Podíl koncentrátu ve stravě dojnic v rané laktaci má kontrastní účinky na globální transkriptomické profily cirkulujících leukocytů, zdraví a plodnost podle parity

Abstraktní:Funkčnost cirkulujících leukocytů u dojnic je po otelení potlačena, přičemž rizikovým faktorem je negativní energetická bilance. Transkriptomické profily leukocytů byly porovnány odděleně u 44 multipar (MP) a 18 prvorodých (PP) holštýnsko-fríských krav, které dostávaly diety lišící se poměrem koncentrátu, aby se ověřilo, zda lze imunitní dysfunkci zmírnit vhodnou výživou. Po otelení byly kravám nabídnuty buď (1) nízkokoncentrované (LC); (2) středně koncentrovaná (MC) nebo (3) vysoce koncentrovaná (HC) strava s poměry koncentrátu k travní siláži 30 %:70 %, 50 %:50 % a 70 %:30 %, v tomto pořadí. Shromážděné údaje o fenotypu krav zahrnovaly cirkulující metabolity, dojivost a záznamy o zdraví a plodnosti. Bylo provedeno sekvenování RNA cirkulujících leukocytů po 14 dnech v mléce. HC dieta zlepšila energetickou bilanci v obou věkových skupinách. U PP bylo více odlišně exprimovaných genů než u MP krav (460 vs. 173, HC vs. LC srovnání) s několika překryvy. Krávy MP na LC dietě vykazovaly zvýšenou regulaci komplementové a koagulační kaskády a vrozených imunitních obranných mechanismů proti patogenům a měly trend více případů mastitid a horší plodnost. Naproti tomu PP krávy na HC dietě vykazovaly větší imunitní reakce na základě genové exprese a fenotypových dat a delší interval od otelení do zabřeznutí. Leukocyty krav MP a PP tedy reagovaly na diety rozdílně mezi věkem, přísunem živin a imunitou ovlivňující jejich zdraví a následnou plodnost.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Klíčová slova:poporodní imunosuprese; imunita; metabolismus; leukocyty; laktační diety; transkriptom; reprodukce; krávy

1. Úvod

Časně po porodu se dojnice vyznačují imunosupresí ovlivňující vrozenou a adaptivní imunitu, včetně imunity zprostředkované buňkami a humorální imunity. Cirkulující leukocyty se během zánětu rekrutují do tkání, jako je mléčná žláza a endometrium. Předchozí studie však prokázaly snížení jak počtu leukocytů, tak jejich funkční kapacity během peripartálního období [1,2]. Mezi hlášené účinky patří zhoršená fagocytóza a aktivita oxidativního vzplanutí [3–5], snížená schopnost cirkulujících T-buněk reagovat na mitogenní agens a snížená produkce imunoglobulinu B-buňkami [6,7]. Příčiny jsou multifaktoriální, ale zdá se, že souvisí s rozdělováním živin ve prospěch produkce mléka na začátku laktace, což ohrožuje imunitní funkce [8–10]. Leukocyty vyžadují pro svou údržbu a funkčnost dostatečný přísun glukózy, různých mastných kyselin a cholesterolu či oxysterolů [8,11,12]. Dostupný přísun živin je však po otelení upřednostňován pro mléčnou žlázu, která vyžaduje přibližně o 25 % více metabolizovatelné energie a bílkovin, než je zajištěno příjmem krmiva [8,13,14]. Kromě toho je porod charakterizován zánětlivými procesy spojenými se změnami sekrece různých prostaglandinů, steroidů a cytokinů a možnými poraněními během samotného procesu porodu [15–17]. Zánětlivé reakce na otelení a metabolity uvolněné během mobilizace tkání mají silné anorektické účinky, dále snižují příjem a zhoršují negativní energetickou bilanci (NEB) [18]. Když příjem krmiva nemůže pokrýt zvyšující se potřebu energie, krávy vstupují do období NEB, přičemž někteří jedinci se stávají metabolicky nevyváženými [19–21]. NEB je spojena s inzulinovou rezistencí, sníženou expresí receptoru jaterního růstového hormonu (GH) a nižší syntézou IGF-1 v játrech [22,23]. Odpojení růstového hormonu od inzulínu u krav po porodu je adaptací, která upřednostňuje dodávku glukózy do tkání, jako jsou epiteliální buňky mléčné žlázy, ve kterých je vychytávání nezávislé na inzulínu [8]. V této situaci je konkurence o dodávku energie mezi mléčnou žlázou a imunitním systémem nevyhnutelná, protože obě se spoléhají na stejné základní substráty a obě jsou hlavními spotřebiteli energie. Kvidera a spol. [24] prokázali, že aktivace plné imunitní odpovědi u krav vyžaduje 2,5 až 3,1 kg glukózy denně. To je podobné odhadované potřebě 2,7 kg/den glukózy přijaté epiteliálními buňkami mléčné žlázy pro produkci mléka 40 kg/den [8].

Mobilizace tkání je také spojena se zvýšenými cirkulujícími koncentracemi neesterifikovaných mastných kyselin (NEFA), beta-hydroxybutyrátu (BHB) a sníženým IGF-1, které všechny přispívají k imunitní dysfunkci [5,9,10,20 ]. Například naše nedávná studie ukázala, že adheze leukocytů mezi buňkami byla inhibována, když koncentrace NEFA přesáhla 750 µM [25]. Ačkoli je mobilizace tkáně normální adaptací savců na podporu laktace, mnoho studií prokázalo, že těžká NEB má velký vliv na následnou schopnost krávy včas zabřeznout [26]. To může být způsobeno řadou faktorů, včetně zpoždění při obnově vhodného děložního prostředí [2]; prodloužené období anovulace [27], špatné intrafolikulární prostředí [28] a zhoršená kvalita oocytů [29]. Mléčné jalovice se obvykle otelí na přibližně 90 % své dospělé tělesné hmotnosti [30]. Naše předchozí studie ukázala, že prvorodičky (PP) měly vyšší koncentrace inzulínu, IGF-1 a leptinu v oběhu, nižší koncentrace krevních metabolitů (BHB, NEFA a močovina) a vyšší koncentrace glukózy než multipary (MP ) krávy po dobu minimálně 7 týdnů po otelení [31,32]. To ukazuje, že dochází k menšímu odpojení somatotrofní osy v časné laktaci u krav PP ve srovnání s kravami MP, což je spojeno se slabší prioritou živin pro mléčnou žlázu, což umožňuje pokračující růst. Profily genové exprese v cirkulujících leukocytech se u krav PP a MP během časné laktace také liší [33].

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Optimalizace nutričního managementu během období sucha může zvýšit příjem sušiny (DMI), snížit výskyt periparturientních onemocnění a zlepšit plodnost [34]. Existují obecná doporučení, jak snížit riziko onemocnění související s krmením a léčbou [35]. Existuje však jen málo dostupných informací o složení stravy pro jednotlivé krávy s metabolickou nerovnováhou během poporodního období, které mohou zlepšit imunitní funkci, snížit výskyt onemocnění a zlepšit následnou reprodukční výkonnost. Praktickým přístupem je sestavování diet s vysokým potenciálem příjmu živin [36]. V této studii byla kravám v rané laktaci nabídnuta dieta s nízkým (LC), středním (MC) nebo vysokým obsahem koncentrátu (HC) na základě poměru koncentrátu k travní siláži a účinků na metabolické zdraví a onemocnění a systémovou imunitu ( hodnocením profilů exprese globálních genů pro cirkulující leukocyty) byly stanoveny. Údaje od krav PP a MP byly analyzovány odděleně, aby se zabránilo jakémukoli matoucímu efektu vyplývajícímu z parity. Naší hypotézou bylo, že vysoce koncentrované diety zlepší imunitní funkce a prospějí plodnosti.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

2. Výsledky

2.1. Vliv diet na příjem sušiny, výtěžnost mléka, energetickou bilanci a krevní metabolity

Parametry mléka, tělesná hmotnost (BW), DMI, skóre tělesné kondice (BCS), energetická bilance (EBAL) a krevní metabolity pro krávy MP a PP kolem 14 dnů v mléce (DIM) jsou shrnuty v tabulce 1. DMI pro krávy MP byly významně odlišné mezi třemi dietními skupinami v pořadí HC > MC > LC (p < 0.01–0.0{{11 }}1). Dojivost u krav MP, které dostávaly dietu HC, byla významně vyšší než u krav dostávajících dietu LC (p < 0.05). Rozdíl v energeticky korigované mléčné užitkovosti (ECM) mezi skupinami LC a HC byl významný (p < 0.05), se středními hodnotami ve skupině MC. Hodnoty EBAL ve všech třech skupinách MP byly negativní, ale hodnoty u krav MC a HC byly významně lepší (méně negativní) než u krav LC (p < 0,01). Cirkulační koncentrace glukózy (p < 0,01) a IGF-1 (p < 0,001) u krav HC byly významně vyšší než u krav LC. Krávy MP nabízené HC diety také produkovaly méně cirkulující močoviny (p < 0,001), BHB (p < 0,05) a NEFA než ty, které nabízely LC diety s koncentracemi LC > MC > HC, ačkoli rozdíly v koncentracích NEFA mezi dietními skupinami nebyly statisticky významné.

Tabulka 1. Celkový příjem sušiny, parametry mléka, tělesné hmotnosti, energetická bilance, skóre tělesné kondice a krevní metabolity přibližně 14 dní po otelení, analyzováno podle parity a diety 1,2

U krav PP měly ty, které dostávaly dietu MC nebo HC, vyšší DMI než ty, které dostávaly dietu LC (p < {{0}}.01). Výnosy mléka se výrazně nelišily. EBAL byl pozitivní u krav, kterým byla nabízena MC nebo HC dieta, zatímco u krav, kterým byla nabídnuta LC dieta, byl negativní. Rozdíly v EBAL mezi kravami HC a LC PP byly signifikantní (p < 0,05). Z měřených metabolitů se mezi skupinami lišily pouze koncentrace močoviny, které byly nižší u krav HC (LC > MC > HC, p < 0,001 pro LC vs. HC nebo MC).

2.2. Vliv diet na zánětlivé parametry

Účinky diety na zánětlivé parametry měřené v děloze a mléčné žláze jsou uvedeny v tabulce 2. U krav PP byl poměr polymorfonukleárních leukocytů k buňkám děložního epitelu (PMN: UEC) odebraným z dělohy pomocí cytobrush významně vyšší pro krávy na HC ve srovnání s LC dietou (p < 0.05). U MP krav byl trend ve stejném směru, s LC < MC < HC, ale nedosáhl statistické významnosti. V mléce měly krávy MP na LC dietě významně vyšší SCC než ty na MC nebo HC dietě (p < 0,05), zatímco u PP krav byl nevýznamný trend opačný. . Koncentrace mléčné N-acetyl- -d-glukosaminidázy (NAGáza) a laktátdehydrogenázy (LDH), mléčných enzymů svědčících pro mastitidu, sledovaly stejné obecné trendy jako hodnoty SCC, ale žádné rozdíly nebyly významné. Tyto výsledky byly podpořeny zdravotními záznamy. U krav MP na dietě HC se nevyskytly žádné případy mastitidy (0/15), zatímco u 4/14 (28,6 %) krav na dietě LC byla klinická mastitida diagnostikována do 16 dnů po otelení. Trend byl opět opačný u krav PP s jednou ze šesti (16,7 %) na LC dietě s klinickou mastitidou ve srovnání s jedním případem klinické a dvěma subklinickými mastitidami na HC dietě (50 %).

Tabulka 2. Zánětlivé parametry kolem 14. dne po otelení podle parity a diety 1,2.

2.3. Údaje o plodnosti

Podrobnosti o údajích o plodnosti jsou uvedeny v tabulce 3. U krav MP trvalo zabřeznutí u krav na LC dietě o něco déle a vyžadovaly více služeb na početí než u krav HC (2,4 ± 0,42 vs. 1,6 ± 0.23), ačkoli více krav HC buď nebylo obslouženo (rozhodnutí vedení), nebo se jim nepodařilo zabřeznout vůbec (6{{10}}.0% vs. 71,4 %). Žádný z těchto rozdílů však nebyl významný. U krav PP tomu bylo naopak, přičemž krávy LC měly nejkratší interval do zabřeznutí o 29 dní (p < {{20}},05), přičemž pět ze šesti zvířat zabřezlo svůj první pokus . Naproti tomu polovina skupiny HC buď nebyla obsloužena (n=2), nebo se jí nepodařilo otěhotnět (n=1), přičemž tři, které otěhotněly, vyžadovaly 2,0 ± 0,41 služby na početí. To vedlo k tomu, že skupina HC měla významně vyšší skóre "v tele podle" (ICB) (p < 0,05).

