Lidská kůže je největším orgánem lidského těla a chrání tělo před toxiny z prostředí

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:V poslední době, když byla identifikována role melaninu proti stárnutí v kůži a inhibice produkce melaninu, přitahuje pozornost vývoj materiálů schopných udržovat homeostázu kůže. V této studii jsme dále zkoumali antimelanogenní účinek extraktu Codonopsis pilosula (CPE) a při oxidativním stresu cytoprotektivní účinek na melanocyty melanocytu vystavené působení H2O2. Za prvé, léčba CPE významně snížila produkci melaninu inhibicí proteinů spojených s melanogenezí, včetně transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF), tyrosinázy a proteinu 2 souvisejícího s tyrosinázou (TRP 2), jako výsledek fosforylace MAPK/JNK v Melanu. - buňky. Dále, abychom prozkoumali ochranné účinky CPE na poškození kůže vyvolané oxidačním stresem a jeho molekulární mechanismus, určili jsme účinek CPE po indukci oxidačního stresu vystavením melanocytů H2O2. CPE chránil buňky před H2O2-indukovanou cytotoxicitou snížením exprese genu kódujícího proapoptotický protein Bax, zatímco indukoval geny kódující rodinu B-buněčného lymfomu (Bcl2) a MITF, což je regulátor transkripce který podporuje diferenciaci melanocytů. Naše výsledky dále ukazují, že CPE zvýšil produkci proteinů souvisejících s autofagií, jako je Beclin-1 a lehký řetězec 3 (LC3)Ⅱ; toto bylo podstatně zvráceno předléčením 3-methyladeninem (MA, inhibitor autofagie). Naše zjištění společně ukazují, že léčba CPE vykazuje nejen antimelanogenní účinek u normálních melanocytů, ale také cytoprotektivní účinek u melanocytů vystavených oxidativnímu stresu indukcí autofagie a exprese MITF.velikost penisu cistanche,Proto se domníváme, že CPE je účinným kandidátem na udržení buněk v melanocytech.

Klíčová slova:Codonopsis pilosula; buňky melan-a; melanogeneze; autofagie; oxidační stres

Kliknutím sem se dozvíte více

1. Úvod

Lidská kůže je největším orgánem lidského těla a chrání tělo před toxiny z okolního prostředí, alergeny a oxidačním stresem. Je známo, že melanin, který je produkován především melanocyty, hraje důležitou roli v prevenci kožních onemocnění a je přítomen v různých tkáních lidského těla [1,2]. Avšak nadměrná produkce a akumulace reaktivních forem kyslíku (ROS) v důsledku stresu, ultrafialového (UV) záření a stárnutí má za následek mnoho kožních poruch, jako je hyperpigmentace, melasma a nakonec degradace melanocytů. Několik studií o léčbě melanogeneze se zaměřilo na regulaci exprese transkripčního faktoru spojeného s mikroftalmií (MITF) a aktivity tyrosinázy [3-5]. Nedávné studie navíc ukázaly, že melanogeneze kůže je zprostředkována prostřednictvím několika melanogenních signálních drah, včetně signalizace mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), proteinkinázy A (PKA) a dráhy zprostředkované cyklickým adenosinmonofosfátem (cAMP) [6].

Cistanche může proti stárnutí

Buněčný autofagický systém je dobře znám jako buněčný proces samočinného trávení, který degraduje poškozené proteiny nebo izoluje dysfunkční organely v buňce a poté je rozkládá v lysozomech, aby byla zachována buněčná homeostáza [7,8]. Nedávné studie identifikovaly autofagii jako součást normální funkce melanocytů a regulaci exprese transkripčního faktoru MITF tvořícího melanin. Proto mají látky indukující autofagii potenciál omezovat poškození způsobené UV zářením a oxidací lipidů a udržovat homeostázu v melanocytech a keratinocytech [9-11].cistanche prášek,O aplikaci přírodních preparátů indukujících autofagii, které chrání melanocyty před oxidačním stresem, je však málo informací.

