Jak proteiny pro opravu buněčné membrány regulují přenos signálu transkripčního faktoru za účelem kontroly renální fibrózy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Haichang Li

ledvinyfibróza je spojena s progresí akutledvinaporanění chronického onemocnění ledvin. Bylo prokázáno, že MG53, protein pro opravu buněčné membrány, chrání před poškozením ledvinových epiteliálních buněk a akutním poškozením ledvin. Zde jsme hodnotili roli MG53 v modulaciledvinafibróza u stárnoucích myší a u myší s jednostrannou ureterální obstrukcí (UUO), což je známý model progresivní fibrózy ledvin. U myší s ablací MG53 se s věkem vyvinulo více intersticiální fibrózy než u MG53-intaktní myši stejného věku. Podobně v nepřítomnosti MG53ledvinafibróza byla přehnaná ve srovnání s myšmi s intaktním MG53 v ucpané ledvině ve srovnání s kontralaterální neucpanou ledvinou nebo ledvinami falešně operovaných myší. Ureterální obstrukceledvinyz MG53-deficitních myší také vykazovaly významně větší zánět než ureterální ucpané ledviny z MG53 intaktních myší. Experimenty in vitro ukázaly, že MG53 může vstupovat do jader proximálních tubulárních epiteliálních buněk a přímo interagovat se složkou p65 transkripčního faktoru NF-kB, což poskytuje možné vysvětlení zesíleného zánětu v nepřítomnosti MG53. Aby se to otestovalo, byla myším vystaveným UUO poskytnuta zvýšená exprese MG53 prostřednictvím upravených buněk nebo přímého dodání rekombinantního proteinu. To snížilo aktivaci NF-kB a zánět a zmírnilo fibrózu ledvin. MG53 tedy může mít terapeutickou roli při léčbě chronického zánětu ledvin a tím poskytovat ochranu protifibrózacož vede k fenotypu chronického onemocnění ledvin.

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Translační prohlášení Chronický zánět vede k fibrotické remodelaci, která může být také základem přechodu od akutního poškození ledvin k chronickému onemocnění ledvin. Na patogenezi zánětu ledvin se podílí aktivace protein-inflamatorního transkripčního faktoru nukleárního faktoru-kB (NF-kB). Zde poskytujeme důkaz, že MG53, dříve identifikovaný protein pro opravu buněčné membrány, přímo interaguje s NF-kB a snižuje jeho transkripční aktivitu. Současně může exogenně podávaný MG53 snížit fibrotickou remodelaci zanícené ledviny. Tato zjištění poukazují na protektivní souhru mezi MG53 a NF-kB pro zmírnění rozvoje zánětem zprostředkované fibrózy ledvin. Farmakologické podávání MG53 může být slibným přístupem k léčbě progresivní fibrózy ledvin.

Dysfunkce ledvin, kterou lze klasifikovat jako akutní poškození ledvin (AKI) nebo chronické onemocnění ledvin (CKD), přerostla ve starší populaci v epidemii. V roce 2017 prevalence CKD dosáhla 14,5 procenta lidí ve věku 65 a více let, což vedlo k výdajům Medicare na léčbu přes 84 miliard dolarů.^1,2AKI a CKD jsou častější u starších jedinců, hlavně kvůli zvýšené náchylnosti ke zranění a snížené schopnosti opravit stárnoucí ledvinu. Klinické studie prokázaly, že CKD je hlavním rizikovým faktorem pro AKI, a naopak epizody AKI mohou urychlit progresi CKD směrem k terminálnímu onemocnění ledvin. V současné době je léčba AKI převážně podpůrná a léčba prokázané CKD je zaměřena na zpomalení progrese prostřednictvím inhibice systému renin-angiotenzin-aldosteron a nyní možná prostřednictvím inhibice kotransportérů sodíku a glukózy-2.^3,4

V závislosti na závažnosti poranění mohou proximální tubulární buňky, hlavní cíl akutního poranění, podléhat změnám v progresi buněčného cyklu,5,6 metabolismu,7 sekreci protein-zánětlivých a profibrotických cytokinů nebo částečnému epiteliálně-mezenchymálnímu přechodu,8 která určí, zda bude remodelace/oprava úspěšná nebo maladaptivní a povede k fibróze ledvin, což je charakteristický znak CKD.9,10 Tato remodelace se obvykle vyskytuje na pozadí zánětu ledvin,

snížené vaskulární zásobení a produkce proteinů extracelulární matrice (ECM) a zahrnuje ztrátu epiteliálních buněk a akumulaci kolagenů, a-aktinu hladkého svalstva a fibronektinu; má také vysokou korelaci se zhoršením funkce ledvin.

