace STAT, jaderné translokace a vazby DNA (Stark a Darnell, 2012). Fosforylace tyrosinu tedy funguje jako spínač aktivace STAT. Důkazy získané prostřednictvím cíleného narušení genů JAK u myší naznačují, že JAK jsou nejdůležitější STAT tyrosinkinázy (Villarino et al., 2017). Ukázalo se však, že tyrosinové zbytky v STAT1, STAT3 a STAT5 jsou také fosforylovány v JAK-deficientních buňkách epidermálním růstovým faktorem a receptory růstového faktoru odvozeného z krevních destiček s vnitřní tyrosinkinázovou aktivitou (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Kromě toho byla pozorována konstitutivní aktivace STAT v transformovaných buňkách exprimujících onkogenní tyrosin kinázy, jako jsou v-Src, v-Abl a BCR-Abl, ale zda jsou STAT přímými substráty těchto kináz, je třeba určit (Danial a Rothman 2000, Reddy a kol., 2000). Savčí Abelsonova kináza c-Abl kódovaná genem c-abl (abl1) a genový protein Arg související s Abl kódovaný genem arg (abl2) jsou členy rodiny intracelulárních nereceptorových tyrosinkináz, které jsou nutné pro mnohočetné buněčné procesy. včetně proliferace, apoptózy, adheze, migrace buněk a stresových reakcí (Bradley a Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Kinázová aktivita c-Abl je za normálních fyziologických podmínek přísně regulována. Retrovirová transdukce a chromozomální translokace vedou k expresi v-Abl nebo BCR-Abl, což je onkogenní forma Abl (Advani a Pendergast, 2002). Kromě toho vede cílená delece genu c-abl u myší k pleiotropním fenotypům spojeným s imunitní dysfunkcí, včetně vysoké perinatální letality, atrofie sleziny a brzlíku, lymfopenie a zvýšené náchylnosti k infekci (Schwartzberg et al., 1991). Navíc léčba BCR-Abl-pozitivní chronické myeloidní leukémie (CML) pomocí Abl inhibitorů STI571 (imatinib) a AMN107 (nilotinib) je u podskupiny pacientů spojena s imunosupresí (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi a kol., 2003). Předchozí studie prokázaly, že cAbl hraje roli v regulaci transdukce signálu zprostředkovaného TCR (T buněčný receptor) a BCR (B buněčný receptor) zprostředkované transdukcí, vývojem, proliferací a tvorbou cytokinů (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002 Silberman a kol., 2008). Abl-deficientní myši také vykazují snížený počet T/B buněk (Gu a kol., 2009; Liberatore a Goff, 2009; Schwartzberg a kol., 1991). Mechanismy, které jsou základem narušené imunity, které vznikají v nepřítomnosti nebo inhibici c-Abl, však zůstávají nepolapitelné. Bylo široce publikováno, že signální dráha JAK-STAT je nezbytná pro transformaci indukovanou BCR-Abl (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Proto stojí za to prozkoumat, zda JAK-STAT může také přispět k vrozené imunitě spojené s c-Abl. Zde uvádíme, že STAT1 interaguje a je fosforylován c-Abl způsobem nezávislým na JAK, čímž je regulována dimerizace, jaderná lokalizace a transkripce genu po směru transkripce STAT1. Tato zjištění odhalila, že kromě JAK kinázy je c-Abl nepostradatelný pro plnou aktivaci STAT1 a následné antivirové odpovědi zprostředkované IFN.

Výhody cistanche tubulosa- posílení imunitního systému

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

VÝSLEDEK

Transkripce interferonem gama-aktivované sekvence downstream genů je regulována Abl kinázou

