Další hodnocení Salvia Haenkei jako inovativní strategie proti foto-stárnutí pokožky a obnovení integrity bariéry
Jul 21, 2022
Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací
abstraktní:Kůže je základní bariérou lidského těla, která plní mnoho funkcí. Endogenní faktory spolu s vnějšími vlivy neustále ovlivňují integritu kůže, což vede k výrazným strukturálním změnám, které ovlivňují nejen vzhled kůže, ale také její různé fyziologické funkce. Změny bariérových funkcí vedou ke zvýšenému riziku rozvoje onemocnění a vedlejších reakcí, proto je zřejmý význam zachování integrity epidermální bariéry a zpomalení procesu stárnutí kůže.cistanche růst penisuSalvia hankie (SH) byla nedávno identifikována jako potenciální činidlo proti stárnutí; jeho extrakt je schopen snížit hladinu senescentních buněk ovlivněním uvolňování ll.1a a snížením tvorby reaktivních forem kyslíku (ROS). V této studii byl SH extrakt testován na lidské keratinocytové buněčné linii (HaCaT) vystavené stresovým faktorům souvisejícím s předčasným stárnutím buněk, jako jsou volné radikály a ultrafialové B záření. Potvrdili jsme, že SH působí jako scavenger ROS a zjistili jsme jeho schopnost obnovit integritu kožní bariéry posílením struktury cytoskeletu, utěsněním těsných spojení a zvýšením rychlosti migrace buněk. Vzhledem k těmto výsledkům se tato práce stává relevantní a identifikuje Salvia hankie jako sloučeninu užitečnou pro ošetření pokožky proti stárnutí v klinické praxi.
Úvod
Zdravá a fungující pokožka je nezbytná pro ochranu před dehydratací a pronikáním různých druhů proti 100 procentům, mikroorganismům, alergenem, dráždivým látkám a záření. Každodenní expozice vnějším činitelům v kombinaci s některými vnitřními faktory, jako je genetika, buněčný metabolismus, hormony a metabolické procesy, vede k přirozenému stárnutí kůže [1]. Fenomén stárnutí kůže je ve velké míře spojen s ultrafialovým zářením, znečištěním, opakovaným používáním svalů a gravitací [2, 3]. Stárnutí kůže je tedy výsledkem kumulativních strukturálních a fyziologických změn a progresivní modulace kožních vrstev [2, 4, 5]. I když stárnutí není považováno za patologický stav, ale spíše za biologický a nevyhnutelný proces, jeho korelace s řadou kožních onemocnění je nyní dobře prokázána. Vzhledem k tomu, že nejrelevantnější kožní onemocnění související s věkem jsou degenerativní poruchy, benigní a maligní novotvary atd., je zřejmá důležitost péče o pleť pro léčbu nebo prevenci určitých kožních poruch.[6-8]. V současnosti působí strategie proti stárnutí pleti tak, aby zvrátily dermální a epidermální známky foto/chronologického stárnutí. Na základě jejich přístupů je lze klasifikovat takto: kosmetologická péče, topické přípravky, invazivní výkony, systémové přípravky, vyhýbání se exogenním faktorům stárnutí, úprava životního stylu a návyků a preventivní medicína [9]. Existují dvě hlavní skupiny látek, které lze použít jako složky přípravků proti stárnutí: 1. Buněčné regulátory, jako je retinol, peptidy a růstové faktory, přímo působící na metabolismus a produkci kolagenu; 2. Antioxidanty, jako vitamíny, polyfenoly a flavonoidy, jsou schopny snížit degradaci kolagenu [9].
Podstatné důkazy podporují myšlenku, že stárnutí kůže je řízeno hlavně ROS, který vzniká během endogenního oxidativního buněčného metabolismu [10,11]. Je známo, že akumulace ROS je zodpovědná za poškození buněk včetně peroxidace lipidů, poškození membránových proteinů a mutace DNA, které vedou ke strukturálním a funkčním změnám kůže. V průběhu času lidské buňky podporují přirozený nárůst hladin ROS, spojený s částečnou ztrátou antioxidační obranyschopnosti. Tento nevyhnutelný stav je dále podporován denním ultrafialovým zářením (UVR), které indukuje syntézu matricových metaloproteináz (MMP) a následně destrukci kolagenu zprostředkovanou MMP [12, 13]. Studie in vivo prokázaly kauzální vztah mezi mitochondriálním oxidačním poškozením, buněčnou senescencí a fenotypy stárnutí [10, 14].