Chronický zánět vede k fibrotické remodelaci, která může být také základem přechodu z AKI na CKD.11–13 Kumulativní výzkum naznačuje účast transkripčního faktoru nukleárního faktoru-kB (NF-kB) v patogenezi zánětu ledvin způsobeného infekcí, poraněním, nebo transplantaci.11,12,14 Aktivace kanonické dráhy NF-kB začíná aktivací inhibitoru NF-kB (IkB) kinázy, která vede k fosforylaci a degradaci IkBa a jaderné translokaci NF-kB heterodimerů.15 Aktivace signalizace NF-kB v epiteliálních buňkách ledvin a infiltrujících imunitních buňkách může být vyvolána patofyziologickými spouštěči, jako je expozice lipopolysacharidům (LPS) nebo ischemicko-reperfuzní poškození.16 Studie molekulárního profilování odhalují nfkb1 jako hlavní hnací sílu fibrózy ledvin.¹⁷Kromě tubulárních buněk ledvin přispívají k poškození ledvin, zánětu a fibrotické remodelaci také vrozené imunitní buňky, jako jsou makrofágy a dendritické buňky.^13,18–20

cistanche je účinný při léčbě dysfunkce ledvin

Rostoucí důkazy naznačují, že svalové sekreční faktory (tj. myokiny) modulují systémovou fyziologii prostřednictvím přeslechů tkání, aby ovlivnily progresi onemocnění ledvin.²¹MG53 (také nazývaný TRIM72) je protein obohacený tripartitním motivem (TRIM) s kritickou funkcí při opravě buněčné membrány.22,23 Proteiny rodiny TRIM mají různé funkce, od regulace imunitní signalizace po opravu tkání.²⁴MG53-zprostředkovaná oprava membrány se podílí na zmírnění akutního poranění kosterního svalstva,²⁵ledviny,²⁶srdce,²⁷ plíce, 28 mozky,^29,30a kůže.³¹Naše předchozí studie identifikovaly nízkou hladinu exprese MG53 v ledvinách, která je klíčovou složkou ochrany AKI, a myši s deficitem MG53 (mg53/ ) byly náchylnější k AKI vyvolanému stresem.²⁶Nedávno jsme také prokázali, že trvalé zvýšení hladiny MG53 v oběhu zvyšuje opravu a regeneraci poranění tkáně.32 Relativní role ledvinově specifického a vnějšího cirkulujícího MG53 v modulaci fibrózy ledvin během progresivního CKD jsou stále neznámé.

Nedávno se vyvinula nově vznikající úloha MG53 při modulaci ochrany tkáně prostřednictvím inhibice zánětu, zejména prostřednictvím modulace signalizace NF-kB. Například MG53 zmírňuje LPS-indukovanou neurotoxicitu a neurozánět inhibicí dráhy TLR4/NF-kB33 a srdeční MG53 reguluje expresi KChIP2 za účelem kontroly elektrofyziologické remodelace během kardiohypertrofie.34 Kromě toho jsme prokázali duální funkci MG53 v prevence maladaptivní hyperzánětlivé reakce během subletální infekce virem chřipky A, charakterizované nadměrnou produkcí interferonu-b, prostřednictvím suprese aktivace IRF3/NF-kB a inhibice aberantní intracelulární signalizace Ca2+ v makrofázích.35 Kromě toho po letální dávce chřipky A virové infekce, bylo prokázáno, že MG53 zabraňuje úmrtnosti a poškození plic, nikoli přímým ovlivněním virových titrů per se, ale zmírněním cytokinové bouře (interferon-b, interleukin-6 a interleukin-1b) prostřednictvím negativní regulace inflamasomu NLRP3 a prevenci pyroptózy plic.36 Navíc byla chronická léčba vysokými dávkami exogenního MG53 spojena se supresí NF-kB – zprostředkovaný zánět ve starém srdci.37 Tyto studie naznačují, že MG53 může modulovat aberantní signalizaci NF-kB během zánětu, ale nebylo studováno, zda k tomu dochází v souvislosti se zánětem ledvin.

Předpokládali jsme, že MG53 reguluje zánět ledvin modulací transkripční aktivity NF-kB, a tím může zmírnit fibrózu ledvin, ke které dochází v důsledku chronického zánětu. Tato studie byla provedena za účelem vyřešení této hypotézy.

cistanche je účinný při léčbě onemocnění ledvin

METODY

Studie na zvířatech

Všechny experimenty se zvířaty se řídily příručkou National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals a řídily se protokoly schválenými Výborem pro ústavní péči a použití zvířat na Ohio State University. Věkově odpovídající divoký typ (WT) nebo mg53^-/-sourozenci kmene 129S1/SvImJ, kteří nejsou ze stejného vrhu, se použili22 ke stanovení úlohy MG53 v modulaci fibrózy ledvin indukované na věku a unilaterální obstrukcí močovodu (UUO). Myši C57B6/J (9–10 týdnů) byly zakoupeny od Jackson Labs.

