Konstrukce rekombinantní vakcíny Lactobacillus Casei proti PEDV a její imunitní reakce u myší

Abstraktní

Pozadí: Prasečí epidemický průjem (PED) je nakažlivé střevní onemocnění způsobené virem epidemického průjmu prasat (PEDV) charakterizované zvracením, průjmem, anorexií a dehydratací, které způsobilo obrovské ekonomické ztráty po celém světě. V současnosti je vakcinační imunita stále nejúčinnější metodou kontroly šíření PED. V této studii jsme zkonstruovali nový rekombinantní kmen L. casei-OMP16-PEDVS exprimující protein PEDVS z PEDV a protein OMP16 z kmene Brucella abortus. Aby se zjistila imunogenicita rekombinantní L. casei-OMP16-PEDVS kandidátní vakcíny, byla porovnána s BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{ 9}} PEDVS a BL21-PEDVS rekombinantní protein.

Výsledek: Výsledky ukázaly, že jsme mohli detekovat vyšší hladiny IgG, neutralizačních protilátek, IL-4, IL-10 a INF- v séru a IgA ve stolici L. casei-OMP16- PEDVS imunizované myši, což ukázalo, že L. casei-OMP16-kandidátní vakcína PEDVS by mohla indukovat vyšší hladiny humorální imunity, buněčné imunity a slizniční imunity.

Závěr: L. casei-OMP16-PEDVS je proto slibnou kandidátskou vakcínou pro profylaxi infekce PEDV.

Klíčová slova: PEDV, vakcína Lactobacillus casei, PEDV S protein, OMP16, imunitní odpovědi

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Úvod

Prasečí epidemický průjem (PED) je způsoben virem epidemického průjmu prasat (PEDV) se symptomy zahrnujícími průjem, zvracení, anorexii, dehydrataci a ztrátu hmotnosti u selat [1, 2]. Prasata všech věkových kategorií mohou být infikována různými příznaky a úmrtnost selat je až 100% [3], což vedlo k obrovským ekonomickým ztrátám po celém světě. Pro kontrolu šíření PEDV je konstruována většina druhů vakcín, jako je inaktivovaná vakcína s adjuvans hydroxidem hlinitým, bivalentní inaktivní zvolený přenosný virus gastroenteritidy (TGEV) a vakcína PEDV a atenuovaná vakcína PEDV [4]. Ačkoli tyto vakcíny hrají důležitou roli při kontrole PED, všechny mají své vady. Inaktivované vakcíny nemohou aktivovat buněčné imunitní reakce, oslabená vakcína není příliš bezpečná a nemohou vyvolat dostatečnou produkci virově specifických IgA protilátek slizniční imunitní odpovědi. Proto je nutné a naléhavé vyvinout novou vakcínu pro kontrolu PED.

Lactobacillus casei je často považován za jistý druh bezpečného vektorového systému pro cílené podávání antigenů při orální imunizaci s příznivými účinky na zdraví lidí a zvířat [5]. Mezitím může být použit jako transportní systém k regulaci odpovědi pomocných T-buněk a stimulaci sekrece specifických IgA pro slizniční imunitu [6]. Na druhou stranu, rekombinantní vakcína Lactobacillus casei se snadněji aplikuje, je menší pravděpodobnost hypersenzitivní reakce a je cenově efektivnější ve srovnání s tradičními vakcínami. Na základě zpráv byly rekombinantní vakcíny Lactobacillus casei úspěšně použity v prevenci a kontrole lidského papilomaviru, Streptococcus pneumonia a Escherichia coli [7–9]. Existují také některé podobné pokusy o navržení PED vakcín. Výzkumníci zjistili, že rekombinantní kmen Lactococcus lactis exprimující variantní gen S1 viru prasečího epidemického průjmu může u imunizovaných myší indukovat vysoké hladiny IL-4 a IFN- [10]. Vakcína proti PEDV na bázi Lactobacillus casei exprimující mikrosložkový peptid Co1 cílený na buňky fúzovaný s COE antigenem PEDV by také mohla vyvolat účinnou imunitní odpověď [11]. Pro zlepšení účinnosti vakcíny PEDV. V této studii jsme konstruovali novou rekombinantní vakcínu Lactobacillus casei PED, která může stimulovat silnější slizniční, humorální a buněčné imunitní reakce proti infekci PEDV prostřednictvím perorálního podání. PEDV, člen čeledi coronaviridae, se skládá ze čtyř strukturních proteinů, které obsahují 150–220 kDa glykosylovaný spike (S) protein, 20–30 kDa membránový (M) protein, 7 kDa obalový (E) protein, 58 kDa nukleokapsidový (N) protein [12]. Tam lze protein S rozdělit na domény S1 (1–735 aminokyselin) a S2 (736-poslední aminokyselina) [13] a protein S1 zahrnuje oblast vázající receptor a hlavní neutralizační epitopy [ 14]. Vakcinační adjuvans působí jako imunomodulátor a může vyvolat a zesílit imunitní reakce proti společně dodaným antigenům. Bylo ověřeno, že protein OMP16 kmene Brucella abortus aktivuje dendritické buňky in vivo, indukuje imunitní odpověď th1 a jedná se o slibnou autoadjuvantní vakcínu [15–17]. Proto byl protein OMP16 v naší studii vložen do případu rekombinantní vakcíny Lacto bacillus. Dosud bylo hlášeno jen málo studií o rekombinantní vakcíně proti PEDV Lactobacillus casei. Tato studie si proto klade za cíl vytvořit novou kandidátskou orální vakcínu Lactobacillus casei, která může poskytnout lepší humorální imunitu, buněčnou imunitu a slizniční imunitu, aby se zabránilo šíření PED.

Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová

Materiály a metody

Bakteriální kmeny, viry, kultivační podmínky, plazmidy a primery

Cistanche prášek

Bakteriální kmeny, plazmidy a primery použité v této studii jsou uvedeny v tabulce 1. Standardní referenční kmen Lactobacillus casei ATCC 393 byl kultivován v bujónu de Man Rogosa and Sharpe (MRS) při 37 stupních [18]. BL21 (DE3) a DH5 byly kultivovány v médiu Luria-Bertani (LB) při 37 stupních [19]. Rekombinantní kmeny Lactobacil lus casei, BL21 (DE3) a DH5 byly kultivovány v odpovídajícím médiu s příslušnými antibiotiky. Brucella abortus byla pěstována v médiu Tryptic Soy Broth (TSB) nebo Tryptic Soy Agar (TSA) (Difco Laboratories, Detroit, MI, USA) při 37 stupních. Buňky Vero infikované kmeny PEDV byly kultivovány v DMEM (Gibco, Langley, VA, USA) doplněném 10 ug/ml trypsinu (Gibco, Langley, VA, USA) [20]. Plazmidy pVE5523 a pET28a (+) byly expresní vektory Lactobacillus casei a Escherichia coli, v daném pořadí.

Tabulka 1 Charakteristiky bakteriálních kmenů, plazmidů a primerů použitých v této studii

Konstrukce rekombinantních kmenů Lactobacillus casei a BL21

Rekombinantní expresní plazmidy byly zkonstruovány na základě plazmidů a primerů v tabulce 1. Nejprve byla vytvořena částečná sekvence genu PEDV S (493–708 aminokyselin), částečná sekvence genu PEDV S' (493–708 aminokyselin), a částečná sekvence genu Brucella abortus OMP16 (26–168 aminokyselin) byly amplifikovány pomocí párů primerů PEDVS-F1/R1, PEDVS-F2/R2 a OMP16-F/R, v daném pořadí. Následně byla ve fragmentech OMP16 a PEDVS použita metoda překryvné extenze ke konstrukci nového fragmentu OMP16-PEDVS s linkerovým polypeptidem (GGGGSGGGGGGGGGS) zaseknutým uprostřed. Poté byly fragmenty PEDVS vloženy do plazmidu pET28a s restrikčními enzymy EcoRI/Xbal, aby se vytvořil rekombinantní plazmid pET28a-PEDVS, a nové fragmenty OMP16-PEDVS byly vloženy do plazmidů pET28a a pVE5523 s EcoRI/Xbal a SalI/EcoRV restrikčními enzymy pro vytvoření rekombinantního plazmidu pET28a-OMP16-PEDVS a pVE5523-OMP16-PEDVS, v daném pořadí. Rekombinantní plazmidy (pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS a pVE5523-OMP16-PEDVS) byly transformovány do BL21 (DE3) nebo Lactobacillus casei ATCC393 transformací nebo elektroporací na základě zveřejněný článek [21].

Analýza proteinové exprese Western blotem

Proteinová exprese kmenů BL21-pET28a-PEDVS, BL21- pET28a-OMP16-PEDVS a L. casei-pVE5523-OMP16- PEDVS byla zjištěno na základě popsané metody s určitou modifikací [21–23]. Rekombinantní kmeny BL21-pET28a-PEDVS a BL21-pET28a OMP16-PEDVS byly kultivovány v LB bujónu a ke sklizni pET28a-PEDVS a pET28a-OMP bylo použito IPTG{{22} } PEDVS proteiny. Slepý vektor byl použit jako negativní kontrola. Po lýze buněk a centrifugaci byly shromážděny supernatant a sediment. Poté byly cílové proteiny purifikovány pomocí kolony pro afinitní chromatografii s niklem na základě předchozí studie [24]. Mezitím byl kultivační supernatant rekombinantního kmene L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS také sklizen centrifugací při 9000×g po dobu 10 minut při 4 stupních. Poté byly vzorky s nanášecím pufrem dodecylsulfát sodný (SDS) vařeny 10 minut. Proteiny byly odděleny elektroforézou na 12% dodecylsulfátu sodného-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE) a poté přeneseny do PVDF membrán (Millipore, Mississauga, ON, Kanada). Membrány byly blokovány 5% odstředěným mlékem po dobu 2 hodin při 37 stupních a poté inkubovány s myší monoklonální protilátkou proteinu S přes noc při 4 stupních a HRP konjugovaným kozím anti-myším IgG (ABclonal, Wuhan, Čína) po dobu 2 hodin při teplotě 37 stupňů. Proteinové pásy byly vizualizovány pomocí Clarity™ Western ECL blotting substrátu (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).