Tabulka 3. Údaje o plodnosti podle parity a diety 1,2

2.4. Transkriptomické profily leukocytů u krav nabízely různé poměry koncentrátu

Referenční bovinní genom ARS-UCD 1.2 poskytnutý RefSeq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly, přístupný 1. května 2022) obsahuje 35 158 genů, z nichž 19 001 leukocytových genů bylo kvantifikovatelných při čtení sekvenování v souborech FASTQ na něj byly mapovány. Grafy vulkánů ukazující profily exprese u krav MP a PP, které dostávaly tři různé diety, jsou uvedeny na obrázku 1. U krav MP bylo 173 odlišně exprimovaných genů (DEG) ve srovnání mezi HC a LC, 126 mezi MC a LC a 68 pro HC vs. MC (doplňkový soubor S1A–C). Vennův diagram ilustroval, že žádný gen (společný DEG) nebyl významný ve všech třech dietních srovnáních (obrázek 2A). U krav PP bylo 460 stupňů ve srovnání HC vs. LC, 178 mezi MC vs. LC a 128 mezi HC vs. MC (doplňkový soubor S2A–C). Pouze jeden společný gen (DCN, násobná změna (FC)=−7,3) byl významný ve všech třech dietních srovnáních (obrázek 2B). To kóduje dekorin, protein, který hraje roli při sestavování kolagenových fibril. Celkově bylo patrné, že větší počet DEG byl nalezen v dietních srovnáních exprese leukocytárních genů u PP než u MP krav navzdory menší velikosti skupin, přičemž většina těchto genů byla upregulována na HC dietě. Kromě toho došlo k malému překrývání v genech identifikovaných mezi různými věkovými skupinami, jak je znázorněno na Vennových diagramech na obrázku 3. To naznačuje, že diety měly různé účinky na transkriptom leukocytů u krav PP a MP. V obou věkových skupinách byly největší rozdíly mezi dojnicemi nabízenými LC vs. HC dietou, proto jsme se v následných analýzách zaměřili na toto srovnání.

Obrázek 1. Grafy sopky ukazují profily exprese u krav MP a PP, které dostávají tři různé diety. (A) MP krávy HC vs. LC, (B) MP krávy HC vs. MC, (C) MP krávy MC vs. LC, (D) PP HC vs. LC, (E) PP HC vs. MC a (F ) PP MC vs. LC. HC: vysoká koncentrace (n=6 u krav PP a n=14 u krav MP), MC: střední koncentrace (n=5 u krav PP a n=15 u krav MP ) a LC: nízká koncentrace (n=6 u krav PP a n=14 u krav MP). Změny skladu byly log2-transformovány. Zelené tečky označují downregulované geny s p (BH) < 0.05 a násobné změny menší nebo rovné −1,5 a červené tečky označují upregulované geny s p (BH) < {{ 16}}.05 a násobné změny Větší nebo rovné 1,5. Oranžové tečky označují geny s p (BH) < 0,05, ale absolutní násobky změn < 1,5.

Obrázek 2. Vennovy diagramy ukazující odlišně exprimované geny cirkulujícími leukocyty mezi třemi dietními skupinami u (A) multiparních (MP) krav a (B) prvorodých (PP) krav. HC: vysoká koncentrace (n=6 u krav PP a n=14 u krav MP), MC: střední koncentrace (n=5 u krav PP a n=15 u krav MP ) a LC: nízká koncentrace (n=6 u krav PP a n=14 u krav MP).

Obrázek 3. Vennovy diagramy ukazující odlišně exprimované geny cirkulujícími leukocyty mezi PP a MP dojnicemi při srovnání (A) vysokého koncentrátu (HC) s nízkým obsahem koncentrátu (LC); (B) HC se středním koncentrátem (MC) a (C) MC s LC. HC: n=6 u krav PP a n=14 u krav MP, MC: n=5 u krav PP a n=15 u krav MP a LC: n {{5 }} u krav PP a n=14 u krav MP

2.5. Srovnání profilů genové exprese leukocytů mezi multiparními kravami, které dostávají stravu s vysokým nebo nízkým obsahem koncentrátu

20 nejlepších upregulovaných a downregulovaných stupňů seřazených podle hodnot p (upravený BH) u krav MP krmených HC ve srovnání s těmi, které byly krmeny dietou LC, je uvedeno v doplňkovém souboru S1D, E. Mezi upregulovanými stupni se většina podílela na GO funkce imunitního systému, proces, metabolismus a reakce na podnět, přičemž mnoho kódujících proteinů má více rolí. Například ALAS2 (kódující 50 -aminolevulinát syntázu 2) hraje roli v metabolickém procesu, reakci na podnět a vývojovém procesu. COL1A1 (alfa 1 řetězec kolagenu typu I) a DAB2 se účastní metabolismu, reakce na podnět, mnohobuněčného organismu, pohybu a vývoje. Top 20 downregulovaných genů ilustruje jasné téma změn imunity se 14 asociovanými DEG. Z nich DMTB1, FGA, FGB a TF kódují antimikrobiální peptidy, ALB a TF kódují negativní proteiny akutní fáze (APP) a FGA a FGG kódují pozitivní APP. Osm genů hraje roli v metabolismu a 10 se podílí na reakci na stimul.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

DEG leukocytů odvozené ze srovnání HC se skupinou LC byly dále podrobeny analýze obohacení GO. 76 upregulovaných stupňů bylo významně obohaceno o 208 funkcí, z nichž prvních 20 na základě skóre obohacení je zobrazeno na obrázku 4A. Ty byly spojeny s různými aspekty buněčné funkce, s vazbou růstového faktoru odvozeného z krevních destiček. Mnoho funkcí souviselo s metabolismem proteinů a aminokyselin (zahrnující APLP1, COL1A1, COL1A2, COL3A1, HTR1B a P2RY12 ve většině z nich), biomineralizací a zpracováním kolagenu (včetně COL1A1, COL1A2, SPP1 a TUFT1) a buněčnou komunikací. Naproti tomu nejvyšší funkce 97 downregulovaných stupňů měly jasné téma různých imunitních obranných procesů (obrázek 4B), které byly převážně spojeny s 20 stupni. Z nich FGA (pozitivní APP) byla snížena 85-krát ve srovnání HC vs. LC. Nástroj prohlížeče GO shrnul biologické funkce jak nahoru, tak dolů regulovaných DEG do osmi významných kategorií (tabulka 4). Kromě biomineralizace byly všechny ostatní biologické funkce, zejména ty spojené s imunitní obranou, spojeny převážně s downregulovanými DEG.

Obrázek 4. Top 20 GO funkcí spojených s DEG odvozenými z porovnání HC vs. LC. (A) MP upregulované DEG, (B) MP downregulované DEG, (C) PP upregulované DEG a (D) PP downregulované DEG.

Tabulka 4. Souhrn hlavních funkcí obohacení GO leukocytů DEG ve srovnání mezi multiparními kravami, které dostávaly vysoce (n=14) a nízko (n=14) koncentrovanou stravu na začátku laktace.

Tabulka 4. Pokr.

Kombinované up a downregulované DEG (n=173) byly významně obohaceny o 23 KEGG drah, které souvisely hlavně s různými imunitními a metabolickými procesy (tabulka 5). Na vrcholu byly komplementární a koagulační kaskády s osmi downregulovanými DEG (CFB, FGA, FGB, FGG, KNG1, PROC, SERPINA1 a VTN). Zánětlivá dráha signalizace podobné NOD byla spojena se šesti DEG (IFNB1, MAPK10, OAS1X, OAS1Y, OAS1Z a OAS2), z nichž všechny kromě MAPK10 byly downregulovány. Dráha trávení a absorpce proteinu obsahovala šest stupňů, z nichž tři (COL1A1, COL1A2 a COL3A1) byly upregulované a tři downregulované (CELA2A, COL5A3 a ELN). Pět downregulovaných DEG bylo zapojeno do signální dráhy peroxisomových proliferátorem aktivovaných receptorů (PPAR) (APOA2, APOC3, FABP1, HMGCS2 a PCK1). Dráhy interakce extracelulární matrix-receptor, fokální adheze a sfingolipidová signalizace jsou všechny zapojeny do udržování buněčné a tkáňové struktury.

Tabulka 5. Významné dráhy identifikované obohacením KEGG dráhy spojené s odlišně exprimovanými leukocytovými geny u multiparních krav, kterým byla podávána vysoce koncentrovaná dieta (n=14) ve srovnání s těmi, která byla nabízena nízkokoncentrovanou dietou (n=14).

2.6. Srovnání vzorců exprese genů pro leukocyty mezi prvorodičkami, které dostávají stravu s vysokým nebo nízkým obsahem koncentrátu

Horních 20 cirkulujících leukocytů DEG u PP krav krmených HC ve srovnání s LC dietami je uvedeno v doplňkovém souboru S2D, E. Imunitní a metabolické procesy převládaly nad biologickými funkcemi shora upregulovaných DEG, obsahujících 11 a 12 DEG, v tomto pořadí. Mezi nimi jsou ACSL6, MMP9 a SLC11A1 zapojeny do proliferace leukocytů a ACSL6, ADGRG3, COL1A2, DUSP1, HCK, MMP9 a PADI4 do vývojového procesu. SLC40A1 je hlavní přenašeč železa, který hraje klíčovou roli při vyrovnávání buněčných a systémových hladin železa. Některé z těchto DEG kódují proteiny s více funkcemi. Například MMP9, DUSP1, SLC11A1 a COL1A2 jsou spojeny s většinou výše uvedených funkcí GO. Biologické funkce shora dolů regulovaných DEG byly rozmanitější. V procesu imunitního systému se podílelo osm stupňů, pět hrálo roli v metabolismu a dva byly spojeny jak s proliferací leukocytů, tak s vývojovým procesem (EPCAM a FCRL3). Opět některé DEG, například CD96 a FCRL3, kódují proteiny s více rolemi.

U krav PP bylo 382 upregulovaných stupňů odvozených z porovnání HC vs. LC významně spojeno s 690 funkcemi GO, přičemž prvních 20 je uvedeno na obrázku 4C. Všechny tyto zahrnovaly 116° (doplňkový soubor S2F) s různými imunitními aktivitami. Vrcholnou funkcí byla signální dráha receptoru buněčného povrchu. To bylo spojeno s 43°, které zahrnovaly geny kódující mnoho receptorů pro imunitní ligandy, jako je CXCR1, CXCR2, IL17RD a IL1RAP. Tato funkce měla šest významných dílčích funkcí včetně lipopolysacharidem (LPS) zprostředkované signální dráhy (PTAFR, TLR4 a SCARB1) a signální dráhy buněčných povrchových receptorů regulovaných imunitní reakcí. Vrcholnou podfunkcí v rámci regulace mnohobuněčných organismů byla regulace produkce cytokinů s 24 upregulovanými DEG, jako jsou MARK13, LTF a TLR4. Bylo méně downregulovaných DEG (pouze 78), které byly spojeny s 298 významnými funkcemi GO, s nižším skóre obohacení a rozmanitějšími biologickými procesy. Obrázek 4D ukazuje 20 nejlepších funkcí. Řada z nich byla spojena s aspekty imunity, jako je buněčná adheze, regulace produkce mediátoru imunitní odpovědi, reakce na LPS a reakce na molekuly bakteriálního původu. Jiné souvisely s udržováním homeostázy, jako je buněčný povrch, cytolýza, transmembránový transport a endopeptidáza serinového typu. Shrnutí významných biologických funkcí spojených s up- a downregulovanými DEG vytvořilo sedm kategorií (Tabulka 6), s procesem imunitního systému navrch a většinou dalších funkcí také spojených s imunitní obranou. Například lokomoce byla obohacena DEG o chemotaktické a imunitní vlastnosti a mezidruhovou interakci mezi organismy, která zahrnuje zabíjení napadených patogenů. Jak buněčný proces, tak biologická regulace byly spojeny s velkým počtem stupňů. Buněčný proces (n=239 stupňů) zahrnoval mnoho dílčích funkcí spojených s buněčnou adhezí, zabíjením buněk, aktivací imunitních buněk a proliferací buněčné populace. Biologická regulace (125°) také zahrnuje mnoho imunitních aktivit, jako je regulace procesu imunitního systému, lokomoce a reakce na podnět. Všechny tyto funkce obsahovaly převážně upregulované DEG na HC dietě.