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 byly identifikovány v c-abl/arg double-knockout (DKO) a WT MEF, z nichž 960 bylo upregulováno a 784 bylo downregulováno (obrázek 1A, vlevo). Abychom dále prozkoumali potenciální buněčné funkce a související dráhy těchto DEG, provedli jsme analýzu genové ontologie (GO) (pro termíny biologického procesu, molekulární funkce a buněčné složky) (obrázek S1A). Geny downregulované c-Abl a Arg byly spojeny hlavně s obrannými reakcemi viru (GO: 0009615, GO: 0051607 a GO: 0045071) a imunitními reakcemi (GO: 0002376, GO: 0045087). Další analýza ukázala, že geny specifické pro IFN (Liu et al., 2012) byly obohaceny mezi downregulované geny (obrázky 1A, vpravo a S1B). Pro ověření profilů diferenciální exprese byly hladiny transkriptů antivirových genů, včetně cxcl10, psmb9, tap1 a isg15, stanoveny pomocí kvantitativních testů reverzní transkripce-polymerázová řetězová reakce (RT-PCR) v reálném čase a normalizovány na hladiny psma5 , která není příliš regulována c-Abl. Ve srovnání s WT MEF vykazovaly c-abl / arg / MEF významně nižší hladiny transkriptů těchto genů, ale snížení indukovaná DKO byla zcela zvrácena záchranou c-Abl způsobem závislým na dávce (obrázky 1B a S1C). Tato data naznačují, že panel IFN-indukovaných genů byl regulován c-Abl a Arg. Pro zkoumání klíčových transkripčních elementů regulovaných Abl kinázami v reakci na IFN byl zkonstruován luciferázový reportérový systém založený na tap1/psmb9 sdíleném obousměrném promotoru regulovaném IFNg (obrázek 1C). Jak se očekávalo, c-Abl/Arg-selektivní inhibitor AMN107 významně inhiboval transkripční aktivitu promotoru tap1 (červená) (obrázek 1D). Je pozoruhodné, že na rozdíl od delece prvků působících na NFkB (modrá) nebo IFN konsenzuální sekvence (žlutá), léčba AMN107 měla malý, pokud vůbec nějaký účinek na aktivitu promotoru tap1, když byl odstraněn prvek gama-aktivované sekvence (GAS) (zelený) (obrázek 1D ). Tato zjištění naznačují, že cis-element GAS zacílený na STAT{47}} se účastní c-Abl-regulované tap1 transkripce, což silně naznačuje, že STAT1 je zodpovědný za c-Abl-zprostředkovanou regulaci IFN-responzivní genové exprese.

c-Abl přímo interaguje se STAT1

Exprese TAP1 indukovaná IFN je regulována c-Abl, možná prostřednictvím STAT1, což naznačuje, že STAT1 může být spojen s c-Abl. Pro potvrzení této hypotézy byly lyzáty buněk MCF-7 podrobeny imunoprecipitaci anti-c-Abl následované imunoblotováním s protilátkou anti-STAT1. STAT1 byl přítomen v anti-c-Abl, ale ne v imunoprecipitátech IgG (obrázek 2A). Dále byly 293T buňky kotransfekovány s Myc-cAbl a Flag-STAT1 nebo Flag-Vector jako kontrola. Přítomnost Myc-c-Abl v imunoprecipitátech anti-Flag připravených z buněk koexprimujících Flag-STAT1, ale ne Flag-Vector, ukázala asociaci mezi ektopicky exprimovanými Myc-c-Abl a Flag-STAT1 (obrázek 2B, vlevo). Podobný výsledek byl také získán v recipročním experimentu (obrázek 2B, vpravo). Navíc další člen rodiny Abl, Arg (Abl2), který je vysoce homologní s c-Abl v jeho N-terminální doméně (NTD), také interagoval se STAT1 (obrázek S2A).

Obrázek 1. c-Abl reguluje promotory IFN-responzivních genů prostřednictvím prvků GAS

