Část Ⅰ: Organoidy ledvin generované z erytroidních progenitorových buněk pacientů s autozomálně dominantním polycystickým onemocněním ledvin

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Roberta Faciolio, Fernando Henrique Lojudice a kol.

Úvod

Autosomálně dominantní polycystikanemoc ledvin(ADPKD) je celosvětově nejčastější genetická příčina chronického onemocnění ledvin (CKD) a je to jedna z nejčastějších dědičných monogenních poruch, která postihuje populaci odhadovanou na 1:400-1000 [1].ADPKD (Autosomal dominantní polycystickýnemoc ledvin) je způsobena mutacemi v genech PKD1 (polycystické onemocnění ledvin typu 1) a PKD2 (polycystické onemocnění ledvin typu 2), které kódují polycystin-1(PC1) a polycystin-2 (PC2), v tomto pořadí, což má za následek změny řasinek a tvorbu cyst. Oba proteiny modulují četné molekulární dráhy i morfogenezi a funkci tkání. Přesné molekulární mechanismy, které jsou základem cystogeneze, však zůstávají nejasné. Bylo dobře přijímáno, že pro cystogenezi je nezbytná zárodečná mutace následovaná somatickou mutací (druhý zásah) v normální alele [2,3]. Navíc na základě výsledků z ortologních myších modelů bylo prokázáno, že pro rychlý a závažný růst cyst ve zralých ledvinách je nutný další renální insult (třetí zásah) [4,5]. Zdá se, že u lidí k většině sekundových zásahů dochází během vývoje ledvin, což vede k cystické tvorbě a růstu dokonce i in utero. Závažnost a rychlost progrese onemocnění ledvin v důsledku mutací PKD1 (polycystické onemocnění ledvin typu 1) a PKD2 (polycystické onemocnění ledvin typu 2) může být ovlivněno několika faktory, včetně načasování inaktivace genů, vývoje ledvin stádium, vliv prostředí, přítomnost doprovodných renálních lézí a rozmanitost genetických mutací.

Přestože existuje nespočet údajů týkajících se patofyziologických mechanismů ADPKD (autosomálně dominantní polycystickénemoc ledvin) získané ze studií využívajících ortologní a neortologní myší modely, je k dispozici pouze několik studií zaměřených na lidské buněčné modely cystogeneze [6]. V roce 2007 Takahashi et al.[Z úspěšně přeprogramovali somatické buňky na pluripotentní kmenové buňky s embryonálními vlastnostmi a pojmenovali je „indukované pluripotentní kmenové buňky“ (iPSC). Od té doby bylo mnoho zdrojů somatických buněk přeprogramováno na iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) ze zvířecích nebo lidských tkání (hiPSC)[Z], přičemž hlavním zdrojem těchto buněk jsou dospělé fibroblasty. V roce 2013 Freedman a spol.[8] indukované hiPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) z fibroblastů ADPKD (autosomálně dominantní polycystickénemoc ledvin) pacientů a zjistili sníženou ciliární expresi polycystinu-2, což podporuje použití takových buněk ke zkoumání patofyziologie polycystických onemocnění (PKD). Nedávno Chen et al uvedli v roce 2016, že získali hiPS buňky z erytroidních progenitorových buněk [9].

Během několika posledních let došlo k významnému pokroku v generování 3-rozměrných organoidů z iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) [Z,10-12]. Hlavníledvinatubulární epiteliální organoidy mohou být odvozeny z ledvinové tkáně, stejně jako z moči, a tyto organoidy jsou důležitým nástrojem pro personalizované modelování onemocnění, jak ukazuje Schutgens et al. [13]. V následujících studiích Freedman et al.[14] dokázali vygenerovatledvinaorganoidy odvozené z komerčně dostupné buněčné linie hiPS, zavádějící protokol pro generování typů buněk přítomných v metanefrické hmotě, které dávají vzniknout všem strukturám nefronu. Poté sražením PKD1 (polycystický typ 1ledvinaonemocnění) nebo geny PKD2 (polycystické onemocnění ledvin typu 2), tito výzkumníci pozorovali tvorbu cystledvinatubuly. S ohledem na všechny tyto pokročilé a inovativní technologie jsme se zaměřili na získání iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) z cirkulujících erytroidních progenitorových buněk ADPKD (autosomálně dominantní polycystickénemoc ledvin)pacientů a testovat vývoj ledvinových organoidů in vitro, aby rekapitulovali kroky zapojené do organogeneze, ve snaze vyvolat některé patofyziologické události související s časnou cystogenezí.