Tabulka 6. Shrnutí hlavních funkcí DEG obohacení GO ve srovnání mezi prvorodičkami, které nabízely vysoce (n=6) a nízko (n=6) koncentrovanou stravu na začátku laktace.

Tabulka 6. Pokr.

Kombinované up a downregulované DEG (460) u PP krav byly obohaceny o 35 významných KEGG drah (tabulka 7). Mnohé byly spojeny s metabolickými procesy zahrnujícími aminokyseliny (valin, leucin, isoleucin, arginin a glutathion), proteiny, lipidy (kyselina arachidonová, glycerolipid a cholesterol), vitamín B6 a některé hormony (aldosteron, kortizol, štítná žláza a růstový hormon ). Tyto metabolické dráhy byly převážně obohaceny o DEG upregulované na HC dietě. Například biosyntéza aminokyselin byla spojena s pěti upregulovanými DEG (ARG2, ASS1, GPT2, SDS a SDSL), dráha syntézy, sekrece a působení růstového hormonu byla obohacena o šest upregulovaných (ADCY6, CREB3L2, CREB5, FOS , MAPK13 a SOCS3) a jeden downregulovaný (BCAR1) DEG a metabolismus kyseliny arachidonové obsahoval pět upregulovaných DEG (CYP2J2, GGT5, GPX3, PLB1 a TBXAS1). Několik drah spojených s imunitním/zánětlivým procesem bylo také významně obohaceno, opět hlavně s upregulovanými DEG. Ty zahrnovaly chemokinové, MAPK a TNF signální dráhy a komplementové a koagulační kaskády. Například chemokinová signální dráha obsahovala osm upregulovaných (ADCY6, CCL16, CCR1, CXCL13, CXCR1, CXCR2, GNG7 a HCK) a dva downregulované DEG (BCAR1 a CCR5), TNF signální dráha obsahovala šest upregulovaných DEG (CREB3L2, CREB5 , FOS, MAPK13, MMP9 a SOCS3) a signální dráhy MAPK obsahovaly 12 upregulovaných stupňů, včetně IL1A, MAP3K6 a MAPK13.

Tabulka 7. Významné dráhy identifikované obohacením Keggovy dráhy spojené s odlišně exprimovanými leukocytovými geny u prvorodiček, kterým byla podávána vysoce koncentrovaná dieta (n=6) ve srovnání s těmi, která byla nabízena nízkokoncentrovanou dietou (n=6).

3. Diskuse

Poporodní dojnice mají homeostatické mechanismy pro kontrolu rozdělování živin mezi laktaci a další důležité životní funkce, jako je imunita a růst [8]. Mobilizace tkání je normální adaptace savců na podporu laktace, ale některé krávy se stávají metabolicky nevyváženými [35,37]. Taková zvířata zažívají nadměrnou mobilizaci tukové tkáně, inzulínovou rezistenci a systémový zánět, což přispívá k oslabené imunitě často pozorované v této době [38]. To je spojeno se zánětlivými mediátory, jako jsou TNF a IL6 [39,40]. V den 14 po otelení, kdy byly odebrány vzorky cirkulujících leukocytů v této studii, byly buňky proto vystaveny období zánětlivé stimulace. Pomocí sekvenování nové generace a bioinformatické analýzy jsme prokázali, že diety s různými podíly koncentrátu měly různé účinky na transkriptom cirkulujících leukocytů u krav PP a MP v časné laktaci. To bylo spojeno s rozdíly v jejich zdraví a plodnosti. Tyto informace přidaly nové poznatky k naší předchozí zprávě o vlivu stravy na produkci mléka a imunitu [32].

3.1. Porovnání účinků vysoce a nízko koncentrované stravy u multiparních krav

Krávy MP na HC dietě měly vyšší DMI než krávy MC a LC a to bylo spojeno s vyššími cirkulujícími koncentracemi glukózy i IGF{{0}}. To vedlo k tomu, že krávy HC byly v méně závažné NEB a produkovaly více mléka. HC dieta byla formulována tak, aby splňovala energetické a proteinové požadavky jak pro laktaci, tak pro udržení tělesné homeostázy a měření metabolitů potvrdilo, že jejich metabolický stav byl skutečně lepší než u LC krav, s menším požadavkem na mobilizaci tkání pro uspokojení energetických požadavků. To by mělo pomoci urychlit vyléčení poporodních zánětlivých procesů, protože mnoho zánětlivých onemocnění v časné laktaci je spojeno s metabolickými poruchami nebo je jimi způsobeno [38] a již dříve jsme ukázali, že zánět dělohy byl vyřešen rychleji u krav s lepším stavem energetické bilance. [2]. V této studii nebyl u MP krav žádný rozdíl v poměru PMN k epiteliálním buňkám v lumen dělohy podle stravy. Tento index je často považován za indikátor cytologické endometritidy [41]. Rozdíly podle stravy však byly pozorovány v mléčné žláze, protože krávy LC měly vyšší SCC a to bylo spojeno s tím, že větší podíl z nich prodělal klinickou mastitidu během prvních 16 DIM (28,6 % vs. 0 % u LC vs. HC skupiny).

Většina DEG identifikovaných v analýze leukocytového transkriptomu se podílela na imunitních a/nebo metabolických procesech, jak se očekávalo v populaci imunitních buněk. Nejvýznamnější KEGG dráhou byla komplementová a koagulační kaskáda, která zahrnovala šest nejvíce downregulovaných genů u HC krav. Z nich CFB kóduje komplementový faktor B, složku alternativní dráhy aktivace komplementu. FGA, FGB a FGG kódují tři podjednotky koagulačního faktoru fibrinogenu, klíčové složky krevní sraženiny, která je také důležitá pro vazbu bakterií na krevní destičky [42]. Vysokomolekulární forma kininogenu, kódovaná KNG1, je také nezbytná pro koagulaci krve a kininogen uvolňuje bradykinin, peptid s různými funkcemi včetně antibakteriální a antifungální aktivity. Vitronektin, kódovaný VTN, se také podílí na regulaci koagulační dráhy a hojení ran, zatímco jeho doména vázající heparin poskytuje antimikrobiální vlastnosti. PROC kóduje plazmatický glykoprotein, jehož aktivovaná forma obsahuje doménu serinové proteázy, která působí při degradaci aktivovaných forem koagulačních faktorů V a VIII, zatímco SERPINA1 kóduje inhibitor serinové proteázy, jehož cíle zahrnují plasmin, trombin a aktivátor plasminogenu. Upregulace komplementové a koagulační kaskády byla dříve prokázána v tkáni mléčné žlázy jako časná reakce hostitele na E. coli nebo Staph. infekce aureus [43]. Protože tato cesta byla více exprimována u krav na LC dietě, podporuje to důkaz o větším výskytu mastitidy u těchto zvířat.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Další špičkovou funkcí shrnutou prohlížečem GO byl proces zabíjení patogenů (mezidruhová interakce mezi organismy), který byl spojen se 14 downregulovanými DEG u krav HC (tabulka 4). To zahrnovalo řadu genů zapojených do antivirové aktivity (IFI6, IFNB1, ISG15, MX2, OAS1Y, OAS1Z, OAS2 a RSAD2), které byly exprimovány na nižších úrovních. Z nich IFNB1 kóduje interferon beta 1, zatímco ostatní jsou všechny geny stimulované interferonem [44,45]. Všechny jsou také součástí signální dráhy NOD-like receptoru (NLR). NLR jsou receptory rozpoznávající cytosolové vzorce, které jsou aktivovány různými složkami, které nejsou vlastními silami, včetně bakteriálního peptidoglykanu, a potenciálně iniciují expresi prozánětlivých cytokinů závislou na NF-kappa B-/AP-1-, expresi interferonů typu I, autofagii a zánět [46]. Naše nedávná studie prokázala, že tato dráha byla upregulována v leukocytech krav infikovaných E. coli [47]. Dalším identifikovaným genem byl MPO, kódující myeloperoxidázu, enzym uložený v azurofilních granulích PMN a makrofágů. Je uvolňován do extracelulární tekutiny během zánětlivých procesů a byl používán jako marker zánětu a oxidačního stresu [48]. IL1R2 kóduje člena rodiny receptoru interleukinu 1 a byl jedním z nejvýznamnějších downregulovaných DEG identifikovaných u MP krav. To může vázat IL1A, IL1B a receptor interleukinu 1, typ I (IL1R1/IL1RA), ale působí jako návnadový receptor k inhibici aktivity ligandu.

Gen s nejvýznamnější rozdílnou expresí mezi MP kravami na různých dietách byl FCER1A, s nižší expresí u krav HC. Ten kóduje podjednotku IgE receptoru, který je iniciátorem alergických reakcí, které se mohly vyvinout k podpoře obrany hostitele proti parazitům prostřednictvím uvolňování mediátorů, jako je histamin [49]. Je zajímavé, že FCER1A byl jedním z pouhých 18 genů, jejichž úroveň exprese byla identifikována jako rozlišující mezi plodností hovězích jalovic [50]. Jeho přesná role u skotu zůstává nejasná, ale ve studii vakcíny s telaty experimentálně infikovanými ekonomicky významným parazitickým háďátkem Ostertagia ostertagi jeho hladiny exprese v krvi korelovaly pozitivně s počtem žírných buněk a negativně s počtem červů [51]. Tři další upregulované geny u HC krav s určitou imunitní funkcí byly ALAS2, GZMB a LIF. ALAS2 kóduje 50 -aminolevulinát syntázu 2, erytroidně specifický mitochondriálně lokalizovaný enzym, který katalyzuje první a rychlost omezující krok v biosyntetické dráze hemu. Hem je nezbytným kofaktorem v řadě klíčových procesů včetně transportu kyslíku, zatímco mutace v tomto genu jsou spojovány s řadou lidských onemocnění včetně anémie [52]. GZMB kóduje preproprotein, který je secernován přirozenými zabíječskými buňkami a cytotoxickými T lymfocyty a je zpracován za vzniku aktivní proteázy, která indukuje apoptózu cílových buněk a také zpracovává cytokiny a degraduje proteiny extracelulární matrix [53]. Cytokinový inhibiční faktor leukémie, kódovaný LIF, byl původně identifikován prostřednictvím zapojení do diferenciace makrofágů, ale také se ukázalo, že hraje důležitou roli ve vývoji embryí a vzniku březosti u různých druhů, včetně skotu [54].

DEG odvozené z porovnání HC vs. LC u MP krav byly také obohaceny o několik významných drah spojených s metabolismem glukózy, proteinů a mastných kyselin. Ty zahrnovaly čtyři downregulované DEG zapojené do signálních drah PPAR (APOA2, APOC3, FABP1 a PCK1). V této studii byly v populaci leukocytů detekovány tři hlavní izoformy PPAR (A, D, G). Ačkoli exprese samotných PPAR nebyla ovlivněna stravou, tato cesta může ovlivnit expresi genů zapojených do metabolismu glukózy a lipidů, diferenciace adipocytů a zánětlivých odpovědí [55,56] a přispívá k metabolické adaptaci na omezený přísun živin. indukující geny zapojené do -oxidace [57]. Metabolická dráha retinolu byla také downregulována u krav HC s nižší expresí RBP4 a TTR (kódujících protein vázající retinol a transtyretin), které oba působí jako transportéry retinolu v krvi. Interakce retinolu se signální dráhou PPAR ovlivňuje transkripci mnoha dalších downstream genů [58]. APOA2 a APOC3 spolu s APOH jsou také součástí metabolické dráhy cholesterolu. Cholesterol je hlavní složkou plazmatické membrány a ovlivňuje její organizaci i funkci [59,60]. Nedávné studie zdůraznily vznikající roli cholesterolu jako důležitého modulátoru vrozené a adaptivní imunitní aktivity [61].

Dráha glykolýzy/glukoneogeneze byla spojena se třemi downregulovanými DEG u krav krmených HC (ADH1C, ALDOB a PCK1). Z nich PCK1 kóduje fosfoenolpyruvát karboxykinázu 1, která působí jako hlavní kontrolní bod pro regulaci glukoneogeneze. Tento enzym spolu s GTP katalyzuje tvorbu fosfoenolpyruvátu z oxaloacetátu s uvolňováním oxidu uhličitého a GDP. Aktivace imunitních/zánětlivých drah podporuje transkripci glukoneogenních genů přes toll-like receptor 4 (TLR4) [62]. To může způsobit, že imunitní buňky přepnou svůj metabolismus glukózy z oxidativní fosforylace na glykolýzu, aby produkovaly energii i živiny potřebné pro proliferaci a produkci imunitních molekul [12,63]. To vede ke zvýšené poptávce po glukóze, která soutěží s požadavkem na produkci laktátu [64].

