Účinek faktoru nervového růstu na podporu prostorové paměti závisí na hipokampální cholinergní inervaci

Pro více informací:ali.ma@wecistanche.com

Abstraktní

Genová terapie pro nervový růstový faktor (NGF) byla použita v klinických studiích Alzheimerovy choroby. Pochopení základního mechanismu toho, jak NGF ovlivňujePaměťmůže pomoci vyvinout nové strategie léčby. Jak NGF, tak cholinergní systém hrají důležitou roli v učení aPaměť. NGF je nezbytný pro udržení cholinergní inervace hipokampu, ale záleží na tom, zda podpůrný účinek NGF na učení aPaměťje specificky závislá na intaktní hipokampální cholinergní inervaci. Zde charakterizujeme chování a hipokampální měření objemu, neurogeneze, dlouhodobé potenciace a cholinergní inervace u mozkově specifických myší s deficitem Ngf. Naše výsledky ukazují, že knockout myši vykazují zvýšenou úzkost, zhoršené prostorové učení a paměť, snížený objem hipokampu v dospělosti, neurogenezi, krátkodobou potenciaci a cholinergní inervaci. Nadměrná exprese Ngf v hipokampu u myší s knockoutem genu Ngf byla zachráněna prostorověPaměťa částečně obnovené cholinergní inervace, ale ne úzkost. Selektivní deplece cholinergní inervace hipokampu měla za následek zhoršení prostorového prostoruPaměť. Nadměrná exprese Ngf v hipokampu však nedokázala zachránit prostorPaměťu myší s hipokampálně selektivní deplecí cholinergních vláken. Závěrem demonstrujeme dopad nedostatku Ngf v mozku a poskytujeme důkaz, že účinek NGF na prostorovéPaměťje závislý na intaktní cholinergní inervaci v hippocampu. Výsledky naznačují, že adekvátní cholinergní cílení může být kritickým požadavkem pro úspěšné použití NGF genové terapie Alzheimerovy choroby.

Wei Zheng Eu1, Yu-Ju Chen1, Wei-Ting Chen1, Kuan-Yu Wu1, Cheng-Yu Tsai1, Sin-Jhong Cheng2,

Roderick N. Carter3 a Guo-Jen Huang 1,4,5

Úvod

Nervový růstový faktor (NGF), neurotrofický růstový faktor poprvé identifikovaný v 50. letech 20. století, podporuje růst neuritů a stimuluje diferenciaci nervových buněk v kultivačních experimentech1–3. V mozku se nejvyšší exprese Ngf mRNA nachází v hipokampu4. NGF aktivuje dva receptory: receptor NGF s nízkou afinitou (společný neurotrofický receptor, p75) a receptor NGF s vysokou afinitou (TrkA), které jsou oba exprimovány v bazálních cholinergních neuronech předního mozku5,6 a je známo, že inervují hipokampální strukturu7. Důkazy naznačují, že NGF je uvolňován z cílových buněk a spouští signální dráhy retrográdně podél axonu8. Existuje silná vazba mezi NGF a cholinergním systémem v hipokampu. Injekce NGF do postranních komor zvyšuje aktivitu cholinacetyltransferázy (ChAT) v hipokampu9. Dále bylo prokázáno, že NGF chrání bazální cholinergní neurony předního mozku po axonálním poškození hipokampálních vyčnívajících vláken10.

Click to Cistanche tubulosa výhody a vedlejší účinky pro paměť

Pro příčinu Alzheimerovy choroby bylo navrženo několik hypotéz. Jednou z nich je hypotéza NGF11. Od počátku 80. let 20. století několik zpráv ukazuje, že u dementních starších lidí dochází k významné cholinergní dysfunkci a že cholinergní neuronální degenerace je spojena s kognitivními deficity u Alzheimerovy choroby1.

Nová pozitronová emisní tomografie (PET) radiotracer 18F-fluoroethoxy benzen středník poskytla novější důkazy, že u pacientů s Alzheimerovou chorobou existuje více kortikální cholinergní terminální ztráty13. Studie na zvířatech také poskytují důkaz, že hustota cholinergních inervací klesá u starých potkanů ​​a transgenních myší podobných Alzheimerově chorobě14,15. Navíc staré anti-NGF myši vykazují fenotypy podobné Alzheimerově chorobě, jako je ztráta neuronů, cholinergní deficity a poruchy prostorové paměti16. Nedávná studie naznačuje, že metabolická dráha NGF je narušena u pacientů s Alzheimerovou chorobou, přičemž bylo zjištěno, že molekulární aparát pro zrání proNGF je snížen, zatímco molekulární aparát pro zrání proNGF je zvýšen17.

Centrální cholinergní systém je zapojen do učení18,19 a zdá se, že NGF hraje důležitou roli v jeho podpoře. Intraventrikulární infuze NGF může zachránit jak mírnou cholinergní depleci v hippocampu, tak deficit paměti u heterozygotních myší s Ngf plus/− mutantem20. Důkazy také ukazují, že NGF moduluje sílu cholinergních projekcí do hipokampu a ovlivňuje neuronální plasticitu a udržení chování při prostorovém učení21. Zůstává však neznámé, zda účinky NGF na učení závisí na těchto cholinergních projekcích do hipokampu. Objasnění tohoto může poskytnout lepší porozumění pro vývoj léčby Alzheimerovy choroby. V této studii jsme tuto otázku řešili pomocí mozkově specifických myší Ngf s podmíněným knockoutem (cKO), abychom odhalili důležitost NGF v úzkosti a prostorové paměti. Dále jsme zjistili, že účinek NGF na prostorovou paměť, nikoli však úzkost, vyžaduje cholinergní projekci do hipokampu.

Materiály a metody

Zvířata

Experimenty byly provedeny na pohlavně vyvážených kohortách 12-týdenních Ngf cKO a myší divokého typu (WT) ze stejného vrhu. Ngf floxované myši z National Laboratory Animal Center, Tchaj-wan, (RMRC 13175) a myši Sox1::Cre (Acc. No. CDB0525K)22 byly použity k vytvoření Ngf flox/flox; Myši Sox1::Cre v této studii. Ngf flox/flox; Myši Sox1::Cre (cKO) a Ngf flox/flox (WT) použité v této studii byly sourozenci vytvořené křížením Ngf flox/flox; Myši Sox1::Cre s homozygotními myšmi Ngf flox/flox. Dvanáctitýdenní samci myší C57BL/6Narl byli použiti pro hipokampální cholinergní denervaci. Myši se množily v podmínkách certifikovaném AAALAC za specifických podmínek bez patogenů. Byli umístěni v cyklu světlo-tma 12:12 h při teplotě 22 stupňů a vlhkosti 60–70 procent. Zvířata měla ad libitum přístup k potravě a vodě. Všechny postupy byly provedeny v souladu s místními předpisy a byly schváleny Institucionálním výborem pro péči o zvířata a jejich použití na univerzitě Chang Gung (číslo povolení: CGU105-033).