Pro studie poškození ledvin byly myši (9–12 týdnů) podrobeny UUO k vyvolání fibrózy ledvin. Myši byly anestetizovány pomocí isofluranu (1,5 procenta – 2.0 procent ), aby byla zajištěna hluboká rovina anestezie. Postup UUO byl proveden podvázáním levého močovodu 5-0 chirurgickým hedvábím dvakrát podle publikovaných protokolů.38 Falešné myši měly pouze abdominální kožní řez. K vyhodnocení účinku rhMG53 na obstrukční poškození ledvin byla 1 skupině UUO myší podáván rhMG53 (2 mg/kg) injekcí do ocasní žíly, počínaje bezprostředně po operaci UUO (den 0) a poté denně po dobu 7 dnů, přičemž 2 další dávky ve dnech 9 a 11. Kontrolní skupina myší UUO dostávala injekce fyziologického roztoku podle stejného schématu. Myši byly usmrceny 12. den po operaci UUO, ledviny byly perfundovány in situ fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem a vzorky tkáně z ledviny UUO a kontralaterální ledviny byly odebrány pro histologii a analýzu Western blot.

V samostatných studiích WT a mg53^-/-myši podstoupily UUO nebo falešnou operaci a byly usmrceny 7. den po operaci. MG53 byl podáván myším za použití přístupu buněčné terapie.39 Makrofágy RAW 264.7 byly infikovány virovými částicemi Ad tPA-MG53- třešňových virů závislých na doxycyklinu (DOX) po dobu 24 hodin. Infikované buňky (v koncentraci {{1{12}}}}/100 ml fyziologického roztoku na myš) byly myším injikovány do ocasní žíly bezprostředně po operaci (injekce 0. den). Myši dostaly 4 injekce Ad-tPA-MG53 transdukovaných RAW buněk ve dnech 0, 1, 3 a 6. Ihned po 0. dni byly myši náhodně rozděleny do skupiny, která dostávala, a skupiny, která nedostala DOX (2 mg/ml v 5% roztoku sacharózy) v pitné vodě po dobu 7 dnů a poté usmrceny. Vzorky tkání z ledviny UUO a kontralaterální ledviny byly odebrány pro histologii, analýzu RNA a proteinů.

Statistické analýzy Data jsou vyjádřena jako průměr -SD. Srovnání v rámci skupin bylo provedeno pomocí Studentova t-testu při porovnání 2 experimentálních základních výzkumů H Li et al.: MG53 moduluje NF-kB u fibrózy ledvin 2 Kidney International (2021) -, --- skupiny a 1-analýza rozptylu pro více než 2 skupiny (Graphpad Prism 8.2; GraphPad) následovaná ad hoc testem vícenásobného porovnání Bonferroni nebo Holm-Sidak. Hodnota P < 0,05="" byla="" považována="" za="" statisticky="">

Doplňkové metody Kompletní metody včetně histologického hodnocení, měření sérového kreatininu, plazmidových konstruktů, buněčné kultury a izolace primárních tubulárních epiteliálních buněk, přípravy adenoviru a buněčné infekce, NF kB p65 jaderný translokační test, imunohistochemie a konfokální snímky, NF-kB luciferázový reportérový test, cytokin enzymový imunosorbentní test, tkáňová frakcionace, imunoblotování, koimunoprecipitace, kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (doplňková tabulka S1) a produkce rhMG53 jsou v doplňkových metodách.

extrakt z cistanche tubulosa: léčba onemocnění ledvin

VÝSLEDEK

U myší s ablací MG53 se vyvine fibróza ledvin závislá na věku

Porovnali jsme vliv stárnutí na funkci ledvin a fibrózu v mg53^-/-a WT myši. Potvrdili jsme naše předchozí pozorování, že ačkoli hladiny kreatininu v séru mladých myší (2 měsíce) s a bez MG53 nebyly významně odlišné, starší (16–20 měsíců) mg53-/-myši vykazovaly významně vyšší sérový kreatinin než kontroly WT odpovídající věku (obrázek 1a). Na základě barvení trichromem jsme zjistili, že mg53-/-myši měly více fibrózy ledvin ve srovnání s myšmi WT, počínaje ve věku 5 měsíců a pokračovaly až do věku 20 měsíců (obrázek 1b a c). Imunohistochemické barvení bylo použito k vyhodnocení dopadu ablace MG53 na infiltraci leukocytů, monocytů a makrofágů v ledvinách myší 2-měsíc a 5-měsíc (obrázek 1d a e). Ledviny mladých myší WT a mg{8}}/- měly podobné hladiny intrarenálních leukocytů, ale významně více zánětlivých buněk bylo nalezeno v mg53 / ledvinách než v ledvinách WT u 5-měsíčních myší.