Imunizace a odběr vzorků

Imunogenicita rekombinantní vakcíny Lactobacillus casei byla hodnocena pomocí šestitýdenních samic myší BALB/c bez specifického patogenu (SPF) [10, 18], které byly zakoupeny ze zvířecího centra Shandong Agricultural University. Celkem 50 myší bylo náhodně rozděleno do 5 skupin po 10 myších v každé skupině. Myši byly imunní rekombinantní vakcínou Lactobacillus casei a purifikovaným proteinem (pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS+Freundovo kompletní adjuvans). Imunizační protokol byl proveden na základě tabulky 2 a posilovací imunizace byla podána po 13 dnech. Pro sérologickou studii bylo sérum odebráno 0, 14 a 28 dní po imunizaci (dpi) proražením ocasní žíly a skladováno při -20 stupních až do použití. Výkaly byly odebrány 1 den před vakcinací a každou posilovací dobou. Pro detekci IgA byly výkaly zředěny (w/v) 0,05 M sodnou solí EDTA v poměrech 1:4 těsně po odběru a inkubovány po dobu 14 hodin při 4 stupních po správném promíchání. Supernatant byl shromážděn 12,000xg centrifugací a uchován při -20 stupních až do použití. Při 28. dpi; tři myši z každé skupiny byly usmrceny a střevo bylo zpracováno pro detekci IgA podle výše popsaného autora [10, 18, 23].

Stanovení analýzy hladin protilátek

Hladiny IgG v séru a IgA ve stolici byly měřeny metodami ELISA s určitými modifikacemi [18, 23]. Metody byly následující: Polystyrenové mikrotitrační destičky byly potaženy přes noc při 4 stupních 100 μl 10 ug/ml PEDVS proteinu, OMP16-PEDVS proteinu nebo 100 μl rekombinantního L. casei-OMP16-PEDVS kmene . Po blokování 5% odstředěným mlékem byly odebrané vzorky sériově zředěny v PBS, přidány v triplikátech a inkubovány při 37 stupních po dobu 1 hodiny. Poté byla do každé jamky přidána HRP-konjugovaná kozí anti-myší IgG nebo IgA protilátka (Invi trogen, USA) (1:5000) a inkubována po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Polystyrenové mikrotitrační destičky byly promyty 5x během každého kroku. Nakonec bylo do každé jamky přidáno 100 μl TMB substrátu (tetramethylbenzidin a H2O2) a po 10 minutách bylo přidáno 50 μl stop roztoku. Hodnoty OD při 630 nm byly měřeny pomocí multimódové čtečky destiček (EnVision).

Testy neutralizace virů

Titry neutralizačních protilátek PEDV v séru byly vyšetřeny podle metod s určitými modifikacemi [25, 26]. Stručně řečeno, myší sérum bylo tepelně inaktivováno (56 stupňů po dobu 30 minut) a poté sériově dvojnásobně naředěno v 96jamkových destičkách (Corning, USA) s triplikáty každého vzorku. Poté byl stejný objem 200 TCID50/50 ul kmenů PEDV přidán do 96jamkových destiček a inkubován po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Směs byla přidána do nových 96jamkových destiček potažených monovrstvami buněk Vero a inkubována po dobu 1 hodiny při 37 stupních. Buňky byly poté promyty a inkubovány v udržovacím médiu při 37 stupních v 5% C02. Po 2 dnech byl pozorován cytopatický efekt (CPE) pomocí inverzního mikroskopu a koncentrace neutrální velikosti byla definována jako nejnižší koncentrace protilátek v séru.

Tabulka 2 Imunitní protokol myší BALB/c

Detekce cytokinů

Pro detekci sekrece cytokinů byly supernatanty získány od laboratorních myší (0, 14 a 28 dní). Hladiny secernovaného IL-4, IL-10 a IFN- byly stanoveny pomocí komerčních souprav ELISA (Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Wuhan) podle doporučení výrobce. Cytokin byl kvantifikován z různých standardních křivek připravených ze standardních činidel poskytnutých soupravami a hodnota optické hustoty (OD) byla detekována při 450 nm z každé destičky pomocí multimódové čtečky destiček (EnVision) [23, 27].

Statistická analýza

Všechna data byla získána z alespoň tří nezávislých experimentů a výsledky byly prezentovány jako průměr ± standardní odchylka (SD). Statistická analýza byla provedena pomocí dvoustranných t-testů a jednosměrné analýzy v Graph Pad Prism 7.0 (GraphPad Software Inc., USA). Významný rozdíl byl definován jako ∗ p < 0.05 a různé stupně významného rozdílu byly označeny jako ∗∗ p < 0,01, ∗∗∗ a p < 0,001, resp.