Behaviorální testy

Pro behaviorální testy byl pohyb zvířat zaznamenáván a sledován pomocí video záznamového systému. Myši pro provádění behaviorální analýzy byly náhodně rozděleny do samostatné klece pro testování s podestýlkou, potravou a vodou, než byly přeneseny zpět do domácí klece. Všechna bludiště jsou vyrobena z akrylu; během testu není v bludišti žádná podestýlka. Všechna data o chování byla zaznamenána a získána automaticky softwarem Ethovision.

Otevřené pole

Myši byly umístěny do kulatého otevřeného pole o poloměru =45 cm a vnitřního kruhu o poloměru =30 cm. Nechali se volně pohybovat po dobu 5 minut a byli sledováni softwarem Ethovision.

Zvýšené plus-bludiště

Zařízení použité pro test ve zvýšeném plus bludišti (EPM) sestávalo ze dvou otevřených ramen (30 × 5 cm) a dvou uzavřených ramen stejné velikosti se stěnami vysokými 15 cm. Bludiště bylo vyvýšeno 38 cm nad podlahu. Myši byly umístěny do EPM na 5 minut se slabým světlem a byla měřena doba strávená v otevřeném rameni.

Morrisovo vodní bludiště

To bylo provedeno v kulatém vodním bludišti (průměr 110 cm, hloubka 50 cm) umístěné ve světlé místnosti. Bazén byl naplněn do hloubky 15 cm vodou, která byla neprůhledná přidáním bílé netoxické barvy. Čtvercová úniková plošina (9 × 9 cm) byla ponořena 0,5 m pod hladinou vody, v pevné poloze v jednom z kvadrantů. Myši byly trénovány po dobu 4 dnů. V každý tréninkový den myši absolvovaly čtyři tréninkové pokusy. Interval mezi zkouškami byl 15 minut. V každém pokusu byly myši umístěny do bazénu na jednom ze čtyř výchozích míst. Myším bylo umožněno plavat/hledat maximálně 90 s nebo dokud nenalezly plošinu a bylo jim umožněno zůstat na plošině 30 s. Pokud se myši nepodařilo najít platformu v dané zkoušce, byla myš navedena na platformu. Osm dní po poslední zkoušce byla platforma kvůli testu paměti odstraněna z fondu a myš ji mohla hledat v 90. letech. Sběr dat a analýza byly prováděny automaticky, včetně délky plavecké dráhy tréninkových zkoušek a procentuálního času stráveného v cílovém kvadrantu pro test paměti.

Nové rozpoznávání objektů

Myši se mohly seznámit se dvěma identickými bílými akrylovými válci (výška=9cm,průměr= 5cm) po dobu 15 minut denně po dobu 2 dnů. Předměty byly na pevném místě v bílé komoře. Během testovací fáze třetího dne byl jeden z exponovaných předmětů nahrazen šedým brokovnicí (výška=8,7 cm, průměr=5 cm) upevněným dnem vzhůru v komoře a druhý předmět byl nahrazen novým, ale identickým bílým akrylovým válcem. Čas strávený zkoumáním každého z objektů byl shromážděn a analyzován softwarem Ethovision.

Objemová analýza hipokampu

Všechna zobrazení magnetickou rezonancí (MRI) byla provedena pomocí ClinScan 70/30 USR (Bruker BioSpin, Ettlingen, Německo) s cívkou s fázovým polem přizpůsobeným pro hlavu myši. Trojrozměrná (3D) sekvence gradient-echo byla vybrána pro získání mozkových obrazů s více řezy s následujícími parametry: doba opakování=30 ms;doba ozvěny=15 ms; úhel převrácení=20";počet průměrů=5; tloušťka řezu =0,2 mm; rozlišení v rovině=256×256; velikost voxelu=59×59 ×200 μm². Celková doba akvizice byla přibližně 15 minut s 1-2 procentním isofluranem jako anestetikem. Objem hipokampu byl měřen pomocí PMOD 3.2 (PMOD Technologies. Švýcarsko). objem každého řezu byl získán vynásobením vyznačené plochy tloušťkou řezu (0,2 mm). Celkový objem mozku byl měřen pomocí ručně vyznačených oblastí napříč 19 sagitálními řezy na zvíře, přičemž naznačená plocha byla znásobena tloušťkou řezu (0,2 Obrázky byly analyzovány za stejných podmínek slepým způsobem.

kvantifikace mRNA

Hippokampální tkáň byla odebrána myším WT a cKO, poté homogenizována v Trizolu, následovala fenol-chloroformová extrakce celkové RNA. cDNA byla poté vyrobena za použití reverzní transkriptázy SuperScript III (Invitrogen). Experimenty byly provedeny duplicitně. Hladiny genové exprese byly poté vypočteny pomocí △ACt metody a normalizovány proti kontrole Gapdh. Ng-Forward: 5'-TTCTA TACTG GCCGC AGTGA-3; Ngf-Reverse 5-TTAGT CCAGT GGGCT TCAGG-3'

Test kortikosteronu

Vzorky krve byly odebírány mezi 7:30 a 20:00 odpoledne punkcí obličejové žíly a byly odebrány do zkumavek Microvette" CB300 LH. Plazma byla oddělena od plné krve centrifugací a uložena v centrifugačních zkumavkách při {{5} „C, dokud nebude provedena analýza. Pro analýzu byly vzorky zředěny v pufru (1/40), poté analyzovány pomocí soupravy Corticosterone EIA kit (Enzo Life Sciences) podle pokynů výrobce, jak bylo popsáno výše.

Příprava virového vektoru a intrahippokampální injekce

Pro experiment s nadměrnou expresí Ngf byly použity fragmenty DNA, které kódovaly Ngf (RefSeq NM 013609) nebo zesílené. Zelené fluorescenční proteiny (eGFP) byly vytvořeny pomocí PCR a subklonovány do místa Note konstruktu viru AAV9. Rekombinantní vektory AAV9 byly produkovány standardní metodou transfekce s trojitým plazmidem a byly purifikovány dvěma cykly Csd centrifugace. Fyzikální vektorové titry AAV byly kvantifikovány měřením počtu sbalených vektorových genomů pomocí metody PCR v reálném čase.

