Účinek proti stárnutí Urolitinu A na hovězí oocyty in vitro

Prosím kontaktujteoscar.xiao@wecistanche.comPro více informací

Abstraktní:Oxidační stres a mitochondriální dysfunkce jsou spojovány s věkem souvisejícím poklesem kvality oocytů a v současnosti se hledají strategie pro jejich prevenci. Urolitin A (UA) je přirozený metabolit s proapoptickými a antioxidačními účinky, který je schopen zabránit akumulaci dysfunkčních mitochondrií v různě starých buňkách. UA nebyla nikdy testována na oocytech skotu. Naším cílem bylo studovat vliv UA na vývojový potenciál exprese komplexů cumulus-oocyte-complexes (COC) a granulózních buněk (GCs) důležitých genů souvisejících s reprodukční schopností. Hodnotila se progrese jaderného zrání, mitochondriální membránový potenciál (MMP) a vývojová kompetence fyziologicky zralých (22 h) a in vitro stárnutých oocytů (30 h IVM) získaných od prepubertálních a dospělých samic, buď doplněných UA, nebo ne. Kromě toho bylo kvantifikováno množství mRNA několika genů (NFE2L2, NQO1 a mt-DN5) a počet kopií DNA mt-ND5 v kultivovaných GC od prepubertálních a dospělých samic, buď doplněných UA, nebo ne. Naše studie potvrdila škodlivý účinek stárnutí oocytů na progresi jaderného zrání, MMP, vývojovou kompetenci a úrovně genové exprese. Léčba UA během zrání in vitro se zlepšila (str<0.05) the="" maturation="" rate="" and="" subsequent="" developmental="" capacity="" of="" aged="" oocytes.="" a="" positive="" effect="">< 0.05)="" of="" ua="" on="" physiological="" maturation,="" mmp,="" and="" embryonic="" development="" was="" also="" identified.="" ua="" also="" interfered="" with="" the="" expression="" profile="" of="" nfe2l2="" and="" nqo1="" genes="" in="" gcs="" cultures.="" our="" findings="" demonstrate="" that="" ua="" supplementation="" is="" an="" effective="" way="" to="" prevent="" oocyte="" aging="" and="" improves="" the="" subsequent="" bovine="" embryonic="">

KSL01

Kliknutím sem se dozvíte více

klíčová slova:oocyt; stárnutí; Urolitin A; technologie asistované reprodukce

1. Úvod

Pokles reprodukční schopnosti žen je jednou z prvních fyziologických funkcí nepříznivě ovlivněných stárnutím, a je tak celosvětově považován za nově se objevující zdravotní problém [1,2]. Kromě několika patologických problémů je věkem podmíněný pokles ženské plodnosti z velké části přisuzován poklesu ovariální rezervy oocytů [1,3-5]spojený s časově závislým zhoršováním jejich kvality [2]. Tento proces zhoršování může nastat v důsledku vystavení oocytů starému ovariálnímu mikroprostředí před ovulací. Kromě toho je samičí gameta často vystavena postovulačnímu stárnutí, kdy proces oplodnění neprobíhá v nejlepším optimálním období a neoplodněný oocyt zůstává ve vejcovodu nebo in vitro před inseminací po dlouhou dobu [6] kvalita oocytů je kritickým faktorem spojeným se selháním technologií asistované reprodukce (ART), protože jejich kvalita je hlavním určujícím faktorem pro vývojový potenciál embrya po oplodnění [7,8]. Často se uvádí, že asynchronní ovulace a staré oocyty zhoršují úspěch programů umělé inseminace a produkce embryí u klisen, skotu a ovcí, což znamená významné ekonomické ztráty [1,9,10]. Proto je prvořadě důležité studovat mechanismy stárnutí oocytů, aby bylo možné navrhnout lepší terapeutické přístupy k záchraně plodnosti u několika druhů, včetně lidí, a také jako nástroj pro genetické zlepšení u hospodářských zvířat.cistanche wirkungZvláštní pozornost je třeba věnovat zlepšení vývojové kapacity oocytů z prepubertálního skotu, které se často používají k urychlení genetického zisku a zkrácení generačních intervalů.