Kromě toho imunohistochemie pro a-aktin hladkého svalstva a fibronektin, 2 proteiny extracelulární matrix běžně se vyskytující v oblastech ledvinové fibrózy, prokázala zvýšené (3- až 8-násobné) zbarvení v glomerulech a tubulointersticiu ledvin z { {4}}měsíční mg53-/- myši ve srovnání s 10-měsíčními WT myšmi (doplňkový obrázek S1).

UUO indukuje zhoršení zánětu ledvin a fibrózu u mg53-/- myší Hladiny MG53 v ledvinách detekované imunoblotem významně vzrostly 7 dní po UUO (obrázek 2a). Ledviny mg53-/- UUO vykazovaly přehnanou fibrózu s o 30 procent více trichromem obarvené oblasti než ledviny WT UUO (obrázek 2b).

MG53 moduluje aktivaci NF-kB a jadernou lokalizaci p65

Aktivita NF-kB (p65) byla hodnocena v modelu UUO. Počet celkového p65 (t-p65) byl významně zvýšen v UUO ledvinách od WT a mg53 / myši, ale aktivace NF-kB, hodnocená jako fosforylace p65, byla vyšší (16-krát) u mg53 / UUO ledviny než ledvina WT UUO (2-násobek) ve srovnání s falešně operovanými zvířaty (obrázek 3a). Analyzovali jsme relativní hladiny RNA transformujícího růstového faktoru b1 (TGF-b1), inhibitoru aktivátoru plazminogenu-1 (PAI-1) a kolagenu typu I alfa 1 (Col1a1) v ucpané ledvině.40 detekovali nízké hladiny genové exprese u falešných zvířat a podobnou indukci (TGF-bl, w10 násobek; PAI-1, w40 násobek; Col1a1, w40 násobek) v UUO ledvině z WT a mg53/ (obrázek 3b). Pro zkoumání prostorové distribuce MG53 v kůře ledvin za normálních podmínek byly analyzovány frakce renální tkáně. Pravidelně jsme získali 10-krát více celkového cytosolového proteinu než celkového extrahovaného jaderného proteinu. Hladiny t-p65 byly srovnatelné v cytosolové frakci mezi WT a mg53-/- myší, ale byly vyšší v jaderné frakci mg53-/- myší (obrázek 3c). MG53 byl detekován v cytosolové frakci (s tubulinem jako cytosolovým markerem). Neočekávaně bylo zjištěno významné množství MG53 v jaderné frakci (s histonem H3 jako markerem jaderné frakce).

Abychom toto zjištění potvrdili, zkoumali jsme také lokalizaci MG53 ve frakcích kosterního svalstva (doplňkový obrázek S2). Reprodukovali jsme naše předchozí studie, ve kterých se MG53 lokalizoval do cytosolu a sarkolemální membrány (adenosintrifosfatáza sodno-draselná jako marker membránové frakce)22,23,25, ale také detekoval obohacený jaderný MG53 z kosterního svalstva.

MG53 interaguje s p65 a kontroluje transkripční aktivitu indukovanou tumor nekrotizujícím faktorem-a Abychom potvrdili naše výsledky frakcionace tkání, provedli jsme následující imunohistochemické studie. V kultivovaných WT proximálních tubulárních epiteliálních buňkách byl p65 nalezen hlavně v cytosolu, ale lokalizován v jádrech v nepřítomnosti MG53 (obrázek 4a). Když byly tyto buňky ošetřeny LPS (5 mg) po dobu 8 hodin, byla sekrece prozánětlivých cytokinů významně vyšší v mg53/buňky než buňky WT (obrázek 4b).

Protože tato data naznačují, že MG53 může interagovat s p65 za účelem regulace exprese zánětlivých cytokinů, byla přímá interakce mezi p65 a MG53 hodnocena koimunoprecipitačními testy s použitím buněk HEK293 kotransfekovaných s Flag-p65 a HA-MG53. Prokázali jsme slabou interakci (obrázek 4c). Kotransfekce plazmidů GFP-p65 a RFP-MG53 a konfokální analýza potvrdily kolokalizaci p65 a MG53 (obrázek 4d). Poté jsme kvantifikovali, zda MG53 ovlivňuje transkripční aktivitu NF-kB (p65) po stimulaci TNF, měřením aktivity luciferázy ze stabilní transkripční reportérové ​​buněčné linie NF-kB/293-GFP-Luc, která byla přechodně transfekována kterýmkoli vektorem pHM6 nebo HA-MG53. Reportérové ​​buňky obsahují transdukovaný lentivirový expresní reportér luciferázy světlušky řízený minimálním promotorem cytomegaloviru ve spojení se 4 kopiemi konsenzuálních NF-kB transkripčních odezvových elementů (kB místo) upstream. V nepřítomnosti TNF-a byla v reportérových buňkách exprimujících proteiny MG53 zjištěna velmi nízká vnitřní luciferázová aktivita. MG53 potlačil transkripční aktivitu NF-kB (p65) vyvolanou TNF-a asi o 40 procent (obrázek 4e).

