Navádění autoreaktivních T buněk a infiltrace zánětlivých buněk

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Experimentální autoimunitní uveitida (EAU) je zvířecí model lidské autoimunitní uveitidy, který je charakterizován infiltrací autoimunitních T buněk se současným zvýšením prozánětlivých cytokinů a reaktivních forem kyslíku. Cílem této studie bylo posoudit, zda betain reguluje progresi EAU u potkanů ​​Lewis. EAU byla indukována prostřednictvím imunizace interfotoreceptorovým proteinem vázajícím retinoid (IRBP) a perorálním podáváním buď vehikula nebo betainu (100 mg/kg) po dobu 9 po sobě jdoucích dnů. Sleziny, krev a sítnice byly odebrány z experimentálních krys v době utracení a použity pro test proliferace T buněk, sérologickou analýzu, polymerázovou řetězovou reakci v reálném čase a imunohistochemii. Test proliferace T buněk odhalil, že betain měl malý účinek na proliferaci slezinných T buněk proti antigenu IRBP v testu in vitro v den 9 po imunizaci. Sérologická analýza ukázala, že hladina sérové ​​superoxiddismutázy se zvýšila ve skupině léčené betainem ve srovnání s hladinou ve skupině léčené vehikulem.extrakt z cistanche tubulosaProtizánětlivý účinek betainu byl potvrzen downregulací prozánětlivých molekul, včetně adhezivní molekuly I cévních buněk a interleukinu-1 v sítnicích potkanů ​​s EAU. Histopatologické nálezy souhlasily s nálezy ionizovaného vápníku vázajícího adaptorovou molekulu l imunohistochemie, což dále ověřovalo, že zánět v sítnici a řasnatých tělíscích byl významně potlačen ve skupině léčené betainem ve srovnání se skupinou léčenou vehikulem. Výsledky této studie naznačují, že betain se podílí na zmírňování EAU prostřednictvím antioxidačních a protizánětlivých aktivit.

Kliknutím sem se dozvíte více

klíčová slova:Protizánětlivé, Antioxidační, Betain, Experimentální autoimunitní uveitida, Sítnice

Úvod

Navádění autoreaktivních T buněk a infiltrace zánětlivých buněk, jako jsou monocyty, spouští uveitidu a retinitidu u EAU [6]. Sítnice je poškozena zánětem s aktivací gliových buněk, které podléhají oxidativnímu stresu[7].

Betain, nazývaný také trimethylglycin (CH:NO:), je alkaloid a netoxická přírodní látka z Fructus Lycia a reprezentativní antioxidační látka [8]. Betain zlepšuje záněty související s věkem u potkanů ​​prostřednictvím zapojení nukleárního faktoru-kB prostřednictvím kinázy indukující jaderný faktor/I kappa B kinázy a mitogenem aktivovaných proteinkináz [9], lidské kardiovaskulární onemocnění potlačením zánětlivých cytokinů, včetně interleukinu (IL){{ 6}} a tumor nekrotizující faktor-a (TNF-a)[10] a tumorigeneze tlustého střeva indukovaná dextransulfátem sodným [11].recenze cistanche tubulosa,Betain navíc zabraňoval patologické angiogenezi/neovaskularizaci u potkanů ​​s diabetickou retinitidou [12] a chránil gangliové buňky sítnice ke zvýšení zrakové ostrosti na zvířecím modelu glaukomu [13]. O přesných mechanismech, které jsou základem účinků betainu u uveitidy, je však známo jen málo.

V této studii byla hodnocena účinnost betainu při zmírňování EAU. Zkoumali jsme protizánětlivý účinek betainu u EAU na základě histopatologického vyšetření a měření cytokinů. Dále byl u potkanů ​​s EAU hodnocen specifický mechanismus betainu jako antioxidantu.