Jednou z hlavních příčin narušené vývojové kompetence u starých oocytů je nárůst oxidačního stresu, který vyvolává mitochondriální dysfunkci, poškození DNA a chyby tvorby vřeténka, ovlivňující kvalitu oocytů [1]. Je dobře známo, že zvýšená produkce volných radikálů je příčinou buněčného stárnutí u několika chronických onemocnění a také v reprodukční biologii, což vede ke špatným výsledkům plodnosti [12]. Ovariální mikroprostředí, které zahrnuje oocyty a granulózní buňky (GC), poskytuje antioxidační obranný mechanismus schopný regulovat oxidační podmínky a udržovat rovnováhu oxidant/antioxidant [13]. Během procesu stárnutí je však účinnost antioxidační obrany při neutralizaci reaktivních forem kyslíku (ROS) oslabena, čímž se zvyšuje úroveň oxidačního stresu. Faktor 2 (Nrf2 nebo NFE2L2) související s jaderným faktorem E2-, také známý jako Nrf2/Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) pathway, je dominantní kaskáda odezvy aktivovaná oxidačním stresem[14]. Tato dráha je buněčný obranný mechanismus, který si buňky vyvinuly, aby se vyrovnaly se škodlivými účinky oxidačního stresu. Za normálních podmínek je Nrf2 negativně regulován Keap1, držen v cytoplazmě a udržován na nízkých úrovních. Když je Nrf2 vystaven oxidantům, je disociován od Keapl, což umožňuje jeho translokaci v jádře, kde se váže na specifické sekvence DNA. Tyto sekvence, nazývané prvky antioxidační odezvy (ARE), vedou k transkripční aktivaci cytoprotektivních genů, jako je NAD(P)H:chinon-oxidoreduktáza-1 (NQO1), hemoxygenáza-1 (HMOX1) a katalytická podjednotka glutamát-cystein ligázy (GCLC)[15,16]. Předchozí studie ukázaly, že aktivace signální dráhy Nrf2-Keapl snižuje poškození oxidativním stresem zvýšením hladiny antioxidantů v lidských GC a myších vaječnících[17,18]. Jeho role v procesu stárnutí ženských gamet však zůstává nepolapitelná, i když je jasně prokázáno, že hlavním produkčním místem ROS během tohoto procesu jsou mitochondrie [9,10].

KSL02

Cistanche může proti stárnutí

Naopak mitochondrie se podílejí na několika kritických buněčných funkcích a jsou zásadní pro uspokojení poptávky po produkci energie požadované během zrání oocytů a následného embryonálního vývoje [19]. Kompetentní mitochondriální aktivita byla vysoce spojena s vyšším obsahem mitochondriální DNA (mt-DNA) a tvorbou ATP [20], vyšším potenciálem mitochondriální membrány [21] a udržováním kvality a kvantity mitochondrií prostřednictvím mitofagie [22]. Navíc se předpokládá, že mitochondriální aktivita přímo koreluje s životaschopností embryí a lepšími výsledky plodnosti [23]. Stále více důkazů podporuje, že mitochondriální alterace související s věkem vedou ke stárnutí vaječníků a následně ke snížení životaschopnosti embryí a potenciálu implantace. Tyto změny zahrnují snížený počet kopií mt-DNA, sníženou tvorbu ATP [20], změny v expresi mitochondriálních genů [24, poškození mt-DNA [25] a snížený potenciál mitochondriální membrány [26].

KSL03

Terapeutické přístupy zaměřené na mitochondrie vyvolaly obrovský zájem o několik patologií spojených se stárnutím kvůli jejich velkému potenciálu při posilování mitochondriální funkce [27]. V tomto rámci bylo prokázáno, že Urolitin A (UA) – přirozený metabolit získaný po požití potravy, jako jsou granátová jablka, po které následuje jeho přeměna střevní mikroflórou – zabraňuje hromadění dysfunkčních mitochondrií s věkem, vyvolává mitofágii a také udržuje mitochondriální biogeneze a respirační kapacity [28,29]. UA se používá jako slibný terapeutický lék k prevenci některých druhů rakoviny, jako je kolorektální karcinom a karcinom prostaty [30,31]. Kromě toho má UA také protizánětlivé [32], antiobezitní [33], antioxidační [34] a anti-aging vlastnosti [35].citrusové bioflavonoidyNedávná studie zdůraznila účinky suplementace UA do senescentních fibroblastů lidské kůže na aktivaci dráhy Nrf2-Keapl, která zvyšuje jejich antioxidační kapacitu. Tato aktivace dráhy Nrf2-Keapl účinně zmírňuje hladinu ROS prostřednictvím upregulace exprese Nrf2 downstream genů odpovědí ARE (SOD, NQO1, GCLC a HMOX1), což ukazuje na slibný účinek proti stárnutí [ 35].