Stručně řečeno, rozdíly v genové expresi mezi MP krávami na HC a LC dietě poskytují důkaz větší upregulované imunitní aktivity a zánětu u LC krav. To bylo doprovázeno vyšším výskytem mastitid. Naproti tomu geny kódující některé proteiny, které pravděpodobně prospívají zdraví a plodnosti, jako jsou ALAS2 a LIF, byly u HC krav upregulovány. To podporuje naměřené metabolické indexy ukazující, že došlo ke zlepšení stavu EBAL u MP krav na HC dietě, což pravděpodobně pomohlo chránit je před rozvojem infekčního nebo metabolického onemocnění.

3.2. Srovnání účinků vysoce a nízko koncentrované stravy u prvorodiček

Podobně jako krávy MP měly krávy PP na HC dietě také vyšší DMI, asi o 4 kg/d, ale dojivost se výrazně nezvýšila. Nebyly zjištěny žádné významné rozdíly v cirkulujících koncentracích glukózy, NEFA, BHB nebo IGF-1, pouze močovina byla vyšší při LC dietě. Naproti tomu mezi dietními skupinami byly významnější rozdíly v expresi genu leukocytů než u krav MP, přičemž 460 vs. 173 stupňů bylo identifikováno v porovnání HC vs. LC, z nichž 83 % bylo upregulováno u PP krav na HC dietě. Mezi těmito dvěma věkovými skupinami se překrývala pouze malá část DEG (obrázek 3), což naznačuje, že změny ve funkci leukocytů vůči rané laktační dietě byly citlivější u krav PP než u krav MP. Očekávali jsme, že HC dieta prospěje PP kravám zvýšením jejich DMI a plně splní vypočtené dietní požadavky na nedegradovatelné a metabolizovatelné bílkoviny. EBAL se skutečně zlepšil na HC dietě, ale analýza genové exprese ukázala mnohem větší upregulaci genů zapojených do imunitní obrany. Krávy krmené HC měly také vyšší poměr PMN: UEC v děloze spolu s numericky větším SCC a více případy mastitidy. To naznačuje, že ve skutečnosti byli náchylnější k nemocem spíše než méně. Již dříve jsme zjistili, že neutrofily odebrané PP kravám v této studii v prvních třech týdnech laktace měly významně vyšší fagocytární index a index oxidativního vzplanutí ve srovnání s MP dojnicemi, ale 2-způsob vlivu stravy a parity na tato měření nebyla uvedena [32].

Procesy imunitního systému identifikované v porovnání HC vs. LC zahrnovaly upregulaci receptoru buněčného povrchu a signální dráhy rozpoznávající vzory, chemotaxi, produkci cytokinů a migraci leukocytů u krav krmených HC. Identifikované DEG byly spojeny s řadou imunitních obranných mechanismů, včetně různých antimikrobiálních peptidů (AMP) (CATHL6, CXCL13, DEFB1, LTF, PGLYRP1, PGLYRP4, SA100A8, SA100A9, S100A1 a SLC11A1). Ty mohou nejen přímo zabíjet napadené organismy, ale také napomáhat modulací dalších imunitních a antimikrobiálních procesů [65–67]. Upregulace antimikrobiálních peptidů v transkriptomických profilech leukocytů byla dříve prokázána u krav s klinickou mastitidou [47,68] a metritidou/endometritidou [69,70]. Funkce adheze leukocytů byla spojena s 16 upregulovanými a pěti downregulovanými DEG u zvířat krmených HC. Adheze leukocytů ke stěnám kapilár je zásadním prvním krokem, který jim umožní transmigrovat z krve a přesunout se do míst poškození tkáně, infekce a zánětu [71]. Interakce buňka–buňka i buňka–matrice ovlivňují fenotyp leukocytů a dysregulace adhezních drah může vést k přetrvávající aktivaci leukocytů s nevyřešeným zánětem [72]. Z identifikovaných upregulovaných DEG jsou ADAM8, ANGPTL3, CD24, ICAM3 a THY1 všechny zapojeny do extravazace [73,74], zatímco FN1, NRP1, TNFAIP6 a VCAN mají potenciální roli v přenosu leukocytů a fungují v zanícených tkáních [72, 75]. Geny kódující chemokinové receptory CXCR1 a CXCR2 byly také upregulovány u krav krmených HC; obě jsou důležité při stimulaci chemotaxe PMN směrem k místům infekce a také při aktivaci biochemických procesů, které zabíjejí napadající bakterie [76].

Z downregulovaných genů spojených s adhezí u krav krmených HC, BCAR1 kóduje multifunkční protein známý jako cas se zapojením do buněčné motility, apoptózy a kontroly buněčného cyklu [77]. Polymorfismy u BCAR1 byly dříve spojeny s rezistencí na SCC a mastitidu [78]. ADGRG1 (také známý jako GPR56) kóduje receptor spřažený s G proteinem, který váže kolagen 3 a transglutaminázu 2, obě složky tkáňového stromatu. Bylo prokázáno, že ADGRG1 hraje roli v lidských přirozených zabíječských (NK) buňkách, u kterých inhibuje jejich cytotoxicitu [79]. Jeho vlastní exprese je downregulována po aktivaci indukované cytokiny, což by odpovídalo zde uvedeným výsledkům. Protein CD96 také působí jako inhibiční kontrolní receptor na NK buňkách [80]. Předchozí studie o změnách v transkriptomu leukocytů během přechodného období také nalezly změny v genové expresi související s transendoteliální migrací, i když s odlišnými závěry uvádějícími buď aktivaci po otelení [81], nebo inhibici [82]. Naše analýza také identifikovala řadu rozdílů v signálních drahách metabolismu aminokyselin u PP krav na HC dietě ve srovnání s těmi na LC dietě, spojených s enzymy kódovanými pěti upregulovanými DEG (ARG2, ASS1, GPT2, SDS a SDSL) . Z nich ASS1 kóduje arginin sukcinátsyntázu 1, která katalyzuje předposlední krok biosyntetické dráhy argininu, zatímco ARG2 kóduje arginázu, která katalyzuje hydrolýzu argininu na ornitin a močovinu. L-arginin může být také přeměněn na oxid dusnatý, signální molekulu, která hraje klíčovou roli v patogenezi zánětu [83]. Glutamicko-pyruvická transamináza 2 (GPT2) je mitochondriální enzym, který katalyzuje reverzibilní transaminaci mezi alaninem a 2-oxoglutarátem za vzniku pyruvátu a glutamátu. Tento gen je upregulován v podmínkách metabolického stresu a hraje roli v řízení glukoneogeneze z metabolismu aminokyselin [84]. Serin dehydratáza (SDS) kóduje enzym, který přeměňuje L-serin na pyruvát a amoniak, zatímco serin dehydratáza (SDSL) je pravděpodobně zapojena do dráhy biosyntézy isoleucinu z threoninu.

Cesta metabolismu cholesterolu byla spojena se čtyřmi upregulovanými DEG na HC dietě (ANGPTL3, LRP1, SCARB1 a SORT1). To by mohlo vést k akumulaci cholesterolu v leukocytech krav krmených HC a podporovat zánět, včetně augmentace TLR signalizace, aktivace zánětu a větší produkce monocytů a neutrofilů v kostní dřeni a slezině [85]. Cesta metabolismu kyseliny arachidonové s pěti upregulovanými DEG (jak bylo uvedeno výše) vede k produkci kaskád pro- a protizánětlivých produktů, jako jsou prostaglandiny a leukotrieny [86]. Cesta metabolismu glycerolipidů byla spojena se čtyřmi upregulovanými DEG (DGAT2, DGKG, GK a GPAT3), které kódují lipogenní geny zapojené do syntézy triacylglycerolu. Jeho akumulace může vyvolat aktivaci leukocytů a zánět [87,88]. Všechna tato zjištění podporují závěr, že HC dieta upregulovala metabolické dráhy leukocytů u krav PP způsobem, který zvýšil jejich imunitní/zánětlivé reakce. Předchozí práce u krav se zaměřovaly hlavně na období stání na sucho a prokázaly, že překrmování a vysoké BCS v této době podporuje následnou mobilizaci lipidů a zvýšenou zánětlivou odpověď během peripartálního období [34]. V této studii poměr PMN: UEC dělohy a trend k vyššímu SCC podporují domněnku, že u PP krav dostávajících HC dietu došlo ke zvýšené migraci leukocytů do dělohy a mléčné žlázy. I když se jedná o základní složku imunitní obrany, nadměrná aktivace může přispět k hyper-zánětu. K potvrzení těchto zjištění je nutná další studie s větší velikostí vzorku.

3.3. Podobnosti v reakci na dietu u multipar a prvorodiček

In terms of metabolic changes, both the MP and PP cows had higher circulating concentrations of urea when on the LC diet. Blood urea in both late pregnancy and early lactation may rise following mobilization of amino acids stored in skeletal muscle [89] or when dietary protein supply exceeds energy availability or protein needed [90], so these situations could have applied here. Elevated levels of urea have been associated with reduced fertility, but only at >4,5 mmol/l, vyšší než koncentrace, kterých bylo dosaženo u zvířat krmených LC v této studii [91]. Co se týče transkripčních dat leukocytárních genů, je zajímavé poznamenat, že DEG odvozené z porovnání HC vs. LC v obou věkových skupinách byly obohaceny o cestu trávení a absorpce proteinů, ve které hrají důležitou roli geny kódující různé izoformy kolagenu. . Mezi nimi byly tři upregulované geny kolagenu (COL1A1, COL1A2 a COL3A1) u MP i PP krav a jeden downregulovaný (COL5A3) kolagenový gen u MP krav. Hodnoty jejich exprese ve vzorcích byly malé, ale rozdíly byly významné. Část této RNA může pocházet z fibrocytů, buněčné populace, která obsahuje pouze 0,1–0,5 % neerytrocytárních buněk v periferní krvi [92,93]. Kolagen je dlouhodobě zavedený imunitní zesilovač, který se účastní mnoha imunitních/zánětlivých procesů [93,94]. Jeho zvýšená produkce v cirkulující krvi HC dietou může tedy ovlivnit funkci leukocytů.

3.4. Důsledky pro plodnost

Mnoho předchozích studií uvádí, že provázaný metabolický a imunitní stav a výskyt onemocnění krav v rané laktaci mají velký vliv na jejich následnou plodnost (např. [38,95]). Naše vlastní práce ukázala, že MP krávy s nízkou koncentrací IGF-1 při 14 DIM měly menší pravděpodobnost, že vůbec zabřeznou [37]. Nedávno jsme uvedli, že 63 % krav s nízkým IGF-1 v této době zaznamenalo více než jeden zdravotní problém během prvních 35 DIM ve srovnání s pouze 26 % krav s vysokým IGF-1. To zahrnovalo více zvířat s infekcí dělohy a klinickou mastitidou [10]. Foley a kol. [69] rozlišovali mezi zdravými kravami, které byly schopny obnovit homeostázu do 3 týdnů po otelení, a jinými, které zaznamenaly závažnější a prodlouženou zánětlivou reakci, která pak pokračovala ve vývoji klinické endometritidy. Souvislost s periferní krví prokázali Galvão et al. [96], kteří prokázali, že neutrofily z krav v horším EBAL měly nižší obsah glykogenu při sedmi DIM a tato zvířata prodělala více onemocnění dělohy, potenciálně spojené se sníženou dostupností oxidačních paliv pro imunitní reakce. Klinická mastitida v časné laktaci je také spojena se zvýšenou mírou preimplantačních ztrát embryí, s určitými náznaky, že nízké BCS riziko dále zvyšuje [97]. Byla navržena řada mechanismů spojených s produkcí cytokinů a prostaglandinů a dalších zánětlivých mediátorů, které by mohly ovlivnit vaječník a/nebo způsobit nepříznivé děložní prostředí [98,99]. Údaje o plodnosti získané od krav v naší studii podpořily zjištění týkající se jejich imunitního stavu a zdraví na začátku laktace. Krávy MP na LC dietě vyžadovaly číselně více S/C v souladu s jejich horším EBAL spolu s důkazy z analýzy leukocytárního transkriptomu probíhající aktivnější imunitní obrany, což podporuje jejich vyšší výskyt mastitid. Naproti tomu PP kravám na HC dietě trvalo zabřeznutí podstatně déle a méně jich zabřezlo ve srovnání s kravami krmenými LC. Měli více důkazů zánětu v časném těhotenství, i když jejich vypočítaný EBAL byl lepší. V současnosti jsou základní mechanismy způsobující jejich špatný zdravotní stav a plodnost nejisté, i když jsme také našli důkazy založené na globální genové expresi zvýšeného zánětu jater a fibrózy (Cheng, Little, Ferris, Takeda, Ingvartsen, Crowe a Wathes, nepublikovaná pozorování) .

