Věkově citlivá účinnost omezení kalorií na mitochondriální biogenezi a poškození MtDNA v játrech krys 2

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

2.4.Vliv stáří a CR na obsah a poškození mtDNA

Protože mitochondriální dynamika úzce souvisí s udržováním mtDNA [16,18], stanovili jsme obsah mtDNA u všech potkanů ​​pomocí kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) (obrázek 8).

S věkem související pokles obsahu mtDNA byl zjištěn u AL-28(-27 procent) a AL-32 potkanů ​​(-23 procent) ve srovnání s AL{{ 5}} zvířat, zatímco mezi skupinami AL-28 a AL-32 nebyl přítomen žádný statistický rozdíl. CR byla velmi účinná v prevenci poklesu obsahu mtDNA souvisejícím s věkem pouze ve 28. měsíci, což vedlo ke zvýšení (plus 19 procent) hodnoty ve skupině CR-28 ve srovnání s protějškem srovnatelným s věkem krmeným AL. Kromě toho nebyl žádný statistický rozdíl mezi hodnotou AL-18 a hodnotou skupiny CR-28. Jak je vidět u jiných markerů v této práci, CR nebyla tak účinná po 32 měsících, protože nebyl žádný rozdíl mezi hodnotou AL-32 a hodnotou CR-32 protějšku. Abychom prohloubili analýzu na úrovni poškození mtDNA, změřili jsme relativní obsah 4,8 Kb "běžné delece" pomocí qPCR (obrázek 9).

Ve všech testovaných skupinách nebyly zjištěny žádné významné změny s věkem ani s CR v relativním obsahu 4,8 Kb delece.

Nakonec jsme provedli screening tří specifických oblastí mtDNA na výskyt oxidovaných purinů, zejména 8-oxo-deoxyguanosinu (8-oxidu), pomocí enzymu formamidopyrimidin DNA glykosylázy (Fpg) citlivého na oxidované puriny. Tyto tři oblasti zahrnovaly vytěsňovací smyčku (D-loop), počátek replikace světelného vlákna (Ori-L) a části obou NADH dehydrogenázových (ND) podjednotek 1 a 2 (ND1/ND2)( Obrázek 10).

Kliknutím sem se dozvíte více

Jak je znázorněno na obrázku 10, procento výskytu 8-oxidů bylo významně odlišné mezi skupinami potkanů ​​v každé analyzované oblasti, i když s podobným vzorem. Postdoc test odhalil význam snížené přítomnosti 8-oxidu u CR-28 potkanů ​​ve srovnání s AL-18 i AL-28 skupinami ({{7} } procent CR-28 vs. AL-18 a -43 procent CR-28 vs. AL-28 v D-smyčce; -48 procent CR -28 vs. AL-18a-49 procent CR-28vs.Cistanche Extract Anti RadiationAL-28 na Ori-L; -54 procent CR-28 vs. AL-18 a -56 procent CR-28 vs. AL{{ 7}} na ND1/ND2).CR se ukázal jako účinný při prevenci oxidačního poškození mtDNA po dobu až 28 měsíců, zatímco výskyt stejného poškození se mezi AL-32 a CR nelišil-32 krysy. Oxidované puriny byly detekovány již u AL-18 potkanů, aniž by se projevil nárůst počtu AL-28 zvířat související s věkem. Srovnání mezi skupinou AL-32 a skupinou CR-32 neukázalo významný rozdíl. Vzhledem k hodnotám konkrétní oblasti je zajímavé zdůraznit, že výskyt D-smyčky byl nejvyšší mezi hodnotami z testovaných oblastí v každé skupině, což podporuje předchozí zjištění, která naznačují, že tato oblast je hotspot pro oxidační poškození [17, {{ 20}}].

Obrázek 10. Incidence poškození oxidovaných purinů v oblastech D-loop, Ori-L a ND1/ND2 mtDNA v játrech z AL-18, AL-28, CR-28, AL -32 a CR-32-měsíční krysy. (A). Sloupce představují data získaná ze dvou nezávislých experimentů provedených v triplikátech a analyzovaných pomocí jednocestného testu ANOVA a Tukeyho testu vícenásobného srovnání. V grafickém znázornění byla data normalizována vůči hodnotě AL-18 potkanů, fixována jako 1 a zobrazena jako střední hodnota a SD.*p<0.05 versus=""><0.05versus al-28="" rats.n:="" number="" of="" analyzed="" animals.="" (a)d-loop;(b)ori-l;(c)="" nd1/nd2.(b).representative="" gel="" of="" formamidopyrimidine="" dna="" glycosylase="" (fpg)-treated="" and="" untreated="" total="" dna="" from="" one="" cr-28="" and="" one="" al-28="" rat;="" 5="" ng="" total="" dna="" were="" amplified="" using="" the="" d-loop="" primers.="">cistanche herbaAlikvot každé PCR amplifikace byl nanesen na agarózový ethidium bromidem obarvený gel a analyzován na intenzity pásů.

Všechna zjištěná zjištění o účinnosti CR ve věkově odpovídajících skupinách jsou shrnuta v tabulce 1.

3. Diskuse

Při dlouhodobém hledání přístupů schopných čelit progresivnímu poklesu stárnutí nabyla CR prvořadou důležitost díky svým pozitivním účinkům, které byly hlášeny u široké řady organismů od kvasinek po člověka [22]. Bylo prokázáno, že CR ovlivňuje velké množství molekulárních drah. Některé z nich jsou zvláště účinné při modulaci mitochondriální biogeneze a aktivity, jako ty, které snímají hladiny živin a/nebo energie, jako je AMP-dependentní kináza (AMPK) a sirtuiny, ve kterých všechny spolupracují s CR-indukovaným přeprogramováním mitochondriálních buněk. metabolismus [23]. Zlepšením oxidačního metabolismu CR snižuje mitochondriální produkci ROS a molekulární poškození vyvolaná nárůstem těchto reaktivních druhů souvisejícím s věkem [8-10]. Ačkoli několik studií zkoumalo účinky CR na mitochondriální úrovni [3,13-15,24], komplexní práce o účincích této nutriční intervence na organely stále chybí. Proto se tato studie snažila otestovat existenci hranic účinnosti CRs ve velkém souboru mitochondriálních markerů. Konkrétně jsme se zaměřili na srovnání mezi účinky vyvolanými tímto dietním režimem u starých (28-měsíčních) a extrémně starých (32-měsíčních) potkanů, abychom ověřili, zda existuje souhra mezi CR a postup stárnutí. Analýza výsledků odhalila komplexní obraz účinnosti CR na mitochondriální biogenezi a poškození mtDNA, který je shrnut v tabulce 1.

Cistanche může proti stárnutí

3.1. Mitochondriální markery u 28-měsíčních potkanů

Velký počet mitochondriálních markerů byl pozitivně ovlivněn CR u 28-měsíčních potkanů. Konkrétně byly hlášeny s věkem související poklesy v aktivitě citrátsyntázy, v množství proteinů TFAM, MFN2 a DRP1 a v obsahu mtDNA ve srovnání s AL-18 kontrolní skupinou s AL-28. . Všem takovým změnám zabránila CR u 28-měsíčních potkanů ​​(CR-28). Tyto výsledky podporují anti-aging efekt CR do tohoto věku v játrech potkana. Podobně pokles výskytu oxidovaných purinů ve všech třech testovaných oblastech mtDNA, indukovaný CR, tento názor dále posiluje. Je třeba poznamenat, že toto oxidační poškození bylo již přítomno u AL-18 zvířat, přičemž u AL-28 potkanů ​​nedošlo k žádnému nárůstu souvisejícímu s věkem, což naznačuje, že jeho vzhled může být identifikován jako časný marker stárnutí. Zvláštní pozornost je třeba věnovat pěti mitochondriálním markerům, které nebyly ovlivněny CR u 28-měsíčních potkanů, konkrétně množství proteinu LonP1. Cvt c, OGGl a APE1 a 4,8 Kb obsah delece. Ve skutečnosti, stejně jako u LonP1 a Cyt c, CR nezabránila poklesu souvisejícímu s věkem zjištěnému u AL-28 zvířat, zatímco množství proteinu OGG1 a APE1, stejně jako obsah 4,8 kb delece, nebyly ovlivněna věkem ani ČR. LonP1 je zodpovědný za degradaci vyčerpaného TFAM [25-27] a bylo hlášeno, že klesá se stárnutím [28] v játrech potkanů ​​[29] až do věku 27 měsíců. Již dříve jsme navrhli, že taková stárnutím snížená exprese LonP1 [16] by mohla souviset s jeho aktivitou při odstraňování TFAM nenavázaného na mtDNA [26]. Jako možné vysvětlení neúčinnosti CR zabránit poklesu exprese LonP1 souvisejícímu s věkem, navzdory obnovené expresi TFAM a vazbě TFAM na oblasti specifické pro mtDNA (současná data a Picca et al. [15]), je CR -zprostředkovaná aktivace Sirt3 [30], která mohla ovlivnit také množství proteinu LonP1 prostřednictvím indukované deacetylace. Pro vysvětlení neúčinnosti CR v prevenci poklesu množství Cyt c souvisejícím s věkem lze navrhnout jinou hypotézu. Tento protein je hlavním spouštěčem mitochondriální apoptotické dráhy prostřednictvím jeho uvolňování do cytosolu, takže jeho snížené intramitochondriální množství u AL-28 potkanů ​​vzhledem k AL-18 hodnotě indikovalo zvýšení vnitřní apoptotický proces se stárnutím [16,31]. Kromě toho, stejně jako u LonP1, množství Cyt c u CR-28 potkanů ​​bylo stále významně nižší než hodnota u AL-18 zvířat, což naznačuje, že CR podstatně neovlivnila konečnou regulaci exprese Cytc /uvolnění do cytosolu a pravděpodobně ani s věkem související zvýšení mitochondriální apoptotické dráhy. To je v souladu s dříve uváděnou podporou apoptózy zprostředkované CR [23].cistanche růst penisuProtože apoptotická dráha může být spuštěna také akumulací poškození DNA [32,33], stanovili jsme proteinovou expresi dvou hlavních mitochondriálních BER enzymů, a to OGG1 a APE1. Množství bílkovin u obou nebylo ovlivněno stárnutím a CR přecházejícím od 18. do 28. měsíce věku. Možným vysvětlením je, že exprese dvou BER enzymů již byla zvýšená a dostatečná u AL-18 potkanů, aby působila proti zvýšenému poškození mtDNA souvisejícím s věkem. Bylo skutečně hlášeno zvýšení aktivity mitochondriálního OGG1 [34,35] a mitochondriálního APE1[36] související s věkem v játrech hlodavců přecházejících z 3-6-měsíců starých zvířat na 20-23-měsíc - staré, pravděpodobně indukované k účinnému potlačení nárůstu poškození mtDNA souvisejícího s věkem. To vše dále podporuje naši hypotézu, že poškození mtDNA, opravené OGG1 a APE1, se objevilo velmi brzy v životě hlodavců (bylo již přítomno u AL-18 potkanů) a indukovalo prostřednictvím retrográdní komunikace mitochondrie-nucleus, časné zvýšení exprese enzymů BER. Pokud jde o absenci účinku CR na OGG1 a APE1, navrhujeme, že CR-snížená přítomnost ROS a související oxidační poškození byla účinně potlačena expresí obou enzymů, která se neliší od exprese AL-zvířat stejného věku. Pokud jde o obsah delece 4,8 kb, nedošlo k žádnému nárůstu souvisejícímu s věkem přecházejícím z AL-18 zvířat na AL-28, jako by se také toto poškození mtDNA objevilo poměrně brzy v životě krys a jejich věku - související zvýšení bylo možné ověřit pouze ve srovnání s mladými zvířaty, jak uvádí jiné studie [19,37-39]. Neúčinnost CR významně snížit obsah 4,8 kb delece u CR-28 potkanů ​​ve srovnání s AL-28 a AL-18 zvířaty dále ukazuje, že dlouhodobá CR vyvolala výrazné snížení přítomnosti ROSin v játrech. To mohlo vést k určité úrovni ustáleného stavu delece 4,8 Kb, která se neliší od úrovně AL-18 protějšku a je kompatibilní s příslušným obsahem mtDNA. Ačkoli oprava mtDNA nebyla stárnutím snížena, pokles obsahu mtDNA související s věkem byl stále přítomen při přechodu z AL-18 potkanů ​​na AL-28, jak bylo dříve popsáno v různých tkáních staří hlodavci [3,15,19,39-42]. To lze vysvětlit zvýšenou vazbou TFAM související s věkem ve specifických oblastech mtDNA, které byly také poškozenými hotspoty [19]. Tato hypotéza by tak uváděla do souladu ztrátu mtDNA související s věkem s nezměněnou expresí a aktivitou opravných enzymů. Další podporou této hypotézy je absence ztráty mtDNA u CR-28 potkanů. Již dříve jsme prokázali, že CR zabránila nárůstu vazby TFAM ve specifických oblastech mtDNA souvisejícímu s věkem [15]. Proto podle současných a našich předchozích dat může modulace vazby TFAM patřit mezi molekulární mechanismy, které se podílejí na regulaci mitochondriální biogeneze zprostředkované stárnutím a CR. Ukázalo se také, že tato regulace stárnutím a CR je sledována prostřednictvím rovnováhy dynamiky mitochondrií, která je ovlivněna stárnutím [43] a vede k převaze fúze nad štěpením [44,45]. Proto jsme vypočítali fúzní index (FI) u všech testovaných zvířat (obrázek 6) a našli hodnoty, které potvrdily a rozšířily naše předchozí výsledky [16].výhody cistanche salsyTato studie může shromáždit některé nové náznaky, konkrétně u AL-18krys pokrývaly hodnoty FI malé rozmezí, zatímco u AL-28 bylo rozmezí FI mnohem větší, s výrazným věkem podmíněný nárůst jednotlivých hodnot, u potkanů ​​ČR-28 malé rozpětí hodnot naznačovalo pozitivní vliv ČR na indukci štěpení, s generalizovaným zvýšením individuálních množství DRP1 ve srovnání s těmi z ČR AL-28 skupina. Zatímco účinné štěpení by mohlo odstranit poškozené organely, podobná fúze entity by mohla zajistit difúzi poškozených makromolekul v mitochondriální síti, a tak zředit jejich negativní účinky [46]. CR zprostředkovaná obnova jemně vyladěné rovnováhy mitochondriální dynamiky by proto mohla vyvolat pozitivní důsledky na modulaci mitochondriální biogeneze, působící synergicky s retrográdní komunikací poškození mtDNA. To je v souladu s existující literaturou, která uvádí, že stav živin a metabolické změny mohou modulovat rovnováhu mitochondriální dynamiky [47], a tak ovlivnit i biogenezi organel. Zejména regulace mitochondriální biogeneze citlivá na ROS může čelit pouze omezenému zvýšení ROS prostřednictvím zvýšení počtu organel [48] a přítomnost ROS se sníženou CR [15] by mohla zabránit překonání prahové úrovně, která by mohla vést k mitochondriální ztrátě. Účinnost CR při snižování přítomnosti ROS byla v této studii prokázána sníženou akumulací oxidovaných purinů v oblastech analyzovaných mtDNA u CR-28 potkanů, což podporuje celkové zlepšení mitochondriálního metabolismu, schopného působit proti věku - související pokles. Přítomnost ROS se sníženou CR byla skutečně široce prokázána také na úrovni mitochondriálních proteinů a lipidů. Zejména bylo prokázáno, že CR snižuje oxidační modifikace mitochondriálních proteinů v srdcích potkanů ​​|49] a modifikuje index saturace/nenasycení v mitochondriálních membránách, čímž zabraňuje oxidativnímu poškození a udržuje fluiditu membrány [8]. Dále bylo prokázáno, že CR snižuje produkci ROS mitochondriálními respiračními komplexy jak v myším kosterním svalu, tak v játrech [8]. Mezi příznivé účinky CR na úrovni ROS patří také zlepšená neutralizace ROS a zvýšená oprava molekul poškozených ROS [10]. Kromě tohoto efektu jsou změny v mitochondriální funkčnosti modulovány aktivací CR-senzitivních AMPK a sirtuinů, které regulují aktivitu transkripčních faktorů peroxisomovým proliferátorem aktivovaný receptor gama koaktivátor 1-alfa (PGC-1). ), a forkhead box (FoxO), přičemž druhý se podílí na biogenezi, oxidativním metabolismu a přeměně mitochondrií [23]. Pozitivní vliv CR zprostředkovaný na mitochondriální metabolismus by tedy měl interagovat s jinými cestami k modulaci konečného spouštěče mitochondriální biogeneze, podle modelu retrográdní komunikace do jádra [50].

3.2.Mitochondriální markery u 32-měsíčních potkanů

Pokud jde o srovnání mezi potkany AL-32 a CR-32, naše údaje ukazují obecnou absenci významných rozdílů. To může naznačovat věkové omezení účinnosti CR v boji proti poklesu souvisejícímu s věkem při přechodu z 28 na 32 měsíců. S ohledem na věkový efekt však lze v závislosti na analyzovaném markeru vyvodit různé závěry. Ve skutečnosti v obou 32-měsíčních skupinách se věkem podmíněný pokles aktivity citrátsyntázy, množství TFAM, LonP1, OGG1, APE1, obsahu mtDNA a delece 4,8 Kb udržoval na úrovni který byl podobný tomu, který byl pozorován u AL-28 potkanů, nebo tomu bylo částečně/zcela zabráněno, jako u množství Cyt c, MFN2, DRP1 a výskytu oxidovaných purinů ve specifických oblastech mtDNA. Tato různá chování mohou být pravděpodobně způsobena souhrou různých cest zahrnujících analyzované markery. Další závěr lze zdůraznit porovnáním 32-měsíců starých skupin s AL-18 a AL-28 pro částky MFN2 a DRP1. Ve skutečnosti nebyl pokles související s věkem přítomen přechod ze skupiny AL-18 do skupin AL-32 a CR-32 pro dva dynamické proteiny. Vzhledem k tomu, že ve srovnání mezi skupinou AL-18 a oběma 32-měsíci starými, stejně jako u ostatních markerů, došlo k poklesu souvisejícímu s věkem podobné nebo menší velikosti než mezi AL{{ 30}} a AL-28 skupiny, můžeme vyvodit určité důsledky. To může naznačovat, že změny markerů související s věkem mohly začít nebo byly přítomny již v 18 měsících a poté dosáhly své nejnižší/nejvyšší hodnoty u starých,28-měsíců starých zvířat „tempem“, které je typické pro proces stárnutí. Naopak u extrémně starých zvířat (32-měsíčních) se zdálo, že se „tempo“ procesu zpomalilo, protože hodnoty byly nižší nebo rovné hodnotám protějšků AL-18, ale ne nižší /vyšší než ty z AL-28, byly nalezeny, i když uplynulo delší časové rozpětí. Hypotéza dvou různých temp v procesu stárnutí [16] implikuje, že poškození z různých příčin začínají ovlivňovat fyzické a metabolické aktivity během dospělosti u každého potkana. Taková poškození jsou účinně potlačována kompenzačními mechanismy a poškození se neprojevují otevřeně, což se shoduje se stabilním „středním“ věkem charakterizovaným úspěšnou homeostázou. V této studii jsme identifikovali jako "rychle" stárnoucí krysy, u kterých se rovnováha mezi intervenujícími poškozeními a kompenzačními mechanismy začne později v životě vytrácet.cistanche tubulosa dávkování redditU těchto zvířat, která tvoří větší část skupiny AL-28, poškození překračují práh kompatibilní s běžnými aktivitami a dochází ke změně stavu. Naopak zbývající menší část zkoumané stárnoucí populace si udržuje homeostatickou rovnováhu mezi poškozením a opravou delší dobu a tvoří skupinu zvířat stárnoucích „pomalu“, včetně AL-32 i ČR{{2} } krysy. Podobná hypotéza o různém tempu stárnutí byla nedávno navržena také pro člověka [51]. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že extrémně stará zvířata mohla dosáhnout dlouhověkosti, aniž by byla významně ovlivněna CR a pravděpodobně kvůli genetické predispozici lépe se vyrovnat s mitochondriální dysfunkcí související s věkem, ale taková hypotéza vyžaduje budoucí výzkum. Tyto nové poznatky mohou dát odpověď na původní a zásadní otázku o existenci limitů účinnosti CR, kterou nastolili Ingram a de Cabo ve své velmi hluboké studii na toto téma l52l, umožňující identifikaci těchto limitů s věkem 28 měsíců pro krysí játra. Nicméně závěr, že CR nebo jakákoli dieta nevyvolaly příznivé důsledky u potkanů ​​přirozeně predisponovaných k dlouhověkosti, by neměl ovlivnit celkovou důvěru v účinnost této nutriční intervence. Ve skutečnosti byla CR stále schopna zprostředkovat příznivé účinky, protože byla schopna zabránit většině věkem souvisejících změn mitochondriální biogeneze a poškození mtDNA v játrech 28-měsíčních potkanů. To dále potvrzuje CR jako dobře podloženou strategii, jak účinně čelit poklesu stárnutí v obecné populaci.

4. Materiály a metody

4.1.Zvířata

Studie byla schválena Institutional Animal Care and Use Committee na Floridské univerzitě. Všechny postupy byly provedeny v souladu s pokyny National Institute of Health (NIH) pro péči a použití laboratorních zvířat. Vzorky jater pocházely od samců potkanů ​​Fischer 344× Brown Norway (F344BNF1) získaných z kolonie National Institute of Aging Colony (Indianapolis, IN, USA) a umístěných jednotlivě při teplotě (20 plus /-2 stupňů) a světle. kontrolované prostředí (12-h cyklus světlo/tma) s běžnou potravou pro krysy a vodou dostupnou ad libitum na Katedře stárnutí a geriatrického výzkumu, Divize biologie stárnutí, College of Medicine, University of Florida, Gainesville, FL( USA). Omezení kalorií bylo zahájeno ve věku 3,5 měsíce (10% omezení), zvýšeno na 25% omezení ve 3,75 měsících a udržováno na 40% omezení od 4 měsíců do konce života každého zvířete, což je 28 měsíců (CR{ {17}}) nebo 32 měsíců (CR-32) věku. Zvířatům s omezeným příjmem kalorií byla podávána strava obohacená NIH31-NIA, aby se zajistilo, že nebudou podvyživená, zatímco zvířata krmená ad libitum dostávala krysí dietu NIH31. Zvířata se skládala z následujících skupin: 18-měsíční krmení ad libitum (AL-18, n=6),28-měsíční krmení ad libitum (AL -28, n=6),28-měsíc stará reklama s omezením kalorií (CR-28, n=6), 32-měsíc stará reklama libitum krmených (AL-32, n=6) a 32-měsíčních krys s omezeným příjmem kalorií (CR-32, n =6). Zvířata byla před utracením anestetizována a vzorky jater byly okamžitě odebrány, rychle zmraženy v isopentanu chlazeném kapalným dusíkem a skladovány v kapalném dusíku až do další analýzy.

4.2. Stanovení aktivity citrátsyntázy

Stanovení aktivity citrátsyntázy bylo provedeno jako v [17]. Stručně, 80 ug celkových proteinů purifikovaných ze vzorků jater bylo inkubováno v reakčním pufru (0,31 mM acetyl-CoA, 100 mM Tris pufr ( pH 8,1), 0,25 procenta Tritonu X-100, 0,1 mM 550-dithiol-bis-2-nitrobenzoové kyseliny a 0,5 mM oxaloacetátu (1 ml) při 30 stupních.

Aktivita citrátsyntázy (umol×min-I×g tkáně-) byla stanovena spektrofotometricky měřením rychlosti produkce kyseliny thionitrobenzoové (TNB) při 412 nm.

4.3. Western Imunoblotting

Jaterní mitochondrie byly izolovány v médiu obsahujícím 220 mM manitol, 70 mM sacharózu, 20 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA a 5 mM EGTA, pH 7,4, při 4 stupních podle 【16】. Kromě toho bylo 10 ug mitochondriálních proteinů použito pro analýzu Western immunoblotting. Anti-TFAM (1:50,000), anti-VDAC (1:50,000, Abcam, Cambridge, Spojené království), anti-OGG1 (1:2500, Abcam, Cambridge, Spojené království) , anti-APE1 (1:5000, Abcam, Cambridge, Spojené království), anti-MFN2 (1:5000, Abnova, Taipei, Taiwan), anti-DRP1 (1:2500, Abnova, Taipei, Taiwan) anti-Cyt c(1:500, Pharmingen, San Diego, CA, USA) a anti-Lon proteáza (1:10 000) byly použity jako primární protilátky. Protilátky proti TFAM a Lon byly vyrobeny na zakázku a laskavě darovány Dr. H. Hinagaki (oddělení chemie, National Industrial Research Institute of Nagoya, Nagoya-shi, Aichi, Japonsko) a Dr. C. Suzuki (oddělení biochemie a molekulární biologie, New Jersey Medical School, University of Medicine and Dentistry of New Jersey, Newark, NJ, USA). Proteiny byly detekovány chemiluminiscencí a imunoreaktivní pásy byly kvantifikovány pomocí softwaru Image Lab Software (BioRad Laboratories Inc., Hercules, CA, USA) a normalizovány proti expresi VDAC.

4.4. Určení mtDNA a mtDNA 4,8 Kb "Common Deletion" Content

Kvantitativní polymerázová řetězová reakce v reálném čase (qPCR) byla použita ke stanovení relativního obsahu mtDNA a mtDNA 4,8 Kb "společná delece". Reakce byly prováděny pomocí SYBR Green chemistry za použití 3 ng celkové DNA jako templátu a následujících primerů: MtDNA pro 5-GGTTCTTACTTCAGGGCCATCA-3'(nt 15.785-15.806), mtDNA rev 5'-TGATTAGACCCGTTACCATCGA-3'(nt 15,868-15,847); -actin pro 5'-CCCAGCCATGTACGTAGCCA-3'(nt 2181-2200), -actinrev5'-CGTCTCCGGAGTCCATC AC-3'(nt 2266-2248);4,8 del pro {{26} }AAGGACGAACCTGAGCCCTAATA-3'(nt8109-8131), 4.8 del rev 5'-CGAAGTAGATGATGCGTATACTGTA-3'(nt 13,020-12,996). Obsah mtDNA ve vztahu k jaderné DNA a 4,8 kb obsah "společné delece" vzhledem k mtDNA byly stanoveny, jak je uvedeno v [19].

4.5. Analýza oxidovaných purinů

K detekci oxidovaných purinů bylo použito štěpení celkové DNA formamidopyrimidinovou DNA glykosylázou (Fpg) (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) [53].

PCR amplifikace oblastí D-loop, Ori-L a ND1/ND2 mtDNA byly provedeny s použitím příslušného páru primerů:

D-loop For5'-TCTGGTCTTGTAAACCAAAAATGA-3'(nt 15,302-15,325),D-loop Rev 5'-TGGAATTTTCTGAGGGTAGGC-3'(nt 16,302-16, 282); Ori-L pro 5'-AACCAGACCCAA ACACGAAA-3' (nt 4414-4433),Ori-L Rev 5'-CTATTCCTGCTCAGGCTCCA-3'(nt 5407-5388);ND1 pro 5 '-AGGACCATTCGCCCTATTCT-3'(nt3390-3409),ND1 Rey 5'-CGCCAAC AAAGACTGATGAA3'(nt 4399-4380) na 5 ng celkové DNA ošetřené a neošetřené Fpg. Podmínky cyklování byly: Předinkubace 10 minut při 95 stupních, následovaných 18 cykly 15 až 95 stupňů, 15 až 58 stupňů C a 1 minuta 72 stupňů. Alikvot z každé PCR amplifikace byl nanesen na 1,3% agarózový gel. Intenzity pásů proužků obarvených ethidium bromidem byly analyzovány softwarem Image Lab Software (BioRad Laboratories Inc., CA, USA). Pro zlepšení grafické vizualizace byl poměr mezi intenzitou pásů ošetřených Fpg a neošetřenými vyjádřen jako procento komplementu ke 100.

4.6. statistika

Data jsou vyjádřena jako průměr a standardní odchylka (SD). Byla použita jednocestná ANOVA s Tukeyovým vícenásobným srovnávacím testem. U všech testů byla statistická významnost nastavena na 5procentní hladině. Analýzy byly prováděny pomocí specifického statistického balíčku (Stata Corp. 2005. Stata Statistical Software: Release. College Station, TX, USA).

Tento článek je převzat z Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 1665. https://doi.org/10.3390/ijms22041665 https://www.mdpi.com/journal/ijms