Pro injekce virového vektoru byl chirurgický zákrok proveden v anestezii (směs Zoletil-Rompun). Myši dostaly bilaterální injekce virových vektorů do hipokampu v objemu 1,5 ul pod stereotaxickým vedením. Celkem byla čtyři místa vpichu (pro dorzální hipokampus, Předozadní (AP)-22 mm. Mediálně-laterální (ML)±2.0 mm od bregmy a Dorsálně-Ventrální ( DV)-1.8 mm od tvrdé pleny; pro ventrální hroší kampus, AP-3.0mm, ML ±3.0 a DV-3 0,3 mm). Konečná koncentrace injikovaného AAV vektoru byla 3,1×10 12vg/ml.

Imunohistochemie/in situ hybridizace a kvantifikace

Všechny řezy pro značení Ki67, Doublecortinu (DCX,5-Brom-2'-deoxyuridin(BrdU)/NeuN a ChAT byly nakrájeny na tloušťku 40μm na posuvném mikrotomu Řezy byly připevněny na sklíčka SuperFrost a sušeny přes noc. Následně byla sklíčka inkubována v 0,01 mol/l citrónovém pufru po dobu 20 minut při 90*C, 3 procenta HaO, po dobu 10 minut, opláchnuta fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem (PBS) a inkubovány přes noc při pokojové teplotě s králičí anti-Ki67 protilátkou (1:3000, Abcam), králičí anti-DCX protilátkou (1:4000, Abcam) a anti-ChAT protilátkou (1:200, Abcam). byla použita standardní králičí IgG ABC souprava (Vector Lab) a sklíčka reagovala 5-10 min s tabletou Sigma DAB. Řezy byly poté překryty DPX.

Pro dvojité značení BrdU/NeuN byly řezy inkubovány v 2N HCl po dobu 15 minut při 37 °C, neutralizovány v boritanu sodném (Sigma) po dobu 10min (pH 8,5) a třikrát promyty v PBS před inkubací s potkanem anti-BrdU (1:1500, Abcam) a myší anti-NeuN (1:1000, Millipore).Po třech promytích v PBS (každé 5 minut) byly řezy inkubovány s fluorescenční sekundární protilátkou (1:250, Alex Fluor 488 a Texas Red, Invitrogen) po dobu 2 hodin v 0,3 procentech Triton/PBS s 2 procenty kozího séra.

Pro Ngf in situ hybridizaci byla použita Ngf sonda (katalogové číslo 565131) a RNAscope 2.5 HD Brown Reagent Kit (Advanced Cell Diagnostics, USA) a barvení bylo provedeno podle manuálu k produktu. Stručně řečeno, sklíčka byla inkubována v 1x vyhledávacím pufru po dobu 5 minut při 100 stupních C, 3 procenta H,O, po dobu 10 minut a opláchnuta v 1x promývacím pufru. Sklíčka byla poté inkubována v proteáze po dobu 20 minut a následně v cílové sondě po dobu 2 hodin při 40 °C. Po sérii amplifikace byla k vizualizaci RNA použita DAB.

DCX, Ki67-značené a BrdU/NeuN dvojitě značené buňky byly spočítány na každém osmém řezu v celém rostrokaudálním rozsahu vrstvy granulárních buněk (šest řezů na zvíře). Počet spočítaných buněk byl poté vynásoben 16, aby se získal odhad celkového počtu DCX, Ki67 a BrdU-pozitivních buněk v gyrus dentatus. Všechny preparáty byly randomizovány a kódovány před kvantitativní analýzou. Buněčné somata značené ChAT byly počítány na každém druhém řezu přes rostrokaudální rozsah jádra vertikálního ramene diagonálního pruhu (VDB) a mediálního septa (MS) (čtyři řezy na zvíře). Pro reprezentativní obraz dvojitého značení BrdU/NeuN byl nejprve pořízen snímek z-stack (sedm řezů ve stohu) pod objektivem x40, poté následovala 3D dekonvoluce s rychlým iteračním režimem pomocí softwaru Axiovision Microimaging (Carl Zeiss).

Cholinergní vlákna byla vizualizována barvením ChAT a zkoumána v tmavém poli pod objektivem ×10 (Axio Imager 2, zachycený Nikonem D5100). Hustota vláken byla kvantifikována jako střední intenzita (střední hodnota šedé) prahového signálu pod oblastí hipokampu s Image 142g (NIH), hustota cholinergních vláken hippocampu byla kvantifikována jednostranně na každém osmém řezu přes celý rostrokaudální rozsah celého hipokampu.

Elektrofyziologie v hipokampálních řezech

Řezy hipokampu (tloušťka 45 0 um) byly příčně řezány vibračním řezačkou tkáně (DSK Microslicer DTK-1000; Dosaka EM, Kyoto, Japonsko). Řezy se nechaly zotavit po dobu alespoň 120 minut a byly přeneseny do záznamové komory ponorného typu namontované na svislém mikroskopu (BX51Wl; Olympus Optical, Kyoto, Japonsko) vybaveném mikroskopickým videem s infračerveným diferenciálním interferenčním kontrastem. Okysličený umělý mozkomíšní mok (5 procent CO,/95 procent O) obsahující 0,1 mM pikrotoxinu byl perfundován do záznamové komory rychlostí 1-2 ml/min. Bipolární stimulační elektroda z nerezové oceli (Frederick Haer Company, Bowdoinham, ME) (impedance 10 Meg-ohmů) a skleněná pipeta naplněná 3 M NaCl byly umístěny do stratum radiatum CA1 pro vyvolání a záznam budicích postsynaptických potenciálů pole (fEPSPs )činnost, resp. Facilitace párového pulsu (PPF) byla zkoumána v různých interstimulačních intervalech a každý interstimulační interval aplikoval dva krátkodobé proudové pulsy （40 μs） každých 20 s po dobu nejméně čtyřikrát. Pro analýzu dat byly měřeny poměry počátečních sklonů od druhé odpovědi fEPSP/první odpovědi fPSP. Pro experimenty dlouhodobé potenciace (LTP) byla stabilní základní aktivita fPSP vyvolána každých 20 s po dobu alespoň 20 minut, poté byla indukována vysokofrekvenční stimulace (HFS)-LTP pomocí 5 sledů 100 pulzů při 100 Hz s intervalem mezi kmeny z 20. let. Elektrofyziologické stopy byly amplifikovány zesilovačem (Multiclamp 700 B; Axon Instruments, Union City, CA). Všechny signály byly filtrovány dolní propustí při 1 kHz a digitalizovány při 10 kHz pomocí rozhraní CED Micro 1401 MKII (Cambridge Electronic Design). Data byla shromážděna pomocí softwaru Signal (Cambridge Electronic Design, Cambridge, UK). Synaptické odpovědi byly normalizovány na průměr výchozí hodnoty. Hodnoty krátkodobé potenciace (STP) a LTP byly stanoveny zprůměrováním 5 minut normalizovaných hodnot sklonu při 10-15 min a 55-60 min po HFS, v daném pořadí. Experimentátoři, kteří provedli elektrofyziologii, byli vůči skupině myší zaslepeni.

Hippokampální cholinergní denervace

Myší p{0}}protilátka se saporinem konjugovaná (mu p75-SAP) (ATS Bio, San Diego) byla použita při cholinergní denervaci. Poté bylo podáno 0,2 ug mu p75-SAP na jedno místo a místa injekce byla podobná místům injekce virového vektoru (čtyři místa injekce na zvíře).

Statistická analýza

Pro každou skupinu byl stanoven průměr ± SEM. Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru Graphpad Prism. Data byla analyzována pomocí analýzy rozptylu nebo t-testu podle potřeby. V případě potřeby byla provedena Bonferroniho metoda. Rozdíly byly považovány za významné, když p bylo<>

Výsledek

Snížená hipokampální neurogeneze, hustota cholinergních vláken a objem u myší Ngf KO specifických pro nervový systém

Hlavní výzvou pro studium funkcí NGF u dospělých myší je to, že konvenční modely KO umírají předčasně. Dosud většina zpráv používala k hodnocení účinku NGF52 blokátory NGF, jako je malá interferující RNA nebo protilátky. Abychom studovali roli NGF v mozku, zkřížili jsme myši Ngf floxed s myšmi Sox: Cre, které exprimují Cre v neurální trubici z E1127. Tyto tkáňově specifické cKO myši nám umožňují zkoumat funkce Ngf v mozku (obr. 1A). Nejprve byla měřena exprese hipokampální Mgf mRNA pomocí kvantitativní PCR. Výsledky ukazují výrazné snížení exprese Ngf u myší cKO (str<0.0001, tuo="8.24)(Fig.1B)." to="" further="" confirm="" the="" specificity="" of="" this="" brain="" cko,="" we="" measured="" ngf="" mrna="" levels="" in="" the="" whole="" brain,="" liver,="" and="" musde="" from="" wt="" and="" cko="" mice,="" and="" our="" results="" confirm="" the="" specificity="" of="" ko="" (supplementary="" fig.="">

Infuze NGF do laterálních komor zvyšuje jak přežití nově narozených neuronů, tak cholinergní aktivitu v hipokampu8. Proto jsme se zeptali, zda myši s deficitem Ngf mají nižší úrovně neurogeneze dospělého hipokampu a cholinergní inervace. K detekci dospělé neurogeneze jsme injikovali BrdU (200 mg/kg, jedna injekce, intraperitoneálně) dospělým myším WT a Ngf cKO (ve věku kolem 13 týdnů). Myši byly usmrceny 34 dní po této injekci BrdU pro hodnocení přežití neuronů. Obarvili jsme mozkovou tkáň na Ki67 (marker buněčné proliferace), DCX (marker pro nezralé neurony) a dvojité barvení na BrdU a NeuN (neuronový marker). Pro posouzení hustoty cholinergních vláken jsme barvili na ChAT, enzym zodpovědný za syntézu acetylcholinu. V gyrus dentatus hippocampu u myší Ngf cKO ve srovnání s myšmi WT. Pokud jde o dvojité značení BrdU a NeuN, myši Ngf cKO také vykazovaly trend pro nižší hladinu BrdU plus /NeuN plus počet buněk (p=0,054, t(14)=2,09) (obr. 1C). Společně tato data ukazují, že deficit NGF v mozku vede ke snížené hipokampální neurogenezi dospělých. Plazmatický kortikosteron je hlavním faktorem při kontrole dospělé neurogeneze29, a tak abychom určili, zda je snížená neurogeneze u Ngf cKO myší způsobena zvýšeným plazmatickým kortikosteronem, měřili jsme bazální hladinu plazmatického kortikosteronu u WT a cKO myší. Nebyl žádný významný rozdíl v bazálním plazmatickém kortikosteronu (p=0,24, t(9)=1,25), což naznačuje, že účinek Ngf na neurogenezi není způsoben rozdílem v plazmatickém kortikosteronu ( Doplňkový obr. S1b).

Předchozí práce ukázaly, že cholinergní projekce do hipokampu jsou z bazálního předního mozku30. Hodnotili jsme tedy, zda existují nějaké změny v cholinergních septohippokampálních projekcích u myší Ngf cKO. Naše výsledky z barvení ChAT ukazují, že hustota cholinergních vláken je dramaticky snížena v hipokampu myší Ngf cKO (snížení asi o 76 procent, p < 0,0001,="" t(8)="9,56)" (obr.="" 1d),="" ale="" ne="" jiné="" kortikální="" oblasti,="" jako="" je="" mediální="" prefrontální="" kůra="" (p="0.12," t(8)="1.73)" a="" časová="" asociační="" kůra="" (p="0.2," t(16="" )="1.31)" (doplňkový="" obr.="" s2a,="" b).="" společně="" tato="" data="" naznačují,="" že="" ngf="" je="" nutný="" pro="" podporu="" cholinergních="" projekcí="" do="" hipokampu,="" ale="" ne="" do="" kortexu.="" dále="" jsme="" analyzovali="" počet="" cholinergních="" neuronových="" buněk="" ve="" vdb="" broca="" a="" ms,="" odkud="" promítá="" cholinergní="" vlákna="" do="" hipokampu31,32.="" myši="" ngf="" cko="" vykazují="" malý="" pokles="" (snížení="" asi="" o="" 20="" procent)="" v="" počtu="" buněk="" chat="" v="" ms="" a="" vdb="" (p="0,022," t(16)="2,52)" (doplňkový="" obrázek="" s2c)="">

Během řezání mozkové tkáně jsme zjistili, že hipokampus cKO myší se zdál být malý. Abychom to potvrdili, provedli jsme sken MRI a naše výsledky potvrzují, že Ngf cKO má menší hipokampy než WT (p < 0,0001,="" t(12)="12)." abychom="" to="" dále="" ověřili,="" pitvali="" jsme="" hipokampus="" a="" změřili="" váhu="" a="" zjistili="" jsme,="" že="" hipokampy="" cko="" myší="" byly="" lehčí="" ve="" srovnání="" s="" wt="" myšmi="" (p="0,01," t(23)="2." 79)="" (obr.="">

Snížená úzkostná reakce a prostorové učení u myší Ngf cKO

Blokáda endogenního NGF narušuje retenci prostorové paměti21 a narušuje cholinergní signalizaci, zatímco delece cholinergního systému předního mozku ovlivňuje úzkost a prostorové učení18,33. Abychom lépe porozuměli účinkům Ngf cKO na úzkost a učení, podrobili jsme myši otevřenému poli, EPM, testování ve vodním bludišti a novému rozpoznávání objektů.

Ngf delece zvýšila chování podobné úzkosti a snížila prostorové učení a paměť, aniž by ovlivnila rozpoznávání nového objektu. V testu open-fifield myši cKO strávily méně ve střední zóně (p=0,04, t(40)=2,09), bez rozdílu v celkové ujeté vzdálenosti (p {{7 }}.31, t(40)=1.01) (obr. 2A). V EPM myši cKO strávily více času v otevřené paži (p=0,001, t(40)=3,43), ale nevykazovaly významný rozdíl v celkové vzdálenosti (p {{ 18}}.25, t(40)=1.15) (obr. 2B). V testu vodního bludiště si myši Ngf cKO vedly hůře v tréninkové sekci (p=0,001, F(1,16)=15,65). O týden později jsme provedli test paměti. Myši byly umístěny do vodního bludiště, ale s odstraněnou platformou. Myši Ngf cKO strávily méně času v cílovém kvadrantu (p=0,01, t(16)=2,79) (obr. 2C). Pro nové rozpoznávání objektů neexistuje žádný rozdíl v DI (p=0.41, t(20)=0.82). Společně tato data naznačují, že NGF hraje roli při zprostředkování úzkosti a prostorového učení/paměti.

Hippokampální LTP byl široce považován za synaptický model paměti34 a přímé intraseptální infuze NGF usnadňují indukci LTP21. Abychom prozkoumali účinek NGF na synaptickou plasticitu, měřili jsme LTP prostřednictvím ex vivo elektrofyziologického záznamu v hipokampální dráze CA1 Schafferových kolaterál mozkových řezů u myší WT a Ngf cKO. Naše výsledky ukázaly, že HFS produkoval trvalé zvýšení sklonu fEPSPs v CA1 neuronech WT i Ngf cKO myší, ale žádný rozdíl v LTP (obr. 2D). Avšak po pěti cyklech tetanizačního stimulu HFS byl STP významně snížen ve skupině Ngf cKO (10–15 minut po HFS, p=0,006, t(10)=3,39) ( Obr. 2E). Abychom dále potvrdili vliv na presynaptický přenos, zkoumali jsme krátkodobou synaptickou plasticitu pomocí PPF. Poměry párových pulzů (PPR) byly u Ngf cKO a WT myší podobné. Pozorujeme však trend zvýšené PPR ze vzorků Ngf cKO pomocí 50 ms interstimulačního intervalu (p=0,094, t(18)=1,76) (obr. 2F), což naznačuje, že presynaptický přenos se mohl u myší Ngf cKO změnit.

Nadměrná exprese Ngf v hipokampu cKO myší zachraňuje prostorovou paměť, ale ne úzkost

Abychom určili, zda behaviorální fenotypy, které jsme pozorovali u myší Ngf cKO, lze zvrátit nadměrnou expresí Ngf v hipokampu, injikovali jsme virový vektor AAV-CB (kuřecí-aktin)-Ngf (nadměrná exprese) nebo virový vektor AAV-CB-eGFP ( kontrola) do hipokampu myší Ngf cKO. Čtrnáct dní po operaci jsme podrobili všechny myši behaviorálnímu testování. Výsledky neukazují žádný významný rozdíl v testu v otevřeném poli (čas v centrální zóně, p=0,59, t(37)=0,54) a EPM (čas v otevřené paži, p {{12} },76, t(37)=0,29) (obr. 3A, B). U vodního bludiště nebyl v tréninkové části nalezen žádný rozdíl (p=0.54, F(1,15)=0.39). Myši cKO s nadměrnou expresí Ngf však strávily více času v cílové zóně ve srovnání s kontrolní skupinou (p=0,008, t(15)=3,01) (obr. 3C, D). Po odběru mozkové tkáně jsme potvrdili nadměrnou expresi Ngf hybridizací in situ a PCR v reálném čase (obr. 3E, F). Také jsme detekovali významně vyšší hladinu cholinergních vláken v hipokampu myší s nadměrnou expresí Ngf (p=0.001, t(10)=4.19) (obr. 3G, H). Tyto výsledky naznačují, že myši Ngf cKO s hipokampální nadměrnou expresí Ngf mohou obnovit cholinergní inervaci a prostorovou paměť, ale ne úzkost.

Zhoršená prostorová paměť u myší s cholinergní denervací v hippocampu

Myši Ngf cKO vykazovaly výrazně sníženou inervaci hipokampálních cholinergních vláken, která byla obnovena hyperexpresí hippocampu Ngf. To korelovalo s obnovením výkonu prostorové paměti (bez zlepšení úzkosti). Zabývali jsme se proto tím, zda vyčerpání cholinergních vláken selektivně v hipokampu ovlivňuje úzkost nebo prostorovou paměť ve vodním bludišti.

Předchozí zpráva ukázala, že anti-p75NTRSaporin je specifický cholinergní imunotoxin u myší35. Za tímto účelem jsme injikovali anti-p75NTRSaporin (nebo PBS vehikulum jako kontrolu) do hipokampu myší C57. Čtrnáct dní po operaci jsme tyto dvě skupiny myší podrobili behaviorálnímu testování. Nezjistili jsme žádný významný rozdíl v testu v otevřeném poli (čas ve střední zóně, p=0,5, t(15) {{10}} 0,68) a EPM (čas v otevřené náruči , p=0,51, t(14)=0,66) (obr. 4A, B). U vodního bludiště nebyl v tréninkové části nalezen žádný rozdíl (p=0.49, F(1,14)=0.49); nicméně myši, kterým byl do hipokampu injikován anti-p75NTRSaporin, strávily méně času v cílové zóně ve srovnání s kontrolou PBS (p=0,035, t(14)=2,33) (obr. 4C, D). Po odebrání mozkové tkáně jsme barvením ChAT potvrdili, že v hipokampu došlo k cholinergní denervaci (p < 0,0001,="" t(10)="11,85)," což="" také="" ukazuje,="" že="" cholinergní="" vlákna="" v="" kůře="" byla="" ušetřena="" (p="" {="" {37}}.184,="" t(14)="1.39)" (obr.="" 4e).="" tyto="" výsledky="" ukazují,="" že="" hipokampální="" cholinergní="" systém="" je="" nezbytný="" pro="" udržení="" funkce="" prostorové="" paměti,="" aniž="" by="" to="" mělo="" vliv="" na="">

Účinek NGF na prostorovou paměť závisí na hipokampálním cholinergním systému

Dále jsme se zabývali tím, zda přínos prostorové paměti získaný nadměrnou expresí Ngf v hipokampu myší Ngf cKO závisí na intaktní hipokampální cholinergní inervaci. Do hipokampu myší Ngf cKO jsme vstříkli jak anti-p75NTRSaporin, tak AAV-Ngf virové vektory. U kontrolní skupiny jsme injikovali jak anti-p75NTRSaporin, tak AAV-eGFP virové vektory. Čtrnáct dní po operaci jsme hodnotili úzkost i prostorovou paměť. Výsledky neukázaly žádný rozdíl mezi AAV-Ngf a AAV-eGFP v testu na otevřeném poli (čas ve střední zóně, p=0,6, t(33)=0,51) a EPM (čas v otevřená ramena, p=0,92, t(33)=0,09) (obr. 5A, B). U prostorového učení a paměti také nebyly mezi skupinami žádné rozdíly, a to jak v tréninkové části (p=0,94, F(1,36)=0,004), tak v testu paměti (p {{ 26}},44, t(36)=0,77) (obr. 5C, D). Po odebrání mozkové tkáně jsme hodnotili hustotu hipokampálních cholinergních vláken pomocí barvení ChAT a obě skupiny vykazovaly závažné vyčerpání hipokampálních cholinergních vláken, ačkoli u myší AAV-Ngf byla nalezena mírně vyšší úroveň hustoty vláken ve srovnání s myšmi AAV-eGFP (p=0.01, t(12)=2.83) (obr. 5E, F). PCR v reálném čase potvrdila, že skupina AAV-Ngf dramaticky zvýšila expresi Ngf ve srovnání s kontrolní skupinou (p=0,0004, t(12)=4,89) (obr. 5G). Tato data naznačují, že prospěšný účinek NGF na prostorovou paměť vyžaduje intaktní hipokampální cholinergní inervaci.

Diskuse

V této studii jsme se rozhodli prozkoumat roli hipokampálního NGF a cholinergního systému na úzkost, učení a paměť. Ukázali jsme, že myši s mozkově specifickou delecí Ngf (Mgf ckO) vykazují zvýšenou úzkost a deficit v prostorovém učení. Myši Ngf cKO také vykazovaly nižší úrovně neurogeneze dospělých, menší objem hipokampu, zhoršenou STP a dramatickou depleci cholinergních inervací v hipokampu. Nadměrná exprese Ngf v hipokampu myší KO genu Ngf zachránila prostorovou paměť, ale nezvyšovala úzkost. Je zajímavé, že jsme také pozorovali částečnou obnovu cholinergní inervace v hippocampu po nadměrné expresi Ngf v této struktuře. Abychom zjistili, zda účinek NGF na prostorovou paměť závisí na těchto cholinergních inervacích, nejprve jsme vyčerpali hipokampální cholinergní vlákna u WT C57 myší injekcí cholinergního imunotoxinu do hipokampu a potvrdili, že hipokampální cholinergní vlákna podporují prostorovou paměť. Dále jsme na myších na pozadí Ngf cKO vyčerpali hipokampální cholinergní vlákna, ale současně zvýšili expresi Ngf pomocí AAV-Ngf, které byly porovnány s podobnými cholinergně vyčerpanými myšmi, ale s injekcí kontroly AAV-eGFP. Výsledek ukázal, že reexprese vysokých hladin Ngf v hipokampu nezlepšila prostorovou paměť. Ukazujeme tedy, že obnovující účinek NGF v Ngf cKO je závislý na intaktních hipokampálních cholinergních inervacích a ne na jiném mechanismu.

Ukázalo se, že exogenně poskytnutý NGF zvyšuje přežití nově narozených neuronů28 a prostorové učení36 u hlodavců, zatímco blokáda NGF protilátkami zhoršuje prostorovou paměť21. V souladu s podpůrnou rolí NGF v těchto parametrech jsme ukázali, že specifická delece Ngf pro centrální nervový systém vykazuje snížení buněčné proliferace a neurogeneze. V testech chování jsme také pozorovali zhoršení úzkosti a prostorového učení/paměti.

Předchozí studie Ngf KO poskytla důkazy prokazující, že NGF je pro učení a paměť nepostradatelný37. Autoři však neprovedli test sondy (paměťová sekce) a místo toho bylo provedeno reverzní učení. Kromě toho 60 procent hipokampálních cholinergních vláken v této studii stále zůstalo u myší Ngff/f–Nes::Cre. V našem modelu myší detekujeme pouze 20 procent cholinergních vláken zbývajících u myší Ngff/f–Sox1::Cre. Tento rozpor může vysvětlit rozdíl v chování, který jsme pozorovali, protože náš experiment poskytuje důkaz, že pro účinek NGF na prostorovou paměť jsou nutné hipokampální cholinergní inervace. Fenotyp úzkosti, který jsme pozorovali u myší Ngf cKO, nelze zvrátit nadměrnou expresí hipokampálního Ngf. Jednou z možností je, že fenotyp úzkosti, který jsme pozorovali u myší Ngf cKO, byl důsledkem inaktivace Ngf v rané fázi. Alternativně může NGF působit mimo hipokampus, aby moduloval úzkost. Pozorujeme však regeneraci cholinergních vláken a zlepšení retence prostorové paměti u hipokampálních myší s nadměrnou expresí Ngf a tento výsledek je v souladu s dřívější studií u starých potkanů38.

Zjistili jsme, že cholinergní léze hipokampu neovlivňuje úzkost, ale zhoršuje prostorovou paměť. Naše výsledky jsou v rozporu s předchozími zprávami, které ukázaly, že mikroinfuze inhibitoru acetylcholinesterázy nebo antagonistů muskarinových M1 a M2 receptorů do hipokampu moduluje úzkost39,40. Naše výsledky jsou však v souladu se zprávou, která nezjistila žádný účinek na úzkost po snížení hipokampální cholinergní inervace, které bylo dosaženo injekcí imunotoxinu v RS a VDB Broca41. Pokud jde o prostorové učení a paměť, několik studií naznačuje, že aktivita ChAT je spojena s prostorovým učením18,35,42,43, ale jiné práce neprokázaly žádný účinek na prostorové učení a paměť po imunotoxinové lézi44,45. V našem experimentu jsme zjistili, že vyčerpání hipokampální cholinergní inervace zhoršuje prostorovou paměť, aniž by to ovlivnilo akvizici. Tyto nesrovnalosti mezi studiemi mohou být způsobeny odlišnými protokoly chování, věkem, kmenem a metodami inhibice cholinergního systému v hipokampu.

Interakce mezi NGF a cholinergním systémem byla dlouho studována. Ztráta TrkA, stejně jako delece Ngf, redukuje cholinergní neurony v RS a cholinergní inervace v kortikálních oblastech a kyčelním pocampu37,46. Podobné výsledky byly pozorovány v našem modelu s deficitem Ngf, kde bylo denervováno přibližně 76 procent hipokampálních cholinergních vláken. Abychom věděli, zda tato cholinergní vlákna přispěla k účinku NGF v prostorovém učení, zvýšili jsme expresi Ngf a mezitím jsme vyčerpali cholinergní inervace u myší Ngf cKO prostřednictvím intrahipokampální injekce se smíšeným AAV-Ngf (nebo AAV-eGFP pro kontrolní skupinu) a anti-p75NTRSaporin. Výsledky ukazují, že jsme dramaticky zvýšili expresi Ngf a také úspěšně vyčerpali tyto cholinergní inervace. Přestože hustota cholinergních vláken ve skupině AAV-Ngf plus anti-p75NTRSaporin byla o něco vyšší než ve skupině AAV-eGFP plus anti-p75NTRSaporin, obě skupiny dosáhly 90 procent deplece cholinergních vláken v hippocampu ve srovnání s neléčenými WT myšmi. Mezi těmito skupinami nebyl pozorován žádný rozdíl v prostorové paměti, což naznačuje, že pouhé zvýšení exprese Ngf bez cholinergní inervace hippocampu nestačí k obnovení prostorové paměti.

Zde používáme mozkově specifické Ngf podmíněné KO myši k odhalení důležitosti NGF při regulaci objemu hipokampu, chování, synaptické plasticity, neurogeneze a cholinergní inervace. Dále jsme prokázali, že účinek hipokampálního NGF na prostorovou paměť závisí na intaktním cholinergním systému. Genová terapie Ngf byla testována u pacientů s Alzheimerovou chorobou, ale v poslední fázi 2 klinické studie nebyly zjištěny žádné účinky47. Nedávná data z předchozí fáze 1 klinické studie s identickým chirurgickým postupem, analyzující post-mortem tkáň, však zjistila, že injikovaný AAV-Ngf přímo nezapojoval cílové cholinergní neurony48. Naše data poskytují důkaz, že AAV-Ngf může být neúčinný bez cholinergní reinervace. Naše studie v kombinaci s tímto nedávným posmrtným pozorováním naznačuje, že je ještě příliš brzy na to, abychom dospěli k závěru, že terapie NGF je u Alzheimerovy choroby neúčinná.

Reference

1 Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Selektivní růst stimulující účinky myšího sarkomu na senzorický a sympatický nervový systém kuřecího embrya. J. Exp. Zool. 116, 321-361 (1951).

2. Levi-Montalcini, R. Účinky transplantace myšího nádoru na nervový systém. Ann. NY Acad. Sci. 55, 330-344 (1952).

3. Cohen, S., Levi-Montalcini, R. & Hamburger, V. Faktor stimulující nervový růst izolovaný ze sarkomů 37 a 180. Proč. Natl Acad. Sci. USA 40, 1014–1018 (1954).

4. Shelton, DL & Reichardt, LF Studie exprese genu beta nervového růstového faktoru (NGF) v centrálním nervovém systému: úroveň a regionální distribuce mRNA NGF naznačují, že NGF funguje jako trofický faktor pro několik různých populací neuronů . Proč. Natl Acad. Sci. USA 83, 2714–2718 (1986).

5. Lee, TH a kol. Lokalizace nervového růstového faktoru, imunoreaktivity trkA a P75 v hipokampální formaci a bazálním předním mozku dospělých potkanů. Neuroscience 83, 335-349 (1998).

6. Sobreviela, T. a kol. TrkA-imunoreaktivní profily v centrálním nervovém systému: kolokalizace s neurony obsahujícími receptor pro nervový růstový faktor p75, cholinacetyltransferázu a serotonin. J. Comp. Neurol. 350, 587-611 (1994).

7. Mesulam, MM, Mufson, EJ, Wainer, BH & Levey, AI Centrální cholinergní dráhy u potkanů: přehled založený na alternativní nomenklatuře (Ch1- Ch6). Neuroscience 10, 1185–1201 (1983).

8. Ehlers, MD, Kaplan, DR, Price, DL & Koliatsos, VE NGF-stimulovaný retrográdní transport trkA v nervovém systému savců. J. Cell. Biol. 130, 149-156 (1995).

9. Vantini, G. a kol. Nervový růstový faktor indukuje na dávce závislé a dlouhodobé zvýšení aktivity cholinacetyltransferázy v oblasti septa a hippocampu nezraněných potkanů. Acta Neurobiol. Exp. (Války.) 50, 323–331 (1990). 10. Hefti, F. Nervový růstový faktor podporuje přežití septálních cholinergních neuronů po fimbriálních transekcích. J. Neurosci. 6, 2155-2162 (1986).

11. Iulia, MF & Cuello, metabolická dysfunkce růstového faktoru AC u Alzheimerovy choroby a Downova syndromu. Trends Pharmacol. Sci. 35, 338–348 (2014).

12. Bartus, RT, Dean, RL3rd., Beer, B. & Lippa, AS Cholinergní hypotéza geriatrické dysfunkce paměti. Science 217, 408-414 (1982).

13. Aghourian, M. a kol. Kvantifikace mozkové cholinergní denervace u Alzheimerovy choroby pomocí PET zobrazování s [(18)F]-FEOBV. Mol. Psychiatrie 22, 1531–1538 (2017).

14. Hu, L., Wong, TP, Cote, SL, Bell, KF & Cuello, AC Vliv plaků Abeta na kortikální cholinergní a necholinergní presynaptické boutony u transgenních myší podobných Alzheimerově chorobě. Neuroscience 121, 421–432 (2003).

15. Case, MA, Wong, TP, De Koninck, Y., Ribeiro-da-Silva, A. & Cuello, AC Stárnutí způsobuje preferenční ztrátu cholinergní inervace charakterizovaných neokortikálních pyramidálních neuronů. Cereb. Cortex 12, 329-337 (2002).

16. Capponi, S. a kol. Alzheimerova neurodegenerace u starých transgenních myší s antinervovým růstovým faktorem. Proč. Natl Acad. Sci. USA 97, 6826–6831 (2000).

17. Pentz, R., Iulia, MF, Ducatenzeiler, A., Bennett, DA & Cuello, AC Metabolická dráha NGF v lidském mozku je narušena v preklinickém a klinickém kontinuu Alzheimerovy choroby. Mol. Psychiatrie, 0797-2 (2020).

18. Nilsson, OG a kol. Poruchy prostorového učení u potkanů ​​se selektivní imunolézí cholinergního systému předního mozku. Neuroreport 3, 1005–1008 (1992).

19. Gage, FH & Bjorklund, A. Cholinergní septální štěpy do hipokampální formace zlepšují prostorové učení a paměť u starých potkanů ​​mechanismem citlivým na atropin. J. Neurosci. 6, 2837-2847 (1986).

20. Chen, KS a kol. Narušení jediné alely genu pro nervový růstový faktor má za následek atrofii bazálních cholinergních neuronů předního mozku a deficit paměti. J. Neurosci. 17, 7288-7296 (1997).

21. Conner, JM a kol. NGF je nezbytný pro plasticitu hipokampu a učení. J. Neurosci. 29, 10883–10889 (2009).

22. Takashima, Y. a kol. Neuroepiteliální buňky dodávají počáteční přechodnou vlnu diferenciace MSC. Cell 129, 1377–1388 (2007).

23. Tsai, CY, Tsai, CY, Arnold, SJ & Huang, GJ Ablace hipokampální neurogeneze u myší zhoršuje reakci na stres během temného cyklu. Nat. Commun. 6, 8373 (2015).

24. Crowley, C. a kol. Myši postrádající nervový růstový faktor vykazují perinatální ztrátu senzorických a sympatických neuronů, přesto se u nich vyvinuly bazální cholinergní neurony předního mozku. Cell 76, 1001-1011 (1994).

25. Kwon, EJ, Skalak, M., Lo Bu, R. & Bhatia, SN Nanočástice cílené na neurony pro dodání siRNA do traumatických poranění mozku. ACS Nano. 10, 7926–7933 (2016).

26. da Silva, JT, Evangelista, BG, Veneto, RAG, Seminowicz, DA & Chacur, M. Léčba anti-NGF může snížit chronickou neuropatickou bolest změnou periferních mediátorů a mozkové aktivity u potkanů. Chovej se. Pharmacol. 30, 79–88 (2019).

27. Huang, GJ a kol. Ektopická migrace cerebelárních buněk způsobuje špatný vývoj Purkyňových buněk a abnormální motorické chování u myší bez Cxcr4. PLoS ONE 9, e86471 (2014).

28. Frielingsdorf, H., Simpson, DR, Thal, LJ & Pizzo, DP Nervový růstový faktor podporuje přežití nových neuronů v dospělém hipokampu. Neurobiol. Dis. 26, 47–55 (2007).

29. Cameron, HA & Gould, E. Neurogeneze dospělých je regulována adrenálními steroidy v gyrus dentatus. Neuroscience 61, 203–209 (1994).

30. Bloem, B. a kol. Topografické mapování mezi bazálními cholinergními neurony předního mozku a mediálním prefrontálním kortexem u myší. J. Neurosci. 34, 16234–16246 (2014).

31. Nyakas, C., Luiten, PG, Spencer, DG & Traber, J. Detailní projekční vzory septálních a diagonálních pásových aferentů do hipokampu u potkana s důrazem na inervaci CA1 a gyrus dentatus. Brain Res. Býk. 18, 533-545 (1987).

32. Palacios, G., Garcia-Ladona, J. & Codina, M. Ultrastrukturální studie cholinergních neuronů v nucleus mediálního septa a vertikální končetině diagonálního pruhu Broca v bazálním předním mozku krysy. J. Chem. Neuroanat. 4, 205-221 (1991).

33. Martinovich, K. a kol. Role p75(NTR), dlouhodobé deprese a cholinergního přenosu při zvládání úzkosti a akutního stresu. Biol. Psychiatrie 71, 75–83 (2012).

34. Bliss, TV & Collingridge, GL Synaptický model paměti: dlouhodobá potenciace v hipokampu. Nature 361, 31-39 (1993).

35. Berger-Sweeney, J. a kol. Selektivní imunoléze cholinergních neuronů u myší: účinky na neuroanatomii, neurochemii a chování. J. Neurosci. 21, 8164-8173 (2001).

36. Pelleymounter, MA, Cullen, MJ, Baker, MB, Gollub, M. & Wellman, C. Účinky intrahipokampálního BDNF a NGF na prostorové učení u starých potkanů ​​Long Evans. Mol. Chem. Neuropathol. 29, 211-226 (1996).

37. Muller, M. a kol. Ztráta signalizace NGF-TrkA z CNS není dostatečná k vyvolání kognitivních poruch u mladých dospělých myší nebo myší středního věku. J. Neurosci. 32, 14885–14898 (2012).

38. Fischer, W. a kol. Zlepšení atrofie cholinergních neuronů a poškození prostorové paměti u starých potkanů ​​nervovým růstovým faktorem. Nature 329, 65-68 (1987).

39. Degroot, A. & Treit, D. Dorzální a ventrální hipokampální cholinergní systémy modulují úzkost v testech plus-bludiště a šokové sondy. Brain Res. 949, 60-70 (2002).

40. File, SE, Gonzalez, LE & Andrews, N. Endogenní acetylcholin v dorzálním hipokampu snižuje úzkost působením na nikotinové a muskarinové1 receptory. Chovej se. Neurosci. 112, 352-359 (1998).

41. McHugh, SB a kol. Deplece acetylcholinu v hipokampu nemá žádný vliv na úzkost, preferenci prostorové novosti nebo rozdílnou odměnu za nízkou míru odezvy (DRL) u potkanů. Chovej se. Neurosci. 129, 491–501 (2015).

42. Dunbar, GL, Rylett, RJ, Schmidt, BM, Sinclair, RC & Williams, LR Hippokampální aktivita cholinacetyltransferázy koreluje s prostorovým učením u starých potkanů. Brain Res. 604, 266-272 (1993).

43. Gil-Bea, FJ a kol. Cholinergní hypofunkce zhoršuje získávání paměti pravděpodobně prostřednictvím hipokampálního oblouku a downregulace BDNF. Hippocampus 21, 999–1009 (2011).

44. Fletcher, BR, Baxter, MG, Guzowski, JF, Shapiro, ML & Rapp, PR Selektivní cholinergní deplece hippocampu šetří jak behaviorálně indukovanou transkripci Arc, tak prostorové učení a paměť. Hippocampus 17, 227–234 (2007).

45. Baxter, MG & Gallagher, M. Intaktní prostorové učení u mladých i starých potkanů ​​po selektivním odstranění hipokampálního cholinergního vstupu. Chovej se. Neurosci. 110, 460-467 (1996).

46. ​​Phillips, HS a kol. Záchrana myší s deficitem NGF II: bazální cholinergní projekce předního mozku vyžadují NGF pro cílovou inervaci, ale ne vedení. Brain Res. Mol. Brain Res. 124, 1-11 (2004).

47. Rafifii, MS a kol. Adeno-asociovaný virový vektor (sérotyp 2)-nervový růstový faktor pro pacienty s Alzheimerovou chorobou: randomizovaná klinická studie. JAMA Neurol. 75, 834–841 (2018).

48. Castle, MJ a kol. Postmortální analýza v klinické studii genové terapie AAV2-NGF pro Alzheimerovu chorobu identifikuje potřebu lepšího dodávání vektorů. Hučení. Gene Ther. 31, 415–422 (2020).