Nadměrná exprese MG53 zabránila jaderné translokaci NF-kB p65 po léčbě TNF-a NF-kB p65 se po léčbě TNF-a translokovala do jádra v epitelu proximálního tubulu ledvin.41 Prozkoumat, zda by léčba MG53 mohla zeslabit jadernou translokaci NF-kB p65 po stimulaci TNF-a jsme nadměrně exprimovali MG53 v HKC-8 buňkách buď prostřednictvím DOX-dependentní virové transdukce Ad-tPA-MG53 nebo prostřednictvím ošetření rekombinantním lidským MG53 (rhMG53). Pomocí MG53-specifické monoklonální protilátky byla po indukci závislé na DOX imunoblotem detekována MG53. MG53 byl přítomen ve velmi vysoké hladině v buňkách HKC-8 transdukovaných Ad-tPA-MG53,

ekvivalent 1 ng rhMG53/mg buněčného lyzátu. Naproti tomu HKC-8 absorboval a exprimoval mnohem menší množství rhMG53 (obrázek 5a). Příjem FL fluorescenčně značeného rhMG53 pomocí HKC -8 byl potvrzen konfokální mikroskopií (doplňkový obrázek S3). Po ošetření TNF-a byl čas k dosažení vrcholu aktivace p65 15 až 30 minut (obrázek 5b). Za bazálních podmínek se NF-kB p65 nacházel hlavně v cytosolu a nadměrná exprese MG53 to nezměnila (obrázek 5c a d). Po stimulaci TNF-a se však p65 translokoval do jader v buňkách HKC-8, které nadměrně neexprimují MG53. Pro srovnání, jaderná translokace p65 klesla o 33 procent (buňky, kterým byl podáván rhMG53) na 50 procent (transdukované buňky, kterým byl podáván DOX) v buňkách nadměrně exprimujících MG53 (obrázek 5c a d).

Adoptivní přenos upravených buněk RAW do modelu UUOmouse byl proveden s 1 - 106 buňkami podanými injekcí do ocasní žíly bezprostředně po operaci UUO. Myši byly náhodně rozděleny do skupiny, která dostávala normální pitnou vodu (-DOX) a skupiny, která dostávala DOX (2 mg/ml) v pitné vodě. Myši UUO dostávaly RAW každý další den celkem 4 injekce. Ledviny byly odebrány 7 dní po operaci.

Myši s infuzí upraveného RAW následované indukcí DOX vykazovaly významně sníženou (o 30 procent) fibrózu ledvin ve srovnání s těmi, které nedostaly žádné buňky nebo ty, kterým byly podány infuze upravené RAW buňky, ale bez indukce Dox (66 procent fibrotická oblast; obrázek 6a a b).

Pouze malá populace RAW/Ad-tPA-MG53 přežila sledování retikuloendoteliálního systému do konce experimentů. Imunohistochemické barvení potvrdilo, že expresi MG53 zprostředkovanou RAW v ledvinách vyvolala léčba DOX (obrázek 6c). Je zajímavé, že ledviny UUO od myší s infuzí RAW a MG53 indukované DOX vykazovaly nižší poměr p-65/t-p65 (asi o 40 procent) než ty, které buď nedostaly RAW, nebo ty, kterým byl RAW podáván bez DOX (obrázek 6d a e). Snížená hladina p-p65 byla potvrzena imunohistochemickým barvením UUO ledvin p-p65 (S536) (obrázek 6f). Domníváme se, že cirkulující MG53 dodávaný pomocí Raw/Ad-tPA-MG53/þDOX a absorpce buňkami proximálního tubulu ledvin by se mohly podílet na snížení p-p65 (S536) a snížení zánětu ledvin UUO. Ve srovnání s ledvinami obsahujícími pouze UUO byla exprese TGF-b1, PAI- 1 a Col1a1 významně zvýšena v ledvinách UUO od myší s infuzí RAW bez DOX (bez indukce MG53). Zvýšení těchto profibrotických genů by mohlo být připsáno indukci silné reakce aloštěpu z buněk infundovaných do imunokompetentních myší. Ledviny UUO od myší, kterým byl podán infuzí RAW a kterým byl podáván DOX (indukce MG53), však vykazovaly významně nižší (60 až 72 procent snížení) PAI-1 a relativně nižší hladiny TGF-b1 a Col1a1 než myši bez léčby DOX (obrázek 6g).

Systémové podávání rhMG53 zmírňuje aktivaci NF-kB a rozvoj fibrózy u myší vystavených UUO

Testovali jsme, zda rhMG53 vykazuje podobný antifibrotický účinek jako dříve popsaná umělá buněčná terapie RAW. Naše dřívější farmakokinetická data naznačovala krátký poločas v oběhu (asi 90 minut u hlodavců) rhMG53.42 Myši tolerovaly chronické podávání 2 až 6 mg/kg

rhMG5326,37 jamky, takže byla použita strategie podávání ukázaná na obrázku 7a. Myším UUO bylo náhodně podáváno buď vehikulum (fyziologický roztok) nebo rhMG53 (2 mg/kg) denně po dobu prvních 7 dnů po operaci a poté každý druhý den, dokud nebyly 12. den usmrceny. Falešné a kontralaterální ledviny vykazovaly zhruba ekvivalentní t-p65 a hladiny exprese fibronektinu, s hladinami p-p65 mírně zvýšenými v kontralaterálních ledvinách ve srovnání s falešnými ledvinami. Po UUO se ledvinový t-p65 zvýšil. Ve srovnání se zvířaty léčenými fyziologickým roztokem byl poměr p-65/t-p65 v ledvinách UUO zvířat léčených rhMG{18}}snížen asi o 37 procent, zatímco IkBa se zvýšil asi o 27 procent (obrázek 7b a C). Navíc se fibronektin snížil asi o 33 procent (obrázek 7b a c). Imunohistochemie potvrdila přítomnost rhMG53 v ledvinách UUO po léčbě (obrázek 7d). Celková fibróza byla snížena v ledvinách UUO léčených rhMG53- (obrázek 7e). Nicméně RNA exprese TGF-b1, PAI-1 a Col1a1 byla podobná u myší léčených buď fyziologickým roztokem nebo rhMG53 (obrázek 7f).

cistanche je účinný při léčbě dysfunkce ledvin

DISKUSE

MG53 je protein TRIM obohacený svalstvem, který byl původně identifikován jako prominentní součást mechanismu pro opravu plazmatické membrány. myokin.32 Již dříve jsme ukázali, že MG53 může kontrolovat zánět během poškození tkáně ve vzdálených orgánech.27,29,33,35–37 Tento výzkum rozšiřuje rozsah MG53-zprostředkované orgánové ochrany na ledviny. Došli jsme k závěru, že MG53 může zmírnit intrarenální zánět a fibrózu ledvin blokováním cytokiny indukované aktivace prozánětlivého a profibrotického transkripčního faktoru NF-kB. Tento závěr je založen na následujících pozorováních: (i) genetická delece MG53 u normálních myší.

vedlo k poklesu funkce ledvin, jak myši stárly, což bylo doprovázeno zvýšením fibrózy ledvin a infiltrací ledvin leukocyty a makrofágy; (ii) v modelu poškození ledvin UUO myší vykazovaly ucpané ledviny MG53-deficientních myší více fibrózy a zánětu než myši s MG53-replecí; (iii) produkce TNF-a a interleukinu-6} buňkami proximálního tubulárního epitelu ošetřenými LPS byla oslabena v přítomnosti MG53; (iv) léčba nebo nadměrná exprese MG53 v proximální tubulární epiteliální buněčné linii snížila TNFa-indukovanou aktivaci NF-kB blokováním jaderné translokace složky p65 z-kB (zjistilo se, že MG53 se váže přímo na p65, i když slabě); a (v) fosforylace p65, nezbytný krok v aktivaci NF-kB, byla snížena v ucpaných ledvinách UUO myší léčených rekombinantním MG53 indukovaným k nadměrné expresi MG53 v makrofázích. Dále, inhibitor aktivace NF-kB, IkBa, byl zvýšen v ucpaných ledvinách UUO myší, kterým byl injikován rekombinantní MG53.

Genetická delece MG53 u normálních myší byla přípustná pro nepříznivé účinky stárnutí na ledviny. To naznačuje, že přítomnost endogenního MG53 poskytuje základní úroveň ochrany během stárnutí. Podobně ztráta endogenního MG53 zhoršila AKI v důsledku obstrukce. Ledvina UUO akumulovala MG53, pravděpodobně odrážející vzdálenou myokinovou aktivitu z kosterního svalstva. Zůstává nejasné, jak může být sval MG53 přiveden do ledviny během poranění; u poškozené ledviny se však často vyvine hypoxie a podléhá oxidativnímu stresu,^44,45signály, které by mohly sloužit k náboru MG53. Pokud ano, tato osa „sval-ledvina-imunitní buňka“ by mohla být využita ke zmírnění poškození ledvin.46 Alternativně ledvinové buňky exprimují nízké hladiny MG53 na začátku,²⁶a během akutního nebo chronického poranění může být produkce MG53 upregulována.