Výsledek

Ověření rekombinantních kmenů Lactobacillus casei a BL21

Pro ověření zkonstruovaných rekombinantních plasmidů byly rekombinantní expresní plasmidy pET28a-PEDVS, pET28a-OMP16-PEDVS a pVE5523-OMP16-PEDVS štěpeny pomocí restrikčních enzymů NcoI/XhoI a výsledky enzymového štěpení jsou uvedeny na obr. 1. Velikosti cílových pásů v elektroforetogramech byly stejné jako očekávané výsledky a výsledky sekvenování ukázaly, že rekombinantní expresní plazmidy nevykazovaly žádnou mutaci. Tyto výsledky ukázaly úspěšnou konstrukci rekombinantních plazmidů pET28a-PEDVS, pET28a OMP16-PEDVS a pVE5523-OMP16-PEDVS. Výsledky western blotu ukázaly, že rekombinantní proteiny pET28a-OMP16-PEDVS a pET28a-PEDVS byly exprimovány v supernatantu BL21-pET28a OMP16-PEDVS a BL21- kmeny pET28a-PEDVS. Protein pVE5523-OMP16-PEDVS byl také ověřen v kultivačním supernatantu kmene L. casei-pVE5523- OMP16-PEDVS. Specifické pásy z obr. 2 ukázaly, že rekombinantní proteiny pET28a-OMP16- PEDVS, pVE5523-OMP16-PEDVS a pET28a-PEDVS byly všechny úspěšně sklizeny (obr. 2).

Obr. 1 Výsledky enzymového štěpení rekombinantních plazmidů. Odpověď: Výsledky enzymového štěpení plazmidu pVE5523-OMP16-PEDVS. M: D8000 DNA Ladder Marker; 1: plasmid pVE5523-OMP16-PEDVS. B: Výsledky enzymového štěpení plazmidu pet28a-OMP16-PEDVS a pET28a-PEDVS. M: D8000 DNA Ladder Marker; 1: pet28a-OMP16-PEDVS plazmid; 2: Plasmid pET28a-PEDVS

Hladiny IgG protilátek v séru myší imunizovaných kandidátními vakcínami

Pro hodnocení specifické imunogenicity generovaných kandidátů na vakcínu byly vybrány myši BALB/c a rozděleny do 5 skupin. Poté byly měřeny hladiny IgG v séru a IgA ve stolici pomocí komerčních souprav ELISA. Výsledky ukázaly, že mezi očkovanými skupinami nebyly žádné podstatné rozdíly v hladinách IgG a u všech myší nebyla před imunizací nalezena téměř žádná IgG protilátka. Podstatné rozdíly však byly následně zjištěny po první vakcinaci a hladiny IgG protilátek v séru po 28 dnech byly vyšší než po 14 dnech. Mezi 5 skupinami myší vykazovaly myši imunizované L. casei-OMP16- PEDVS a BL21-OMP16-PEDVS-F podobnou a nejvyšší imunogenicitu. Proto L. casei-OMP{10}} PEDVS a BL21-OMP16-PEDVS-F mohly vyvolat nejvyšší imunogenicitu, následované BL21-OMP16- PEDVS a BL21-PEDVS (obr. 3).

cistanche doplněk výhody-zvyšuje imunitu

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Hladiny IgA protilátek ve výkalech myší imunizovaných kandidátními vakcínami

Pro hodnocení specifické imunogenicity generovaných kandidátů na vakcínu byly také hodnoceny hladiny IgA protilátek ve výkalech myší. Výsledky ukázaly, že před imunizací neexistovala žádná speciální anti-PEDVS IgA protilátka. Velká množství protilátky IgA ve výkalech myší imunizovaných L. casei-OMP16-PEDVS BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{{7} }PEDVS a BL21-PEDVS skupiny myší 14 dní po imunizaci. 28 dní po imunizaci dosáhly hladiny IgA protilátek u myší imunizovaných L. casei-OMP16-PEDVS svého nejvyššího maxima. Mezitím hladiny IgA protilátek v ostatních třech skupinách nepředstavovaly zjevné zvýšení. Kandidátní vakcína L. casei OMP16-PEDVS by tedy mohla stimulovat vyšší hladiny protilátek u imunizovaných myší ve srovnání s BL21- OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP{ Myši imunizované {18}}PEDVS a BL21- PEDVS (obr. 4).

Obr. 2 Ověření rekombinantních expresních proteinů. M: proteinový marker; 1: sekreční proteinová forma rekombinantního kmene L. casei pVE5523-OMP16-PEDVS; 2: purifikovaný protein z kmene BL21-pET28a-OMP16-PEDVS; 3: purifikovaný protein z kmene BL21-pET28a-PEDVS

Hladiny neutralizačních protilátek v séru u imunizovaných myší

Vyhodnotit ochranný účinek kandidátních vakcín L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS a BL21-PEDVS u myší byly měřeny hladiny neutralizačních protilátek. Výsledky ukázaly, že před imunizací nebyla detekována žádná neutralizační protilátka. Neutralizační protilátka byla detekována 14 dní po imunizaci a zvýšila se 14 dní po posilovací imunizaci. Protilátková odpověď u myší, které dostaly L. casei-OMP16-PEDVS, měla silnější neutralizační aktivitu proti PEDV než u myší, kterým byl perorálně podáván BL21-OMP16-PEDVS-F, BL 21-OMP16-PEDVS a BL21-PEDVS. Kandidátní vakcína L. casei OMP16-PEDVS by proto mohla stimulovat nejvyšší hladinu neutralizačních protilátek, následovaná BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP{{ 24}}PEDVS a BL21-PEDVS (obr. 5).