3.5. Omezení studie

Bylo k dispozici méně krav PP na skupinu, což snížilo statistickou sílu analýz týkajících se fenotypů. K potvrzení účinků stravy na reprodukci a nemoci je proto zapotřebí další studie s větší velikostí vzorku. V této studii jsme extrahovali veškerou RNA z celé periferní krve pomocí zkumavek Tempus a jejího izolačního systému. To nabízí snadný sběr pro studii ve velkém měřítku, ale neodděluje typy buněk, které budou zahrnovat T a B lymfocyty, přirozené zabíječské buňky, krevní destičky, monocyty, granulocyty (neutrofily, eozinofily a bazofily) a fibrocyty. Prezentovaná data genové exprese byla proto ovlivněna možnými léčebnými účinky na relativní podíly konkrétních typů buněk kromě jejich individuálních transkripčních změn. Tyto výsledky jsou také založeny na úrovních transkripce genů a nezahrnují informace o jejich posttranslačním zpracování, které také ovlivní, kolik funkčního proteinu je produkováno.

4. Materiály a metody

4.1. Zvířata a diety

Všechny postupy byly provedeny podle zákona o zvířatech (vědecké postupy) z roku 1986 a pokryty licenčním číslem projektu Home Office PPL2754 a osvědčením o určení pro provozovnu. Práce byla také schválena Etickým a sociálním výborem Agri-Food and Biosciences Institute (AFBI, Belfast, Severní Irsko, Spojené království). Ze stáda AFBI bylo rekrutováno 62 holštýnsko-fríských dojnic. Z nich bylo 18 PP (laktace 1) a 44 MP s čísly laktace 2–7 (3,5 ± 1,28) a všechny krávy byly podle vyšetření veterinářem zdravé. Hmotnost při otelení byla 680 ± 62 (průměr ± STD) kg pro krávy MP a 550 ± 39 kg pro krávy PP. Po otelení byly krávy PP a MP odděleně rozděleny do tří dietních skupin, přičemž rozdělení v každé věkové skupině bylo vyváženo pro předpokládanou přenosovou schopnost pro tuk plus bílkoviny (kg), BW před otelením a BCS. Krávy MP byly také vyváženy z hlediska parity a předchozí 305-denní dojivosti laktace. Krávám byl nabídnut buď (1) nízký koncentrát (LC, 30% koncentrát plus 70% travní siláž, n=6 pro PP a n=14 pro MP); (2) střední koncentrát (MC, 50 % koncentrát plus 50 % travní siláž, n=6 pro PP a n=15 pro MP) nebo (3) vysoký koncentrát (HC, 70 % koncentrát plus 30 % travní siláž, n=6 pro PP a n=15 pro MP) diety (procenta na bázi sušiny). Koncentrát pro každou léčbu byl formulován tak, aby se dosáhlo běžné celkové koncentrace surových bílkovin (CP) v potravě pro každou z LC, MC a HC (152, 152 a 154 g/kg sušiny), zatímco vypočtená celková dieta metabolizovatelná energie ( ME) obsahy byly 12,0, 12,4 a 12,8 MJ/kg sušiny. Odhaduje se, že diety dodávají 1556, 1997 a 2420 g/den účinného proteinu degradovatelného v bachoru; 559, 733 a 888 g/den dietního nedegradovatelného proteinu a 1346, 1817 a 2275 g/den metabolizovatelného proteinu pro LC, MC a HC, v daném pořadí. Přístup k ošetřovaným krmným dávkám byl kontrolován krmným systémem Calan Broadbent (American Calan Inc., Northwood, NH, USA) napojeným na elektronický identifikační systém, který umožňoval denně zaznamenávat jednotlivé příjmy krav. Diety pro každou léčbu byly nabízeny ve 107 % příjmu z předchozích dnů, aby byla zajištěna konzumace ad libitum. Všem kravám bylo také nabídnuto dalších 0,5 kg koncentrátu při každém dojení prostřednictvím systému krmení v dojírně, aby se pomohl udržet účinný tok krav. Tato studie byla součástí širšího projektu a všechny podrobnosti o nabízených dietách, řízení krmení a složení krmiva byly popsány dříve [32].

4.2. Sběr dat fenotypu krávy

Tělesná hmotnost byla zaznamenávána dvakrát týdně pomocí váhových vah. BCS byl odhadnut na přibližně 14 DIM [100]. Všechny krávy byly podojeny dvakrát denně a byly zaznamenávány jejich denní výnosy. Vzorky mléka byly analyzovány dvakrát týdně pomocí střední infračervené analýzy na koncentrace proteinu, tuku a laktózy a byly počítány mléčné somatické buňky. Další ranní vzorky mléka (2 × 8 ml) byly odebírány dvakrát týdně a skladovány při -18 ◦C pro analýzu LDH (EC. 1.1.1.27) a NAGázy (EC 3.2.1.30) pomocí fluorometrických testů [101]. Energeticky korigovaná dojivost (ECM; kg/den) byla vypočtena podle metod používaných v naší skupině [32]. EBAL každé krávy byl odhadnut pomocí výše popsané metody [102].

Klinická mastitida byla diagnostikována pomocí standardních metod založených na každodenním pozorování abnormálních změn ve vzhledu mléka (např. vločky, sraženiny), kvalitě, dojivosti a zánětlivých reakcích mléčné žlázy (zarudnutí, otok, horkost nebo bolest). Hodnoty SCC mléka spolu s klinickými diagnózami byly použity ke kategorizaci krav do tří skupin. Zdravé krávy byly definovány jako s SCC < 100,000 buněk/ml mléka a bez klinických příznaků. Subklinicky mastitické krávy byly definovány jako krávy s SCC mezi 100,000 a 400,{5}} buněk/ml mléka a bez zjevných klinických příznaků. Krávy, u kterých byla diagnostikována klinická mastitida, měly SCC > 400,{7}} buněk/ml mléka a vykazovaly některé z výše uvedených klinických příznaků. Krávy byly inseminovány při pozorovaném říji za použití běžné praxe stáda a údaje o plodnosti po dobu následující laktace nebo do vyřazení zvířete byly získány ze záznamů stáda. Vykazované údaje zahrnovaly dny do prvního porodu (DFS), dny do zabřeznutí (dny otevření), počet výkonů na počet zabřeznutých krav a podíl krav, které zabřezly. Kromě toho byly údaje o početí hodnoceny pomocí 4-bodu u telete podle (ICB) skóre jako (1)<100 days, (2) 100–200 days, (3) >200 dní, nebo (4) se nepodařilo zabřeznout nebo utratit.

4.3. Cytologická analýza dělohy

Vzorek děložního cytobrush (Minitube, Minitüb GmbH, Tiefenbach, Německo) byl odebrán každé krávě přibližně ve 14 DIM k vyhodnocení endometriální cytologie, jak bylo popsáno dříve [103]. Cytobrush s dvojitým krytem byl manuálně veden přes děložní hrdlo do dělohy, vnitřní kryt byl vytlačen z vnějšího krytu a kartáček byl jemně rotován proti stěně endometria. Kartáček byl poté vytažen do vnitřního krytu a odstraněn. Sklíčka pro cytologické vyšetření byla připravena navalením cytokartonu na čisté skleněné mikroskopické sklíčko a fixací vzorku pomocí Fisherbrand™ CytoPrep™ Cytology Fixative (Fishers Scientific, Blanchardstown, Irsko). Fixovaná sklíčka byla odeslána na UCD School of Veterinary Medicine, University College Dublin, Irsko ke zpracování a obarvena modifikovaným barvivem Giemsa. Cytologické hodnocení bylo provedeno počítáním PMNs UEC při 400násobném zvětšení (Leitz Labourlux-S, Wetzlar, Německo) a stanovením jejich poměru, zprůměrováním počtu 10 vysoce výkonných polí na sklíčko.

4.4. Analýza cirkulujících metabolitů a IGF-1

14 ± 2 (průměr ± STD) dnů po otelení bylo odebráno 10 ml krevních vzorků z krční žíly všech krav do zkumavek s heparinem sodným pro plazmu a obyčejných zkumavek pro sérum. Po separaci plazmy nebo séra centrifugací byly až do analýzy skladovány při -20 ◦C. Koncentrace plazmatické glukózy, močoviny, BHB, NEFA a cholesterolu byly měřeny pomocí metod popsaných dříve [20,25]. Stručně, koncentrace NEFA v séru byla stanovena metodou ACS-ACOD za použití souprav NEFA C (Wako, Neuss, Německo). Glukóza v plazmě byla kvantifikována enzymatickou metodou (ADVIA 1800 Clinical Chemistry System, Siemens Healthcare Diagnostics, Ballerup, Dánsko). Sérový BHB byl stanoven měřením absorbance při 340 nm v důsledku produkce NADH při alkalickém pH v přítomnosti BHB dehydrogenázy. Sérová močovina byla analyzována spektrofotometrií. Intra- a inter-test variační koeficienty (CV) byly ve všech případech pod třemi a čtyřmi procenty, v daném pořadí, jak pro nízké, tak pro vysoké kontrolní vzorky. Koncentrace sérového IGF-1 byly kvantifikovány radioimunoanalýzou po extrakci kyselým ethanolem [104]. Intra-test CV byl 12,4, 7,5 a 9,9 % pro nízké, střední a vysoké kontrolní vzorky, v daném pořadí.

4.5. Extrakce krevní RNA

Vzorky krve pro extrakci RNA byly odebrány pomocí jugulární venepunkce od všech krav při 14 ± 2 DIM do zkumavek Tempus krevní RNA (Thermo-Fisher Scientific, Loughborough, UK). Ihned po odběru byly zkumavky intenzivně třepány po dobu 15–2{16}} sekund, poté byly zmraženy a skladovány při −80 ◦C pro extrakci RNA. RNA z plné krve byla extrahována pomocí izolačních souprav Tempus Spin RNA (Thermo-Fisher) podle pokynů výrobce, jak bylo popsáno dříve [20]. K hodnocení množství a integrity RNA byl použit Agilent BioAnalyzer 2000 (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK) s Agilent RNA 6000 Nano Kit (Agilent Technologies UK Ltd., Cheadle, UK). Množství a čistota byly navíc ověřeny pomocí NanoDrop 1000 (Thermo Fischer). Údaje o kvalitě jsou shrnuty v doplňkovém souboru S3. To ukázalo, že všechny vzorky RNA měly přiměřenou integritu (číslo RIN > 8,7, 9,3 ± 0,3) a čistotu (260/280 mezi 2,01 a 2,15, průměr ± STD 2,10 ± 0,03), takže žádná zvířata nebyla z analýzy odstraněna. RNA byla skladována při -80 °C pro následné sekvenování RNA.

4.6. RNA-sekvenování, mapování a kvantifikace

Extrahovaná leukocytová RNA byla sekvenována na platformě Illumina NextSeq 500, jak bylo popsáno dříve [68]. Stručně, pomocí pracovní stanice pro manipulaci s kapalinami epMotion (Eppendorf, Hamburg, Německo) bylo 750 ng celkové RNA reverzně transkribováno do sekvenačních knihoven cDNA pomocí sady Illumina TruSeq Stranded Total RNA Library Prep Ribo-Zero Gold kit (Illumina, San Diego, CA, USA ). Sdružené knihovny cDNA byly sekvenovány na sekvenátoru Illumina NextSeq 500 při čtení na jednom konci délky 75 nukleotidů, aby bylo dosaženo v průměru 33,5 milionů čtení na vzorek. Nezpracované soubory FASTQ byly uloženy do European Nucleotide Archive (E-MTAB-9347 a E-MTAB-9431). Všechny sekvenační analýzy byly provedeny pomocí CLC Genomic Workbench v21 (Qiagen, Manchester, UK). Každý vzorek obsahoval čtení ze čtyř pruhů a byly sloučeny do jednoho souboru fastq. Kvalita nezpracovaných i oříznutých souborů fastq byla hodnocena pomocí Illumina Pipeline 1.8 a všechna neúspěšná čtení byla odstraněna. Čtení byla poté mapována do referenčního genomového sestavení Bos taurus (ARS-UCD1.2 poskytnutá RefSeq na https://www. ncbi.nlm.nih.gov/assembly, přístupná 1. ledna 2021) a kvantifikována jako čtení na gen, čtení na milion kilobází (RPKM) a přepisy na milion kilobází (TPM). Ty byly uloženy jako soubory genové exprese (GE) v CLC Genomics Workbench pro použití pro následující analýzu diferenciální genové exprese.