MATERIÁLY A METODY

Zvířata

Obě pohlaví krys Lewis (ve věku 7-9 týdnů; Orient Bio Inc, Gyeonggi-do, Korea) byla umístěna v našem zařízení za laboratorních podmínek (cyklus 12-h světlo/tma, teplota 23±2 stupně). Všechny experimentální postupy byly provedeny podle pokynů pro péči a použití laboratorních zvířat Národní univerzity Jeju (číslo povolení:2020-0012). Všechny protokoly týkající se zvířat byly v souladu s mezinárodními zákony a zásadami NIH, včetně Péče o laboratorní zvířata a jejich používání (publikace NIH č.{7}},1985, revidováno v roce 1996).

Indukce EAU

Krysy byly imunizovány 200 ul smíšené emulze složené ze stejného objemu hovězího interfotoreceptorového retinoid-vazebného proteinu (IRBP) (1 mg/ml; PTARSVGAADGSS-WEGVGVVPDV, Komabiotech, Soul, Korejská republika) a Freundova kompletního adjuvans (CFA )doplněno mnou mg/ml Mycobacterium tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories Inc., Detroit, MI, USA) na tlapkách jejich zadních končetin.

Experimentální skupiny

Pro posouzení účinků betainu (obr. 1A) na EAU byly čtyři experimentální skupiny označeny následovně: normální kontrola (n=8); CFA kontrola (n=8);EAU plus vehikulum (n=8);a EAU plus betain (n=8). Dávka při léčbě k testování terapeutického účinku betainu(1 0 mg/kg tělesné hmotnosti/den, B2629, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) bylo vybráno na základě předchozí studie [14]. Krysy byly orálně léčeny 9 betainem ode dne 0 po imunizaci do dne 9 po imunizaci.

Příprava tkáně

Krysy byly usmrceny v hluboké anestezii inhalací plynu CO2 v den 9 po imunizaci.cistanche UKTkáně pro histopatologické vyšetření byly uloženy do parafinového vosku a nařezány

mikrotomem (RM 2135; Leica, Nussloch, Německo) do tloušťky 5 um a obarvené hematoxylinem a eosinem. Krev a sítnice byly skladovány při -80 stupni pro analýzu séra a analýzu polymerázové řetězové reakce (PCR) v reálném čase.

Test proliferace T buněk

Mononukleární buňky sleziny ze zvířat v každé skupině byly disociovány a suspendovány, jak je popsáno v naší předchozí studii [15]. Poté bylo do jamek přidáno 10 ug/ml IRBP (konečná koncentrace). Po 48 hodinách stimulace pomocí IRBP byly buňky inkubovány v 1 μCi 'H-methylthymidinu （specifická aktivita 42 Ci/mmol; Amersham, Arlington Heights, IL, USA) po dobu 18 hodin. Poté byly buňky sklizeny pro měření inkorporace thymidinu.

Cistanche může proti stárnutí

Sérologická analýza

Krysy byly usmrceny v den odběru vzorků a krev byla odebrána ze srdce. Vzorky plné krve byly rozděleny na sérum a krevní buňky pomocí centrifugy (VS-5500CFN; Vision Scientific, Daejeon, Korejská republika). Aktivita superoxiddismutázy (SOD) v séru byla hodnocena pomocí soupravy SOD (ab65354; Abcam, Cambridge, UK).

Imunohistochemie

Imunohistochemie byla provedena za použití stejného protokolu, jaký byl popsán v naší předchozí studii [16]. Primární protilátky včetně ionizované molekuly adaptéru vázajícího vápník (Ibal) (1:1,000;019-19741, Wako Pure Chemical Industries,Ltd,Osaka,Japonsko),CD68(ED1;1:800;MCA341,Serotec,Kidlington,UK) a glutaminsyntetáza (GS)(1:5,000;MAB302,Chemicon In -ternational, Temecula, CA, USA) byly použity jako marker pro mikrog-lia, makrofágy a Müllerovy buňky.