Kliknutím zobrazíte vedlejší účinky a přínos pro ledviny

Metody Výběr pacienta

Vzorky krve byly odebrány dvěma nepříbuzným pacientkám (PT1 a PT2), u kterých byla klinicky diagnostikována ADPKD (autosomální dominantní polycystická choroba ledvin) (PT1:66 let, eGFR 43,8 ml/min na 1,73 m2 a PT2:56 let, eGFR 60,2 ml/ min na 1,73 m2), sledováno u Polycystické choroby ledvin. Ambulance nefrologické divize Federální univerzity v Sao Paulu (UNIFESP) a od jedné zdravé ženy byl odebrán další vzorek, který sloužil jako kontrola ke stabilizaci a normalizaci techniky. Diagnóza ADPKD (autosomální dominantní polycystická choroba ledvin) byla založena na pozitivní rodinné anamnéze a na přítomnosti renálních cyst podle ultrasonografických diagnostických kritérií Pei et al.[15] (rodokmeny rodiny jsou uvedeny na obr. S1A). Oba pacienti měli cystické ledviny a játra (snímky magnetické rezonance jsou uvedeny na obr. S1B). Studie byla přezkoumána a schválena Etickým poradním výborem univerzity (CEP UNIFESP, „Comite de Etica em Pesquisa da Universidade Federal de Sao Paulo“, Nr.1199.{20}}/2018). Po rozhovoru za účelem vysvětlení účelu studie pacienti i zdravá kontrola podepsali formulář informovaného souhlasu.

Expanze erytroidních progenitorových buněk izolovaných z plné krve Vzorky krve byly odebrány do zkumavky Vacutainer obsahující EDTA (jako antikoagulant) při teplotě místnosti. Erytroidní progenitorové (EP) buňky byly poté separovány pomocí metody RosetteSep (15216; Stem Cell Technologies), která odstranila nežádoucí buňky, jako jsou zralé erytrocyty a krevní destičky, přičemž byla zachována požadovaná EP populace. Vzhledem k nízké koncentraci EP v plné krvi byly buňky expandovány a kultivovány ve specifickém kultivačním médiu obsahujícím cytokiny a doplňky (X-Vivo medium, Lonza). EP buňky byly identifikovány průtokovou cytometrií pomocí transferinového receptoru (CD71) a glykoforin A (Gly A) jako markery značené GFP (obr. S2).

Přeprogramování erytroidních progenitorových buněk

Expandované EP buňky byly shromážděny a nukleofikovány pomocí Epi5 Episomal iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) Reprogram-ming kit (Thermo Fisher) obsahující optimalizovanou směs pěti přeprogramovacích faktorů (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc, a Klf4). Transfekce (elektroporace) byla provedena epizomálními vektory (bez virů, neintegrující se) ze soupravy Lonza Nucleo factor kit. Po transfekci byly buňky umístěny do kultivačního média specifického pro ReproTeSR pro přeprogramování (Stem Cell Technologies) za standardních podmínek buněčné kultivace (37 °C, 95 % CO a 5 % O2).

karyotypizace

Aby se ověřilo, zda proces přeprogramování zachoval chromozomální integritu, byla na genetickém oddělení UNIFESP provedena analýza karyotypu. Buňky byly ošetřeny 1 00 ul kolchicinu (0,08 ug/ml) v 5 ml iPs buněčné kultivační médium pro vyvolání zástavy buněčného cyklu, po kterém následovalo přidání 0,075 M hypotonického roztoku KCl pro vyvolání jaderného bobtnání; buňky byly poté fixovány směsí methanolu a kyseliny octové (3:1). Metafázové chromozomy byly sklizeny a pro cytogenní analýzu G-pásů bylo použito Wrightovo barvení (obr. S3).

iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) charakterizace kolonie

EP buňky byly přeprogramovány epizomálními vektory, které vytvořily typické kolonie iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) a představovaly normální karyotyp (obr. S3). Charakteristiky kolonie iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) byly porovnány s charakteristikami zavedené kontroly odvozené z buňky linie H9 (hESC, Human Embryonic Stem Cells, WA09, dostupné od Wicell Research Institute, USA)( Obr. 1B). Protože iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) vykazovaly typickou morfologii, byly markery pluripotence identifikovány imunofluorescencí. Buňky byly fixovány 4% paraformaldehydem po dobu 30 minut při teplotě místnosti. Po fixaci byly vzorky třikrát promyty PBS, blokovány v 5% PSA a 0,3% Triton-X-100/DPBS a inkubovány přes noc s primárními protilátkami (Cell Signaling, Ma, EUA), jmenovitě OCT4(1 :400 ředění) jako test pluripotence. Následující den bylo připraveno nové sklíčko, promyto v PBS a inkubováno se sekundární protilátkou Alexa Fluor (ředění 1:200, Cell Signaling) a bylo přidáno DAPI (1:1000, Invitrogen, MA, USA) pro jaderné identifikace.

Obr. 1. Generování a charakterizace iPSC(indukované pluripotentní kmenové buňky). iPSC byly přeprogramovány z expandovaných erytroidních progenitorových (EP) buněk od zdravé kontroly (HC) a dvou různých pacientů s ADPKD (PT1 a PT2).

A. Schematické postupné generování ledvinových organoidů B. Podobnost iPSC (a. typický obrázek iPSC z komerčních embryonálních buněk H9. b. iPSC z progenitorových erytroidních buněk ze zdravé kontroly)

C. Morfologie iPSC kolonií D. Charakterizace iPSC pluripotence pozorované pod invertovaným digitálním fluorescenčním mikroskopem EVOS fl.

Značení protilátky OCT4 bylo použito jako marker pluripotence k charakterizaci povahy pluripotence HC, PT1 a PT2 kolonií.

Buněčná jádra byla označena pomocí DAPI (měřítko pro obr. 1B: 200 μm; stupnice pro obr. 1C: 1000 μm; stupnice HC / PT2 pro obr. 1D: 1000 μm; stupnice PT1 pro obr. 1D: 200 μm).

Schopnost iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) diferencovat se na všechny tři zárodečné vrstvy

iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) byly pěstovány v 6-jamkových destičkách potažených Matrigelem (1:10, BD Biosciences, NY, EUA) v kultivačním médiu mTeSR1 (Stem Cell Technologies, BC, Kanada). Aby se zabránilo iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) v diferenciaci, byly kolonie pasážovány ručně mechanickou fragmentací špičkou pipety pod mikroskopem nebo byly disociovány enzymatickým štěpením pomocí Gentle Cell (Life Technologies) (obr. S4). Pomocí těchto metod byly iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) udržovány po 22 sériových pasáží, aby bylo zajištěno, že buňky správně začlenily přeprogramovací faktory. iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) byly poté stimulovány k diferenciaci do tří zárodečných vrstev pomocí STEMdiff Trilineage Differentiation kit (Stem Cell Technologies). Po pěti dnech byly buňky sklizeny pro analýzu liniově-věkově specifických markerů mezodermu a endodermu a po sedmi dnech byly analyzovány na ektoderm podle STEMdiff Trilineage Differentiation protokolu (S5 obr.).

Molekulární charakterizace všech tří zárodečných linií pomocí qRT-PCR

Celková RNA z kultur tří zárodečných vrstev byla extrahována pomocí soupravy GE RNA Spin Mini kit (GE Healthcare, USA) a poté převedena na cDNA pomocí soupravy High Capacity Reverse Transscription Kit (Applied Biosystems, USA) podle pokynů výrobce. Kvantitativní PCR v reálném čase (gRT-PCR) byla prováděna pomocí soupravy SYBR Green PCR kit (Applied Biosystems, USA) podle protokolu výrobce. Hladiny exprese mRNA byly vypočteny pomocí metody 2^Ct. Hydroxymethylbilansyntáza (HMBS) a glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) byly použity jako vnitřní kontroly a exprese OCT4 byla použita jako kvantitativní kontrola. Exprese SOX17 byla použita k identifikaci diferenciace do endodermu, CXCR4 byla použita k identifikaci diferenciace do mezodermu a PAX6 byla použita k identifikaci diferenciace do ektodermu (obr. S6). Všechny sekvence primerů jsou specifikovány v tabulce S1 a křivka účinnosti byla vyhodnocena pro každý pár primerů.