Codonopsis pilosula je kořen Codonopsis pilosula (Fr.) Nanny., patřící do rodiny Campanula. Pěstuje se nebo pěstuje v horách Gangwon-do v Koreji a je také rozšířen v severních a západních oblastech Číny, jako jsou oblasti Guanxi a Shanxi [12]. V lidovém léčitelství se používá jako náhražka ženšenu po stovky let, protože má stejné farmakologické účinky, jako je doplňování energie, posilování imunitního systému, snižování gastrointestinálních onemocnění a regulace krevního tlaku, ale za nižší cenu. Fytochemický výzkum ukazuje, že C. pilosula obsahuje velké množství sacharózy, polysacharidů, triterpenů, saponinů, fytosterolů, fenolických glykosidů, alkaloidů a polyacetylenů [13]. Mezi nimi je známo, že lobetyolin, hlavní acetylen C. pilosula, aktivuje NF-kB a má imunostimulační účinek. C. pilosula významně inhibuje alergické reakce způsobené ovalbuminem, zatímco vodní extrakt snižuje hladinu glukózy v plazmě a butanolový extrakt vykazuje aktivitu pohlcující volné radikály a inhibiční účinek na peroxidaci lipidů v homogenátu mozku potkana[15-17] .

Dříve bylo zjištěno, že antioxidační aktivita C.pildsula se mění v důsledku rozdílů v obsahu polyfenolů v závislosti na použitém extrakčním rozpouštědle [18]. Zkoumali jsme tedy melanogenní inhibiční účinek extraktu C. pilosula (CPE) za normálních podmínek prostřednictvím mechanistických signálních drah a také cytoprotektivní účinek proti H2O2-indukovanému oxidativnímu stresu v melanocytech melanocytů.

2. Materiály a metody

2.1. Činidla

RPMI 1640 a fetální bovinní sérum (FBS) byly zakoupeny od Welgene (Daegu, Korea).extrakt z cistanche salsyPenicilin-streptomycin byl zakoupen od GibcoBRL (Eggenstein, Německo). Phorbol 12-myristát 13-acetát (TPA) byl zakoupen od společnosti TOCRIS (Bristol, Spojené království). Peroxid vodíku (HaO2),3-(4,5-dimethylthiazol{{7} }yl)-2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT), 4',6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) a 3-MA byly zakoupeny od společnosti Sigma -Aldrich (St Louis, MO, USA). Všechny ostatní chemikálie a činidla byly analytické čistoty.

2.2. Příprava extraktu Codonopsis Pilosula

Kořen C. pilosula (CP) byl jednoduše nasekán a 100 g CP bylo ponořeno do 1 Lof 50% ethanolu (w/v); poté byl třikrát extrahován pomocí ultrazvukových vln při 30 stupních. Poté, co byl každý extrakt odstředěn, aby se shromáždil supernatant, byl supernatant koncentrován a lyofilizován za účelem přípravy extraktu C. pilosula (CPE).

2.3. Buněčná kultura a příprava zásobního roztoku CPE

Melanocytové buňky Melan-a byly pěstovány a udržovány v RPMI 1640 doplněném 10 procenty FBS, penicilinem (100 U/ml), streptomycinem (100 U/ml) a 200 nM forbol 12-myristátem 13- acetátem (TPA) a udržována při 37 stupních v inkubátoru s 5% CO2. Po kultivaci 3 x 105 buněk na jamku v šestijamkové destičce byly buňky Melan-a umístěny do inkubátoru na 48 hodin, dokud se barva média nezměnila na černou. Zásobní roztoky (100 mg/ml) CPE byly rozpuštěny ve sterilní vodě a skladovány při -20 stupních.

2.4. Měření životaschopnosti buněk

Buněčná životaschopnost CPE v buňkách Melan-a byla stanovena pomocí MT kolorimetrického testu a průtokové cytometrie. Buňky byly udržovány, dokud nedosáhly 80 procent konfluence v 96-jamkových destičkách, a poté byly ošetřeny CPE a/nebo 0,5 mMH202 po dobu 24 hodin. Bylo přidáno buněčné médium s 10 ul roztoku MTT (5 mg/ml) a buňky byly inkubovány další 4 hodiny. Po inkubaci buněk byly nerozpustné krystaly formazanu rozpuštěny ve 100 ul dimethylsulfoxidu. Absorbance při 540 nm byla měřena spektrofotometrií za použití čtečky mikrodestiček. Mrtvé buňky byly stanoveny pomocí soupravy pro detekci buněčné smrti PI/Annexin V (EMD Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) podle protokolu výrobce. Stručně, buňky byly promyty a inkubovány po dobu 15 minut při teplotě místnosti ve tmě obsahující FITC-Annexin V a PI. Poté byly mrtvé buňky analyzovány analyzátorem buněk MuselM.