PCR v reálném čase

Celková RNA v očních bulvách ve všech skupinách (n{0}} na skupinu) byla izolována pomocí TRIzol RNA Isolation Reagent (Life Technologies, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) a cDNA byla připravena pomocí CellScript M All-in -Jeden 5X první standardní hlavní směs syntézy cDNA (CellSafe, Gyeonggi-do, Korejská republika). Informace o primeru jsou uvedeny v tabulce 1. PCR byla provedena pomocí MIC cycleru (BMS, Queensland, Austrálie) za použití 2x SYBR Green (PhileKorea, Soul, Korejská republika) a následujícího programu: 55 cyklů denaturace (5 s,95 stupně ), žíhání (20 s, 60 stupňů) a prodlužování (10 s, 72 stupňů).

Western blot analýza

Analýza Western blot byla provedena stejným protokolem, jaký byl popsán v naší předchozí studii [16].cistanche wirkungPrimární protilátky včetně Kelch-like ECH-asociated protein 1 (Keap1)(1:1,000;abl19403,abcam,MA,USA) a Nuclear factor erythroid-2-re-lated factor2 (Nrf2 )(1:1,000;sc-722,Santa cruz,CA,USA).

Statistická analýza

Všechna měření jsou uvedena jako průměr ze tří nezávislých experimentů. Všechny hodnoty jsou uvedeny jako střední standardní chyba průměru (SEM). Výsledky byly analyzovány pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované Student-Newman-Keulsovým posthoc testem pro vícenásobná srovnání. P-hodnota<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" significance.="" immunostaining="" was="" analyzed="" semi-quantitatively="" based="" on="" the="" positive="" areas="" in="" the="" photographs="" using="" imagej="" software="" (national="" institutes="" of="" health,="" bethesda,="" md,="" usa).eau="" was="" histopathologically="" evaluated="" using="" a="" method="" modified="" from="" a="" previous="" study="" [17].="" antibody-positive="" areas="" were="" measured="" as="" follows:(1)three="" different="" sections="" from="" each="" rat="" (n="3" animals="" per="" group)="" were="" used;="" then,="" (2)="" the="" percentage="" of="" the="" stained="" area="" [(positive="" area/total="" area)x100(%)]="" was="" calculated.="" the="" total="" area="" included="" all="" layers="" of="" the="" retina.="" these="" results="" are="" presented="" as="" the="">

VÝSLEDEK

Betaine had no immunomodulatory function in EAU The T cell proliferation assay was performed to determine whether betaine affected the proliferation of IRBP-specific T cells (Fig.1B). No significant changes were observed between the EAU-induced groups in medium only and those that were IRBP-stim-ulated (medium only, p>0.05 vs.EAU+Vehicle; IRBP stimulation, p>0.05 vs. EAU plus vozidlo). Tato data naznačují, že betain nebyl zapojen do IRBP-specifických T buněk nebo jejich auto-reaktivity.

Betain upreguloval hladiny SOD v séru v EAU

Hodnotili jsme oxidační poškození v séru pomocí SOD jako markeru oxidativní modifikace. Nebyl pozorován žádný významný rozdíl mezi normálními a CFA skupinami. Aktivita SOD se významně snížila ve skupině EAU plus vehikulum ve srovnání s hladinami ve skupinách s normální kontrolou a CFA. Léčba betainem významně obnovila úroveň aktivity SOD na úroveň normální kontrolní skupiny a skupiny CFA (obr. 2). Tento výsledek ukazuje, že léčba betainem potlačila oxidační stres u potkanů ​​s EAU.