KSL04

Bylo provedeno několik studií s cílem oddálit stárnutí vaječníků a následně zlepšit kvalitu oocytů a výsledky plodnosti. Vzhledem k přispění oxidačního stresu k procesu stárnutí vaječníků a také k mitochondriální dysfunkci se suplementace antioxidanty jeví jako slibná terapie [36,37]. Není však známo, zda suplementace Urolitinem A může obnovit poškození, ke kterému dochází během stárnutí vaječníků, což přispívá k prevenci problémů s neplodností. Cílem této studie proto bylo: (1) demonstrovat, že stárnutí může změnit vývojový potenciál komplexů cumulus-oocyte (COC) a expresi GC důležitých genů zapojených do signální dráhy Nrf2; (2) určit, zda UA může zachránit ženská plodnost prokazující účinek proti stárnutí u starších COC a GC; a (3) vyhodnotit účinek UA na úroveň exprese genů zapojených do signální dráhy Nrf2 a také na kvalitu oocytů.

2. Materiály a metody

2.1. Experimentální design

Tato studie byla schválena Výborem pro péči o zvířata Národního veterinárního úřadu (stupeň N 08965DGAV) podle pokynů Evropské unie (č. 86/609/EEC). Ke zkoumání vlivu stárnutí na změnu kvality oocytů a potenciálního účinku UA proti stárnutí byl použit model využívající COC odebrané od prepubertálních a dospělých krav podrobených stárnutí in vitro (30 hodin zrání) nebo fyziologickému zrání (22 h) byly použity procesy.

2.1.1. Předchozí test – studie dávka-odpověď

Předchozí test ke stanovení koncentrace UA, který by měl být použit během procesu zrání COC skotu, byl proveden na základě studie závislosti odpovědi na dávce ve čtyřech sezeních. Vzhledem k tomu, že UA nebyla nikdy testována na oocytech skotu, byly použity předchozí dávky úspěšně aplikované k prevenci a zmírnění některých rakovin a k prokázání účinku UA proti stárnutí v různých buněčných liniích [28,39]. COC získané od prepubertálních a dospělých dospělých krav (n=978) byly vybrány a poté náhodně rozděleny do pěti skupin pro testování různých dávek UA: kontrola, 1, 10, 25 a 50 uM během fyziologického zrání in vitro. Po období zrání byly některé oocyty (n=154) obarveny, aby se určila chromozomální konfigurace a stadia zrání. Zbývající zralé oocyty byly podrobeny inseminaci in vitro se zmrazeným/rozmraženým spermatem. Předpokládané zygoty byly kultivovány a rychlost štěpení a blastocyst byla stanovena v den 2 a 7. den kultivace, v daném pořadí. Na základě získaných výsledků, konkrétně absence škodlivých účinků a podpory zrání a rozvoje blastocyst, byla zvolena koncentrace 1 uM UA.

2.1.2. Experiment1

V tomto experimentu, provedeném v šesti relacích, byly COC z prepubertálního věku (průměrný věk=9 měsíců,n=660) a dospělých (průměrný věk =39měsíců,n=674) krávy byly odebrány za účelem posouzení kvality oocytů a vývojového potenciálu starých a fyziologicky zralých oocytů, jakož i účinku UA na záchranu samičí plodnosti. COC byla náhodně rozdělena do 8 skupin: (1) kontrolní prepubertální skupina, COC od prepubertálních telat zrála 22 hodin (n=148); (2) Prepubertální skupina UA, COC od prepubertálních telat zrála v médiu doplněném 1 uM UA po dobu 22 hodin (n=155);(3)kontrolní 30h prepubertální skupina, COC od prepubertálních telat ve věku do 30h in oitro zrání (n=149);(4)UA ve věku 30h prepubertální skupina, COC od prepubertálních telat stárnutých in vitro po dobu 30 hodin v dozrávacím médiu doplněném 1 uM UA(n=144);(5) kontrolní skupina dospělých, COC od dospělých krav dozrávajících 22 hodin (n=155 );(6) skupina dospělých UA, COC od dospělých krav dozrálých v médiu doplněném 1 uM UA po dobu 22 hodin (n=129);(7) kontrolní skupina dospělých ve věku 30 hodin, COC od dospělých krav ve věku do 30 hodin zrání in oitro (n=148); a (8) skupina dospělých UA ve věku 30 hodin, COC od dospělých krav ve věku in oitro po dobu 30 hodin v médiu pro zrání doplněné 1 uM UA(n=138).výhody cynomoriumPo příslušných obdobích zrání in vitro byly oocyty inseminovány rozmraženým kapacitním býčím semenem. Následně byl hodnocen embryonální vývoj, přičemž se hodnotila jak rychlost štěpených a produkovaných embryí, tak i jejich kvalita.