NF-kB je významným transkripčním hybatelem zánětu a fibrózy při poškození ledvin a stárnutí.^14,17,47,48Byli jsme vyzváni, abychom prozkoumali, zda by účinky MG53 mohly být zprostředkovány prostřednictvím NF-kB, protože přítomnost MG53 v jaderném kompartmentu ledvinových homogenátů naznačovala potenciál pro transkripční interferenci. Jaderná lokalizace MG53 není bez precedentu. V transgenním modelu nadměrně exprimujícím myokardiální MG53 nukleární MG53 reguloval expresi peroxisomového proliferátorem aktivovaného receptoru-alfa na transkripční úrovni a ovlivnil metabolismus srdečních lipidů.49 Kromě toho jsme nedávno prokázali, že rhMG53 potlačuje aktivaci NF-kB ke zmírnění srdečního selhání souvisejícího s věkem snížením prozánětlivých cytokinů, apoptózy a oxidačního stresu ve starých kardiomyocytech.³⁷

Molekulární mechanismus toho, jak MG53 moduluje jadernou/cytoplazmatickou mobilizaci p65, zůstává nejasný. MG53 neobsahuje žádný jaderný lokalizační signál, ale obsahuje 3 domnělé N-koncové jaderné exportní signály bohaté na leucin, motiv rozpoznávaný exportinem jaderného exportního proteinu.⁵⁰Přímá interakce mezi MG53 a p65 byla spíše slabá jako jediný nebo hlavní rušivý účinek MG53 na aktivaci NF-kB. Ačkoli se zdá, že MG53 ovlivňuje dynamické nukleocytoplazmatické převádění kritických složek NF-kB, přesné mechanismy je třeba ještě určit.

Zdá se, že kritickým výsledkem MG53-zprostředkované renoprotekce je snížení fibrotické remodelace prostřednictvím zmírnění zánětu zprostředkovaného NF-kB. Fibróza ledvin je komplexní proces zahrnující patologické ukládání různých ECM proteinů.51 Zdá se, že MG53 má jasné účinky na ECM protein fibronektin. Fibronektin se zvýšil u UUO ledvin s deficitem MG53 a snížil se u UUO myší léčených MG53. Exprese jiných ECM proteinů v přítomnosti a nepřítomnosti MG53 je obtížnější pochopit. Již dříve jsme ve studii in vitro prokázali, že rhMG53 negativně reguluje signalizaci TGF-b1/Smad a potlačuje syntézu ECM proteinů.31 In vivo transkripty TGF b1, PAI-1 a Col1a1 se nezvýšily v ledvinách UUO z mg53 / deficitní zvířata. Tyto transkripty se snížily u zvířat UUO indukovaných k nadměrné expresi MG53 podáním virově indukované myši

makrofágy, ale když byl podán rekombinantní MG53, nebyl pozorován žádný účinek. To může být jednoduše případ dostatečného dávkování, protože dosažené intrarenální hladiny MG53 byly mnohem vyšší u zvířat, kterým byl podáván makrofágový vektor, na rozdíl od rekombinantního MG53. Kromě toho nebyly měřeny hladiny proteinů a post-transkripční události mohly modifikovat ECM v UUO. K objasnění vznikající role MG53 při modulaci specifických ECM proteinů je zapotřebí dalšího výzkumu. Závěrem lze říci, že tato studie prokázala, že myokin může pomoci regulovat základní zánět ve vzdáleném orgánu, jako je ledvina, a v případě poškození ledvin může pomoci zmírnit a kontrolovat zánět. Obrázek 8 představuje pracovní model úlohy MG53 v renoprotekci. Během stimulace molekulárních vzorů spojených s poškozením (DAMP, jako je TNF-a) a molekulárních vzorů spojených s patogenem (PAMP, jako je LPS) a ischemického stresu se v ledvinách aktivuje NF-kB signalozom. MG53 chrání ledviny inhibicí fosforylace a aktivace signalizace NF-kB, stabilizací IkBa a snížením jaderné mobilizace p65, blokováním aktivace prozánětlivých programů. Ačkoli endogenní MG53 může zprostředkovat tyto účinky, navrhujeme, aby byla poskytnuta robustnější ochrana pomocí MG53 terapeuticky, což je proveditelné na základě schopnosti exogenního MG53 redukovat poranění při UUO. Je třeba provést další výzkum, abychom pochopili, jak může být tento myokin klinicky využíván.

přínos cistanche: chrání játra a působí proti fibróze

ZVEŘEJNĚNÍ

JM má majetkový podíl ve společnosti TRIM-edicine, Inc., která vyvíjí rhMG53 pro léčbu lidských onemocnění. Patenty na použití MG53 vlastní Rutgers University a The Ohio State University. Všichni ostatní autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.