4.7. Analýza diferenciální genové exprese mezi dietními skupinami

Před diferenciální analýzou exprese pro dietní účinek jsme použili analýzu hlavních složek (PCA) s hodnotami RPKM k identifikaci odlehlých hodnot, což ukázalo, že dvě krávy (Blood020009, MP a Blood020103, PP) byly odlehlé hodnoty populace a byly proto vyloučeny z další analýzy (doplňkový soubor S4A). Analýza hlavní složky také ukázala, že došlo pouze k omezenému překrývání v celkovém vzoru genové exprese mezi kravami PP a MP (doplňkový soubor S2B). To podpořilo původní návrh studie analyzovat každou věkovou skupinu zvlášť. Soubory GE odvozené ze všech jednotlivých vzorků byly proto rozděleny podle věkových skupin (PP, n=5–6 na skupinu a MP, n=14–15 na skupinu). DEG mezi dietními skupinami u krav PP nebo MP byly identifikovány pomocí CLC Genomics Workbench V21 pomocí jednosměrného postupu podobného ANOVA. Míra falešných objevů (FDR) pro více testů byla upravena pomocí Benjamini-Hochberga (BH) a významnost byla uvažována při p < 0,05. násobné změny (FC) byly vypočteny jako poměr genové exprese skupiny s vyšším koncentrátem ke skupině s nižším koncentrátem (např. HC vs. LC, MC vs. LC nebo HC vs. MC), pokud hodnota skupiny s vyšším koncentrátem byla vyšší než u skupiny s nižším koncentrátem (pozitivní násobná změna, upregulace). Pokud byla hodnota skupiny s nižším koncentrátem vyšší než u skupiny s vyšším koncentrátem, použil se poměr skupiny s nižším koncentrátem ke skupině s vyšším koncentrátem (např. LC vs. HC, MC vs. HC a LC vs. MC ) (negativní násobná změna, downregulace). DEG upregulované a downregulované s absolutní násobnou změnou Větší nebo rovnající se 1,5 mezi dietními skupinami byly vybrány pro další analýzu.

4.8. Analýza obohacení genové ontologie (GO).

DEG odvozené z párových srovnání mezi dietními skupinami byly vloženy do Partek Genomics Suite V7.1 (Partek Incorporation, Chesterfield, MO, USA) pro analýzu obohacení GO pro zkoumání biologických funkcí a interakcí mezi DEG a související Kyoto Encyclopedia of Dráhy genů a genomů (KEGG) s genomem Bos taurus ARS-UCD1.2. Byl použit Fisherův exaktní test s úpravou BH a statistická významnost byla uvažována při p < 0,05.

4.9. Statistická analýza fenotypových dat

Údaje získané od všech krav byly nejprve rozděleny podle věkové skupiny (krávy PP a MP) podle návrhu studie. Hodnoty DMI, BW, parametry mléka, EBAL, BCS, cirkulující metabolity (glukóza, močovina, BHB, NEFA, cholesterol a IGF{{0}}), SCC (logaritmicky transformované) a počty děložních buněk a jejich poměry byly shrnuty jako průměr ± standardní chyba průměru (SE). Statistická analýza byla použita k porovnání rozdílů mezi dietními skupinami pomocí jednocestné ANOVA zabudované do softwarového balíku SPSS V28 (Chicago, IL, USA). Homogenita rozptylu pro každou proměnnou byla testována pomocí statistiky Levene před ANOVA. Výsledky ukázaly, že homogenity mezi skupinami pro ECM, EBAL, glukózu, močovinu, BHB a IGF-1 u PP krav nebylo dosaženo, proto byla pro tyto proměnné použita logaritmická transformace. Tam, kde ANOVA prokázala významnost, byla provedena vícenásobná srovnání s Fisherovou metodou LSD, aby se identifikoval zdroj rozdílů. Vzhledem k tomu, že po logaritmické transformaci nebylo možné dosáhnout homogenity rozptylu pro data mléčného SCC a děložní cytologie, byly tyto proměnné testovány pomocí Kruskal-Wallis jednosměrné ANOVA s Dunnovým vícenásobným srovnáním. Údaje o plodnosti byly testovány Wilcoxonovou metodou. Ve všech případech byla významnost uvažována při p < 0,05.

5. Závěry

Tato studie podporuje dřívější práci při prokazování jasných souvislostí mezi metabolickým stavem krav na začátku laktace a jejich imunitní funkcí. Většina předchozích výzkumů zaměřených na zlepšení poporodního zdraví prostřednictvím lepší výživy se zaměřila na předporodní období a prokázala, že nadměrné krmení a vysoké BCS v tomto období podporují následnou mobilizaci lipidů a zvýšenou zánětlivou odpověď během peripartálního období [34]. Místo toho jsme hodnotili, zda je možné změnit imunitní funkci po otelení změnou laktační stravy. Zjistili jsme, že reakce na další zahrnutí koncentrátu, který poskytl stravu formulovanou tak, aby vyhovovala energetickým a proteinovým požadavkům zvířete, vyvolala různé účinky na transkriptom leukocytů u krav MP a PP. U MP krav byla HC dieta jednoznačně prospěšná, protože leukocyty LC krávy měly upregulaci komplementové a koagulační kaskády a vrozené imunitní obranné mechanismy proti patogenům. Naproti tomu leukocyty u krav PP na HC dietě vykazovaly větší imunitní/zánětlivé reakce a měly vyšší poměr PMN:UEC, což naznačuje zvýšenou migraci leukocytů do dělohy. Tyto krávy měly následně delší interval od telení do zabřeznutí, což ukazuje na horší plodnost. Je zapotřebí další práce s větším počtem krav, aby se potvrdilo zjištění vlivu stravy na plodnost a aby se lépe pochopilo, jak se liší metabolické reakce poporodní stravy u mladších zvířat.

Reference

1. Kachna divoká, BA; Dekkers, JC; Irsko, MJ; Leslie, KE; Sharif, S.; Vankampen, CL; Wagter, L.; Wilkie, BN Změna imunitní reakce během peripartálního období a její důsledky na zdraví dojnic a telat. J. Dairy Sci. 1998, 81, 585–595. [CrossRef] [PubMed]

2. Wathes, DC; Cheng, Z.; Chowdhury, W.; Fenwick, MA; Fitzpatrick, R.; Morris, DG; Patton, J.; Murphy, JJ Negativní energetická bilance mění globální genovou expresi a imunitní reakce v děloze dojnic po porodu. Physiol. Genom. 2009, 39, 1–13. [CrossRef]

3. Ingvartsen, KL; Moyes, K. Výživa, imunitní funkce a zdraví dojného skotu. Zvíře 2013, 7 (Suppl. 1), 112–122. [CrossRef] [PubMed]

4. Kehrli, ME, Jr.; Nonnecke, BJ; Roth, JA Změny ve funkci bovinních neutrofilů během periparturiního období. Dopoledne. J. Vet. Res. 1989, 50, 207–214. [PubMed]

5. Ster, C.; Loiselle, MC; Lacasse, P. Vliv koncentrace neesterifikovaných mastných kyselin v séru po otelení na funkčnost imunitních buněk skotu. J. Dairy Sci. 2012, 95, 708–717. [CrossRef] [PubMed]

6. Lacetera, N.; Scalia, D.; Bernabucci, U.; Ronchi, B.; Pirazzi, D.; Nardone, A. Funkce lymfocytů u nadměrně kondiciovaných krav kolem porodu. J. Dairy Sci. 2005, 88, 2010–2016. [CrossRef] [PubMed]

7. Nonnecke, BJ; Kimura, K.; Goff, JP; Kehrli, ME, Jr. Účinky mléčné žlázy na funkční kapacity krevních mononukleárních leukocytárních populací z periparturientních krav. J. Dairy Sci. 2003, 86, 2359–2368. [CrossRef]

8. Habel, J.; Sundrum, A. Nesoulad alokace glukózy mezi různé životní funkce v přechodném období dojnic. Zvířata 2020, 10, 1028. [CrossRef]

9. Horst, EA; Kvidera, SK; Baumgard, LH Vyzvaná recenze: Vliv imunitní aktivace na zdraví a užitkovost krav v přechodu – kritické hodnocení tradičních dogmat. J. Dairy Sci. 2021, 104, 8380–8410. [CrossRef]

10. Wathes, DC; Becker, F.; Buggiotti, L.; Crowe, MA; Ferris, C.; Foldager, L.; Grelet, C.; Hostens, M.; Ingvartsen, KL; Marchitelli, C.; a kol. Asociace mezi koncentracemi cirkulujícího IGF-1, stavem onemocnění a transkriptomem leukocytů u dojnic v rané laktaci. Přežvýkavci 2021, 1, 147–177. [CrossRef]

11. Dimeloe, S.; Burgener, AV; Grahlert, J.; Hess, C. metabolismus T-buněk řídící aktivaci, proliferaci a diferenciaci; modulární pohled. Imunologie 2017, 150, 35–44. [CrossRef] [PubMed]

12. Loftus, RM; Finlay, DK Imunometabolismus: Buněčný metabolismus mění imunitní regulátor. J. Biol. Chem. 2016, 291, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

13. Bauman, DE; Currie, WB Rozdělení živin během těhotenství a kojení: Přehled mechanismů zahrnujících homeostázu a homeorézu. J. Dairy Sci. 1980, 63, 1514–1529. [CrossRef] [PubMed]

14. Drackley, JK ADSA Foundation Scholar Award. Biologie dojnic v přechodném období: konečná hranice? J. Dairy Sci. 1999, 82, 2259–2273. [CrossRef] [PubMed]

15. Jabbour, HN; Prodej, KJ; Catalano, RD; Norman, JE Zánětlivé dráhy v ženském reprodukčním zdraví a nemoci. Reprodukce 2009, 138, 903–919. [CrossRef]

16. Pascottini, OB; LeBlanc, SJ Modulace imunitní funkce v peripartu bovinní dělohy. Teriogenologie 2020, 150, 193–200. [CrossRef]

17. Sheldon, IM; Lewis, GS; LeBlanc, S.; Gilbert, RO Definování poporodního onemocnění dělohy u skotu. Theriogenology 2006, 65, 1516–1530. [CrossRef]

18. Kuhla, B. Přehled: Prozánětlivé cytokiny a hypotalamický zánět: Důsledky nedostatečného příjmu krmiva u přechodných dojnic. Zvíře 2020, 14, s65–s77. [CrossRef]

19. Ingvartsen, KL; Moyes, KM Faktory přispívající k imunosupresi u dojnic v periparturiním období. Jpn. J. Vet. Res. 2015, 63 (Suppl. 1), S15–S24.