Kromě toho byly v tomto experimentu získány COC z každé skupiny, aby se posoudilo jejich stadium jaderného zrání (kontrolní prepubertální skupina, n=7; prepubertální skupina UA, n =7; kontrola ve věku 30 hodin prepubertální skupina, n{ {3}}; předpubertální skupina UA ve věku 30 hodin, n=6; kontrolní skupina dospělých,n=16;skupina dospělých UA,n=21;kontrolní skupina dospělých ve věku 30 hodin, n{ {9}}; skupina dospělých UA ve věku 30 hodin, n=18). Byl také hodnocen mitochondriální membránový potenciál (MP) COC (kontrolní prepubertální skupina, n=10; prepubertální skupina UA, n{ {13}};kontrolní 30h prepubertální skupina,n=9;UA ve věku 30h prepubertální skupina,n=9;kontrolní dospělá skupina, n=15; UA dospělá skupina, n{ {19}}; kontrolní skupina dospělých ve věku 30 hodin, n=10; skupina dospělých ve věku 30 hodin, n=14).

2.1.3. Experiment2

Protože GC hrají zásadní roli v růstu folikulů a vývoji oocytů, byl proveden druhý experiment v pěti sezeních, aby se dále studoval vliv věku a UA na expresi NFE2L2, NQO1 a mt-ND5. Byl také hodnocen počet kopií genu mt-ND5. GC byly získány po centrifugaci folikulární tekutiny odsáté z vaječníků prepubertálních (průměrný věk=10 měsíců) a dospělých krav (průměrný věk =62 měsíců). Tyto buňky byly kultivovány za následujících podmínek: (1) prepubertální kontrola, kultivace GC prepubertálních telat; (2) prepubertální UA, kultivace GC prepubertálních telat doplněná 1 uM UA; (3) dospělá kontrola, kultivace GC dospělých krav; a (4) dospělá UA, kultura GC dospělých krav doplněná 1 uM UA. Po konfluenci GC 5. den kultivace byly rychle zmraženy v tekutém dusíku a později byly extrahovány DNA a RNA, což umožnilo následnou kvantifikaci transkriptů mRNA NFE2L2, NQO1 a mt-ND5 a také počtu kopií mt-ND5.

2.2. Odběr oocytů a in vitro zrání

Vaječníky od dospělých a prepubertálních krav (předchozí test, n {{0}} a oček. 1, n=1334) byly odebrány na místních jatkách a udržovány při 35-37 stupni v fosfátem pufrovaný fyziologický roztok (PBS) doplněný 0,15 procenta bovinního sérového albuminu (w/v, BSA) doplněného 0,05 mg ml-l kanamycinu. V laboratoři byly ovariální folikuly o průměru 2-8 mm odsáty jehlou 19-. Pouze COC s alespoň třemi vrstvami kompaktních buněk cumulus a homogenní ooplasmou byly promyty a vybrány pro zrání podle experimentálního plánu.pouštní hyacintZrání bylo provedeno v inkubátoru při 38,8 stupních, 5 procentech CO2 ve zvlhčeném vzduchu po dobu 22 nebo 30 h v maturačním médiu složeném z tkáňového kultivačního média 199 (TCM) s 10 procenty fetálního bovinního séra, 0,2 mM sodíku pyruvát, 10 ng ml-l epidermálního růstového faktoru a 10 μl ml-l gentamicinu【40】.