Dále byly lyzáty připravené z 293T buněk exprimujících Flag-c-Abl inkubovány s agarózou konjugovaným GST-STAT1 nebo samotným GST a Flag-c-Abl byl detekován v GST-STAT1, ale ne v GST adsorbátech (obrázek 2C). Aby se vyloučila nepřímá vazba zprostředkovaná jinými složkami v buněčných lyzátech, byly imunoprecipitáty anti-Flag připravené z buněk 293T exprimujících Flag-c-Abl podrobeny SDS-PAGE (elektroforéza na dodecylsulfátu sodného a polyakrylamidovém gelu) a proteiny byly přeneseny do membrána PVDF (polyvinylidenfluorid) a poté blotována rozpustným GST-STAT1 nebo GST (jako kontrola). Výsledky ukázaly, že GST-STAT1, ale ne GST, vázal c-Abl přímo in vitro (obrázek 2D). Pro definování c-Abl-vazebné domény byly s agarózou konjugované a GST-fúzované STAT1 plné délky nebo zkrácené STAT1 (obrázek 2E, horní panel) inkubovány s lyzáty 293T buněk exprimujících Flag-c-Abl. Analýza adsorbátů imunoblotováním s protilátkou anti-Flag ukázala, že aminokyseliny 577–750 STAT1, které tvoří oblast obsahující doménu SH2 a transaktivační doménu, byly zodpovědné za interakci c-Abl (obrázek 2E, spodní panel) . Podobně Flag-STAT1 imunoprecipitovaný anti-Flag protilátkou byl frakcionován pomocí SDS-PAGE a byl přenesen na PVDF membránu. Poté byla membrána blotována rozpustným GST-c-Abl SH3 nebo GST-c-Abl SH2 a pouze GST. Výsledek ukázal, že doména c-Abl SH3 byla hlavní doménou zodpovědnou za asociaci STAT1 (obrázek 2F). Kromě toho byla in situ interakce endogenního c-Abl s STAT1 hodnocena pomocí Duolink proximity ligation assay (PLA). Komplexy STAT1:c-Abl byly pozorovány hlavně v cytoplazmě a tvorba těchto komplexů byla podstatně zesílena stimulací IFNg (obrázek 2G). Souhrnně tato zjištění demonstrují přímou souvislost mezi c-Abl a STAT1 jak in vitro, tak in vivo.

Obrázek 2. c-Abl interaguje se STAT1

c-Abl zprostředkovává fosforylaci STAT1 nezávislou na JAK

Aby se zjistilo, zda je STAT1 substrátem c-Abl, byl purifikovaný His-značený STAT1 inkubován s rekombinantním c-Abl (obsahujícím katalytickou doménu na aminokyselinách 237–643) v přítomnosti ATP pro in vitro kinázový test. Imunoblotování reakčního produktu s anti-fosfo-tyrosinem a anti-fosfo-STAT1 Y701 prokázalo, že STAT1 byl přímo fosforylován c-Abl na tyrosinovém zbytku (zbytcích), včetně Y701, in vitro (obrázek 3A). Dále jsme zjistili, že Flag-STAT1 exprimovaný v 293T buňkách byl fosforylován tyrosinem, zejména na zbytku Y701, pomocí Myc-c-Abl, ale ne kinázou inaktivní mutant Myc-c-Abl (K290R). Kromě toho po léčbě c-Abl/Arg-selektivním inhibitorem AMN107 byla fosforylace STAT1 zprostředkovaná c-Abl téměř eliminována, což ukazuje, že fosforylace tyrosinu STAT1 je závislá na aktivitě c-Abl kinázy (obrázek 3B). Fosforylace STAT1 zprostředkovaná c-Abl byla podstatně narušena, když byl STAT1 Y701 nahrazen fenylalaninem, což ukazuje, že Y701 je hlavním fosfositem Abl (obrázek 3C). Kromě toho byl STAT1 také fosforylován Arg (obrázek S2B). Pro další vymezení specifických zbytků STAT1 fosforylovaných c-Abl byl Flag-STAT1 koexprimovaný s Myc-c-Abl podroben kapalinové chromatografii spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií. Kromě dobře definovaného a funkčně důležitého STAT1 fosfozitu Y701 (Schindler a kol., 1992; Shuai a kol., 1993) byly identifikovány také dva další fosfozity, Y106 a Y665 (obrázek S4A). Ve srovnání s WT STAT1 vykazovaly mutanty Y106F i Y701F zhoršenou fosforylaci tyrosinu (obrázek 3C). Fosforylace STAT1 Y701 však nebyla významně ovlivněna fosforylací Y106 a Y665, což naznačuje, že Y106 a Y665 mohou hrát odlišné role (obrázek S4B). Společně tato zjištění naznačují, že tyrosinové zbytky STAT1, včetně dříve popsaného zbytku Y701, mohou být fosforylovány kinázami rodiny Abl.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