Buněčná senescence je definována jako stabilní zastavení buněčného růstu, ke kterému dochází ve všech lidských buňkách během stárnutí [15-17]. V důsledku stresových událostí, jako je nadměrná exprese onkogenu, tvorba ROS a poškození DNA (například vyvolané UVR, zejména UVB světlem), mohou buňky předčasně zestárnout [18].výhody cistanche salsyV tomto scénáři se zdá být evidentní význam vývoje inovativních strategií schopných zabránit akumulaci senescentních buněk nebo je selektivně zabíjet, a tak působit proti stárnutí a poruchám spojeným se stárnutím. Nedávno jsme identifikovali Salvia hankie (SH), bolivijskou rostlinu bohatou na vitamín B a antioxidační vlastnosti, jako potenciální činidlo proti stárnutí [18].
Je dobře známo, že akumulace senescentních buněk v průběhu času je jedním z nejdůležitějších mechanismů, kterými tkáně podléhají procesu stárnutí, který se zdá být v zásadě spouštěn přetrváváním typického zánětlivého stavu. Ve skutečnosti, přestože senescentní buňky nejsou schopny proliferovat, mají vysokou metabolickou aktivitu a účinně produkují několik prozánětlivých molekul [19]. Použitím modelu lidské pokožky (EpiSkin) bylo skutečně prokázáno, že SH extrakt snižuje hladiny senescentních buněk ovlivněním uvolňování ILla a snížením tvorby ROS [18].
V homeostatických podmínkách je kůže účinnou bariérou, která chrání před vnějšími útoky a endogenními faktory a reguluje ztrátu tekutin, elektrolytů a bílkovin. Tento důležitý úkol je připisován především epidermis, dynamickému, vysoce vrstvenému epitelu. Dvěma hlavními složkami epidermis jsou stratum corneum, vnější vrstva a těsná spojení (TJ), mezibuněčná spojení, která utěsňují přilehlé keratinocyty ve stratum granulosum [20]. Buněčné adheze jsou nezbytné pro udržení integrity epidermální bariéry.cistanche tubulosa dávkování redditTuto důležitou funkci plní specializovaná spojení buňka-buňka: adherentní spojení (AJ), desmozomy a těsné spojení. Tyto struktury nejen umožňují fyzické spojení mezi buňkami, ale celkově organizují cytoskeletální prvky a modulují signální dráhy zapojené do vývoje, struktury a fyziologie tkání. Nedávné genetické studie neočekávaně odhalily nekanonickou roli junkčních proteinů, čímž poukázaly na důležitost junkčního přeslechu, vzájemných závislostí a kompenzace pro zajištění robustnosti tkáně [21].
Zde jsme studovali aktivitu extraktu ze šalvěje haenkei, abychom pochopili molekulární mechanismus zodpovědný za jeho ochranné účinky na foto/chronologické stárnutí pleti. Z tohoto pohledu byly lidské spontánně imortalizované keratinocyty (HaCaT) použity jako in vitro model a mechanismus účinku SH byl analyzován v bazálním režimu i za stresových podmínek vyvolaných ozářením H202 a/nebo UVB.
VÝSLEDEK
Bezpečný profil extraktu SH a vlastnosti proti stárnutí Oxidační stres v kůži hraje hlavní roli v procesu stárnutí a v patogenezi několika kožních poruch [22]. Matic a kol. již prokázala, že anti-senescenční aktivita Salvia haenkei také koreluje s jejími vychytávacími vlastnostmi [18]. Tyto ochranné účinky by mohly být využity k vývoji nového ošetření na opravu pokožky schopného zachovat integritu bariéry. S cílem hloubkově prozkoumat vlastnosti SH byla nejprve ověřena aktivita extraktu na životaschopnost buněk a tvorbu ROS v buněčném modelu HaCaT.