2.3. Odběr a kultivace buněk granulózy

Buňky granulózy byly získány ze získané folikulární tekutiny po centrifugaci po dobu 10 min při 200x g[41]. Peleta byla suspendována v 1 ml kultivačního média (TCM199 plus 10 procent séra), aby se provedla další centrifugace po dobu 5 minut. Nová peleta byla resuspendována v 1 ml kultivačního média buď doplněného 1 uM UA nebo ne podle experimentálního návrhu a homogenizována injekční stříkačkou připojenou k 19G jehle, alespoň 30krát, aby se buňky oddělily. Po vyhodnocení životaschopnosti GC (barvivo trypanová modř, 0,4 procenta hm./obj.) byly buňky naočkovány v koncentraci 2×105 životaschopných buněk ml-1 a kultivovány po dobu pěti dnů při 38,8 stupních, 5 % CO2 ve zvlhčené atmosféru až do soutoku. Každých 48 hodin bylo kultivační médium vypuštěno a obnoveno novým. Pro extrakci DNA a RNA byly GC sebrány a promyty centrifugací při 200x g po dobu 10 minut. Buněčné pelety byly resuspendovány v 1 ml PBS, okamžitě rychle zmraženy v kapalném dusíku a skladovány při -80 stupni.

2.4. Nukleární zrání oocytů

Stádia jaderného zrání byla hodnocena po 22h nebo 30h období zrání in vitro.Metoda extrakce flavonoidů pdfObnažené oocyty byly fixovány v roztoku kyselina octová/ethanol (1:3, obj./obj.) a udržovány při 4 stupních po dobu 48 hodin. Poté byly oocyty obarveny 1% acetolakmoidním roztokem, umístěny do Neubauerovy komůrky a pozorovány pod mikroskopem s fázovým kontrastem (Olympus BX41). Oocyty byly klasifikovány následovně: Germinální vezikuly (GV), kondenzační chromozomy I (CCI), kondenzační chromozomy II (CCII), diakineze, anafáze-I/telofáze-I (AI/TI) a MII (metafáze-II) . V úvahu byly brány pouze oocyty s viditelným zbarvením chromatinu [42].

2.5. Posouzení potenciálu mitochondriální membrány

Pro měření mitochondriálního membránového potenciálu (MP), indikátoru mitochondriální aktivity, byly mitochondrie obarveny 5, 6, 6'-tetrachlor-1, 1', 3, 3'tetraethylbenzimidazolkarbocyanin jodidem (JC-1). , Invitrogen, Waltham, MA, USA). Obnažené oocyty byly inkubovány s 5 ug ml-l JC-1 [37] v maturačním médiu po dobu 30 min při 38,8 stupních a 5 procentech CO2 ve zvlhčeném vzduchu ve tmě. Oocyty byly dvakrát promyty v PBS a okamžitě přeneseny na předehřáté sklíčko a pozorovány pod fluorescenčním mikroskopem (Olympus BX51) s použitím modrého fluorescenčního filtru (BP 470-490 objektiv UPlanFI 20×/0,50). Potenciál mitochondriální membrány byl poté vypočten jako poměr naměřené červené/zelené fluorescence pomocí softwaru Image] (National Institute of Health, Bethesda, MD, USA). 2.6. Oplodnění in vitro a kultivace embryí

In vitro fertilizace byla provedena se zmrazenými a rozmraženými spermiemi holštýnsko-fríského býka, které byly předtím podrobeny kapacitní metodě Percoll gradient (45 a 90), v koncentraci 2 x 10 stupňů spermií mL-4.COCs and spermie byly koinkubovány po dobu 20 hodin při 38,8 stupních a 5 procentech CO2 ve zvlhčeném vzduchu. Předpokládané zygoty byly poté přeneseny do kapiček média syntetické vejcovodné tekutiny (SOF) doplněného BME a MEM aminokyselinami, glutaminem, glutathionem a BSA [40]. Po 48 hodinách inseminace byla překročena rychlost štěpení (odštěpená embrya na celkový počet inseminovaných oocytů) a rozštěpená embrya byla udržována v SOF doplněném BSA a 10 procenty fetálního bovinního séra (FBS). Embrya byla kultivována po dobu 12 dnů [41,43], aby se vyhodnotila rychlost vývoje blastocyst (7, 9 a 12 dnů; embrya D7 na štěpená embrya) a počet vylíhnutých embryí (vylíhnutá embrya na embrya D7) a jejich kvalita [43]. Embrya 7. dne byla klasifikována jako 1. stupeň (dobrá kvalita), 2. (dobrá kvalita) a 3. stupeň (špatná kvalita)[4].