20. Wathes, DC; Cheng, Z.; Salavati, M.; Buggiotti, L.; Takeda, H.; Tang, L.; Becker, F.; Ingvartsen, KI; Ferris, C.; Hostens, M.; a kol. Vztahy mezi metabolickými profily a genovou expresí v játrech a leukocytech dojnic v časné laktaci. J. Dairy Sci. 2021, 104, 3596–3616. [CrossRef]

21. Pinedo, P.; Melendez, P. Poruchy jater spojené s metabolickou nerovnováhou u dojnic. Vet. Clin. N. Am. Jídlo Anim. Praxe. 2022, 38, 433–446. [CrossRef] [PubMed]

22. Fenwick, MA; Fitzpatrick, R.; Kenny, DA; Diskin, MG; Patton, J.; Murphy, JJ; Wathes, DC Vzájemné vztahy mezi negativní energetickou bilancí (NEB) a regulací IGF v játrech laktujících dojnic. Domest. Anim. Endocrinol. 2008, 34, 31–44. [CrossRef] [PubMed]

23. Kobayashi, Y.; Boyd, CK; Bracken, CJ; Lamberson, WR; Keisler, DH; Lucy, MC Snížená ribonukleová kyselina receptoru růstového hormonu (GHR) v játrech skotu v období porodu je způsobena specifickou down-regulací GHR 1A, která je spojena se sníženým růstovým faktorem podobným inzulínu I. Endocrinology 1999, 140, 3947–3954. [CrossRef]

24. Kvidera, SK; Horst, EA; Abuajamieh, M.; Mayorga, EJ; Fernandez, MV; Baumgard, LH Požadavky na glukózu aktivovaného imunitního systému u laktujících holštýnských krav. J. Dairy Sci. 2017, 100, 2360–2374. [CrossRef] [PubMed]

25. Cheng, Z.; Wylie, A.; Ferris, C.; Ingvartsen, KL; Wathes, DC; Gplus, EC Vliv stravy a hladin neesterifikovaných mastných kyselin na globální transkriptomické profily v cirkulujících mononukleárních buňkách periferní krve u dojnic v rané laktaci. J. Dairy Sci. 2021, 104, 10059–10075. [CrossRef]

26. Wathes, DC; Fenwick, M.; Cheng, Z.; Bourne, N.; Llewellyn, S.; Morris, DG; Kenny, D.; Murphy, J.; Fitzpatrick, R. Vliv negativní energetické bilance na cykličnost a plodnost u vysokoprodukčních dojnic. Theriogenology 2007, 68 (Suppl. 1), S232–S241. [CrossRef]

27. Santos, JE; Bisinotto, RS; Ribeiro, ES Mechanismy, které jsou základem snížené plodnosti u anovulárních dojnic. Theriogenology 2016, 86, 254–262. [CrossRef]

28. Pascottini, OB; Leroy, J.; Opsomer, G. Malaadaptace na přechodné období a důsledky na plodnost dojnic. Reprod. Dom. Anim. 2022, 57 (Suppl. 4), 21–32. [CrossRef]

29. Leroy, JL; Valckx, SD; Jordaens, L.; De Bie, J.; Desmet, KL; Van Hoeck, V.; Britt, JH; Marei, WF; Bols, PE Výživa a metabolické zdraví matek ve vztahu ke kvalitě oocytů a embryí: Kritické názory na to, co jsme se naučili z modelu dojnice. Reprod. Fertil. Dev. 2015, 27, 693–703. [CrossRef]

30. Coffey, MP; Hickey, J.; Brotherstone, S. Genetické aspekty růstu holštýnsko-fríských dojnic od narození do dospělosti. J. Dairy Sci. 2006, 89, 322–329. [CrossRef]

31. Wathes, DC; Cheng, Z.; Bourne, N.; Taylor, VJ; Coffey, poslanec; Brotherstone, S. Rozdíly mezi prvorodičkami a vícerodičkami ve vzájemných vztazích mezi metabolickými znaky, dojivostí a skóre tělesné kondice v periparturiním období. Domest. Anim. Endocrinol. 2007, 33, 203–225. [CrossRef] [PubMed]

32. Malý, MW; Wylie, ARG; O'Connell, NE; Welsh, MD; Grelet, C.; Bell, MJ; Gordon, A.; Ferris, CP Imunologické účinky změny koncentrace koncentrátu v krmivu na bázi travní siláže pro rané laktace holštýnských fríských krav. Zvíře 2019, 13, 799–809. [CrossRef] [PubMed]

33. Buggiotti, L.; Cheng, Z.; Salavati, M.; Wathes, CD; Genotype plus Environment, C. Srovnání transkriptomu v cirkulujících leukocytech v časné laktaci mezi prvorodičkami a dojnicemi vícerodičkami poskytuje důkazy pro změny související s věkem. BMC Genom. 2021, 22, 693. [CrossRef] [PubMed]

34. Cardoso, FC; Kalscheur, KF; Drackley, JK Přehled sympozia: Strategie výživy pro zlepšení zdraví, produkce a plodnosti během přechodného období. J. Dairy Sci. 2020, 103, 5684–5693. [CrossRef] [PubMed]

35. Ingvartsen, KL Nemoci související s krmením a řízením u přechodných krav. Anim. Feed Sci. Technol. 2006, 126, 175–213. [CrossRef]

36. Ferris, CP; Gordon, FJ; Patterson, DC; Mayne, CS; McCoy, MA Krátkodobé srovnání užitkovosti čtyř systémů produkce mléka založených na pastvinách pro dojnice telení na podzim. Grass Foage Sci. 2003, 58, 8. [CrossRef]

37. Taylor, VJ; Cheng, Z.; Pushpakumara, PG; Beever, DE; Wathes, DC Vztahy mezi plazmatickými koncentracemi inzulínu podobného růstového faktoru-I u dojnic a jejich plodností a dojivostí. Vet. Rec. 2004, 155, 583–588. [CrossRef]

38. LeBlanc, SJ Interakce metabolismu, zánětu a zdraví reprodukčního traktu v poporodním období u mléčného skotu. Reprod. Domc. Anim. 2012, 47 (Suppl. 5), 18–30. [CrossRef]

39. Vailati-Riboni, M.; Kanwal, M.; Bulgari, O.; Meier, S.; Kněz, NV; Burke, ČR; Kay, JK; McDougall, S.; Mitchell, MD; Walker, CG; a kol. Skóre tělesného stavu a rovina výživy před porodem ovlivňují transkriptomové regulátory tukové tkáně a metabolismus a zánět u pasoucích se dojnic v přechodném období. J. Dairy Sci. 2016, 99, 758–770. [CrossRef]

40. Trevisi, E.; Minuti, A. Hodnocení vrozené imunitní odpovědi u krávy v období porodu. Res. Vet. Sci. 2018, 116, 47–54. [CrossRef]

41. Druker, SA; Sicsic, R.; van Straten, M.; Goshen, T.; Kedmi, M.; Raz, T. Diagnostika cytologické endometritidy u dojnic prvorodičných versus vícerodých. J. Dairy Sci. 2022, 105, 665–683. [CrossRef] [PubMed]

42. Hamzeh-Cognasse, H.; Laradi, S.; Osselaer, JC; Cognasse, F.; Garraud, O. Snížení patogenu amotosalen-HCl-UVA nemění poststorage metabolismus rozpustného ligandu CD40, ligandu Ox40 a interkeukinu-27, cytokinů, které se obecně spojují se závažnými nežádoucími účinky. Vox zpíval. 2015, 108, 205–207. [CrossRef] [PubMed]

43. de Greeff, A.; Zadoks, R.; Ruuls, L.; Toussaint, M.; Nguyen, TK; Downing, A.; Rebel, J.; Stockhofe-Zurwieden, N.; Smith, H. Časná odezva hostitele v mléčné žláze po experimentální expozici Streptococcus uberis u jalovic. J. Dairy Sci. 2013, 96, 3723–3736. [CrossRef] [PubMed]

44. Cheng, Z.; Chauhan, L.; Barry, AT; Abudureyimu, A.; Oguejiofor, CF; Chen, X.; Wathes, DC Akutní virová infekce bovinního virového průjmu inhibuje expresi genů stimulovaných interferonem tau v endometriu skotu. Biol. Reprod. 2017, 96, 1142–1153. [CrossRef]

45. Schoggins, JW Interferonem stimulované geny: Co všechno dělají? Annu. Virol. 2019, 6, 567–584. [CrossRef] [PubMed]

46. ​​Ohto, U. Aktivační a regulační mechanismy NOD-like receptorů založené na strukturní biologii. Přední. Immunol. 2022, 13, 953530. [CrossRef]

47. Cheng, Z.; Palma-Vera, S.; Buggiotti, L.; Salavati, M.; Becker, F.; Werling, D.; Wathes, DC; Gplus, EC Transkriptomická analýza cirkulujících leukocytů získaných během zotavování z klinické mastitidy způsobené Escherichia coli u holštýnských dojnic. Zvířata 2022, 12, 2146. [CrossRef]

48. Loria, V.; Dato, I.; Graziani, F.; Biasucci, LM Myeloperoxidáza: Nový biomarker zánětu u ischemické choroby srdeční a akutních koronárních syndromů. Mediat. Inflamm. 2008, 2008, 135625. [CrossRef]

49. Olivera, A.; Beaven, MA; Metcalfe, DD Žírné buňky signalizují jejich význam pro zdraví a nemoci. J. Allergy Clin. Immunol. 2018, 142, 381–393. [CrossRef]

50. Dickinson, SE; Griffin, BA; Elmore, MF; Kriese-Anderson, L.; Elmore, JB; Dyce, PW; Rodning, SP; Biase, FH transkriptomové profily v periferních bílých krvinkách v době umělé inseminace rozlišují hovězí jalovice s různým potenciálem plodnosti. BMC Genom. 2018, 19, 129. [CrossRef]

51. Van Meulder, F.; Van Coppernolle, S.; Borloo, J.; Rinaldi, M.; Li, RW; Chiers, K.; Van den Broeck, W.; Vercruysse, J.; Claerebout, E.; Geldhof, P. Granulová exocytóza granulysinu a granzymu B jako potenciální klíčový mechanismus ve vakcínou indukované imunitě skotu proti háďátku Ostertagia ostertagi. Infikovat. Immun. 2013, 81, 1798–1809. [CrossRef] [PubMed]

52. Taylor, JL; Brown, BL Strukturální základ pro dysregulaci syntázy kyseliny aminolevulové u lidských onemocnění. J. Biol. Chem. 2022, 298, 101643. [CrossRef] [PubMed]

53. Trapani, JA; Sutton, VR Granzyme B: Proapoptotické, antivirové a protinádorové funkce. Curr. Opin. Immunol. 2003, 15, 533–543. [CrossRef] [PubMed]

54. Campanile, G.; Baruselli, PS; Limone, A.; D'Occhio, MJ Lokální působení cytokinů a imunitních buněk v komunikaci mezi konceptem a dělohou během kritického období raného vývoje, uchycení a implantace embrya – Důsledky pro přežití embryí u skotu: Přehled. Teriogenologie 2021, 167, 1–12. [CrossRef] [PubMed]

55. Bougarne, N.; Weyers, B.; Desmet, SJ; Deckers, J.; Ray, DW; Staels, B.; De Bosscher, K. Molekulární působení PPARalpha v metabolismu lipidů a zánětu. Endokr. Rev. 2018, 39, 760–802. [CrossRef]

56. Sobolev, VV; Tchepourina, E.; Korsunskaya, IM; Geppe, NA; Chebysheva, SN; Soboleva, AG; Mezentsev, A. Role transkripčního faktoru PPAR-gama v patogenezi psoriázy, kožních buněk a imunitních buněk. Int. J. Mol. Sci. 2022, 23, 9708. [CrossRef]

57. Píseň, S.; Attia, RR; Connaughton, S.; Niesen, MI; Ness, GC; Elam, MB; Hori, RT; Cook, GA; Park, EA Peroxisomový proliferátorem aktivovaný receptor alfa (PPARalfa) a PPAR gama koaktivátor (PGC-1alfa) indukují karnitin palmitoyltransferázu IA (CPT-1A) prostřednictvím nezávislých genových elementů. Mol. Buňka. Endocrinol. 2010, 325, 54–63. [CrossRef]

58. Ziouzenková, O.; Plutzky, J. Metabolismus retinoidů a odpovědi jaderných receptorů: Nové poznatky o koordinované regulaci komplexu PPAR-RXR. FEBS Lett. 2008, 582, 32–38. [CrossRef]

59. Espenshade, PJ; Hughes, AL Regulace syntézy sterolů u eukaryot. Annu. Genet. 2007, 41, 401–427. [CrossRef]

60. Van Meer, G.; Voelker, DR; Feigenson, GW Membránové lipidy: Kde jsou a jak se chovají. Nat. Mol. Buňka. Biol. 2008, 9, 112–124. [CrossRef]

61. Aguilar-Ballester, M.; Herrero-Cervera, A.; Vinue, A.; Martinez-Hervas, S.; Gonzalez-Navarro, H. Vliv metabolismu cholesterolu na funkci imunitních buněk a aterosklerózu. Živiny 2020, 12, 2021. [CrossRef] [PubMed]

62. Mamedová, LK; Yuan, K.; Laudick, AN; Fleming, SD; Mashek, DG; Bradford, BJ Toll-like receptor 4 signalizace je nutná pro indukci glukoneogenní genové exprese palmitátem v buňkách lidského karcinomu jater. J. Nutr. Biochem. 2013, 24, 1499–1507. [CrossRef] [PubMed]