Imunofluorescence pro různé zárodečné vrstvy

iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) byly indukovány k diferenciaci na krycích sklíčkách v šestijamkových destičkách. Po diferenciaci byla krycí sklíčka odstraněna z původních jamek a přenesena na novou destičku, kde byly buňky fixovány 4% paraformaldehydem a poté promyty PBS, jak je popsáno výše. Byly použity primární protilátky proti OCT4(1:400; Cell Signaling),CXCR4(1;100;Cell Signaling),PAX6(1:100;Thermo Fisher) a SOX17 (1:100;R&D Systems). Fluorescence byla hodnocena pomocí sekundární protilátka Alexa Fluor (1:200; buněčná signalizace).

Diferenciace ledvinových organoidů od iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky)

Renalorganoidy byly vytvořeny podle protokolu popsaného Cruzem et al. [6] s některými úpravami. Stručně řečeno, 50 000 iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) od HC a dvou pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) bylo použito k výrobě suspenzí jednotlivých buněk s roztokem pro oddělení Accutase (Stem Cell Technologies). Jednotlivé buňky byly doplněny 10uM inhibitorem Rho-kinázy (Y27632, Stem Cell Technologies nebo Stemgent). Po 16 hodinách bylo kultivační médium nahrazeno 1 ml mTeSR1 plus 2,5 procenta Matrigel plus 10 μuM Y27632. Po 20 hodinách bylo médium nahrazeno pouze 1 ml mTeSRI; o 14 hodin později bylo kultivační médium nahrazeno a buňky byly indukovány 6 uM CHIR99021 (AT104; Kmenové buňky nebo Stemgent GSK-3b inhibitor/agonista Wnt dráhy) plus Advanced RPMI (Thermo Fisher) plus Glutamax (Life Technologies) plus 10 ug/ml antibiotikum (Ampicillin; 1:1000; Gibco ). Nakonec, o 36 hodin později, bylo kultivační médium nahrazeno médiem DRB obsahujícím Advanced RPMI (Thermo Fischer) plus Glutamax (Thermo Fischer) plus B27 Supplement (17504-044; Life Technologies) plus antibiotikum. Médium DRB bylo měněno každé tři dny po dobu 28 dnů. Tato doba (28 dní) stačila k tomu, aby byly organoidy viditelné mikroskopicky.

Molekulární charakterizace organoidů pomocí RT-PCR

Semikvantitativní genová exprese byla hodnocena pomocí RT-PCR během embryogenního procesu, přičemž celková RNA byla purifikována z buněčných struktur vytvořených ve dnech 0 (iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky)) a ve 14, 21, 28 a 35 dní po indukci diferenciace. Byla hodnocena exprese WT1 (vyvíjející se ledvina), AQP1 (proximální trubice) a ECAD (marker cystického epitelu). Jako vnitřní kontrola byl použit GAPDH. Exprese OCT4 byla použita jako kvantitativní standard.

Výsledek

Získávání iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) z erytroidních progenitorů (EP)

Je shrnut protokol použitý k získání organoidů ledvin z erytroidních progenitorů. Expanze EP vedla k buňkám 1x10 stupňů po přibližně 20 dnech (obr. S2A) a přibližně o dva měsíce později byly EP identifikovány pomocí jejich exprese markerů CD71 a Gly A. Účinnost separační metody odhalila expresi; 88 procent buněk byly CD71 pozitivní a 57,4 procenta byly Gly A pozitivní (S2BFig).

Po ověření, že buňky byly EP, byly transfekovány přeprogramovacími faktory (Oct-4, Sox2, Lin28, L-Myc a klf4) a poté byly udržovány ve specifickém médiu pro přeprogramování (ReproTeSR, Stem Cell Technologies) po dobu přibližně pěti dnů. iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) vyvinuly typické buněčné charakteristiky vytvořením kolonií s morfologií odlišnou od morfologie nepřeprogramovaných buněk přítomných ve stejné buněčné kultuře. Buňky byly monitorovány, dokud jsme nepozorovali typické kolonie podobné iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky), které byly podobné koloniím komerční buněčné linie H9 (Eig 1B). Kolonie iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) byly také rozpoznány podle jejich relativně větší velikosti, těsné balení buněk, dobře definovaný homogenní tvar a pravidelné okraje. Identifikace byla usnadněna nízkým stupněm přerůstání kolonií z diferencovaných buněk v přeprogramovacím médiu bez vyživovače (Eig 1C). Nebyly nalezeny žádné detekovatelné rozdíly mezi koloniemi iPSC od pacientů s HC a ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) (PTl a PT2), pokud jde o morfologii kolonií a markery pluripotence, jak je znázorněno na obr. 1D.

iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) byly dále charakterizovány svou schopností diferencovat se do tří zárodečných vrstev. Typické obrazy progrese vývoje zárodečné vrstvy v buňkách z HC jsou uvedeny na S5 Obr. Vývoj tří zárodečných vrstev byl ověřen typickou morfologií (Eig 2A) a imunofluorescenčním značením pro diferenciační markery, konkrétně FOXA2 pro endoderm , aktin hladkého svalstva (SMA) pro mezoderm a SOX2 pro ektoderm (Eig2B-2D). Negativní kontroly pro protilátky jsou ukázány na obr. S7. Obr. 2E ukazuje hladiny genové exprese specifických markerů endodermu (SOX17), mezodermu (CXCR4) a ektodermu (PAX6), jak bylo detekováno pomocí RT-PCR.

Obr. 2. Charakterizace tří zárodečných vrstev. Zdravá kontrola (HC) a pacienti s ADPKD1 (PT1 a PT2).

A. Typická morfologie tří zárodečných listů. Zárodečné vrstvy byly charakterizovány imunofluorescenčním barvením pomocí specifických protilátek. B. Endoderm (FOXA2),

C. Mesoderm (SMA) a D. Ectoderm (SOX2). Buněčná jádra byla obarvena DAPI. Poslední sloupce zobrazují sloučené obrázky.

E. Genová exprese OCT4 indikuje pluripotenci iPSC, SOX17 byl marker pro endoderm, CXCR4 byl marker pro mezoderm a PAX6 byl marker pro ektoderm (n=2).

Exprese OCT4 pomocí iPSC byla použita jako interní kvantitativní kontrola. Exprese OCT4 byla nedetekovatelná v buňkách tří zárodečných vrstev (měřítko: 200 μm).

Generování ledvinových organoidů z iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky)

Trojrozměrné renální struktury byly vytvořeny z iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) odvozené od pacientů s HC a obou pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin) po krocích, které rekapitulují embryonální vývoj. Obr. 3 ukazuje kroky, které jsou nezbytné pro získání příslušných embryonálních struktur. Kolonie iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) (Eig 3A) byly disociovány pomocí Accutase (obr. 3B), aby se získaly jednotlivé iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) (obr. 3C). Vzhledem k normálnímu embryogennímu procesu by se očekávalo, že se kolonie diferencují na blastulu a poté na gastrulu, ale spontánní diferenciace iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) v kultuře je stále výzvou, protože buňky spontánně podléhají apoptóze [16]. Aby se předešlo tomuto nežádoucímu výsledku, byl 16 hodin po jednobuněčném stádiu přidán ROCK inhibitor signalizace （10μM inhibitor Rho-kinázy Y27632）. Inhibice dráhy ROCK brání buňkám ve spouštění cest smrti, což jim umožňuje přežít a přizpůsobit se, aby pokračovaly v procesu diferenciace. iPSC (indukované pluripotentní kmenové buňky) pak rostly, dokud nedosáhly stádia epiblastu, které je charakterizováno přítomností sféroidních dutin (obr. 3D). Dále byl přidán silný inhibitor GSK-3b/agonista dráhy Wnt (CHIR99021), po kterém následovalo přidání média DRB k vyvolání epiteliálně-mezenchymálního přechodu (obr. 3E a 3E) a nakonec mezenchym-epiteliálního přechodu( obr. 3G); tyto kroky umožnily epitelizaci a sekvenční tvorbu pre-tubulárních agregátů a ledvinových vezikul (Eig 3H), což nakonec umožnilo tvorbu renálních tubulárních organoidů (obr. 3D). Všechny tyto kroky embryogeneze in vitro byly podobné pro buňky odvozené od pacientů s HC i ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin).

Přítomnost tubulárních struktur byla ověřena expresí specifických markerů imunofluorescencí: NHE3 a AQP1 pro proximální tubuly (Eig4A) a NPHS2 pro glomeruly (Eig 4B). Naproti tomu značení AQP2 nebylo detekováno (Eig 4B), což potvrzuje, že toto metodika umožnila pouze rozvoj metanefrické hmoty, ale nikoli ureterického pupenu. Marker ECAD nebyl detekován v nepřítomnosti forskolinu (obr. 4B).

Pro ověření přítomnosti specifických markerů exprimovaných během procesu vývoje progenitorových ledvin byly všechny vzorky (HC, PT1 a PT2) odebrány v pěti bodech celého procesu diferenciace: den 0 (iPSC (indukovaný pluripotentní kmen buňky)), 14., 21., 28. den a poté 35. den (7 dní po indukci cysty). Časový průběh genové exprese odhalil diferenciaci během procesu embryogeneze, jak je znázorněno na obr. 5A-5C. Pluripotenční marker OCT4 byl exprimován pomocí iPSC (den O), ale jeho hladiny byly během 14 dnů sníženy a po diferenciaci dosáhly velmi nízkých hladin. Naproti tomu exprese specifických markerů metanefrického mezenchymu (WT1) a proximálního tubulu (AQP1) se progresivně zvyšovala, když byl proces diferenciace zahájen 14. den, a dosáhl plató do 21. dne. Obr. 5D ukazuje expresi ECAD, cystogenezi marker, v den 35, tj. 7 dní po indukci cysty forskolinem. V nepřítomnosti forskolinu byla exprese ECAD velmi nízká, a to i u pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin). Nicméně, když byl přidán forskolin (den 28), oba pacienti vykazovali zvýšenou expresi ECAD; ale stejný vzorec nebyl pozorován u HC organoidu, který zůstal s nízkými hladinami exprese ECAD i v přítomnosti forskolin.

Přítomnost cyst vytvořených z organoidů stimulovaných forskolinem byla evidentní u pacientů s ADPKD (autosomální dominantní polycystické onemocnění ledvin), jak je ukázáno v Eig6. Horní panel ukazuje obrázky organoidů v den 28, před přidáním forskolinu (Eig6Aa). Eig6Ab (panoramatický pohled-4X) a 6Ac (20X prohlížení) ukazují organoidy v den 35 v přítomnosti forskolin ukazující přítomnost cyst podobných struktur ve vzorcích od obou pacientů (PT1 a PT2), ale ne ve vzorku HC. Přítomnost cyst byla také ověřena imunofluorescenčním barvením (obr. 6B). ECAD značení nebylo detekováno v HC organoidu, ale bylo jasně pozorováno v organoidech u obou pacientů. Je zajímavé, že lze také pozorovat přítomnost lumenu cysty.

Obr. 3. Generování tubulárních organoidů.

Fázově kontrastní snímky generování epiteliálních tubulárních ledvinových organoidů po 28 dnech z iPSC generovaných ze skupin HC, PT1 a PT2. Během prvních 36 hodin byly iPSC udržovány ve 3D kultuře.

Poté byly disociovány, transformovány do jednotlivých buněk a ošetřeny Y-27632, což umožnilo buněčnou reorganizaci a přežití, produkující epiblastové sféroidy (d).

Poté byly přidány CHIR99201 a DRB, které aktivovaly Wnt/-catenin dráhu a umožnily diferenciaci na tubulární organoidy (I).

Morfologie mezi sféroidy odvozenými od pacientů s ADPKD a od dárce HC je podobná. (Měřítko pro a a f: 1000μm; stupnice pro b, cd, e, g, hai: 200 μm).

PRO ROZDĚLENÍ KLIKNĚTE ZDEⅡ