Cistanche může proti stárnutí
Test buněčné životaschopnosti byl proveden za účelem řešení možných cytotoxických účinků extraktu Salvia haenkei na keratinocyty. Buňky HaCaT byly ošetřeny extraktem SH （0.01-10 ug/ml） po dobu 24 a 48 hodin. Životaschopnost buněk byla hodnocena vylučovacím testem s trypanovou modří. Obrázek 1A a 1B ukazují, že ošetření SH extraktem neovlivňuje životaschopnost buněk, což potvrzuje bezpečnostní profil extraktu na HaCaT buňkách za použitých experimentálních podmínek.
Aktivita extraktu Salvia haenkei na tvorbu ROS byla testována v HaCaT buňkách po 3-24 hodinách léčby a před a po expozici H2O2.
Výsledky na obrázku 2A ukazují, že SH je schopen snížit bazální hladiny ROS v buňkách, zejména během 3-hodinové doby léčby. Kromě významného zvýšení hladin ROS po stimulaci H-Oz (obrázek 2C) je SH schopen zabránit produkci ROS. Extrakt SH (0,01 ug/ml) významně redukoval (-25 procent) tvorbu ROS indukovanou oxidačním stimulem (obrázek 2B), vykazující účinek srovnatelný s NAC po 3 hodinách léčby. 24 hodinová léčba SH se zdá být účinnějším proti zvýšení ROS při významném snížení hladin ROS při 1 a 10 ug/ml (obrázek 2B). Tyto výsledky potvrzují Salvia haenkei
antioxidační účinky, jak bylo dříve pozorováno [18], vykazují antioxidační bazální účinek již počínaje krátkými ošetřeními; účinek v prevenci zvýšení indukovaného oxidačním stimulem je nejrelevantnější pro delší dobu léčby.
Uvádí se, že ultrafialové záření vyvolává zvýšení intracelulárních hladin ROS v lidské kůži, což způsobuje poškození a předčasné stárnutí a další patologické stavy [23-25]. Proto byl hodnocen vliv SH extraktu na produkci ROS zprostředkovanou UVB. Jak se očekávalo, výsledky na obrázku 3C ukazují významné zvýšení intracelulárních hladin ROS po stimulaci UVB. Léčba SH, která vyvolává tendenci snižovat bazální hladiny ROS v buňkách (obrázek 3A), je schopna zabránit zvýšení indukované stimulací UVB (obrázek 3B). 3 hodinová léčba SH indukuje tendenci ke snížení hladin ROS; delší léčba SH je účinnější v boji proti oxidačnímu stresu a vykazuje významný pokles, jak je uvedeno na obrázku 3A. Tyto údaje podtrhují antioxidační aktivitu šalvěje haenkei také při oxidativním stresu zprostředkovaném UVB zářením.
Jak již bylo zmíněno, stále více důkazů naznačuje, že stárnoucí buňky se hromadí v chronologicky a fotostárnuté kůži, což přispívá ke kožním alteracím a patologiím souvisejícím s věkem [26]. Účinek Salvia hankie byl proto hodnocen na markerech stárnutí p21 a p27 (které zabraňují fosforylaci proteinu retinoblastomu (Rb) a s inhibiční aktivitou na CDK2-cyklin E, resp. [27]) po fotostresu vyvolaném ultrafialová radiace. Výsledky na obrázku 4 ukazují, že UVB záření indukuje významné zvýšení hladin p21 a p27 mRNA ve srovnání s nestimulovanou kontrolou.cistanche แอ ม เว ย์Podobný trend v prevenci nárůstu je pozorován u buněk ošetřených SH. SH 1 ug/ml indukuje významné snížení hladin p21 ve srovnání s kontrolou stimulovanou UVB, zatímco ostatní koncentrace indukují tendenci k redukci (obrázek 4A). Hladiny P27 jsou významně sníženy předléčením SH 0.01, 0,1 a 10 ug/ml (obrázek 4B).