63. Soto-Heredero, G.; Gomez de Las Heras, MM; Gabande-Rodriguez, E.; Oller, J.; Mittelbrunn, M. Glykolýza-Klíčový hráč v zánětlivé odpovědi. FEBS J. 2020, 287, 3350–3369. [CrossRef] [PubMed]

64. Kominský, DJ; Campbell, EL; Colgan, SP Metabolické posuny v imunitě a zánětu. J. Immunol. 2010, 184, 4062–4068. [CrossRef]

65. Afacan, NJ; Yeung, AT; Pena, OM; Hancock, RE Terapeutický potenciál obranných peptidů hostitele u infekcí rezistentních na antibiotika. Curr. Pharm. Des. 2012, 18, 807–819. [CrossRef]

66. Auvynet, C.; Rosenstein, Y. Multifunkční obranné peptidy hostitele: Antimikrobiální peptidy, malí, ale velcí hráči ve vrozené a adaptivní imunitě. FEBS J. 2009, 276, 6497–6508. [CrossRef]

67. Hilchie, AL; Wuerth, K.; Hancock, RE Imunitní modulace pomocí mnohostranných kationtových obranných (antimikrobiálních) peptidů hostitele. Nat. Chem. Biol. 2013, 9, 761–768. [CrossRef]

68. Cheng, Z.; Buggiotti, L.; Salavati, M.; Marchitelli, C.; Palma-Vera, S.; Wylie, A.; Takeda, H.; Tang, L.; Crowe, MA; Wathes, DC; a kol. Globální transkriptomické profily cirkulujících leukocytů u krav v rané laktaci s klinickou nebo subklinickou mastitidou. Mol. Biol. Rep. 2021, 48, 4611–4623. [CrossRef]

69. Foley, C.; Chapwanya, A.; Callanan, JJ; Whiston, R.; Miranda-CasoLuengo, R.; Lu, J.; Meijer, WG; Lynn, DJ; O'Farrelly, C.; Meade, KG Integrovaná analýza lokálních a systémových změn předcházejících rozvoji poporodní cytologické endometritidy. BMC Genom. 2015, 16, 811. [CrossRef]

70. Machado, VS; Silva, TH Adaptivní imunita v poporodní děloze: Potenciální použití vakcín ke kontrole metritidy. Teriogenologie 2020, 150, 201–209. [CrossRef]

71. Ley, K.; Hoffman, HM; Kubeš, P.; Cassatella, MA; Zychlinsky, A.; Hedrick, CC; Catz, SD Neutrofily: Nové poznatky a otevřené otázky. Sci. Immunol. 2018, 3, eaat4579. [CrossRef] [PubMed]

72. Wahl, SM; Feldman, GM; McCarthy, JB Regulace adheze a signalizace leukocytů při zánětu a onemocnění. J. Leukoc. Biol. 1996, 59, 789-796. [CrossRef] [PubMed]

73. Schubert, K.; Polte, T.; Bonisch, U.; Schader, S.; Holtappels, R.; Hildebrandt, G.; Lehmann, J.; Simon, JC; Anderegg, U.; Saalbach, A. Thy-1 (CD90) reguluje extravazaci leukocytů během zánětu. Eur. J. Immunol. 2011, 41, 645–656. [CrossRef] [PubMed]

74. Dreymueller, D.; Pruessmeyer, J.; Schumacher, J.; Fellendorf, S.; Hess, FM; Seifert, A.; Babendreyer, A.; Bartsch, JW; Ludwig, A. Metaloproteináza ADAM8 podporuje nábor leukocytů in vitro a při akutním zánětu plic. Dopoledne. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 2017, 313, L602–L614. [CrossRef]

75. Kostelník, KB; Barker, A.; Schultz, C.; Mitchell, TP; Rajeeve, V.; White, IJ; Aurrand-Lions, M.; Nourshargh, S.; Cutillas, P.; Nightingale, TD Dynamický obchod a obrat JAM-C je nezbytný pro migraci endoteliálních buněk. PLoS Biol. 2019, 17, e3000554. [CrossRef] [PubMed]

76. Stillie, R.; Farooq, SM; Gordon, JR; Stadnyk, AW Funkční význam exprese dvou typů IL-8 receptorů na PMN. J. Leukoc. Biol. 2009, 86, 529–543. [CrossRef]

77. Bouton, AH; Riggins, RB; Bruce-Staskal, PJ Funkce adaptorového proteinu Cas: Konvergence signálu a stanovení buněčných odpovědí. Oncogene 2001, 20, 6448–6458. [CrossRef]

78. Chen, X.; Cheng, Z.; Zhang, S.; Werling, D.; Wathes, DC Kombinací celogenomových asociačních studií a analýz dat rozdílné genové exprese identifikují kandidátní geny ovlivňující mastitidu způsobenou dvěma různými patogeny u dojnic. Otevřete J. Anim. Sci. 2015, 5, 358–393. [CrossRef]

79. Chang, GW; Hsiao, CC; Peng, YM; Vieira Braga, FA; Kragten, NA; Remmerswaal, EB; van de Garde, MD; Straussberg, R.; König, GM; Kostenis, E.; a kol. Adhezní G protein spřažený receptor GPR56/ADGRG1 je inhibiční receptor v lidských NK buňkách. Buňka. Rep. 2016, 15, 1757–1770. [CrossRef]

80. Bi, J.; Tian, ​​Z. Dysfunkce NK buněk a kontrolní imunoterapie. Přední. Immunol. 2019, 10, 1999. [CrossRef]

81. Minuti, A.; Gallo, A.; Lopreiato, V.; Bruschi, S.; Piccioli-Cappelli, F.; Uboldi, O.; Trevisi, E. Vliv velikosti vrhu na prepartální metabolický a aminokyselinový profil u králíků. Zvíře 2020, 14, 2109–2115. [CrossRef] [PubMed]

82. Crookenden, MA; Moyes, KM; Kuhn-Sherlock, B.; Lehnert, K.; Walker, CG; Loor, JJ; Mitchell, MD; Murray, A.; Dukkipati, VSR; Vailati-Riboni, M.; a kol. Transkriptomická analýza cirkulujících neutrofilů u metabolicky stresovaných peripartálních pasoucích se dojnic. J. Dairy Sci. 2019, 102, 7408–7420. [CrossRef] [PubMed]

83. Sharma, JN; Al-Omran, A.; Parvathy, SS Role oxidu dusnatého u zánětlivých onemocnění. Inflamopharmacology 2007, 15, 252–259. [CrossRef] [PubMed]

84. Martino, MR; Gutierrez-Aguilar, M.; Yiew, NKH; Lutkewitte, AJ; Zpěvák, JM; McCommis, KS; Ferguson, D.; Liss, KHH; Yoshino, J.; Renkemeyer, MK; a kol. Umlčení alanintransaminázy 2 v diabetických játrech zmírňuje hyperglykémii snížením glukoneogeneze z aminokyselin. Cell Rep. 2022, 39, 110733. [CrossRef] [PubMed]

85. Tall, AR; Yvan-Charvet, L. Cholesterol, záněty a vrozená imunita. Nat. Rev. Immunol. 2015, 15, 104–116. [CrossRef]

86. Wathes, D.; Cheng, Z.; Mareiy, W.; Fouladi-Nasht, A. Polynenasycené mastné kyseliny a plodnost u samic savců: Aktualizace. CABI Rev. 2013, 8, 1–14. [CrossRef]

87. Alipour, A.; van Oostrom, AJ; Izraeljan, A.; Verseyden, C.; Collins, JM; Frayn, KN; Plokker, TW; Elte, JW; Castro Cabezas, M. Aktivace leukocytů lipoproteiny bohatými na triglyceridy. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 2008, 28, 792–797. [CrossRef]

88. Castoldi, A.; Monteiro, LB; van Teijlingen Bakker, N.; Sanin, DE; Rana, N.; Corrado, M.; Cameron, AM; Hassler, F.; Matsushita, M.; Čaputa, G.; a kol. Syntéza triacylglycerolu zvyšuje zánětlivou funkci makrofágů. Nat. Commun. 2020, 11, 4107. [CrossRef]

89. Bell, AW Regulace metabolismu organických živin během přechodu z pozdní březosti do časné laktace. J. Anim. Sci. 1995, 73, 2804–2819. [CrossRef]

90. Moore, DAPSU; Varga, G. BUN a MUN: Testování močovinového dusíku u mléčného skotu. Kompendium 1996, 18, 712–720.

91. Wathes, DC; Bourne, N.; Cheng, Z.; Mann, GE; Taylor, VJ; Coffey, MP Vícenásobné korelační analýzy metabolických a endokrinních profilů s plodností u prvorodých a vícerodých krav. J. Dairy Sci. 2007, 90, 1310–1325. [CrossRef] [PubMed]

92. Abe, R.; Donnelly, SC; Peng, T.; Bucala, R.; Metz, CN Fibrocyty periferní krve: Diferenciační dráha a migrace do míst poranění. J. Immunol. 2001, 166, 7556–7562. [CrossRef] [PubMed]

93. Schreier, S.; Triampo, W. Populace vzácných buněk v krevním oběhu. Co to je a k čemu je to dobré? Buňky 2020, 9, 790. [CrossRef] [PubMed]

94. Lynn, AK; Yannas, IV; Bonfield, W. Antigenita a imunogenicita kolagenu. J. Biomed. Mater. Res. 2004, 71, 343–354. [CrossRef]

95. Roche, JR; Burke, ČR; Crookenden, MA; Heiser, A.; Loor, JL; Meier, S.; Mitchell, MD; Phyn, CVC; Turner, SA Plodnost a přechodná dojnice. Reprod. Fertil. Dev. 2017, 30, 85–100. [CrossRef]

96. Galvao, KN; Flaminio, MJ; Brittin, SB; Sper, R.; Fraga, M.; Caixeta, L.; Ricci, A.; Stráž, CL; Butler, WR; Gilbert, RO Asociace mezi onemocněním dělohy a indikátory neutrofilního a systémového energetického stavu u laktujících holštýnských krav. J. Dairy Sci. 2010, 93, 2926–2937. [CrossRef]

97. Dahl, MO; Maunsell, FP; De Vries, A.; Galvao, KN; Risco, CA; Hernandez, JA Důkaz, že mastitida může způsobit ztrátu březosti u dojnic: Systematický přehled observačních studií. J. Dairy Sci. 2017, 100, 8322–8329. [CrossRef]

98. Hansen, PJ; Soto, P.; Natzke, RP Mastitida a fertilita u skotu – možné zapojení zánětu nebo imunitní aktivace na embryonální mortalitě. Dopoledne. J. Reprod. Immunol. 2004, 51, 294–301. [CrossRef]

99. Malinowski, E.; Gajewski, Z. Mastitida a poruchy fertility u krav. Pol. J. Vet. Sci. 2010, 13, 555–560.

100. Edmonson, AJ; Lean, IJ; Weaver, LD; Farver, T.; Webster, GA Tabulka hodnocení tělesného stavu pro holštýnské dojnice. J. Dairy Sci. 1989, 72, 11. [CrossRef]

101. Larsen, T.; Rontved, CM; Ingvartsen, KL; Vels, L.; Bjerring, M. Enzymová aktivita a proteiny akutní fáze v mléce používané jako indikátory akutní klinické mastitidy vyvolané E. coli LPS. Zvíře 2010, 4, 1672–1679. [CrossRef] [PubMed]

102. Krogh, MA; Hostens, M.; Salavati, M.; Grelet, C.; Sorensen, MT; Wathes, DC; Ferris, CP; Marchitelli, C.; Signorelli, F.; Napolitano, F.; a kol. Variace mezi stádem a v rámci stáda v biomarkerech krve a mléka u holštýnských krav na začátku laktace. Zvíře 2020, 14, 1067–1075. [CrossRef] [PubMed]

103. Buggiotti, L.; Cheng, Z.; Wathes, DC; Gplus, EC Mining nemapované hodnoty v datech bovinní RNA-Seq odhaluje prevalenci bovinního herpes viru-6 u evropských dojnic a související změny v jejich fenotypu a transkriptomu leukocytů. Viry 2020, 12, 1451. [CrossRef] [PubMed]

104. Beltman, ME; Forde, N.; Furney, P.; Carter, F.; Roche, JF; Lonergan, P.; Crowe, MA Charakterizace endometriální genové exprese a metabolických parametrů u hovězích jalovic poskytujících životaschopná nebo neživotaschopná embrya 7. den po inseminaci. Reprod. Fertil. Dev. 2010, 22, 987–999. [CrossRef] [PubMed]