2.5. Odhad melaninu in vitro

Přibližně 2x105 buněk/jamka bylo pěstováno v šestijamkové destičce. Po ošetření CPE a/nebo 0,5 mM H-Op, jak bylo popsáno dříve [19], byly buňky promyté PBS sklizeny, lyžovány v 1× PBS obsahujícím 1 procento Tritonu X-100 a centrifugovány při 4 stupních při 13, 000 ot./min. po dobu 15 min. Obsah buněčného melaninu byl solubilizován pomocí 1N NaOH. Ke kvantifikaci melaninu měřením absorbance při 405 nm byla použita čtečka destiček ELISA. Data byla získána ze tří experimentů a byl vypočten obsah melaninu a označen jako násobek změny ve srovnání s kontrolními buňkami. 2.6 Izolace proteinů a Western Blot Assay

Vzorky proteinů byly extrahovány tak, jak je vysvětleno v naší předchozí práci [20]. Poté byla měřena koncentrace proteinu v buněčném lyzátu za použití soupravy pro stanovení proteinů BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Ekvivalentní množství denaturovaného buněčného lyzátu (30 ug buněčného lyzátu na vzorek) byla oddělena elektroforézou na 10% dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a přenesena na nitrocelulózovou membránu. Membrána byla inkubována s primární protilátkou zředěnou v 5 procentech sušeného odstředěného mléka v PBS obsahujícím 0,05 procenta Tween 20 (PBST) přes noc při 4 stupních.

Po inkubaci primární protilátky byly membrány promyty a inkubovány v HRP-konjugované sekundární protilátce zředěné v 5% odstředěném mléce v PBST po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Proteinová exprese byla analyzována pomocí detekčního systému zesílené chemiluminiscence (ECL) (AI680, GE Healthcare, Uppsala, Švédsko).

2.7. Odhad intracelulárního ROS barvením DCFH-DA

Buněčné hladiny ROS v buňkách Melan-a ošetřených Hoo byly odhadnuty metodou fluorescenční mikroskopie DCFH-DA [21]. Hladiny intracelulární fluorescence DCF jsou úměrné produkovanému intracelulárnímu ROS. Nejprve bylo 2 x 105 buněk/jamka ošetřeno individuálními koncentracemi CPE a/nebo H-02 po dobu 24 hodin, poté byl 2 hodiny před koncem reakce přidán DCFH2-DA. Data byla shromážděna ze tří nebo více nezávislých experimentů. 2.8. Statistické zpracování

Všechny experimentální výsledky jsou prezentovány jako průměr ± standardní odchylky (SD) tří biologických replikátů.cistanche stonekStatistická významnost mezi vícenásobnými středními hodnotami byla hodnocena jednosměrnou analýzou rozptylu (ANOVA), následovanou Duncanovým vícenásobným srovnávacím testem pomocí SPSS 18.0(SPSS Inc., Chicago, IL, USA), jak je uvedeno v legendách. P-hodnota<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">

3. Výsledky

3.1.Downregulace melanogeneze v melanocytech pomocí CPE

Melanocyty syntetizují melanin v reakci na vnější podněty, jako je UV záření. Hlavní faktory, jako je a-melanocyty stimulující hormon (-MSH), faktor kmenových buněk (SCF) a endotelin-1(ET-1), se vylučují z melanocytů a zvyšují expresi MITF, čímž podporují melanogenezi [22,23]. Nejprve jsme zkoumali, zda léčba CPE inhibovala produkci melaninu a proteiny související s melanogenezí.