Bylo také zjištěno, že senescentní buňky negativně ovlivňují mikroprostředí sekrecí prozánětlivé směsi chemokinů, cytokinů, růstových hormonů a proteáz, známé jako senescenčně asociovaný sekreční fenotyp (SASP) [28]. Výsledky na obrázku 5 ukazují, že stimulace UVB indukuje významné zvýšení hladin mRNA ILla (A), IL6(B) a IL18(C) s ohledem na nestimulovanou kontrolu. Předběžná léčba SH představuje silnou aktivitu v boji proti zvýšení hladin cytokinů. Jak je znázorněno na obrázku 5A, SH 10 ug/ml významně snížil hladiny ILla; na zvýšení IL6 významně působí SH 0,01,0,1 a 10 ug/ml (obrázek 5B), zatímco všechny testované koncentrace jsou schopny významně snížit hladiny IL18 (obrázek 5C). Udržování kožní bariéry Vzhledem k výše uvedeným výsledkům na epiteliální buněčné linii byl hodnocen účinek SH extraktu na několik proteinů a procesů zapojených do udržování kožní bariéry a opravy poškození tkáně.
Sirtuin-1 výraz
Několik studií in vitro uvádí, že UVB záření indukuje pokles hladin proteinu Sirtuinl (SIRT1) v lidských fibroblastech, což ukazuje na zapojení SIRT1 do poškození zprostředkovaného UVB [29]. Účinek extraktu ze Salvia haenkei na expresi proteinu Sirtuinl byl tedy hodnocen testem western blot (obrázek 6). Jak se očekávalo, stimulace UVB indukovala významný pokles exprese proteinu SIRTI v buňkách HaCaT. Byla proto zkoumána aktivita SH extraktu na hladiny SIRT1. Je zajímavé, že výsledky ukazují, že 1 ug/ml SH extraktu ve srovnání s kontrolou vyvolalo zvýšení exprese SIRTl (plus 40 procenta) za bazálních podmínek, což ukazuje na potenciální stimulační účinek na hladiny SIRT1. Jak se očekávalo, stimulace UVB vyvolává významné snížení hladin SIRT1. Výsledky ukazují, že předběžné ošetření 0,01 ug/ml SH extraktu vykazuje zlepšující účinek na hladiny Sirtuinu 1 ve srovnání s kontrolou ošetřenou UVB.
Test hojení ran
Keratinocyty jsou hlavní složkou epidermis, tvoří bariéru mezi organismem a prostředím. Jejich proliferace a migrace proto hrají klíčovou roli při udržování účinné bariéry a při hojení ran po úrazech [30, 31]. Byl tedy hodnocen účinek SH na migraci HaCaT buněk. Obrázky na obrázku 7A ukazují, že ošetření SH vede ke snížení tloušťky vrypu, což ukazuje na účinek na migraci HaCaT buněk. Obrázek 7B uvádí konstrukci kymogramu migrační rychlosti HaCaT buněk; obrázky ukazují na koncentraci závislé zvýšení buněčné migrace. Graf na obrázku 7C ukazuje významné zvýšení rychlosti buněčné migrace po 4-8 hodinách působení 0,01 ug/ml SH extraktu. Maximálního nárůstu je dosaženo v intervalu 8-12 hodin, kde rychlost buněk s rychlostí migrace buněk je přibližně 165 procent vzhledem ke kontrole. Tato data, jako výsledky získané o buněčné proliferaci, naznačují, že nejnižší koncentrace SH extraktu je schopna vyvolat zvýšení rychlosti buněčné migrace nesouvisející s hyperproliferativním fenotypem.
Údržba těsných spojů
Stejně jako stratum corneum hrají těsná spojení (TJ) důležitou roli v integritě kůže, působí jako bariéra pro vodu a rozpuštěné látky a podílejí se na diferenciaci, proliferaci, buněčné polaritě a procesech přenosu signálu buněk. Nedávné studie prokázaly, že UV záření mění expresi a lokalizaci jednotlivých proteinů struktury TJ, což následně narušuje bariérovou funkci kůže [32].