PODĚKOVÁNÍ

Tuto práci podpořily National Institutes of Health (NIH) R01-DK106394 (JM, BHR a P-HL) a NIH R01-AG062896 (P-HL a BHR). Tento projekt byl také částečně podpořen intramuralLockwood fondem The Ohio State University (P-HL) a cenou od National Center for Advancing Translational Sciences (NCATS; P-HL, číslo ocenění UL1TR002733). Za obsah zodpovídají výhradně autoři a nemusí nutně představovat oficiální názory NCATS nebo NIH.

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKYHL,

PD, P-HL, JM a BHR koncipovali a/nebo navrhli studie; HL, PD, P-HL, ZL a XZ provedli experimenty, získali data a provedli analýzu dat; PD, P-HL a BHR interpretovaly výsledky; a P-HL a BHR vypracovaly, zrevidovaly a schválily rukopis. Všichni autoři přečetli a schválili konečnou verzi.

DOPLŇKOVÝ MATERIÁL

Doplňkový soubor (PDF) Doplňkové metody.

Tabulka S1.Sekvence primerů. Obrázek S1. mg53-/- myši vykazují zvýšenou depozici proteinu ECM. Věkové (10 měsíce staré) divokého typu (WT) a mg53-/- ledvinové tkáně byly obarveny 40 6-diamidino-2-fenylindolem (DAPI; modrá, levé panely), a- aktin hladkého svalstva (SMA; zelená, druhé panely), fibronektin (červený, třetí panely) a sloučený (pravé panely). Tyč ¼ 25 mm. Kvantifikace oblasti renální fibrózy (n ¼ 3 na skupinu). Data jsou prezentována jako průměr -SD. Studentův t-test. ***P <>

Obrázek S2.Distribuce kosterního svalstva MG53 mezi jádrem a cytoplazmou. Kosterní sval odvozený od divokého typu (WT) ormg53-/- myší byl frakcionován a imunoblotován s na zakázku vyrobenou anti-MG53 protilátkou (3 mg lyzáty) a markery buněčného kompartmentu (20 mg lyzáty). Adenosintrifosfatázy sodno-draselné se používají jako marker buněčné membrány, histon H3 jako jaderný marker a tubulin jako cytosolový marker.

Obrázek S3.Buňky proximálního tubulu ledvin HKC-8 specificky vychytávají rhMG53 značený AlexaFluor 647. rhMG53 (Trimedicine) a bovinní sérový albumin (BSA; ThermoFisher Scientific) byly označeny soupravami Alexa Fluor(AF) Antibody Labeling kits (Life Technologies) podle protokolu výrobce. Buňky HKC-8 byly kultivovány na misce se skleněným dnem Delta TPG (Bioptechs Inc.) v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (DMEM) s 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS) v přítomnosti značených proteinů, BSA-AF647 (vlevo ) a rhMG53-AF647 (vpravo) po dobu 24 hodin. Snímky Z-stack byly pořízeny konfokálním mikroskopem LSM780 (Zeiss). Obrázky ukazují buňky na dně misek. Tyč ¼ 25 mm.

Obrázek S4.Konstrukce buněk RAW pro zprostředkování indukovatelné sekrece MG53. (A) RAW buňky byly infikovány Ad-tPA-MG53 po dobu 24 hodin a ošetřeny bez (doxycyklin [Dox]) nebo s Dox (þDox, 1 mg/ml) po dobu dalších 24 hodin pro indukci exprese tPA-MG53. Konfokální snímky ukázaly indukci exprese MG53 (protilátka anti-MG53 vyrobená na zakázku, červená, spodní panely) z buněk RAW podobných makrofágům (barvení F4/80, zelené, horní panely). Tyče ¼ 25 mm. (B, C) Western blot analýza buněčných lyzátů (v množství 0,6, 3 a 6 mg) pro indukovanou expresi tPA-MG53 a MG53 z infikovaných RAW buněk (B) a odpovídající kultury koncentráty médií (v objemech 2, 5 a 10}ml) (C). Jako standardy byla zavedena různá množství rhMG53 (v množství 0,2, 1, 0,05 a 0,025 ng). Mw, markery molekulové hmotnosti.