2.7. Extrakce a kvantifikace DNA a RNA

Celková DNA a RNA byly izolovány z GC pomocí sady High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Basel, Švýcarsko) a PureLinkTM RNA Mini Kit (InvitrogenTM, Waltham, MA, USA), v daném pořadí, podle pokynů výrobce. Tyto protokoly zahrnovaly použití rotačních kolon používaných k izolaci vysoce kvalitní celkové DNA a RNA a DNázy jako ošetření k odstranění genomové DNA z RNA[40]. Po extrakci byly vzorky uloženy při -80 stupních. Koncentrace a kvalita DNA a RNA byly stanoveny pomocí spektrofotometru NanoDropTM One/OneC (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA).

2.7.1. Komplementární syntéza DNA

Syntéza komplementární DNA (cDNA) z izolátů RNA byla provedena pomocí soupravy Xpert cDNA Synthesis Mastermix kit (GRiSP, Porto, Portugalsko, podle pokynů výrobce. RNA byla reverzně transkribována pomocí 500 ng extrahované RNA z každého vzorku k provedení syntézy cDNA, která byla provedena pomocí termocykleru (T100 Thermal Cycler, Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Výsledné cDNA byly skladovány při -20 stupni až do použití pro další testy. 2.7.2.

Pro tuto studii byly navrženy primery pro cílený (NFE2L2 a NQO1) a endogenní kontrolní gen (6-aktin) pomocí softwaru Primer-BLAST Národního centra pro biotechnologické informace (NCBI) (http://www. .ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/, přístupný dne 6. března 2020). Sekvence primerů pro referenční geny a cílové geny jsou uvedeny v tabulce 1. Kromě toho byl v této práci použit gen mt-ND5 a podrobnosti o primerech mt-ND5 byly získány z předchozí studie [45].

2.7.3. Kvantitativní reverzní transkripční polymerázová řetězová reakce

PCR analýzy v reálném čase byly provedeny pomocí Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X s ROX v termocykleru QuantStudio 3 (ThermoFisher ScientificTM, Waltham, MA, USA), s použitím cDNA v koncentraci 25 ng uL-l. Stanovení počtu kopií mitochondriální DNA (mt-DNA) genu ND5 bylo provedeno pomocí qPCR prostřednictvím dříve extrahované DNA za použití stejného zařízení jako pro kvantifikaci genů. Byla provedena každá optimalizovaná reakce skládající se z Xpert Fast SYBR Green Mastermix 2X s ROX, primeru (Forward a Reverse) každého cílového genu, vzorku (cDNA/DNA) a vody bez RNázy, což představuje celkový objem 10 μl. Vzorky byly analyzovány v duplikátech a reakce obsahující vodu místo templátu byly zahrnuty jako negativní kontroly. Vzorky byly podrobeny amplifikačnímu protokolu, který sestával z počátečního cyklu při 95 stupních po dobu 2 minut denaturační fáze, následovaných 40 denaturačními cykly při 95 stupních po dobu 55 s, 40 cyklů žíhání po dobu 30 s při 60 stupních (v závislosti na teplotě tání sekvence primerů) a prodlužovací fáze při 72 stupních po dobu 30 s a nakonec konečná extenzní perioda při 72 stupních po 10 minut.

Pro kvantifikaci genové exprese byla použita metoda relativní kvantifikace. Tato metoda relativní kvantifikace genové exprese byla provedena s expresními hladinami studovaných cílových genů, které byly normalizovány s provozními geny, srovnávací metodou CT. Protože amplifikace pomocí RT-qPCR byla provedena duplicitně, byly určeny průměrné hodnoty CT pro každý gen a hladiny exprese byly vypočteny pomocí následujícího vzorce:

kde △Ct=cílový gen Ct – endogenní kontrolní gen Ct.

Pro kvantifikaci počtu kopií mt-DNA byla použita relativní kvantifikace normalizovaná proti jednotkové hmotnostní metodě. Tato metoda byla provedena s hodnotami CT GC ošetřených UA (nazvaným jako test), které byly normalizovány s kontrolními vzorky (v současnosti označenými jako kalibrátor). Protože počet kopií mt-ND5 byl hodnocen pomocí qPCR a proveden duplicitně, byly určeny průměrné hodnoty CT pro vzorky testů a kalibrátorů a poměry byly vypočteny pomocí následujícího vzorce: