Klinické charakteristiky, diagnostika, výsledky a analýza plicního mikrobiomu u invazivní plicní aspergilózy u komunitních pacientů s pneumonií

ABSTRAKTNÍ

Pozadí

Invazivní plicní aspergilóza (IPA) zůstává u pacientů s komunitní pneumonií (CAP) podceňována. Tato studie si klade za cíl popsat klinické rysy a výsledky IPA u pacientů s CAP, posoudit diagnostický výkon metagenomického sekvenování nové generace (mNGS) pro IPA a analyzovat plicní mikrobiom prostřednictvím dat mNGS.

V poslední době vzbudila po celém světě širokou pozornost nová epidemie koronavirové pneumonie. Mnoho lidí si začalo dávat pozor na to, zda je jejich imunita dostatečně silná, protože imunita je první linií obrany těla proti nemocem. V tomto článku zkoumáme vztah mezi pneumonií a imunitou.

Pneumonie je závažná respirační infekce a zánětlivé onemocnění způsobené mnoha příčinami. Viry, jako je běžné nachlazení, chřipka a nový koronavirus, všechny mohou způsobit zápal plic. Těžiště tohoto onemocnění spočívá v tom, že způsobuje nevratné poškození dýchacího systému a může vést k selhání dýchání.

Pokud je však vaše imunita přiměřená, vaše tělo je lépe vybaveno k boji proti virům a bakteriím. Mohou za to především bílé krvinky – jedna z nejdůležitějších imunitních buněk v těle. Bílé krvinky dokážou rozpoznat napadající patogeny a napadnout je přímo a mohou také vylučovat protilátky na obranu proti invazi patogenů.

Kromě bílých krvinek patří mezi další důležité složky imunitního systému lymfocyty a fagocytóza. Lymfocyty aktivují imunitní systém rozpoznáním cizích patogenů, zatímco fagocytóza je stav, kdy určité typy bílých krvinek pohltí a rozloží patogeny, jako jsou napadající bakterie.

Udržování zdravého imunitního systému je tedy účinným způsobem prevence respiračních infekcí, jako je zápal plic. Imunitu můžete zlepšit konzumací potravin bohatých na vitamíny, bílkoviny a antioxidanty, jako jsou hlubinné ryby, ořechy, fazole, jahody, borůvky a další. Kromě toho je také velmi důležité udržovat si dobré zdraví, včetně nekouření, více cvičení, udržování dobrého spánku a snižování stresu.

Stručně řečeno, abychom se vyhnuli respiračním infekcím, jako je zápal plic, je nezbytné udržovat dobrou imunitu. Imunitu organismu musíme zlepšit zdravou stravou, správným cvičením a spánkovými návyky. Rozumně naplánujte svůj životní styl, aby vaše tělo mělo lepší obranný mechanismus a drželo se dál od nemocí, jako je zápal plic. Z tohoto pohledu musíme zlepšit imunitu. Cistanche může výrazně zlepšit imunitu, protože popel z masa obsahuje celou řadu biologicky aktivních složek, jako jsou polysacharidy, dvě houby, Huang Li atd. Tyto složky mohou stimulovat imunitní systém Různé typy buněk v systému, zvyšují jejich imunitní aktivitu.

Klikněte na zdravotní přínosy cistanche

Metody

Tato retrospektivní kohortová studie zahrnovala pacienty s CAP od 22. dubna 2019 do 30. září 2021. Byla analyzována klinická a mikrobiologická data. Diagnostická výkonnost mNGS byla porovnána s tradičními detekčními metodami. Plicní mikrobiom detekovaný pomocí mNGS byl charakterizován a byla hodnocena jeho souvislost s klinickými znaky.

Hlavní výsledky

IPA byla diagnostikována u 26 (23,4 procenta) ze 111 pacientů s CAP. Pacienti s IPA vykazovali sníženou imunitu, vyšší nemocniční úmrtnost (30,8 procenta vs 11,8 procenta) a úmrtnost na jednotkách intenzivní péče (42,1 procenta vs 17,5 procenta) ve srovnání s pacienty bez IPA. Antigenní test galaktomannanu (GM) měl nejvyšší citlivost (57,7 procenta) při detekci Aspergillus spp, následovaný mNGS (42,3 procenta), kultivací (30,8 procenta) a nátěrem (7,7 procenta). Hrnky, kultura a nátěr měly 100% specificitu, zatímco GM test měl 92,9% specificitu. Mikrobiální struktura IPA se významně lišila od pacientů bez IPA (str<0.001; Wilcoxon test). Nineteen different species were significantly correlated with clinical outcomes and laboratory biomarkers, particularly for Streptococcus salivarius, Prevotella timonensis, and Human betaherpesvirus 5.

Závěry

Naše výsledky ukazují, že pacienti s infekcí Aspergillus mívají vyšší časnou mortalitu. NGS může být navrženo jako doplněk k rutinním mikrobiologickým testům při diagnostice pacientů s rizikem infekce Aspergillus. Plicní mikroflóra je spojena se zánětlivými, imunitními a metabolickými stavy IPA, a tak ovlivňuje klinické výsledky.

ÚVOD

Invazivní plicní aspergilóza (IPA) je důležitou příčinou morbidity a mortality, typicky postihující imunokompromitované hostitele, jako jsou pacienti s infekcí HIV, stejně jako pacienti léčení kortikosteroidy, příjemci transplantátu nebo hematologická rakovina.1 Četné případy chybné diagnózy nebo opomenutí diagnózy a jsou podceňovány pouze postmortálně diagnostikované z důvodu nedostatku lékařských zdrojů a nových rizikových faktorů.2 Klinická diagnóza IPA zahrnuje hostitelské faktory, klinické rysy a mykologické důkazy.3 Problémy vyplývající z nedostupnosti vzorků tkáně, nízké citlivosti kultivace, špatné použitelnosti tradiční hostitelské faktory a absence typických klinických a radiologických nálezů vedou k opožděné a zmeškané diagnóze u pacientů s IPA.4 Nedávno publikované pokyny pro klinickou praxi American Thoracic Society pro diagnostiku plísňových infekcí zdůrazňují diagnostické testy nezávislé na kultuře s důraznými doporučeními. detekce DNA Aspergillus v tekutině z bronchoalveolární laváže (BALF) pomocí PCR.5.

V posledním desetiletí vývoj molekulárních metod pro kvantifikaci a sekvenování patogenní DNA značně usnadnil detekci různých mikroorganismů. Metagenomické sekvenování nové generace (NGS) se nyní široce používá k diagnostice infekčních onemocnění v klinických podmínkách, zejména se specifickými nebo neidentifikovanými nebo smíšenými patogeny v necíleném přístupu.6 Například kombinace mNGS s konvenčními detekčními metodami by mohla zvýšit míru detekce komplexu mycobacterium tuberculosis7 a usnadnit detekci smíšených patogenů u pacientů s imunokompromitovanou těžkou komunitní pneumonií (CAP).8 Dosud není jasná diagnostická výkonnost NGS pro detekci infekce plicní aspergilózou.

Nedávno byly popsány variace ve složení a diverzitě plicních mikrobiomů napříč četnými respiračními onemocněními, což poskytlo nové pohledy pro přesnou diagnózu. Pacienti s bakteriologicky potvrzenou tuberkulózou vykazovali značný nárůst bakteriálních druhů ve srovnání s pacienty s negativní tuberkulózou.9 Nerovnováha plicní komunity způsobená obohacením potenciálním patogenem koreluje s výsledky u intubovaných/mechanicky ventilovaných pacientů.10 Hérivaux et al objevili pacienty s IPA vykazovaly rozdílnou abundanci specifických bakteriálních taxonů.11

S dostupnými novějšími diagnostickými technikami je možné zhodnotit klinické charakteristiky a plicní mikrobiom IPA z nové perspektivy pro komplexní pochopení onemocnění. Tato studie byla navržena tak, aby popsala klinické charakteristiky a výsledky IPA u pacientů s CAP, zhodnotila diagnostický výkon mNGS pro IPA a odhalila vztah mezi klinickými charakteristikami a plicním mikrobiomem u IPA.

METODY

Návrh studie a účastníci

Jednalo se o retrospektivní kohortovou studii, která se skládala z hospitalizovaných pacientů (ve věku do 18 let) s diagnózou CAP v The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University mezi 22. dubnem 2019 a 30. zářím 2021. Pacienti zařazení do této studie by měli splňovat následující zahrnující kritéria: (1) diagnostikovaná CAP splňující směrnice IDSA/ATS z roku 200712, (2) podstoupila bronchoalveolární laváž, (3) nebyla vystavena antibiotikům v posledních 2 týdnech před odběrem vzorku a (4) podstoupila test na galaktomannan (GM), stěr, kultivace a BALF mNGS výsledky BALF. Případy s pravděpodobnou IPA vyžadují přítomnost alespoň jednoho hostitelského faktoru, klinickou manifestaci a mykologický důkaz u BALF podle kritérií pro rok 2019 od Evropské organizace pro výzkum a léčbu rakoviny/mykóz Study Group (EORTIC/MSG).3 V této studii bylo modifikací diagnostických kritérií přidání NGS jako jedné z mykologických testovacích metod včetně GM testu, nátěru a kultivace. Případy bez pravděpodobné IPA zahrnovaly pacienty bez klinických nebo radiologických důkazů nebo bez přítomnosti Aspergillus spp v BALF. Všichni zařazení pacienti byli telefonicky sledováni, aby se zeptali na přežití nebo datum úmrtí.

Sběr dat a mikrobiologické testování

Klinické informace byly extrahovány z elektronických lékařských záznamů pomocí standardizovaného formuláře pro sběr dat, který zahrnoval demografické informace, klinická data, laboratorní nálezy, CT hrudníku, antimykotické léčby a výsledky. Všechna data byla přezkoumána dvěma výzkumníky nezávisle na ověření přesnosti dat. Pořadová škála 7-kategorií13 byla upravena na základě návrhu studie, který se skládal ze vzájemně se vylučujících kategorií takto: kategorie 7, smrt; kategorie 6, vyžadující invazivní ventilaci a další orgánovou podporu (např. kontinuální renální substituční terapii nebo mimotělní membránovou oxygenaci); kategorie 5 vyžadující invazivní mechanickou ventilaci; kategorie 4, vyžadující neinvazivní ventilaci nebo kyslík s vysokým průtokem; kategorie 3, vyžadující doplňkový kyslík maskou nebo nosními hroty; kategorie 2, hospitalizován, bez kyslíku; kategorie 1, vybitá. Zlepšení klinického stavu bylo definováno jako pokles o 2 kategorie hodnocené pomocí 7-úrovňové ordinální stupnice v pevně stanovených časových bodech (1., 7., 14., 21. a 28. den).
Testování na GM antigen v séru a GM v BALF se obecně provádí u všech zařazených pacientů. Výsledek byl považován za pozitivní, když hodnoty optického indexu byly větší nebo rovné 1.0 v séru nebo větší nebo rovné 1.0 v BALF nebo větší nebo rovné 0 0,7 v séru a větší nebo rovno 0,8 v BALF. Vzorky BALF byly podrobeny mNGS, mikroskopickému nátěru a kultivaci běžných hub.

Metagenomické sekvenování nové generace

Od každého pacienta bylo odebráno 1,5–3 ml BALF podle standardních postupů.14 1,5ml mikrocentrifugační zkumavka obsahující 0,6ml BALF vzorek, enzym a 1g 0,5mm skleněných kuliček byla protřepána vortexový mixér a 0,3 ml vzorek byl rozdělen do 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky a DNA byla extrahována pomocí soupravy TIANamp Micro DNA Kit (DP316, Tiangen Biotech) podle návodu výrobce. 15 DNA knihoven bylo vytvořeno pomocí DNA fragmentace, oprava konce, ligace adaptéru a amplifikace PCR. Poté byly knihovny s potvrzenou kvalitou sekvenovány platformou Illumina NextSeq 550 s jedním čtením 75 bp (Illumina, San Diego, Kalifornie, USA).16

Před extrakcí DNA byla ke vzorku přidána vnitřní kontrola, nazvaná unikátní molekulární přídavek (UMSI). Sekvence UMSI se v různých vzorcích lišila. Každý běh testu NGS zahrnoval externí negativní kontrolu, která probíhala paralelně s klinickými vzorky. Během analýzy bylo možné zjistit kontaminaci mezi vzorky, pokud byla sekvence UMSI stejná nebo hodnoty některých patogenů v externí kontrole byly velmi vysoké.

Vysoce kvalitní sekvenační data byla generována odstraněním nekvalitních čtení, následovaným výpočtovým odečtením lidských hostitelských sekvencí mapovaných do lidského referenčního genomu (hg19) pomocí Burrows-Wheelerova zarovnání.17 Zbývající data odstraněním čtení s nízkou složitostí byla klasifikována současným přiřazením ke čtyřem databázím mikrobiálních genomů (bakterie, houby, viry a paraziti), které byly staženy z Národního centra pro biotechnologické informace (ftp://ftp.ncbi. nlm.nih.gov/genomes/). Interpretaci mých výsledků lze vidět v online doplňkových metodách.

Zapojení pacientů a veřejnosti

Pacienti a veřejnost nebyli zapojeni do návrhu a provádění této studie, výběru výsledků měření ani náboru. Výsledky této studie nebudou šířeny účastníkům a propojeným komunitám.

Statistické analýzy

Spojité proměnné byly vyjádřeny jako medián (IQR) a porovnány s Mann-Whitney U testem. Kategorické proměnné byly vyjádřeny jako čísla ( procenta ) a porovnány pomocí χ2 testu nebo Fisherova exaktního testu. Kontingenční tabulky 2×2 byly vytvořeny pro stanovení citlivosti, specificity, pozitivní prediktivní hodnoty (PPV) a negativní prediktivní hodnoty (NPV). Oboustrannost menší než 0.05 byla považována za statisticky významnou. Statistické analýzy byly provedeny pomocí IBM SPSS Statistics, V.23.0, pokud není uvedeno jinak.

Vysoce kvalitní údaje byly nejprve mapovány do lidského referenčního genomu (hg19) a poté byly údaje, které nebyly provedeny u člověka, zarovnány do čtyř databází mikrobiálního genomu (bakterie, houby, viry a paraziti). Po odstranění mikrobiálního pozadí, které se objevilo v negativních kontrolách (online doplňková tabulka 1), byl k odhadu relativní početnosti druhů použit Bayesovský přehodnocení abundance (online doplňková tabulka 2). Index alfa diverzity pro každý vzorek byl vypočten na základě indexů Shannon a Simpson a diverzita beta byla vypočtena na základě vážené vzdálenosti UniFrac a vzdálenosti Bray-Curtis. Hodnoty P pro alfa a beta analýzu byly vypočteny pomocí Wilcoxonova rank-sum testu. Velikost účinku lineární diskriminační analýzy (LDA) byla použita k nalezení významně odlišných druhů mezi skupinami s prahovými hodnotami log10 skóre LDA větším nebo rovným 2 a hodnotou p menší nebo rovnou 0,05. Korelace mezi reprezentativní mikroflórou a klinickými daty byla vyhodnocena Spearmanem.

VÝSLEDEK

Nábor pacientů a klinické charakteristiky

Celkem bylo přezkoumáno 123 pacientů se 128 vzorky BALF a do této studie bylo zařazeno 111 pacientů.

U 26 pacientů byla diagnostikována pravděpodobná IPA (označená jako IPA) au 85 kontrol bez IPA (označená jako kontrola) (obrázek 1). Srovnání demografických a klinických charakteristik mezi skupinou IPA a kontrolní skupinou byla shrnuta v tabulce 1. Studovaná populace měla střední věk 60 (IQR, 53–73) let a 66,7 procenta byli muži. Celkově 33 pacientů (29,7 procenta) mělo v anamnéze kouření. 22 pacientů (19,8 procenta) mělo chronickou obstrukční plicní nemoc. Patnáct pacientů (13,5 procenta) dostávalo kortikosteroidy a 36 pacientů (32,4 procenta) bylo považováno za imunokompromitované (online doplňková tabulka 3). Pacienti s pravděpodobnou IPA měli významně vyšší míru známých rizikových faktorů aspergilózy než pacienti bez IPA, včetně léčby kortikosteroidy delší než 28 dní (38,5 procenta vs 5,9 procenta, p=0.000) a imunokompromitovaných stav (53,8 procenta oproti 25,9 procenta, p=0,008). Nebyly nalezeny žádné významné rozdíly ve skóre sekvenčního hodnocení orgánového selhání a skóre zmatenosti, močoviny, dechové frekvence, krevního tlaku a věku 65 pacientů mezi těmito dvěma skupinami při přijetí.

Mikrobiologické, CT snímky a laboratorní nálezy

Izoláty Aspergillus fumigatus byly získány pro 6 z 26 (23,1 procenta) pravděpodobných případů IPA, následoval Aspergillus flavus pro 3 z 26 (11,5 procenta) a Aspergillus ustus pro 1 z 26 (3,8 procenta) (tabulka 2). Ztluštění bronchiální stěny bylo častěji prokázáno na CT hrudníku v IPA (44.0 procent vs 12,8 procenta, p=0.000) (tabulka 2). Pacienti s IPA mají významně nižší hladiny celkového počtu lymfocytů (774,1 vs. 1088,9, p=0.009) a subpopulace lymfocytů, včetně počtu CD3 plus T lymfocytů (553,0 vs 782,6, p=0,016), počet CD4 plus T lymfocytů (287,9 vs. 409,5, p=0,031) a počet CD4− CD8− T lymfocytů (25,9 vs 45,0, p=0,007 ) než kontrolní pacienti (online doplňková tabulka 4), což ukazuje na oslabenou imunitní funkci pacientů s IPA.

Porovnání diagnostického výkonu

Pro srovnání diagnostického výkonu BALF mNGS a konvenčních testů pro rozlišení případů s pravděpodobnou IPA od případů bez pravděpodobné IPA jsou výsledky uvedeny na obrázku 2. GM test (57,7 procenta) měl nejvyšší citlivost při detekci Aspergillus spp, následovaný mNGS (42,3 procenta), kultura (30,8 procenta) a šmejd (7,7 procenta). Ve srovnání s nátěrem měl mNGS výrazně vyšší citlivost 42,3 procenta oproti 7,7 procenta, p=0.{{30}}1). mNGS, kultura a nátěr měly 100 procentní specifičnost, zatímco GM test měl 92,9 procentní specifičnost, s významným rozdílem mezi mNGS (nebo kulturou nebo nátěrem) a GM testem (p{ {18}}.029). PPV mNGS, kultury a nátěru pro identifikaci Aspergillus spp byla 100 procent, zatímco test GM byl 71,4 procenta. NPV byla hodnocena jako GM test (87,8 procenta), mNGS (85,0 procenta), kultivace (82,5 procenta) a stěr (78,0 procenta), bez významného rozdílu mezi těmito metodami. Analyzovali jsme rozdíly v citlivosti/specifičnosti/PPV/NPV GM v séru oproti BALF pomocí BAL tekutinového GM indexu většího nebo rovného 1,0 nebo sérového GM indexu většího nebo rovného 1,0 jako pozitivní, podle 2019 EORTIC /MSG. Bylo významně vyšší v senzitivitě, ale nižší ve specificitě GM BALF než GM séra (57,7 procenta vs. 26,9 procenta, p=0,048, 92,9 procenta vs. 100 procent, 0,029, v tomto pořadí), což bylo ukázáno v online doplňková tabulka 5. Nebyly žádné rozdíly v PPV a NPV.

Klinické výsledky

Mezi těmito dvěma skupinami nebyly žádné významné rozdíly v úmrtnosti 28-den, 60-den a 90-den (tabulka 3). Nemocniční úmrtnost (30,8 procenta vs. 11,8 procenta, p=0,021) a úmrtnost na jednotkách intenzivní péče (JIP) (42,1 procenta vs. 17,5 procenta, p=0,029) byla významně vyšší ve skupině IPA než v kontrolní skupině. Rozdělení pacientů spadajících do každé kategorie 7-kategorie škály ukázalo statistický rozdíl mezi těmito dvěma skupinami ke dni 28 (p=0,017); signifikance se statistickým testováním však nebylo dosaženo v 7-řadové škále kategorií ve dnech 1, 7 a 14 (obrázek 3). Více antimykotik bylo podáváno 23,1 procentům pacientů s pravděpodobnou IPA ve srovnání s 5,9 procenty pacientů bez pravděpodobné IPA (p=0,01). Podíl pacientů užívajících vorikonazol byl pozoruhodně vyšší v případech s pravděpodobnou IPA (53,9 procenta vs 8,2 procenta, p=0.000). Mezi těmito dvěma skupinami nebyl žádný významný rozdíl v použití amfotericinu B a kaspofunginu (tabulka 3).

Analýza plicního mikrobiomu

Abychom porovnali celkové složení a diverzitu plicního mikrobiálního podpisu u pacientů s IPA a kontroly, analyzovali jsme vzorky BALF odebrané od 109 pacientů s CAP, včetně 24 případů (postrádali 2 pacienty kvůli ztrátě dat mNGS) s diagnostikovanou pravděpodobnou IPA (tzv. IPA) a 85 případů bez pravděpodobné IPA (pojmenovaná kontrola). Diverzitu plicních komunit jsme hodnotili pomocí Shannonova a Simpsonova indexu diverzity. Došlo ke snížení diverzity jak v indexu diverzity podle Shannona, tak u Simpsonových indexů u pacientů s IPA ve srovnání s pacienty bez IPA navzdory významným rozdílům (obrázek 4A, B). Pomocí vážené metriky UniFrac a metriky Bray-Curtis jsme pozorovali, že diverzita pacientů s IPA se významně lišila od pacientů bez IPA (p<0.001; Wilcoxon test), suggesting that lung community structure of patients diagnosed with probable IPA differed substantially from those without probable IPA (figure 4C, D). Based on the average relative abundance, we plotted the top 10 phyla, genera, and species among 2 groups. 

V celkové kohortě byly nejhojnějšími kmeny Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria, Bacteroidetes a Ascomycota, zatímco Prevotella, Streptococcus, Acinetobacter a Pneumocystis byly nejčastějšími rody (obrázek 5A, B). Relativní četnost top 10 u druhů zařazených jako Pneumocystis jirovecii, Acinetobacter baumannii, Lautropia mirabilis, Streptococcus oralis, Corynebacterium striatum, Human betaherpesvirus 5, Rothia mucilaginosa, Staphylococcus aureus pouze H. beta, Prevotnica withella5ogenic H. beta, Prevotella withella5 významně odlišné mezi dvěma skupinami (obrázek 5C). Zaměřením na rozdílné druhy v IPA ve srovnání s jejich kontrolami jsme našli 21 druhů se skóre LDA vyšším nebo rovným 2 a p<0.05, which H. betaherpesvirus 5, A. fumigatus, Aspergillus niger, Citrobacter braakii, Bacillus thermoamylovorans, Helcococcus kunzite, Lactobacillus delbrueckii, Burkholderia dolosa, Marinobacter hydrocarbonoclasticus, Riemerella anatipestifer, Corynebacterium halotolerant, and Lactobacillus plantarum were significantly abundant in the cases diagnosed with probable IPA, and Streptococcus salivarius, Citrobacter freundii, Paraburkholderia fungorum, Dolosigranulum program, Prevotella timonensis, Sphingobium yanoikuyae, Serratia marcescens, and Corynebacterium oculi were enriched in cases without probable IPA (figure 5D, online supplemental figure 1).

Abychom dále prozkoumali korelaci mezi klinickými údaji a plicní mikroflórou IPA, provedli jsme Spearmanův korelační test založený na pořadí na 21 významně odlišných druzích s klinickými výsledky a laboratorními nálezy (obrázek 6A). Pozorovali jsme, že 19 různých druhů významně korelovalo se 7 klinickými výsledky a 22 laboratorními biomarkery, zejména S. salivarius, P. Sinensis a H. betaherpesvirus 5. S. salivarius primárně pozitivně koreloval s osmi laboratorními biomarkery, včetně červených krvinek, celkem lymfocyty, T lymfocyty, T pomocné buňky, cytotoxické T lymfocyty, B lymfocyty, sérový draslík a albumin, a negativně relativní s aspartátaminotransferázou, přímým bilirubinem a D-dimerem. Zatímco S. salivarius byl hlavně negativně spojen s 11 klinickými výsledky, včetně úmrtnosti na JIP, délky pobytu na JIP, úmrtnosti v nemocnici, úmrtnosti v den 28 a doby do dodatečné nezávislosti na kyslíku během 28 dnů, a pozitivně koreloval s délkou úmrtnosti pobytu v nemocnici v den 28, dny bez ventilátoru během 28 dnů a čas do zlepšení klinického stavu. Podobně jako S. salivarius byl P. timonensis primárně pozitivně relativizován k šesti laboratorním biomarkerům, včetně celkových lymfocytů, T lymfocytů, T pomocných buněk, CD4−CD8− T buněk, B lymfocytů a draslíku v séru, a negativně koreloval s prokalcitoninem.

Stejně tak P. timonensis byla hlavně negativně spojena s délkou pobytu na JIP a mortalitou v nemocnici, ale pozitivně se dny bez ventilátoru do 28 dnů. Na rozdíl od S. salivarius a P. Sinensis byl H. betaherpesvirus 5 negativně asociován se šesti laboratorními biomarkery, včetně celkových lymfocytů, T lymfocytů, T pomocných buněk, CD4 plus CD8 plus T buněk, B lymfocytů a draslíku v séru, a pozitivní relativní s močovinový dusík v krvi. Mezitím virus H. betaherpesvirus 5 negativně koreloval s délkou pobytu na JIP a dobou do dodatečné kyslíkové nezávislosti během 28 dnů. Tato pozorování naznačují, že dysbióza mikrobiálních komunit v plicích je spojena s patofyziologickými stavy pacienta a může tak ovlivnit klinické výsledky.

Abychom dále prozkoumali klinický dopad 21 významně odlišných druhů, provedli jsme analýzu přežití vynesením křivky kumulativní pravděpodobnosti. Jak ukazují obrázky 6B a C, detekce A. fumigatus a H. betaherpesvirus 5 významně predikovala horší výsledky JIP (p=0.045, 00,032) . Zatímco na obrázku 6D, E jsme zjistili, že detekce S. salivarius a P. timonensis extrémně významně predikovala lepší výsledky JIP (p=0,0031, 0,0054). Dospěli jsme tedy k závěru, že v plicní mikrobiotě CAP lze výsledky na JIP předpovídat složením komunity, konkrétně A. fumigatus, H. betaherpesvirus 5, S. salivarius a P. Sinensis.

DISKUSE

V této retrospektivní kohortové studii jsme zkoumali klinické charakteristiky IPA. Je zajímavé, že jsme zaznamenali, že pacienti kategorizovaní jako s pravděpodobnou infekcí Aspergillus měli významně vyšší nemocniční úmrtnost (30,8 procenta) a úmrtnost na JIP (42,1 procenta) ve srovnání s kontrolou. Mortalita v den 28, i když nebyla statisticky významná, byla numericky vyšší u pacientů s IPA než u kontroly. Tyto údaje naznačují, že pacienti s infekcí Aspergillus mají tendenci mít vyšší časnou mortalitu. Předchozí studie uváděla odhadem 45 procent úmrtnosti na JIP a 26 procent nemocniční úmrtnosti18 Mezi invazivní tracheobronchiální aspergilózou, vzácnou entitou IPA, byla 30-denní a 90-denní úmrtnost až 90 procent . 19 Loughlin et al uvedli, že mortalita na JIP u pacientů s pravděpodobnou infekcí Aspergillus nebyla významně vyšší než u pacientů bez infekce Aspergillus4, což je pravděpodobně způsobeno obecně kritickým stavem v kohortě pacientů s plicní ventilací na JIP. V této studii byl celkový stav zařazených pacientů s CAP relativně mírný, což může být pozoruhodně zhoršeno infekcí Aspergillus a potenciálně život ohrožující.

Cornillet et al navrhli, že nespecifické klinické rysy a diagnostické potíže pacientů s IPA, zejména pokud pacienti bez neutropenie snadno vedou k suboptimálnímu řízení a opožděnému zahájení léčby, což má za následek vysokou mortalitu a morbiditu.20 Vzhledem ke zničující míře úmrtnosti pacientů s IPA a přesná diagnóza je zdůrazněna a naléhavě potřebná pro účinnou antifungální léčbu, aby se snížila morbidita a mortalita. V posledním desetiletí byla detekce GM široce používána v diagnostice IPA.21 Testování GM pro vzorky séra má však omezenou citlivost při diagnostice IPA u neutropenických hostitelů.22 Místo toho detekce GM ve vzorcích tekutin BAL pacientů v riziku IPA má vynikající diagnostickou přesnost,23 24 protože GM se uvolňuje dříve a ve vyšších koncentracích v tekutině BAL ve srovnání se sérem.25 V poslední době hraje mNGS stále důležitější roli v diagnostice plísňových onemocnění. Ding et al prokázali, že senzitivita mNGS byla významně vyšší než u kultury při detekci Candida albicans. 9 V této studii byl BALF odebrán přímo z dolního dýchacího traktu, čímž se zabránilo kontaminaci z ústní mikroflóry. Aspergilly v BALF byly detekovány pomocí mNGS, kultivace, nátěru a GM testu. Výsledky ukázaly, že NGS má srovnatelnou specificitu a PPV jako kultivace při detekci Aspergillus. Přestože citlivost mNGS byla nižší než GM test, mNGS vykazoval vyšší senzitivitu než nátěr a vyšší specificitu než sérum a BALF GM testy. Tyto výsledky ukázaly, že mNGS působí jako užitečný nekulturní test pro detekci Aspergillus, což naznačuje doplněk k rutinním mikrobiologickým testům v diagnostice pacientů s rizikem IPA.

Naše studie zjistila, že pacienti s CAP s Aspergillus byli častěji koinfikováni bakteriální nebo (a) virovou infekcí kvůli imunokompromitovanému stavu a léčbě kortikosteroidy. U pacientů s chřipkou, kteří byli imunokompromitovaní, byl hlášen výskyt IPA až 32 procent, zatímco ve skupině případů chřipky bez imunokompromitované chřipky byl výskyt 14 procent.18 Se vznikem pandemie COVID{4}} a užívání kortikosteroidů u pacientů s těžkou COVID-19,26 COVID-19-asociovaná plicní aspergilóza (CAPA) byla hlášena v několika kazuistikách.27–29 V metaanalýze byla incidence a mortalita CAPA na JIP byly odhadnuty na 10,2 procenta, respektive 54,9 procenta.30

Vzhledem k rozsáhlým mikrobiálním čtením v datech mNGS, které lze použít k analýze mikrobiálních podpisů u řady onemocnění, se naše studie pokusila prozkoumat rozdíl ve struktuře a složení mikrobiomu mezi pacienty s IPA a pacienty s CAP bez IPA analýzou dat mNGS. Naše současná studie zahrnovala plicní mikroflóru 24 pacientů s IPA a 85 pacientů s non-IPA CAP. Byl zkoumán vztah mezi různou mikroflórou a klinickými údaji u všech 109 pacientů s CAP. U alfa diverzity nebyly žádné významné rozdíly v Shannonově indexu a Simpsonově indexu mikrobioty u pacientů s IPA a pacientů bez IPA CAP, což dokazuje, že diverzita komunit v rámci vzorku byla podobná mezi pacienty s IPA a pacienty bez IPA.

Pokud jde o diverzitu beta, naše výsledky ukázaly dramatický rozdíl ve vážené vzdálenosti UniFrac (p=2.1×10−6) a vzdálenosti Bray-Curtis (p=0.033) mezi IPA a non-IPA Pacienti s CAP, což ukazuje na potenciální účinek Aspergillus spp na strukturu plicní mikroflóry u pacientů s diagnózou IPA. Podobné studie prokázaly významné rozdíly v beta diverzitě mikrobioty mezi IPA a kontrolami.11 To může být způsobeno tím, že původci v kontrolách byli komplexní, což mohou být jakékoli patogeny CAP (jako jsou bakterie, viry, houby, paraziti a dokonce atypické patogeny) kromě Aspergillus. Plicní mikrobiální heterogenita v kontrole byla tedy vyšší než IPA. Mezitím tyto studie prokázaly, že Firmicutes, Proteobacteria, Actinobacteria a Bacteroidetes byly nejhojnějšími kmeny v kohortě IPA.11 Kromě bakterií však naše studie zjistila, že relativní množství Ascomycota bylo také vysoké na úrovni kmene, např. metagenomika dokáže sklidit téměř všechny nukleové kyseliny mikrobioty, včetně bakterií, hub, virů a parazitů.

Významně odlišné druhy, zejména S. salivarius, P. Sinensis a H. betaherpesvirus 5, úzce souvisely s klinickými údaji. S. salivarius a P. timonensis pozitivně souvisely s laboratorními biomarkery, jako jsou T lymfocyty, a negativně souvisely s klinickými výsledky, jako je nemocniční mortalita. Zatímco H. betaherpesvirus 5 negativně souvisel s laboratorními biomarkery, jako jsou T lymfocyty, a pozitivně souvisel s klinickými výsledky, jako je nemocniční mortalita. Předchozí studie prokázaly, že S. salivarius je probiotická bakterie, která může inhibovat adherenci pneumokoků k epiteliálním buňkám hltanu.31 Další studie také prokázala, že izoláty S. salivarius mají vynikající schopnost inhibovat růst Haemophilus influenzae, Moraxella catarrhalis, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes a Staphylococcus aureus. 32 Všechny tyto studie se shodovaly s naší studií, že S. salivarius pozitivně koreloval s lepším klinickým výsledkem pacientů.

Možný mechanismus S. salivarius pozitivně korelující se zlepšeným výsledkem pacientů může spočívat v tom, že mohou inhibovat růst potenciálního patogenu a aktivovat imunitní systém hostitele. U P. Sinensis předchozí studie ukázala, že P. timonensis by mohla dramaticky indukovat expresi mucinů asociovaných s membránou v trojrozměrném modelu endometriálních epiteliálních buněk a vytvořila biofilm na povrchu epitelu, což zase ovlivňuje adhezi jiných bakterií. .33 Důvodem pozitivní korelace s lepším klinickým výsledkem pacientů může být odolnost proti kolonizaci P. Sinensis v plicích a aktivace imunitního systému hostitele. V klinických podmínkách může H. betaherpesvirus 5 vytvářet celoživotní latentní infekce u zdravých lidí. Jakmile je však imunokompromitován, může být virus H. betaherpesvirus 5 reaktivován, například u příjemců transplantovaných solidních orgánů a HIV pozitivních pacientů.34 Reaktivace viru H. betaherpesvirus 5 tedy indikovala oslabený imunitní systém a špatné klinické výsledky pacientů s IPA. .

Naše studie má několik omezení. Za prvé, retrospektivní studie byla navržena tak, aby analyzovala shromážděná data a byla omezena na relativně malou velikost vzorku, což by ji mohlo předurčit k zavedení zkreslení z neúplných informací. Za druhé, toto byla pozorovací studie. Přestože jsme našli některé zajímavé korelace mezi plicní mikrobiotou a klinickými údaji, kauzální vztah je třeba vyřešit prospektivní kohortovou studií nebo experimentem s mechanismem, jako je experiment na zvířatech, který bude dalším krokem naší studie. Jinak studie identifikovala pacienty s pravděpodobnou infekcí Aspergillus striktně na základě nových diagnostických kritérií EORTIC/MSG 2019, takže několik případů nemohlo splnit kritéria pro pravděpodobnou diagnózu IPA kvůli absenci klasických hostitelských faktorů.

Přispěvatelé

Koncepce a design studie: YL, ZA a HX. Získávání dat: ZA, ML, HL a MD. Analýza a interpretace dat: ZA a HX. Návrh rukopisu: ZA, HX a YL. Kritická revize rukopisu pro důležitý intelektuální obsah: HX, ZA a YL. Statistická analýza: ZA, HL a HX. Administrativní, technická nebo materiální podpora: HX, HL a YL. Všichni autoři přispěli k článku a schválili předloženou verzi.

Financování

Lékařský vědecký výzkumný projekt Chongqing (společný projekt Chongqingské zdravotní komise a úřadu pro vědu a technologii (2022GDRC010)).

Konkurenční zájmy

Žádná nebyla vyhlášena.

Zapojení pacientů a veřejnosti

Pacienti a/nebo veřejnost nebyla zapojena do návrhu, provádění, podávání zpráv nebo plánů šíření tohoto výzkumu.

Souhlas pacienta se zveřejněním

Nelze použít.

Etické schválení

Tato studie zahrnuje lidské účastníky. Tato studie byla schválena etickou komisí First Affiliated Hospital of Chongqing Medical Hospital (schválené číslo 2021-301). Účastníci před účastí dali informovaný souhlas s účastí ve studii.

Provenience a vzájemné hodnocení

Nezadáno; externě recenzováno.

Prohlášení o dostupnosti dat

Všechna data relevantní pro studii jsou zahrnuta v článku nebo nahrána jako online doplňkové informace.

Doplňkový materiál

Tento obsah byl dodán autorem (autory). Nebyla prověřena společností BMJ Publishing Group Limited (BMJ) a možná ani nebyla recenzována. Jakékoli diskutované názory nebo doporučení jsou výhradně názory autora (autorů) a nejsou podporovány společností BMJ. BMJ se zříká veškeré odpovědnosti a odpovědnosti vyplývající z jakéhokoli spoléhání se na obsah. Pokud obsah zahrnuje jakýkoli přeložený materiál, společnost BMJ nezaručuje přesnost a spolehlivost překladů (včetně, nikoli však výhradně, místních předpisů, klinických pokynů, terminologie, názvů léků a dávkování léků) a nenese odpovědnost za žádné chyby a/ nebo opomenutí vyplývající z překladu a adaptace nebo jinak.

Otevřený přístup

Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný licencí Creative Commons Attribution Non-Commercial (CC BY-NC 4.0), která ostatním umožňuje nekomerčně distribuovat, remixovat, upravovat a stavět na tomto díle a licencovat svá odvozená díla za jiných podmínek, za předpokladu, že původní dílo je řádně citováno, je uveden patřičný kredit, jsou uvedeny jakékoli provedené změny a použití je nekomerční. Viz http://creativecommons.org/licenses/by-nc/4.0/.

REFERENCE

1 Taccone FS, Van den Abeele AM, Bulpa P, et al. Epidemiologie invazivní aspergilózy u kriticky nemocných pacientů: klinický obraz, základní stavy a výsledky. Crit Care 2015;19:7.

2 Danion F, Rouzaud C, Duréault A, et al. Proč je tolik případů invazivní aspergilózy vynecháno? Lékařská mykologie 2019;57:S94–103.

3 Donnelly JP, Chen SC, Kauffman CA, et al. Revize a aktualizace konsenzuálních definic invazivních plísňových onemocnění od Evropské organizace pro výzkum a léčbu rakoviny a Konsorcia pro vzdělávání a výzkum Mycoses Study Group. Clin Infect Dis 2020;71:1367–76.

4 Loughlin L, Hellyer TP, White PL a kol. Plicní aspergilóza u pacientů s podezřením na ventilátorovou pneumonii na britských JIP. Am J Respir Crit Care Med 2020;202:1125–32.

5 Hage CA, Carmona EM, Evans SE, et al. Souhrn pro klinické lékaře: mikrobiologické laboratorní vyšetření v diagnostice mykotických infekcí v plicní a intenzivní péči. Annals ATS 2019;16:1473–7.

6 Mitchell SL, Simner PJ. Sekvenování nové generace v klinické mikrobiologii: už jsme tam? Clin Lab Med 2019;39:405–18.

7 Liu X, Chen Y, Ouyang H a kol. Diagnostika tuberkulózy metagenomickým sekvenováním nové generace na tekutině bronchoalveolární laváže: průřezová analýza. Int J Infect Dis 2021;104:50–7.

8 Sun T, Wu X, Cai Y, a kol. Metagenomické sekvenování nové generace pro patogenní diagnostiku a antibiotickou léčbu těžké komunitní pneumonie u imunokompromitovaných dospělých. Front Cell Infect Microbiol 2021;11:661589.

9 Ding L, Liu Y, Wu X a kol. Metagenomika patogenu odhaluje odlišné signatury plicní mikroflóry mezi bakteriologicky potvrzenými a negativními pacienty s tuberkulózou. Front Cell Infect Microbiol 2021;11:708827.

10 Dickson RP, Schultz MJ, van der Poll T, et al. Plicní mikrobiota předpovídá klinické výsledky u kriticky nemocných pacientů. Am J Respir Crit Care Med 2020;201:555–63.

11 Hérivaux A, Willis JR, Mercier T, a kol. Plicní mikrobiota předpovídá invazivní plicní aspergilózu a její výsledek u imunokompromitovaných pacientů. Thorax 2022;77:283–91.

12 Mandell LA, Wunderink RG, Anzueto A, et al. Americká společnost pro infekční nemoci/Americká hrudní společnost konsensuální směrnice o léčbě komunitní pneumonie u dospělých. Clin Infect Dis 2007;44 Suppl 2:S27–72.

13 Wang Y, Fan G, Horby P a kol. Srovnávací výsledky dospělých hospitalizovaných se sezónní infekcí virem chřipky A nebo B: použití 7-řadové stupnice kategorií. Otevřete fórum Infect Dis 2019;6:ofz053.

14 Chen X, Ding S, Lei C, a kol. Metagenomické sekvenování nové generace krve a bronchoalveolární tekutiny u pneumonie. Can J Infect Dis Med Microbiol 2020;2020:6839103.

15 Long Y, Zhang Y, Gong Y a kol. Diagnostika sepse s bezbuněčnou DNA technologií sekvenování nové generace u pacientů na JIP. Arch Med Res 2016;47:365–71.

For more information:1950477648nn@gmail.com