Betain snižoval infiltraci Ibal-pozitivních buněk v řasnatých tělíscích a sítnicích potkanů ​​indukovaných EAU

Řasnaté tělísko je hlavním místem infiltrace zánětlivých buněk kvůli velkému množství krevních cév[18]. Pouze několik buněk kulatého typu bylo detekováno v řasnatých tělíscích u normálních a CFA skupin (obr. 3A, 3B), zatímco infiltrace některých buněk kulatého typu byla potvrzena ve skupinách indukovaných EAU (šipky na obr. 3C ,3D). Normální (obr. 3E) a CFA (obr. 3F) skupiny konzistentně vykazovaly podobné výsledky jako ty pozorované pro Ibal imunoreaktivitu. Ibal-pozitivní imunoreaktivita se zvýšila ve skupinách EAU plus vehikulum a EAU plus betain (šipky na obr. 3G, 3H). Počet Ibal-pozitivních buněk se však významně snížil ve skupině EAU plus Betain ve srovnání se skupinou EAU plus vehikulum (obr. 3I). Také jsme analyzovali lokalizaci EDI jako další přístup k vyhodnocení přesné lokalizace infiltrace zánětlivých buněk v ciliárním tělísku. )skupiny. Na rozdíl od toho bylo mnoho ED{19}}pozitivních buněk detekováno ve skupinách EAU plus vehikulum a EAU plus betain (dvojité šipky na obr. 3L, 3M).citrusové bioflavonoidySemikvantitativní analýza počtu ED1-pozitivních buněk potvrdila, že léčba betainem potlačila infiltraci zánětlivých buněk do řasnatého tělíska EAU-indukovaných potkanů.

Dále jsme zkoumali histopatologické změny na sítnici (obr. 4). Několik zánětlivých buněk bylo detekováno v sítnicích s EAU, ale ne v normálních a CFA potkaních sítnicích (obr. 4A~4D). Léze byly hodnoceny histopatologicky podle závažnosti EAU [17], což odhalilo úlevu od zánětu sítnice (obr. 4E). Aktivace mikrogliálních a Müllerových buněk indikující zánět sítnice byla potvrzena na základě globální (Obr. 4F~4I) a GS imunoreaktivity (Obr. 4K~4N), v daném pořadí. Lokalizace Ibal v mikrogliích byla velmi vzácná u normální skupiny a skupiny CFA (šipky na obr. 4F, resp. 4G). Aktivace mikroglie byla inhibována u EAU potkanů ​​(šipky na obr. 4H) působením betainu (obr. 41, 4J). Výsledek GS-pozitivní imunoreaktivity byl podobný jako výsledek globální v sítnici (obr. 4K~4N). Aktivované Müllerovy buňky ve skupině EAU plus vehikulum měly nižší hladiny GS-imunoreaktivity (obr. 40).

Betain potlačil adhezní molekulu a prozánětlivé mediátory v EAU

Dále jsme zkoumali expresi adhezních molekul pomocí PCR v reálném čase (obr. 5A). Byl pozorován prudký pokles hladiny adhezní molekuly 1 (VCAM1) mRNA cévních buněk ve skupině EAU plus Betain (p<0.05 vs.eau+vehicle).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,interleukin-1β(il-1β),="" tumor="" necrosis="" factor-alpha="" (tnf-a),="" inducible="" nitric="" oxide="" synthase(inos),="" and="" cyclooxygenase="" at-2(cox-2)as="" pro-inflammatory="" mediators,="" were="" assessed="" to="" confirm="" the="" inflammatory="" condition="" (fig.="" 5b).="" the="" mrna="" levels="" of="" serpina3n,="" il-1β,="" tnf-a,="" cox-2="" were="" significantly="" downregulated="" in="" the="" eau+betaine="" group="" compared="" with="" that="" of="" vehicle-treated="" eau="" group="" (fig.5b).="" these="" results="" indicate="" that="" the="" betaine="" treatment="" suppressed="" the="" upregulation="" of="" pro-inflammatory="">

Betain upreguloval antioxidační enzymy katalázu (CAT) a SODinEAU

Studie úrovní oxidačního poškození v séru nás přiměla prozkoumat stav antioxidační odezvy antioxidačních enzymů, včetně CAT, SOD1, SOD2 a SOD3 (obr. 5C). Pozorovali jsme významně zvýšené hladiny exprese CAT, SOD1, SOD2 a SOD3 v očních bulvách skupiny EAU plus Betain ve srovnání se skupinou EAU plus vehikulum.

Betain aktivoval dráhu Keapl-Nrf2

Pro podporu antioxidačního účinku betainu byla zkoumána dráha Keapl-Nrf2 (obr. 6). Hladiny proteinu Keapl (0,75±0,05násobné změny,p<0.05,fig.6a)and nrf2(0.79±0.04fold=""><0.05,fig.6b)in eau+vehicle="" group="" were="">

ve srovnání s běžnou kontrolou. Na druhou stranu Keapl a Nrf2 vykázaly buď 1,46±0.00násobné změny nebo 1,13±0,34násobné změny oproti těm ze skupiny EAU plus Vehide (str<0.01 and=""><0.001,>

DISKUSE

Toto je první studie, která uvádí, že betain zmírňuje progresi patogeneze EAU prostřednictvím protizánětlivých a antioxidačních účinků, ale ne potlačením proliferace T buněk (schématická ilustrace na obr. 7).

Předpokládá se, že regulační účinek betainu u autoimunitních onemocnění, jak bylo prokázáno pomocí EAU, prototypu autoimunitního onemocnění, je způsoben snížením oxidačního stresu a prozánětlivých mediátorů, nikoli však proliferace T buněk, betainem [19]. Podobně tato studie odhalila, že betain měl malý vliv na proliferaci T lymfocytů a cytokinový profil v kultivačním supernatantu v modelu EAU, což naznačuje, že betain neovlivňuje imunitní odpověď na proliferaci autoimunitních T lymfocytů v EAU. Uvea je cílovým orgánem v EAU. Uvea a sítnice jsou imunologicky izolované orgány bez lymfatických uzlin [20]. Autoimunitní T-buňky v EAU jsou invadovány přes větev ciliárních a očních arterií [21]. Oxidační stres je kritickou signalizací progrese zánětlivé odpovědi a zvýšené reaktivní formy kyslíku způsobují endoteliální dysfunkci a poškození tkáně [22]. Narušené endoteliální buňky vedou k podpoře průchodu zánětlivých buněk a zánětlivých molekul [22]. Zánětlivé mediátory a buňky v uvea jsou spouštěny v retinálních pigmentových epiteliálních buňkách, které narušují spojení mezi tyčinkovými a čípkovými buňkami a pigmentovými epiteliálními buňkami, což vede k oddělení sítnice [23]. Řasnaté tělísko je vstupním místem pro oční zánět. Typický zánět sítnice se podílí na aktivaci rezidentních mikroglií a infiltraci zánětlivých buněk v důsledku porušení hemato-retinální bariéry [24]. Za neuropatologických stavů, včetně mozkových nádorů [25], axotomie [26] a virové infekce [27], byly pomocí Ibal rozlišeny aktivované makrofágy a mikroglie. Aktivované rezidentní mikroglie se navíc podílejí na patologických změnách vyskytujících se u degenerativních onemocnění sítnice a uvolňují zánětlivé mediátory, které zhoršují proces onemocnění [28]. Tyto výsledky naznačují, že betain má protizánětlivé účinky na uveu a řasnaté tělísko, hlavní cíle EAU, a může snižovat oxidační stres v séru. Přesný mechanismus však zbývá prostudovat.