Hladiny cytokinů

Chcete-li porovnat úroveň buněčné imunitní odpovědi L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21- OMP16-PEDVS, a BL21-PEDVS imunizovaných myší, IL- 4, IL-10 a IFN-, v daném pořadí. Výsledky ukázaly, že hladiny cytokinů IL-4, IL-10 a IFN- v séru myší byly všechny velmi nízké a neměly před imunizací žádný významný rozdíl. Zatímco podobné změny byly pozorovány ve výsledcích IL-4, IL-10 a IFN-. 14 dní po imunizaci byly hladiny IL-4, IL-10 a IFN- u myší imunizovaných L. casei-OMP16-PEDVS im vyšší než BL21- Myši imunizované OMP16-PEDVS F, BL21-OMP16-PEDVS a BL21-PEDVS. 14 dní po posilovací imunizaci byla zjištěna vyšší hladina IL-4, IL-10 a IFN- u myší imunizovaných L. casei-OMP16- PEDVS ve srovnání s hladinami u jiných myší tři skupiny. Kandidátní vakcína L. casei-OMP16-PEDVS by proto mohla stimulovat nejvyšší hladiny IL-4, IL-10 a IFN-, následované BL21-OMP{{ 40}} PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS a BL21-PEDVS (obr. 6).

Obr. 3 Hladiny IgG protilátek kandidátních vakcín v séru imunizovaných myší. Sérum bylo odebráno ve dnech 0, 14 a 28 dnů před nebo po imunizaci vyšetřeno pomocí komerčních souprav ELISA a měřeno při absorbanci 450 nm. Sloupce představují průměr ± standardní odchylku tří nezávislých experimentů. * p < 0.05, ** p < 0,01 a **** p < 0,0001 představují rostoucí stupně významných rozdílů a ns znamená žádný významný rozdíl