Aby bylo možné vyhodnotit účinek extraktu Salvia haenkei jako možného ochranného činidla proti narušení TJs, byla exprese okludinu měřena imunocytochemií po expozici UVB záření. Obrázky na obrázcích 8A a 8B ukazují, že ošetření oběma koncentracemi SH indukuje zvýšení exprese okludinového proteinu, což podporuje tvorbu spojení užitečných pro udržení integrity epidermální bariéry. Jak se očekávalo, po vystavení UVB záření buňky vykazují nepravidelný a nedefinovaný membránový prstenec (obrázek 8A). Léčba SH, zejména při vyšší koncentraci, zachovává morfologii membrány se zachováním struktury srovnatelné s nestimulovanou kontrolou. Extrakt SH podporuje zpevnění spojů a zabraňuje poškození způsobenému vystavením UVB záření a udržuje funkčnost kožní bariéry.
Filagrinský výraz
Vliv extraktu Salvia haenkei na expresi proteinu filagrinu (FLG) byl hodnocen imunocytochemicky. Filaggrin je strukturální protein zásadní pro vývoj a udržování kožní bariéry. Výsledky na obrázcích 9A a 9B ukazují na koncentraci závislé zvýšení exprese proteinu filagrinu po ošetření SH extraktem po dobu 24 hodin. Kromě toho exprese F-aktinového proteinu ukazuje na pravidelnou distribuci buněk po ošetření SH, což vede k dobře organizované strukturální kontinuitě epiteliální bariéry. Tyto údaje naznačují, že SH má příznivý vliv na kožní bariéru, zlepšuje expresi filaggrinu, který je nezbytný pro správnou tvorbu a funkci kůže.
Exprese metaloproteinázy
Expozice kůže ultrafialovému záření vyvolává poškození extracelulární matrice (ECM), což způsobuje vrásky, ochabování a ochablost kůže, což jsou hlavní charakteristiky stárnutí kůže. Matrixové metaloproteinázy (MMP) jsou hlavní odpovědné za degradaci složek ECM, jako je kolagen, elastin, fibronektin a proteoglykany [33].kolik cistanche vzítVelký počet studií zdůrazňuje, že vystavení kůže UV záření vyvolává zvýšenou regulaci různých MMP, což ovlivňuje vzhled a zdraví pokožky [34-37].
Výsledky na obrázku 10 ukazují, že UVB záření zvyšuje expresi mRNA želatinázy MMP-2, která degraduje kolageny bazální membrány a denaturované strukturální kolageny [38]. Léčba pomocí SH je schopna významně snížit hladiny MMP-2 mRNA (SH 0.01-0.1-10 ug/ml） indikující aktivitu extraktu SH při udržování strukturální integrity buňky kůže, poškozená fotostresem.
DISKUSE
Stárnutí kůže je kumulativní účinek vnitřních a vnějších faktorů, které vedou k poklesu kůže, což způsobuje ztenčení, ztuhnutí a ztrátu pružnosti. Kůže je první bariérou mezi organismem a prostředím, proto je nezbytné zachovat její funkční a anatomickou integritu. Kromě přirozených procesů stárnutí a stavů souvisejících se stárnutím, jako je cukrovka, menopauza atd., mohou vnější faktory ovlivňovat strukturu pokožky; zejména fotopoškození, znečištění nebo faktory životního stylu (kouření, strava, emoční stres atd.) mohou narušovat strukturu a funkce kůže [39,40]. Keratinocyty jsou hlavními složkami epidermis a poskytují buněčný základ pro nejvzdálenější bariéru; v této práci byla buněčná linie lidských keratinocytů HaCaT vystavena stresovým faktorům, jako jsou volné radikály a ultrafialové záření B, aby se napodobilo přirozené stárnutí kůže, a tím se změnila bariérová funkce. Salvia hankie byla nedávno identifikována jako potenciální činidlo proti stárnutí, což naznačuje její možné použití při stárnutí kůže a poruchách souvisejících se stárnutím kůže; proto byl účinek extraktu z této rostliny hluboce zkoumán na parametry související se stárnutím pokožky, udržováním integrity pokožky a fyziologickými podmínkami. Předpokládá se, že produkce reaktivních forem kyslíku nebo volných radikálů prostřednictvím normálních endogenních metabolických procesů nebo UVR a znečištění přispívá k procesům stárnutí pokožky. Kůže je zranitelná vůči různým redoxním reakcím a redoxní rovnováha je nezbytná pro udržení homeostázy kůže. Nízké koncentrace ROS vyvíjejí fyziologické aktivity, ale zvýšené hladiny těchto druhů se podílejí na aktivaci drah, což vede ke zvýšené degradaci kolagenu, akumulaci elastinu, aktivaci matrix-degradujících metaloproteáz atd. [41]. ROS navíc hraje významnou roli v patologických procesech včetně stárnutí, zánětů, poranění a patogeneze několika kožních onemocnění, jako je psoriáza a vitiligo [42]. Zajímavé je, že extrakt ze šalvěje haenkei snižuje hladiny ROS v bazálních podmínkách, v podmínkách oxidačního stresu a stresových podmínkách vyvolaných UVB zářením, což ukazuje na potenciální ochranný účinek proti změnám zprostředkovaným ROS [22].