Aktivované mikroglie jsou hlavním zdrojem prozánětlivých cytokinů při degenerativních stavech sítnice [29]. Prozánětlivé cytokiny, včetně IL a TNF, jsou silně spojeny se zánětem oka [30] a retinitidou [6,29]. Kromě mikroglie jsou Müllerovy buňky aktivovány při všech patologických událostech, které se vyskytují v sítnici [31]. Aktivované Müllerovy buňky se podílejí na neurozánětlivém účinku v sítnici tím, že syntetizují a uvolňují molekuly související se zánětem [31]. Předpokládáme, že betain zmírňuje zánětlivou reakci u potkanů ​​indukovaných EAU potlačením aktivace mikroglií a Müllerových buněk. Upregulace VCAMl se významně podílí na infiltraci zánětlivých buněk [32]. VCAMl je expedována do CD4 Tlym-fagocytů prostřednictvím křížových hovorů s pozdním antigenem-4[3]. Kromě toho Serpina3n, enzym, který iniciuje zánět [34], byl detekován v Müllerových buňkách, astrocytech a pigmentovém epitelu sítnice světlem poškozených sítnic [35] a má významně proměnlivé hladiny v sítnici Nrl'myší s poškozenými čípkovými buňkami [36]. Serpina3n je zvýšená v EAU u potkanů ​​se závažným zánětem sítnice, ale významně poklesl ve skupině EAU léčené betainem. Podobný nález byl popsán u schizofrenie s neurozánětem [34], protože myší Serpina3n je ortologem lidské Serpiny3 [37]. Dále bylo pozorováno zvýšení IL-1 u poškození sítnice vyvolané vysokým obsahem fruktózy [38]. Předpokládáme, že protizánětlivý účinek betainu je spojen s down-regulací VCAM1, Serpina3n a IL-1 u potkanů ​​indukovaných EAU. Ke sledování oxidačního stresu se používá cesta Keep-Nrf2 [39]. Betain byl známý jako antioxidační molekula, která byla spojena s dráhou Keapl-Nrf2 v modelu akutního poškození jater vyvolaného acetaminofenem [40]. Kromě toho bylo provedeno profilování exprese jaterních genů po léčbě 3H-1,2-dithiol-3-thionem, které mělo za úkol posílit detoxikaci karcinogenů a chránit před neoplazií [4]. Výsledek tohoto profilování odhalil, že Keap1-Nrf2 regulovaný nrf2-závislý 3H-1,2-dithiol-3-thionem indukovatelný gen, včetně AF033381, jako betain homocystein methyl transferáza, byla zvýšena a zapojena do detoxikace a antioxidace [41]. Zánětlivá odpověď u EAU byla indukována infiltrací zánětlivých buněk, jako jsou T buňky a makrofágy [42], a produkcí oxidačního stresu, zejména ve fotoreceptorových mitochondriích časného stadia [43]. Podle těchto výsledků byla léčba betainem kandidátem na zmírnění poškození tkáně vyvolaného EAU modulací dráhy Keap1-Nrf2, jako klíčové cesty k regulaci oxidačního stresu.

Antioxidační účinek betainu byl široce hodnocen na modelech poškození vyvolaného radikály [44]. V mozku s oxidativním poškozením vyvolaným levodopou byl betain zvýšen na hladiny CAT a SOD, což jsou reprezentativní antioxidační enzymy[4]. SOD1, SOD2 a SOD3 jsou aktivovány různými mechanismy a jsou lokalizovány v cytoplazmě, mitochondriích a extracelulární matrix [45]. Betain se jako antioxidační molekula podílí na snižování oxidačního poškození [46]. Snížený oxidační stres byl rozšířen na řešení zánětu, indikovaného Ibal-pozitivními makrofágy/mikrogliemi u mnoha onemocnění, včetně Alzheimerovy choroby, Parkinsonovy choroby a roztroušené sklerózy [47]. Léčba betainem byla upregulována na hladiny mRNA markeru oxidačního stresu ve srovnání s těmi ve skupině EAU plus vehikulum. Tento výsledek naznačuje, že léčba betainem snížila oxidační stres v oběhovém systému, aniž by interferovala s proliferací T buněk v imunitních orgánech potkaního modelu EAU.

Souhrnně tato studie naznačuje, že betain může zmírnit zánět v sítnicích a řasnatých tělech potkanů ​​indukovaných EAU, pravděpodobně prostřednictvím antioxidačních a protizánětlivých mechanismů.

Tento článek je převzat z https://doi.org/10.5607/en21011