Diskuse

K rozsáhlému propuknutí PED způsobenému variantami PEDV došlo v říjnu 2010, což mělo za následek obrovské ekonomické ztráty v Číně a na celém světě [1]. Tradiční vakcíny jsou však všechny navrženy na základě klasického kmene CV777, který nemůže poskytnout dostatečnou ochranu variantě PEDV [4]. Pro kontrolu šíření PEDV a snížení ekonomických ztrát jsou také navrženy nové vakcíny variantních kmenů PEDV. V současné době jsou inaktivovaná vakcína PEDV a atenuovaná vakcína variantních kmenů PEDV všechny schváleny čínskou vládou a všechny vykazují slibné vyhlídky při kontrole PED. Ale defekty existují také ve dvou druzích nových vakcín. PEDV infikuje prasata přes trávicí trakt a má tropismus střevní tkáně. Proto je slizniční imunita účinnější než systémová imunita v prevenci vstupu PEDV do střevních epiteliálních buněk a vakcíny musí účinně poskytovat slizniční ochranu ve střevním traktu. V této studii tedy konstruujeme nový druh vakcíny, která může stimulovat silnější protilátky IgG a IgA specifické proti PEDV. Lactobacillus casei má potenciální imunomodulační vlastnosti jako vehikulum pro dodávání vakcíny a exprese bioaktivních sloučenin na buněčné stěně této bakterie může stimulovat vhodné imunitní reakce [28, 29]. Je široce používán pro expresi několika heterologních antigenů lidského papilomaviru, Streptococcus pneumonia a Escherichia coli jako vakcíny na zvířecích modelech, které všechny vykazovaly vynikající imunogenicitu [7– 9]. Ve srovnání s inaktivovanou vakcínou a atenuovanou vakcínou může vektorová vakcína Lactobacillus casei také stimulovat vyšší hladiny IgA a buněčnou imunitní odpověď. Studie ukázaly, že první obranná linie IgA ve střevě by byla lepší než IgG při ochraně selat před infekcí PEDV [10, 30]. Proto je slibné vyvinout druh Lactobacillus casei vektorové vakcíny PED. Na základě zpráv lze protein S PEDV rozdělit na domény S1 (1–735 aminokyselin) a S2 (736-poslední aminokyselina) [13] a protein S1 zahrnuje oblast vázající receptor a hlavní neutralizační epitopy [14]. Epitop neutralizující jádro (COE) může indukovat silné neutralizační protilátky proti PEDV [31, 32]. V kombinaci s analýzou antigenicity byla pro konstrukci rekombinantního plazmidu vybrána částečná sekvence genu S1 (1477–2124 bp). Bylo prokázáno, že vybraný malý fragment má nejen dobrou imunitní geničnost, ale také přispívá k sekretované expresi Lactobacillus casei. Na druhé straně Pasquevich zjistil, že vnější membránový protein 16 Brucella abortus může aktivovat dendritické buňky in vivo, indukuje imunitní odpověď th1 a je to slibná autoadjuvovaná vakcína proti systémové a orální získané brucelóze [15]. Podobný výzkum, který nelipidovaný protein vnější membrány omp16 z Brucella spp. bylo také prokázáno, že nosní adjuvans může indukovat imunitní odpověď th1 a modulovat alergickou odpověď th2 na proteiny kravského mléka [16]. Proto byla pro konstrukci rekombinantního plazmidu pro posílení imunitní funkce v naší studii vybrána částečná sekvence genu omp16. Aby se vědělo, zda nová vakcína doporučená Lactobacillus casei může vyvolat humorální imunitní reakce, byly měřeny hladiny IgG, IgA a neutralizačních protilátek. Hladina IgG protilátek u myší imunizovaných rekombinantní vakcínou L. casei-OMP16- PEDVS neměla žádný významný rozdíl od myší imunizovaných rekombinantní vakcínou BL21-OMP16-PEDVS-F PEDVS-F. Hladiny IgA a neutralizačních protilátek však byly vyšší než u BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDV S a BL{{47 }}PEDVS rekombinantní vakcíny-imizované myši. Výsledky ukázaly, že L. casei-OMP{50}}PEDVS může vyvolat silnější humorální imunitní reakce, zejména hladiny IgA protilátek. Studie ukázaly, že IgA je první obrannou linií ve střevě a při ochraně selat před infekcí PEDV by byl lepší než IgG [30]. Výzkum také ověřil výsledek, že L. casei-OMP16-PEDVS rekombinantní vakcína by mohla poskytnout lepší imunologickou ochranu PEDV. Abychom prozkoumali typ imunitní odpovědi indukované rekombinantním L. casei-OMP16-PEDVS, byly detekovány hladiny IL-4, IL-10 a IFN- za účelem vyhodnocení aktivity T lymfocyty. Na základě zprávy hraje IFN- důležitou roli v buněčné imunitní odpovědi způsobené invazí patogenů do těla, IL-4 hraje důležitou roli v humorální imunitní odpovědi a podporuje imunitní toleranci a slizniční imunitu [33], IL -10 hraje zásadní roli v boji proti slizniční mikrobiální infekci a udržuje integritu slizniční bariéry ve střevě [34]. Mezitím výsledky detekce cytokinů ukázaly, že myši imunizované L. casei-OMP16-PEDVS rekombinantní vakcínou mohly vyvolat silnější expresi IL-4, IL-10 a IFN- , které podpořily výsledky, že L. casei-OMP16-PEDVS rekombinantní vakcína by mohla vyvolat silnější humorální imunitní odpověď, hladinu IgA protilátek a buněčnou imunitní odpověď, v daném pořadí.

Obr. 5 Hladiny neutralizačních protilátek kandidátních vakcín v séru imunizovaných myší. Sérum bylo odebráno ve dnech 0, 14 a 28 dnů před nebo po imunizaci a vyšetřeno pomocí neutralizačního testu. Sloupce představují průměr ± standardní odchylku tří nezávislých experimentů. * p < 0.05, ** p < 0,01 a **** p < 0,0001 představují rostoucí stupně signifikantních rozdílů a ns znamená žádné významné rozdíl

Obr. 6 Detekce hladin cytokinů ze séra imunizovaných myší. Sérum bylo odebráno ve dnech 0, 14 a 28 dnů před nebo po imunizaci a vyšetřeno pomocí komerčních souprav ELISA. Hodnota absorbance byla měřena při absorbanci 450 nm pro IL-4 (a), IL-10 (b), respektive IFN- (c). Sloupce představují průměr ± standardní odchylku tří nezávislých experimentů. * p < {{1{12}}}},05, ** p < 0,01 a **** p < 0,0001 představují rostoucí stupně významných rozdílů, v tomto pořadí

Závěr

Stručně řečeno, L. casei-OMP16-PEDVS, BL21-OMP16- PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS a BL{{7 }}V této studii byly zkonstruovány kandidátní vakcíny PEDVS. Mezitím byly hodnoceny hladiny humorální imunitní reakce a buněčné imunitní reakce těchto kandidátních vakcín u myší. Výsledky ukázaly, že myši imunizované L. casei-OMP16-PEDVS mohly produkovat vyšší hladiny IgG, IgA, neutralizačních protilátek, IL-4, IL- 10 a INF- ve srovnání s myši imunizované BL21-OMP16-PEDVS-F, BL21-OMP16-PEDVS a BL21-PEDVS. Rekombinantní L. casei OMP16-PEDVS kandidátní vakcína proto může vytvořit základ pro vývoj bezpečné, účinné a pohodlné rekombinantní slizniční vakcíny pro profylaxi PEDV infekce.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Reference

1. Wang D, Fang L, S X. Prasečí epidemický průjem v Číně. Virus Res. 2016; 226:7–13.

2. Sueyoshi M, Tsuda T, Yamazaki K, Yoshida K, Nakazawa M, Sato K, et al. Imunohistochemické vyšetření epidemického průjmu prasat. J Comp Pathol. 1995;113(1):59–67.

3. Sun RQ, Cai RJ, Chen YQ, Liang PS, Song CXJEID. Propuknutí prasečího epidemického průjmu u sajících selat, Čína. Emerg Infect Dis. 2012; 18(1):161–3.

4. Tong YE, Feng L, Li W. Vývoj bikombinované atenuované vakcíny proti viru přenosné gastroenteritidy a viru epidemického průjmu prasat. Chin J Prev Vet Med. 1999;21(6):35–9.

5. Pouwels PH, Leer RJ, Boersma WJ. Potenciál Lactobacillus jako nosiče pro orální imunizaci: vývoj a předběžná charakterizace vektorových systémů pro cílené dodávání antigenů. J Biotechnol. 1996;44(1–3):183.

6. Tsai YT, Cheng PC, Pan TM. Biotechnologie: Imunomodulační účinky bakterií mléčného kvašení pro zlepšení imunitních funkcí a výhod. Appl Microbiol Biotechnol. 2012;96(4):853–62.

7. Adachi K, Kawana K, Yokoyama T, Fujii T, Tomio A, Miura S, et al. Perorální imunizace vakcínou Lactobacillus casei exprimující lidský papilomavirus (HPV) typu 16 E7 je účinnou strategií k indukci slizničních cytotoxických lymfocytů proti HPV16 E7. Vakcína. 2010;28(16):2810–7.

8. Campos IB, Darrieux M, Ferreira DM, Miyaji EN, Silva DA, Arêas APM a kol. Nazální imunizace myší Lactobacillus casei exprimující pneumokokový povrchový protein A: indukce protilátek, ukládání komplementu a částečná ochrana proti čelenži Streptococcus pneumoniae. Infikují mikroby. 2008;10(5):481–8.

9. Wen LJ, Hou XL, Wang GH, Yu LY, Wei XM, Liu JK a kol. Imunizace rekombinantními kmeny Lactobacillus casei produkujícími K99 a fimbriální protein K88 chrání myši proti enterotoxigenní Escherichia coli. Vakcína. 2012;30(22): 3339–49.

10. Guo M, Yi S, Guo Y, Zhang S, Niu J, Wang K a kol. Konstrukce rekombinantního kmene lactococcus lactis exprimujícího variantní gen S1 viru prasečího epidemického průjmu a analýza jeho imunogenicity u myší. Viral Immunol. 2019;32(3):144–50.

11. Wang X, Wang L, Zheng D. Orální imunizace vakcínou proti viru epidemického průjmu prasat (PEDV) na bázi Lactobacillus casei exprimující mikrosložený peptid Co1 cílený na buňky fúzovaný s COE antigenem PEDV. J Appl Microbiol. 2017;124(2):368–78.

12. Duarte M, Tobler K, Bridgen A, Rasschaert D, Ackermann M, H L. Sekvenční analýza genomu viru prasečího epidemického průjmu mezi nukleokapsidovými a spike proteinovými geny odhaluje polymorfní ORF. Virologie. 1994;198(2):466.

13. Lee DK, Park CK, Kim SH, Lee C. Heterogenita v genech spike proteinu virů prasečího epidemického průjmu izolovaných v Koreji. Virus Res. 2010;149(2): 175–82.

14. Sun DB, Feng L, Shi HY, Chen JF, Liu SW, Chen HY, et al. Oblast spike proteinu (aa 636789) viru prasečího epidemického průjmu je nezbytná pro indukci neutralizačních protilátek. Acta Virol. 2007;51(3):149–56.

15. Pasquevich KA, Garcia Samartino C, Coria LM, Estein SM, Zwerdling A, Ibanez AE, et al. Proteinová část proteinu vnější membrány Brucella abortus 16 je nový molekulární vzorec spojený s bakteriálním patogenem, který aktivuje dendritické buňky in vivo, indukuje imunitní odpověď Th1 a je slibnou samoadjuvantní vakcínou proti systémové a orální získané brucelóze. J Immunol. 2010;184(9):5200.

16. Ibanez AE, Smaldini P, Coria LM, Delpino MV, Pacífico LGG, Oliveira SC a kol. Nelikvidovaný protein vnější membrány Omp16 (U-Omp16) z Brucella spp. jako nosní adjuvans indukuje Th1 imunitní odpověď a moduluje Th2 alergickou odpověď na proteiny kravského mléka. PLoS One. 2013;8(7):e69438.

17. Pasquevich KA, Estein SM, Samartino CG, Zwerdling A, Coria LM, Barrionuevo P a kol. Imunita: Imunizace rekombinantním proteinem vnější membrány druhu Brucella Omp16 nebo Omp19 v adjuvans indukuje specifické CD4+ a CD8+ T buňky a také systémovou a orální ochranu proti infekci Brucella abortus. Infect Immun. 2009;77(1):436–45.

18. Ma S, Wang L, Huang X, Wang X, Chen S, Shi W a kol. Perorální rekombinantní vakcína Lactobacillus zaměřená na střevní mikroskládané buňky a dendritické buňky pro dodání základního neutralizačního epitopu viru prasečího epidemického průjmu. Microb Cell Factory. 2018;17(1):20.

19. Chu S, Zhang D, Wang D, Zhi Y, Zhou P. Heterologní exprese a biochemická charakterizace asimilační nitrátové a nitritreduktázy odhaluje adaptaci a potenciál Bacillus megaterium NCT-2 v sekundární salinizační půdě. Int J Biol Macromol. 2017;101:1019.

20. Guo N, Zhang B, Hu H, Ye S, Chen F, Li Z a kol. Caerin1.1 potlačuje růst viru prasečího epidemického průjmu in vitro prostřednictvím přímé vazby na virus. Viry. 2018;10:9.

21. Chen Z, Lin J, Ma C, Zhao S, She Q, Liang Y. Biotechnologie: charakterizace pMC11, plazmidu s duálními počátky replikace izolovaného z Lactobacillus casei MCJ a konstrukce kyvadlových vektorů s každým replikonem. Appl Microbiol Biotechnol. 2014;98(13):5977.

22. Xiaona W, Li W, Xuewei H, Sunting M, Meiling Y, Wen S a kol. Orální podávání probiotik exprimujících peptid cílený na dendritické buňky fúzovaný s antigenem COE viru prasečí epidemie průjmu: Slibná vakcinační strategie proti PEDV. Viry. 2017;9(11):312.

23. Bhuyan AA, Memon AM, Bhuiyan AA, Zhonghua L, Zhang B, Ye S, et al. Konstrukce rekombinantního Lactobacillus casei exprimujícího BVDV E2 protein a jeho imunitní odpověď u myší. J Biotechnol. 2018;270:51–60.

24. Noi NV, Chung YCJB, zařízení B. Optimalizace exprese a purifikace rekombinantní domény S1 proteinu spike viru epidemie diarey prasat (PEDV-S1) v Escherichia coli. Biotechnol Biotechnol Equip. 2017;31(2):1–11.

25. Li C, Li W, Esesarte E, Guo H, Elzen P, Aarts E, a kol. Domény pro připojení buněk spike proteinu viru prasečí epidemie průjmu jsou klíčovými cíli neutralizačních protilátek. J Virol. 2017;91(12):1–16.

26. Wen Z, Xu Z, Zhou Q, Li W, Wu Y, Du Y a kol. Perorální podávání potažených mikrokuliček naplněných PEDV vyvolalo PEDV-specifickou imunitu u odstavených selat. Vakcína. 2019;09(014):161–6.

27. Gao Q, Zhao S, Qin T, Yin Y, Yang Q. Účinky viru epidemického průjmu prasat na dendritické buňky odvozené z prasečích monocytů a střevní dendritické buňky. Vet Microbiol. 2016;106:149–58.

28. Bonet MEB, Chaves AS, Mesón O. Imunomodulační a protizánětlivá aktivita navozená perorálním podáním probiotického kmene lactobacillus casei. Zánět. 2006;4(1):31–41.

29. Grangette C, Müller-Alouf H, Geoffroy MC, Goudercourt D, Turner M, Mercenier A. Ochrana proti tetanovému toxinu po intragastrickém podání dvou rekombinantních bakterií mléčného kvašení: vliv životaschopnosti kmene a perzistence in vivo. Vakcína. 2002;20(27–28):3304–9.

30. Song DS, Oh JS, Kang BK, Yang JS, Moon HJ, Yoo HS, et al. Orální účinnost viru prasečího epidemického průjmu kmene DR13 atenuovaného buňkami Vero. Res Vet Sci. 2007;82(1):134–40.

31. Makadiya N, Brownlie R, Jan V, Berube N, Allan B, Gerdts V a kol. S1 doména spike proteinu viru epidemie průjmu prasat jako vakcinační antigen. Virol J. 2016;13:1.

32. Chang SH, Bae JL, Kang TJ, Ju K, Chung GH, Lim CW a kol. Buňky: Identifikace epitopové oblasti schopné indukovat neutralizační protilátky proti viru prasečího epidemického průjmu. Mol Cell. 2002;14(2): 295–9.

33. Sumi T, Fukushima A, Fukuda K, Kumagai N, Nishida T, Yagita H a kol. Diferenciální příspěvky B7–1 a B7–2 k rozvoji myší experimentální alergické konjunktivitidy. Immunol Lett. 2007;108(1):62–7.

34. Xue M, Zhao J, Ying L, Fu F, Li L, Ma Y a kol. IL-22 potlačuje infekci prasečími enterickými koronaviry a rotaviry aktivací signální dráhy STAT3. Antivir Res. 2017;142:68–75.