Na podporu dříve pozorovaného antiaging efektu Salvia hankie jsme v této práci prokázali schopnost SH extraktu snižovat stárnutí v keratinocytech stimulovaných UVB zářením. Výsledky ukazují, že SH je schopen snížit genovou expresi markerů stárnutí p21 a p27, které jsou stimulovány UVB zářením. Zajímavé je, že extrakt SH vykazuje slibnou aktivitu při snižování zánětlivé reakce podporované fotopoškozením v buňkách snížením transkripce interleukinů. Kromě toho jsme zajímavě prokázali, že extrakt Salvia haenkei indukoval expresi proteinu Sirtuinl nejen po stresu, ale také za bazálních podmínek, což ukazuje slibnou aktivitu při zpomalování procesů stárnutí. Bylo prokázáno, že rodina sirtuinů, a zejména SIRT1, hraje roli při stárnutí-fotoaging, zejména prostřednictvím inhibice MMP a následné degradace kolagenu; četné studie zdůraznily jeho ochrannou roli při fotostárnutí zprostředkovaném UVB zářením. Bylo prokázáno, že přírodní sloučeniny, jako je juglon (5-hydroxy-1,4-naftalendion), obnovují SIRT1 na normální úroveň po léčbě UVB, což naznačuje, že SIRTI může hrát roli v prevenci karcinogeneze vyvolané UVB zářením. [29]. Naše výsledky rovněž naznačují možné zapojení sirtuinů do procesu reparace po UVB stresu a jejich roli v udržování homeostázy epidermis.
Běžné zánětlivé kožní poruchy, jako je atopická dermatitida a psoriáza, stejně jako procesy stárnutí, vykazují sníženou bariérovou funkci a reakce epidermálních buněk na narušení bariéry může tyto stavy zhoršit, udržet nebo dokonce iniciovat. Výsledky této práce odhalily silnou schopnost SH obnovit integritu kožní bariéry modulací několika proteinů účastnících se těchto procesů. Zejména bylo pozorováno, že stimulace transkripce okludinu a filaggrinu ukazuje na zesílení adhezí mezi buňkami. Dědičný a získaný nedostatek filaggrinu ovlivňuje epidermální bariéru a mění organizaci
cytoskeleton keratinová filamenta a struktura zrohovatělé obálky kůže [43]. Poruchy exprese FLG dále vyvolávají pokles počtu keratohyalinových granulí, výrazný pokles koncentrace přirozeného zvlhčujícího faktoru (NMF) a alkalizaci pH kůže [44]. Navíc jsou dobře popsány změny v klaudinech a okludinových proteinech, které patří k proteinům těsných spojů (TJs), pokud jde o procesy stárnutí. TJ jsou zodpovědné za utěsnění mezibuněčného prostoru mezi epiteliálními buňkami, za vytvoření funkční bariéry a podílejí se na buněčné proliferaci a diferenciaci [45]. Bylo prokázáno, že extrakt ze šalvěje haenkei zlepšuje expresi filaggrinu a zachovává lokalizaci okludinu na buněčných membránách, narušenou UVB zářením. Další aktivita extraktu SH při udržování zdravé pokožky byla prokázána jeho schopností snižovat transkripci matrixových metaloproteináz 2 (MMP-2), stimulovanou UVB zářením. Upregulace MMP usnadňuje stárnutí a kožní patologické stavy tím, že degraduje kolagen a elastin, což způsobuje poškození extracelulární matrix (ECM) [33, 38], takže snížení těchto proteináz je v kontextu stárnutí kůže cenné.
Pozitivní účinky léčby SH pozorované v této studii na nejběžnější kožní molekulární parametry potvrdila i nedávná klinická studie provedená na kohortě padesáti bělošských žen ve věku 45 až 60 let [46]. Salvia hankie byla podávána ve formě krému a několik parametrů, jako je zarudnutí a elasticita kůže, hloubka vrásek a antioxidační potenciál, bylo hodnoceno jak klinickým, tak instrumentálním hodnocením, stejně jako sebehodnocením subjektů. Výsledky této studie odhalují účinnost SH při zmírňování úbytku pleti při každodenní aplikaci v kontextu mírného stárnutí pleti. Ve skutečnosti po 84 dnech aplikace byla pokožka žen pružnější a vykazovala nižší počet červených oblastí a mělčích vrásek. Kromě toho studie prokazuje progresivní zvýšení antioxidační schopnosti pokožky po každodenní aplikaci krému [46].
Kůže je jako ochranný úkryt těla před vnějším prostředím neustále vystavena potenciálnímu poranění, a proto je hojení ran nezbytným procesem pro přežití všech organismů. Vzhledem k prokázané schopnosti SH udržovat zdravou a neposkvrněnou pokožku jsme předpokládali, že tento extrakt by mohl pomoci také zlepšit regeneraci pokožky tím, že je užitečný při opravě kožních lézí. Nakonec byla tedy zvážena aktivita SH na migraci keratinocytů, která je klíčovým krokem při obnově kožní bariéry po poranění. Léčba extraktem SH odhalila zajímavou aktivitu, která je schopna zvýšit rychlost migrace HaCaT, což prokazuje silný účinek na obnovení epiteliálního poškození po lézích. Vzhledem k tomu, že migrace je kritickým prvkem v procesu hojení ran, naše údaje, také s ohledem na nehyperproliferační aktivitu extraktu, naznačují potenciální účinek SH extraktů v rychlejším potlačení účinku poranění v kožní bariéře, čímž se snižuje riziko vzniku infekce.
Naše údaje poukazují na extrakt ze šalvěje haenkei jako na užitečnou sloučeninu, která buď pomáhá při obnově bariéry, nebo tlumí reakci epidermálního stresu. Současně s nedávným pokusem na lidech tato práce poskytuje další pohledy na mechanismy podílející se na pozitivním účinku extraktu na stárnutí pokožky.
Tato práce na podporu předchozích prací [18, 46] identifikuje zvláštnějším způsobem molekulární mechanismus spojený s účinností Salvia hankie při modulaci kožních parametrů, což zdůrazňuje význam Salvia hankie jako přitažlivého činidla užitečného pro anti-aging. a kožních poruch souvisejících se stárnutím.
MATERIÁLY A METODY Buněčná kultura a UVB ozařování
Buňky HaCaT (lidské spontánně imortalizované keratinocyty) byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eaglově médiu (DMEM) s vysokým obsahem glukózy doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (Life-Technologies, Waltham, MA, USA), 2 mM glutaminem, 100 U/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (Lonza, Basilea, Švýcarsko). Buňky byly udržovány ve zvlhčené atmosféře 5 procent CO2 ve vzduchu a inkubovány při 37 stupních.
Na základě požadavku experimentálního protokolu byly buňky vystaveny 30 KJ/m² UVB záření dodávanému nízkopásmovou UVB PL-S lampou Philips Medical. Aby se zabránilo absorpci světla médiem pro tkáňovou kulturu, bylo toto před ozářením odstraněno a nahrazeno DMEM FBS a červeným fenolem bez obsahu podle ozařovacího protokolu [47]. Po ozáření UVB byly buňky krmeny čerstvým růstovým médiem nebo použity pro experimenty podle protokolu.
Test životaschopnosti buněk-vylučovací test trypanové modři 35 x 103 buněk bylo naneseno na 12jamkové destičky a po inkubaci přes noc byly vystaveny různým koncentracím hydroethanolického extraktu Salvia haenkei podle experimentálních protokolů. Extrakt byl laskavě poskytnut společností IBSA Farmaceutici Italia (Lodi, Itálie) a představuje obsah markeru kyseliny rosmarinové 0,6 procent hmotn./hmotn. podle HPLC. Po ošetření byly buňky promyty, odděleny 0,25 procenty trypsinu-0,2 procenta EDTA a suspendovány v trypanové modři (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) v poměru 1:1 v roztoku média. Buňky byly spočítány za použití komorového Burkerova hemocytometru.
ROS fluorescenční test
ROS byla kvantifikována pomocí 2',7'-dichlorfluorescein-diacetátu (Hz-DCF-DA, Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA), jak bylo popsáno dříve [48]. Stručně, buňky (5x10') byly naočkovány do 96-jamkových destiček, ponechány přes noc přilnout a poté vystaveny SH extraktu na 3 nebo 24 hodin. N-acetylcystein 5 mM (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) byl použit jako pozitivní kontrola.
Pro podmínky oxidačního stresu byla hladina ROS měřena po přidání 50 μM Hz-DCF-DA v nepřítomnosti nebo přítomnosti H2Oz [48]. Intenzita fluorescence DCF byla měřena při excitaci 485 nm - emise 535 nm, za použití Multilabel Plate Reader VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Pro hodnocení hladin ROS v podmínkách stresu UVB byl protokol mírně upraven inkubací buněk v SH roztoku - 50 μM Hz-DCF-DA v PBS. Po 25 minutách inkubace při 37 stupních byla destička vystavena UVB záření a intenzita fluorescence DCF byla okamžitě změřena při excitaci 485 nm – emise 535 nm, pomocí Multilabel Plate Reader VICTOR X3 (PerkinElmer, Waltham, MA, USA).
Imunofluorescenční mikroskopie
10x104 buněk bylo nasazeno na skleněná krycí sklíčka předem potažená kolagenem v 24-jamkových destičkách, ponechána přes noc přichytit a ošetřena SH extraktem podle protokolu. Pro detekci -cateninových a okludinových proteinů byly buňky vystaveny UVB záření, jak je popsáno ve výše uvedeném protokolu. Po ozáření byly buňky krmeny čerstvým růstovým médiem nebo použity pro experiment podle protokolu. Pro imunofluorescenční test byly buňky 4 hodiny po ozáření UVB promyty, fixovány 4% formaldehydem, permeabilizovány 0,1% Tritonem X-100 v PBS a barveny po dobu 1 hodiny při 37 stupních různými protilátkami specifickými pro protein: myší monoklonální anti-okludin (Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, USA), myší anti-filaggrin (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA). Po promytí PBS byly buňky inkubovány se sekundárními protilátkami/fluorescein isothiokyanátem (Alexa Fluor 488 anti-myší nebo Alexa Fluor 536 anti-králičí imunoglobulin G, Molecular Probes, Invitrogen Life Technologies, Waltham, MA, USA) a s faloidinem po dobu 1 hodiny při pokojová teplota. Po 10 minutách působení RNázy byla krycí sklíčka připevněna na sklíčka pomocí Mowiolu 40-88 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA) a přidán propidium jodid. Snímky byly získány pomocí konfokálního mikroskopu LSM 800, zvětšení 60X, software ZN 2.1 blue Edition (Carl Zeiss, Jena, Německo) a kvantifikovány pomocí softwaru ImageJ.
Statistická analýza
Statistická analýza byla provedena pomocí GraphPad Prism verze 7.02 pro Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Pokud není uvedeno jinak, výsledky jsou uvedeny jako průměr plus SEM. Byl použit Studentův t-test a hodnoty p<0.05 were="" considered="" statistically="">
Zkratky
AJ:adherens křižovatka; ECM: extracelulární matrix;FLG: filagrin; Hz-DCF-DA: 2',7'-dichlorfluorescein-diacetát; H2Oz: peroxid vodíku; MMP: matricová metaloproteináza; NAC: N-acetylcystein; NMF:faktor; ROS: přírodní hydratační reaktivní kyslík
druh; SIRTl: Sirtuinl; SH: Salvia kapesníček; TJ: těsné spojení; UVB: Ultrafialové záření B.
Tento článek je převzat z www.aging-us.com