Léčba CPE při 100 200 a 300 ug/ml významně snížila produkci melaninu ve srovnání s negativní kontrolou. Konkrétně léčba 300 ug/ml CPE vedla ke snížení podobnému snížení vyvolanému léčbou arbutinem (obrázek 1A, B). Kromě toho jsme zkoumali melanogenezní proteiny tyrosinázu, TRP-1, TRP{{6 }} a MITF metodou Western blotting.výhody a vedlejší účinky cistanche tubulosaLéčba pomocí CPE v koncentracích 300 ug/ml významně snížila hladiny proteinů MITF, TRP-2 a tyrosinázy (obrázek 1C). Protože bylo potvrzeno, že CPE inhibuje expresi proteinů souvisejících s MITF, inhibuje tvorbu melaninu, dále jsme zkoumali, zda CPE ovlivňuje signální dráhu MAPK. CPE zvýšil fosforylaci MAPK způsobem závislým na dávce, specificky indukoval fosforylaci JNK (obrázek 1D). Tyto výsledky naznačují, že inhibice melanogeneze pomocí CPE je výsledkem downregulace exprese MITF a tyrosinázy indukcí fosforylace JNK/MAPK.

3.2. Vliv CPE na H2O2-indukovanou buněčnou smrt v melanocytech

Kožní buňky, jako jsou keratinocyty a melanocyty, citlivě reagují na ROS, jako je peroxid vodíku (HzOz) a superoxidový anion, aby si udržely normální stav. Nerovnováha v oxidačně-antioxidačním stavu v důsledku nadměrného buněčného ROS však může vést k akumulaci poškozených proteinů nebo organel, což případně vede k apoptotické buněčné smrti [24,25]. Nedávno bylo publikováno, že melanin podporuje stárnutí kůže tím, že stimuluje tvorbu melaninu v závislosti na vnějším prostředí kůže, stejně jako zdraví pokožky, které je udržováno zachováním intracelulárního obsahu melaninu [26]. Zkoumali jsme tedy účinek extraktu CPE na buňky vystavené oxidativnímu stresu prostřednictvím působení H2O2. Buňky ošetřené HzO2-vykázaly pokles životaschopnosti buněk o 32,8 procent ve srovnání s neošetřenými buňkami. Ošetření CPE však snížilo inhibici životaschopnosti buněk způsobem závislým na koncentraci při ošetření H-02. Konkrétně CPE při 300 ug/ml obnovil životaschopnost buněk na 91,9 procent (obrázek 2A). Navíc byla detekována apoptotická smrt buněk ošetřených CPE a/nebo H2O2- dvojitým barvením Annexinem V- FITC/PI, následovaná průtokovou cytometrickou analýzou. Po ošetření H2O2 se procento apoptotických buněk zvýšilo na 34,5 procenta ve srovnání se 14,8 procenty u neošetřených buněk. Ošetření CPE však výrazně inhibovalo apoptotickou smrt vyvolanou H2O2-, přičemž procento buněk barvených annexinem V bylo 22,2 procenta (obrázek 2B). Protože to ukazuje stejný vzorec jako obsah ROS, tyto výsledky ukazují, že CPE udržuje životaschopnost buněk inhibicí buněčné smrti prostřednictvím ochrany proti H2O2-indukovaným ROS (obrázek 2C).

3.3. Vliv CPE na HzO2-indukovanou buněčnou smrt v melanocytech

Jak bylo dříve potvrzeno, CPE udržuje životaschopnost buněk inhibicí nárůstu apoptózy po léčbě Hz02. Dále jsme tedy zkoumali účinek CPE na expresi proteinů zapojených do buněčné smrti a proteinu MITF, který reguluje produkci melaninu v přítomnosti H2O2. Jak je znázorněno na obrázku 3, v buňkách ošetřených H202 byla exprese MITF mírně snížena, na druhé straně v buňkách ošetřených CPE a exprese MITF byla téměř stejná jako v neošetřených buňkách. Kromě toho H2O2 zvýšila expresi proteinu Bax indukujícího apoptózu [27,28], ale snížila expresi Bax způsobem závislým na koncentraci v buňkách ošetřených CPE. Naproti tomu H202 snižoval expresi proteinu Bcl2, který podporuje přežití buněk [28,29], ale exprese Bel2 byla působením CPE zvýšena v závislosti na koncentraci. Když jsme vypočítali expresi těchto dvou proteinů pro stanovení poměru Bax/Bcl2, byla pozorována stejná tendence. Proto při H2O2-indukovaném oxidativním stresu byla exprese MITF snížena indukcí buněčné smrti, zatímco CPE vykazoval silný ochranný účinek, zabraňoval H2Oz-indukované buněčné smrti a udržoval expresi MITF.

3.4. Vliv CPE na aktivaci autofagie v melanocytech indukovaných oxidačním stresem

Nedávné studie odhalily, že autofagie a její regulátor hrají klíčovou roli v antioxidační odpovědi proti oxidativnímu stresu vyvolanému ROS v lidských buňkách [26,30]. Feng a spol.[31] ukázali, že extrakt z listů Apocymum venetum chrání poškozené neurony před apoptózou vyvolanou H2O2- tím, že snižuje ROS-indukovanou aktivaci autofagie. Protože byla prokázána souvislost mezi modulací autofagie a antimelanogenezí, byla v buňkách Melan-a zkoumána role autofagie v ochranném účinku CPE proti oxidativnímu stresu vyvolanému H-Oz. Hladiny LC3, autofagozomového proteinu, byly použity jako indikátor autofagie. Data Western blot ukázala, že CPE významně upreguloval expresi pro-autofagických proteinů LC3-Ⅱ a Beclin, jejichž exprese byla snížena působením H2O2. To naznačuje, že CPE má cytoprotektivní účinek prostřednictvím aktivace autofagie v rámci intracelulárního oxidačního stresu (obrázek 4A). Dále byl dále analyzován vnitřní vztah mezi cytoprotektivním účinkem a autofagií CPE v buňkách Melan-a ošetřených HzOz pomocí silného autofagického inhibitoru,3-MA. Ve srovnání s předchozími údaji vykazovaly buňky předem ošetřené 3-MA a CPE a stimulované H2O2 snížené hladiny exprese LC3-II (obrázek 4B). Celkově tato data naznačují, že inhibice autofagie negativně ovlivňuje cytoprotektivní účinnost CPE v buňkách ošetřených HzO2-, což naznačuje, že autofagie je nezbytná pro cytoprotektivní účinky CPE.

4. Diskuze

Již dříve jsme stanovili optimální extrakční metodu vedoucí k nejvyšší antioxidační aktivitě a také obsahu polyfenolů [18]. V této studii jsme použili metodu vysokovýtěžné ultrazvukové extrakce a zjistili jsme, že extrakt vykazuje cytoprotektivní účinek aktivací autofagie za podmínek oxidačního stresu a také inhibicí melanogeneze v buňkách Melan-a.

Nejprve jsme dále zkoumali antimelanogenní účinek CPE.CPE snižoval melanogenezi snížením exprese genů souvisejících s melanogenezí, jako jsou MITF, tyrosináza a TRP-2. Několik studií prokázalo, že biosyntetické mechanismy melanogeneze související s expresí enzymů jsou zprostředkovány různými signálními cestami, včetně mitogenem aktivované proteinkinázy (MAPK), proteinkinázy A (PKA) a PI3K/Akt [32]. Mezi nimi aktivace signální dráhy MAPK potlačila MITF na úrovni proteinové stability a také na úrovni transkripce v lidských primárních melanocytech [33,34]. Fosforylace MAPK a signální kaskády extracelulární responzivní kinázy (ERK), c-Jun N-terminální kinázy (JNK) a p38 také regulují produkci melaninu. Mezi nimi aktivátor JNK potlačuje melanogenezi prostřednictvím fosfo-inhibice exprese MITF závislé na transkripčním koaktivátoru 3 (CRTC3) regulovaném CREB [35,36]. Naše výsledky ukazují, že fosforylace MAPK, zejména JNK, se po ošetření CPE účinně zvyšuje ve srovnání s kontrolními buňkami. Tato zjištění naznačují, že CPE-indukovaná depigmentace v melanocytech melanocytů se může vyskytovat prostřednictvím MITF/JNK-regulovaných signálních drah.

Melanocyty produkují pigment melanin a přenášejí ho do keratinocytů, kde pigmenty pomáhají chránit pokožku před oxidačním stresem z prostředí, jako jsou látky znečišťující ovzduší, chemické produkty a poškození UV zářením [37-39]. MITF je jedním z hlavních transkripčních regulátorů odpovědných za klíčové geny, které podporují vývoj a diferenciaci melanocytů a také regulují melanogenezi. MITF navíc reguluje expresi určitých genů, které udržují buněčnou homeostázu, včetně těch, které kódují proteiny zapojené do proliferace (např. CDK2) a apoptózy (např. Bcl2)[40-42]. Stein-Grimson et al.[43]identifikovali MITF mutantní myši jako postižené ztrátou sluchu a pigmentovými poruchami v důsledku ztráty melanocytů, stejně jako vadných osteoklastů a žírných buněk. To naznačuje, že MITF hraje důležitou roli ve vývoji těchto typů buněk.

CPE je derivátem rostlinných léků používaných k léčbě gastrointestinálních a alergických onemocnění díky svým anti-agingovým a antialergickým účinkům[15,44]. Zda však CPE může chránit melanocyty před oxidačním stresem, zůstává neznámé. Abychom odhadli účinek CPE na přežití melanocytů v reakci na oxidační stres, nejprve jsme pozorovali buněčnou smrt v melanocytech vystavených H-O2. Po ošetření 0,5 mM H-02 po dobu 24 hodin byla životaschopnost buněk snížena ve srovnání s neošetřenými buňkami. Nicméně životaschopnost buněk ošetřených CPE byla obnovena snížením obsahu ROS; pak se poměr Bax/Bcl2 a exprese MITF zvýšily, na rozdíl od buněk ošetřených H2O2-.

Autofagie je hlavní intracelulární degradační systém, kterým poškození lysozomů vede k jejich degradaci. Mizushima a kol. [45] prokázali, že za podmínek hladovění, zánětu nebo oxidačního stresu může autofagický proces regulovat degradaci poškozených proteinů a organel v buňkách, takže lze dosáhnout buněčné renovace a homeostázy. Lehký řetězec proteinu 1 asociovaný s mikrotubuly 3 (LC3) a Beclin-1 hrají hlavní roli v autofagii savců. LC3 existuje ve dvou formách, a to v cytosolové formě (LC3 I) a ve formě konjugované s lipidovým fosfatidylethanolaminem (LC3 III), která je vložena do vnitřní i vnější membrány rostoucího autofagosomu[46,47]Zhang et al. 48] použili konverzi LC3I na LC3II jako biochemický marker k analýze stavu autofagie v melanocytech. Další výzkum ukázal, že LC3 je markerem konečné tvorby autofagozomů, zatímco Beclin-1 je zapojen do počátečního kroku tvorby autofagozomů aktivující autofagii [49]. Konstitutivní autofagická aktivita hraje klíčovou roli v prevenci oxidačního poškození v melanocytech, ale existuje jen málo studií o molekulárních mechanismech regulujících autofagii v melanocytech pod oxidačním stresem.

Následně jsme zkoumali implikaci autofagie zprostředkované CPE pro přežití buněk v melanocytech vystavených oxidativnímu stresu. Naše výsledky ukazují, že po ošetření CPE byla aktivována autofagie prostřednictvím zvýšené exprese Beclin-1 a indukované konverze LC3I na LC3 II. To naznačuje, že CPE má cytoprotektivní účinek prostřednictvím aktivace autofagie v melanocytech vystavených oxidačnímu stresu.

Na závěr tato studie prokázala, že léčba CPE má nejen antimelanogenní účinek prostřednictvím MITF/JNK dráhy v normálních melanocytech, ale také při HzOg-indukovaném oxidativním stresu udržovala buněčné přežití a vyvíjela cytoprotekci prostřednictvím MITF, což mělo za následek trvalou aktivaci. autofagie v Melan-a buňkách.

Tento článek je převzat z Cosmetics 2021, 8, 67. https://doi.org/10.3390/cosmetics8030067 https://www.mdpi.com/journal/cosmetics