JAK jsou primárně zodpovědné za IFN-indukovanou fosforylaci STAT1 Y701 (Villarino et al., 2017). Jak se očekávalo, fosforylace STAT1 Y701 byla indukována IFNg a byla významně inhibována ruxolitinibem, bispecifickým inhibitorem JAK1 a JAK2 (obrázek 3D). Pozoruhodně byla také pozorována zhoršená fosforylace Y701 po inhibici Abl (obrázek 3D, dráha 4), což ukazuje, že c-Abl částečně přispívá k aktivaci STAT1 indukované IFNg. Dále byla fosforylace STAT1 Y701 také indukována DPH, aktivátorem c-Abl propustným pro buňky, v menší míře než IFNg, což by mohlo být zcela zvráceno pomocí AMN107 (obrázek 3E). Pro potvrzení aktivace Abl indukované DPH byla také detekována fosforylace c-Abl Y412, indikátor aktivace Abl (obrázek 3E). Bylo prokázáno, že aktivace JAK2 nastává jako první a je potřebná pro následnou aktivaci JAK1 (Briscoe et al., 1996). Abychom vyloučili vliv JAK2 na aktivaci STAT1, vytvořili jsme buněčnou linii jak2-KO MCF-7 prostřednictvím CRISPR. Snížená, ale detekovatelná fosforylace STAT1 Y701 byla pozorována v buňkách jak2-KO MCF-7 ve srovnání s rodičovskými buňkami MCF-7, která by mohla být podobně potencována v přítomnosti Myc-c-Abl ale ne Myc-c-Abl (K290R) (obrázek 3F) a byl dále snížen po léčbě AMN107. V c-abl/arg/buňkách byla IFNg-indukovaná fosforylace STAT1 na Y701 značně narušena způsobem závislým na čase a dávce (obrázek 3G). Všechna tato pozorování ukazují, že c-Abl kináza by mohla přímo fosforylovat a aktivovat STAT1 nezávisle na signální dráze IFNg-JAK a že, co je důležité, tyto dvě kinázy mohou mít synergické účinky na fosforylaci STAT1 na Y701.

Obrázek 3. STAT1 je fosforylován c-Abl

Obrázek 4. c-Abl podporuje tvorbu dimeru STAT1 a import jádra

Fosforylace zprostředkovaná c-Abl reguluje transaktivační aktivitu STAT1

Fosforylace tyrosinu STAT je základním krokem v JAK-STAT dráze IFN signalizace a je zapojena do dimerizace STAT, jaderné translokace a vazby DNA. Aby se zjistilo, zda fosforylace zprostředkovaná c-Abl reguluje dimerizaci STAT, GFP-STAT1 a Flag-STAT1 byly koexprimovány v buňkách 293T v přítomnosti nebo nepřítomnosti Myc-c-Abl. Hladiny GFP-STAT1 v imunoprecipitátech anti-Flag byly zkoumány pro indikaci dimerizace STAT1. Jak je znázorněno na obrázku 4A, koexprese c-Abl potencovala tvorbu homodimerů STAT1-STAT1. Imunofluorescenční mikroskopie buněk MCF-7 dále prokázala, že ablace c-abl/arg nebo léčba AMN107 významně narušila IFNg-indukovanou STAT1 jadernou translokaci (obrázky 4B a 4C).

Kromě toho byly k analýze vazebné aktivity promotoru STAT1 použity testy posunu elektromobility. Biotinem značená promotorová oblast IRF1 obsahující konsenzuální sekvenci vázající STAT1 byla použita jako detekční sonda (Aaronson a Horvath, 2002). Tato sonda byla inkubována s jadernými extrakty z buněk 293T exogenně exprimujících STAT1 s nebo bez c-Abl, což bylo vyváženo na základě obrázku S5A. Jak je znázorněno na obrázku 4D, v jaderných extraktech bylo pozorováno mnoho komplexů navázaných na sondu IRF1 obsahujících STAT1 (obrázek 4D, dráha 1). Tvorba komplexu se mírně zvýšila při léčbě IFNg (obrázek 4D, dráha 2) a významně se zvýšila v buňkách ektopicky exprimujících c-Abl (obrázek 4D, dráha 3). Ve srovnání s WT STAT1 však c-Abl vykazoval malý, pokud vůbec nějaký účinek na vazbu promotoru STAT1 obsahujícího Y701F (obrázek 4D, dráhy 7 a 8), zatímco mutace Y106F a Y665F nevykazovaly téměř žádný rozdíl s WT STAT1. Specifičnost komplexů obsahujících STAT1 a detekční sondu byla potvrzena po přidání neznačené kompetitivní sondy (obrázek 4D, dráha 9). Navíc přidání protilátky proti STAT1 vedlo k vytvoření superposunutého pásu (obrázek 4D, dráha 11). Když byly značené sondy inkubovány s jadernými extrakty buněk 293T jako kontrolou, nebyly pozorovány žádné komplexy (obrázek 4D, dráha 10). Tyto výsledky ukazují, že fosforylace STAT1 Y701 zprostředkovaná c-Abl zesiluje vazbu STAT1 s jeho cílovými promotory.

Obrázek 5. c-Abl reguluje genovou expresi související s IFN

Poté byla IFNg indukovaná transaktivace hlavních STAT1-regulovaných genů, včetně ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 a tap1, hodnocena ve WT nebo c-abl/ arg DKO MCF{13}} buněk prostřednictvím RT-PCR. Jak se očekávalo, genová transkripce byla významně narušena deplecí c-abl/arg (obrázek 5A). Navíc geny typicky indukované IFNg a IFNa nebyly stimulovány IFN v přítomnosti AMN107 (obrázky 5B a 5C). Tato zjištění ukazují, že transaktivační aktivita STAT1 je pozitivně regulována c-Abl.

c-Abl podporuje IFN-dependentní antivirové účinky

TAP1 a PSMB9 se podílejí na produkci a prezentaci peptidů v dráze zpracování antigenu MHC třídy I (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). V souladu s předchozími zjištěními byla prezentace antigenu ovalbuminu buňkami JAWS II buňkám B3Z významně potlačena AMN107 kvůli snížené produkci IL2 (obrázek 6A). Pro další posouzení antivirových biologických důsledků regulace STAT1 pomocí c-Abl, WT a c-abl / arg / MEF předem ošetřené sériově zředěnými IFNg nebo bez nich byly infikovány virem vezikulární stomatitidy (VSV). Infekce VSV způsobila závažnější buněčnou smrt u buněk c-abl/arg/MEF a WT buněk ošetřených AMN107 než u WT MEF ošetřených vehikulem (obrázek 6B). Léčba IFNg výrazně snížila buněčnou smrt indukovanou virovou infekcí, ale měla mnohem méně výrazný účinek v přítomnosti AMN107. V souladu s tímto zjištěním vedla ablace c-abl/arg v MEF k necitlivosti na stimulaci IFN, ale tento účinek byl výrazně zvrácen pomocí záchrany c-Abl (obrázek 6B). Dále byly buňky A549 ošetřené nebo bez AMN107 infikovány virem newcastleské choroby (NDV) exprimujícím GFP a výsledky odhalily, že virová replikace byla také potencována léčbou AMN107, ale potlačena expresí c-Abl (obrázek 6C). V souladu se zjištěním, že transfekce DNA vede k aktivaci endogenní odpovědi IFN (Park et al., 2003), transfekce vektorem pcDNA inhibovala proliferaci viru. Je pozoruhodné, že transfekce Flag-c-Abl vedla k výraznějšímu inhibičnímu účinku na virovou proliferaci než transfekce prázdným vektorem (obrázek 6C). Kromě toho léčba IFNg měla malý, pokud vůbec nějaký, účinek na virovou infekci v přítomnosti c-Abl-selektivního inhibitoru AMN107 (obrázek 6D). Tyto údaje naznačují, že c-Abl hraje důležitou roli v antivirových účincích zprostředkovaných STAT1-. Dále jsme zkoumali role c-Abl při virové infekci u call/fl, Lck-Cre (c-abl-podmíněný knockout, c-abl-cKO) myší, u kterých byl c-abl specificky vyřazen v thymocytech (obrázek S7A ), protože vyřazení genu c-abl ze zárodečné linie vede k běhu a smrti během prvních dvou týdnů po narození (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). Poté byly myši WT a c-abl-cKO intranazálně infikovány virem chřipky A (IAV). Statisticky nevýznamně vyšší mortalita byla pozorována u myší c-abl-cKO než u myší WT. WT myši kontinuálně podávané AMN107, které systematicky potlačují c-Abl/Arg kinázy ve všech tkáních, vykazovaly významně zvýšenou citlivost k IAV (obrázek 6E). Souhrnně tato zjištění naznačují, že c-Abl je vyžadován pro antivirovou imunitu u zvířat.

Obrázek 6. c-Abl podporuje IFN-dependentní antivirové účinky

DISKUSE

IFNg je jedním z nejdůležitějších imunomodulačních cytokinů a hraje zásadní roli ve vrozené imunitě proti virové infekci. V kanonické IFNg signalizaci se po stimulaci IFNg JAK1 a JAK2 rekrutují do cytoplazmatických konců agregovaných IFNg receptorů (IFNGR) a aktivují se prostřednictvím sekvenční autofosforylace a transfosforylace (Stark, 2007; Villarino et al., 2017). Poté se STAT1 ukotví k IFNGR spojením své domény SH2 s rozpoznávací sekvencí v IFNGR (Y440DKPH444), ve které je Y440 fosforylován JAK (Greenlund et al., 1995). Po fosforylaci na Y701 pomocí JAK se STAT1 dimerizuje a translokuje do jádra, kde podporuje transkripci řady genů reagujících na IFNg (Aaronson a Horvath, 2002; Stark a Darnell, 2012). Ablace Stat1 u myší vede k absenci transkripčních odpovědí na IFN a nedostatku IFN-indukovaných antimikrobiálních a antivirových aktivit v buňkách (Meraz et al., 1996). Stat1 / myši také vykazují zvýšenou náchylnost k rozvoji spontánních a chemicky (3-methylcholanthrenem) indukovaných nádorů (Kaplan et al., 1998) a přecitlivělost na určité zánětlivé patologické stavy (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Signalizace STAT1 navíc chrání T buňky před cytotoxicitou zprostředkovanou přirozenými zabíječskými buňkami (Kang et al., 2019).Tato zjištění naznačují, že STAT1 zprostředkovává vrozenou imunitní aktivaci a nádorovou imunitu.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Schlatterer a kol. uvedli, že c-Abl, ale ne Arg, může vyvolat ztrátu neuronů tím, že vyvolá aktivaci STAT1 a produkci interferonu. Přesný mechanismus zodpovědný za aktivaci STAT1 závislou na c-Abl však nebyl objasněn (Schlatterer et al., 2012). Zde ukazujeme, že c-Abl se váže a fosforyluje STAT1 a interaguje s STAT2 přímo in vitro (obrázky 2 a 3, S8A, S9A a S10A). STAT1 Y701 je výhradně fosforylován JAK kinázami, které regulují tvorbu dimeru STAT1 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) a nukleocytoplazmatický transfer během IFNg signalizace (Mao et al., 2005; Mertens et al.; Zhong a kol., 2005). Naše studie neočekávaně zjistila, že c-Abl, další kináza jiná než JAK, také přispívá k fosforylaci STAT1 Y701 nezávisle (obrázek 3). Přestože fosforylace Y701 zprostředkovaná c-Abl není tak silná jako fosforylace JAK, zdá se, že je nezbytné, aby Y701 dosáhl maximální fosforylace, protože vážně narušená fosforylace Y701 byla pozorována v c-abl / arg/buňkách po stimulu IFNg a IFNg- indukovaná fosforylace STAT1 Y701 byla inhibována AMN107, od 1,25 mM do 5 mM, způsobem závislým na dávce (obrázky 3G a S11A). Fosforylace Y701 však není příliš ovlivněna fosforylačním stavem Y106 a Y665, dalších dvou fosfozitů c-Abl, což naznačuje, že zesílená fosforylace STAT1 Y701 není výsledkem c-Abl zprostředkované vícemístné fosforylace STAT1, ale je možná přisuzováno zvýšené aktivitě JAK. Předchozí studie ukázaly, že konstitutivní aktivace JAK1 a variabilní aktivace JAK2 byly pozorovány v buňkách exprimujících BCR-Abl (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Navíc se ukázalo, že BCR-Abl mírně aktivuje STAT1 a STAT2 prostřednictvím fosforylace tyrosinu JAK1, JAK2 a JAK3 (Henderson et al., 1997). Současné důkazy podporují, že Abl a JAK mohou mít výrazné synergické účinky na fosforylaci STAT1 na Y701 (obrázek 3E).

Kromě Y701 byla současně identifikována fosforylace Y106 a Y665 (obrázky 3C a S4A). Tyto fosfozity se nepodílely na fosforylaci STAT1 Y701 ani homodimerizaci STAT1 (obrázky S4B a S4C). Murphy a kolegové však zjistili, že interakce mezi NTD (N-terminální proteinová interakční doména, aminokyseliny 1–136) monomerů je nezbytná pro dimerizaci nefosforylovaných molekul STAT v plné délce (Ota et al., 2004). Mutanty STAT1 (F77A a/nebo L78A) nevytvářejí nefosforylované dimery a tyto mutanty vykazují fenotypově perzistentní fosforylaci v buňkách ošetřených IFN a rezistenci vůči TC45-zprostředkované defosforylaci in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 v NTD, který je blízko F77 a L78, může být zodpovědný za udržování STAT1 ve stavu fosforylovaného dimeru a za udržování STAT1 v jádře pod ionizujícím zářením (obrázky S6A a S6B). Navíc doména SH2 interaguje s doménou obsahující fosforylovaný tyrosin, když je tvorba fosforylovaného homodimeru indukována IFN (Shuai et al., 1994). Y665, který leží v doméně SH2, může ovlivnit dimerizaci. Funkce fosforylačních míst zprostředkovaných c-Abl (Y106 a Y665) vyžadují další zkoumání.

Podobně jako u JAK fosforylace zprostředkovaná c-Abl reguluje tvorbu dimeru STAT1 (včetně tvorby homodimeru STAT1- STAT1 a tvorbu heterodimeru STAT1-STAT2 (obrázky 4A, S12A a S12B)), jadernou translokaci, vazbu DNA a transkripce IFN-stimulovaných genů. Narušení Abl přispělo k potencované virové proliferaci a zvýšené virem indukované buněčné smrti (obrázky 6B, 6C a 6D). Kromě toho jsme zjistili, že ionizující záření (IR) indukovalo jadernou translokaci STAT1 v nepřítomnosti inhibitoru c-Abl (obrázky S6A a S6B). IR aktivuje c-Abl přímo (Pendergast, 2002) a následně STAT1-závislou IFNg signalizaci, která může poskytnout základní mechanismus, kterým radiační terapie iniciuje IFN-kaskádový vrozený a adaptivní imunitní útok na nádor (Burnette et al. ., 2011) a nabízí silnější vrozený imunitní stav v reakci na IR podněty. Ve srovnání s WT sourozenci vykazovaly myši, u kterých byl c-abl podmíněně vyřazen v thymocytech, vyšší, ale ne statisticky významnou mortalitu. Je pozoruhodné, že myši systematicky podávané c-Abl/Arg inhibitor AMN107 měly vyšší mortalitu (obrázek 6E), což ukazuje, že exprese c-Abl v různých tkáních přispěla k antivirové imunitě u zvířat. Z těchto dat předpokládáme, že endogenní Abl nabízí latentní bazální rezistenci vůči virové infekci a že aktivovaný Abl stimulovaný ionizujícím zářením chrání buňky. Abl kinázy jsou konstitutivně aktivovány u většiny pacientů s CML. Inhibitory Abl kinázy STI571 a AMN107 představují přední léčbu terapie CML. Běžně jsou však pozorovány infekce horních cest dýchacích a imunosuprese, které mohou být způsobeny represí imunitní regulační dráhy zprostředkované STAT (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Naše zjištění přidala teoretický základ pro optimalizaci terapie.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

V souhrnu bylo zjištěno, že tyrosinkináza c-Abl se asociuje se STAT1 in vivo a in vitro, podporuje fosforylaci STAT1 na Y701 nezávisle na JAK, zesiluje transaktivaci a zprostředkovává vrozené imunitní reakce proti infekci, zejména v kontextu c - Stres související s Abl. Naše zjištění poskytuje doplňkový přístup k aktivaci STAT1, který přispívá k rostoucímu množství znalostí týkajících se regulace signální dráhy downstream IFN.

REFERENCE

Aaronson, DS, a Horvath, CM (2002). Cestovní mapa pro ty, kteří neznají JAK-STAT. Věda 296, 1653–1655.

Advani, AS a Pendergast, AM (2002). BcrAbl varianty: biologické a klinické aspekty. Leuk. Res. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH a Kuchroo, VK (2004). Ztráta T-betu, nikoli však STAT1, brání rozvoji experimentální autoimunitní encefalomyelitidy. J. Exp. Med. 200, 79–87.

Bradley, WD a Koleske, AJ (2009). Regulace buněčné migrace a morfogeneze kinázami rodiny Abl: vznikající mechanismy a fyziologické souvislosti. J. Cell Sci. 122, 3441–3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN, and Kerr, IM (1996). Kináza-negativní mutanty JAK1 mohou udržovat genovou expresi indukovatelnou interferonem-gama, ale ne antivirový stav. EMBO J. 15, 799–809.

Carlesso, N., Frank, DA a Griffin, JD (1996). Tyrosylová fosforylace a DNA vazebná aktivita signálních přenašečů a aktivátorů transkripčních (STAT) proteinů v hematopoetických buněčných liniích transformovaných Bcr/Abl. J. Exp. Med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL a Rothman, P. (1997). Konstitutivní aktivace JAK a STAT v BCR Abl-exprimujících buněčných liniích a periferních krevních buňkách odvozených od leukemických pacientů. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Colicelli, J. (2010). ABL tyrosin kinázy: vývoj funkce, regulace a specifičnosti. Sci. Signál. 3, re6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY, and Rothman, PB (1998). Pro aktivaci STATs a proliferaci indukovanou v-Abl je nutná přímá interakce Jak1 a v-Abl. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.

Danial, NN a Rothman, P. (2000). JAK-STAT signalizace aktivovaná Abl onkogeny. Oncogene 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R., and Koenderman, L. (1999). Aktivace STAT5 pomocí BCR-Abl přispívá k transformaci leukemických buněk K562. Krev 94, 1108–1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR a Vuk-Pavlovic, S. (2004). Imatinib mesylát inhibuje proliferaci T-buněk in vitro a hypersenzitivitu opožděného typu in vivo. Krev 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. a Liu, X. (2017). Globální regulace diferenciální genové exprese pomocí c-abl/arg onkogenních kináz. Med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanovic, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , a kol. (2014). Upregulace imunoproteazomových podjednotek u myositidy indikuje aktivní zánět se zapojením buněk prezentujících antigen, CD8 T-buněk a IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. a Schreiber, RD (1995). Získávání statu tyrosinem fosforylovanými cytokinovými receptory: uspořádaný proces řízený reverzibilní afinitou. Imunita 2, 677–687.

Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. a Pendergast, AM (2013). Role kináz rodiny ABL u rakoviny: od leukémie po solidní nádory. Nat. Rev. Rak 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR a Pendergast, AM (2009). Abl tyrosinkinázy v signalizaci T-buněk. Immunol. Rev. 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. a Deisseroth, AB (1997). Potenciální role bcr-abl v aktivaci JAK1 kinázy. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE a kol. (2016). Dlouhodobé přínosy a rizika přední linie nilotinibu vs imatinib pro chronickou myeloidní leukémii v chronické fázi: 5-roční aktualizace randomizované studie ENESTnd. Leukémie 30, 1044–1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. a Snapper, SB (2019). Signalizace STAT1 chrání T buňky před cytotoxicitou zprostředkovanou NK buňkami. Nat. Commun. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ a Schreiber, RD (1998). Demonstrace systému sledování nádorů závislého na interferonu gama u imunokompetentních myší. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA a Baltimore, D. (1998). Základní role tyrosinkináz Abl a Arg při neurulaci. Neuron 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE a Stark, GR (1996). Role JAK při aktivaci STAT a stimulaci exprese genu c-fos epidermálním růstovým faktorem. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.