Tetrandrin zmírňuje poškození podocytů prostřednictvím kalpainové blokády-1 závislé na vápníku

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Yin Ding, Xuanli Tang, Yuhui Wang, Dongrong Yu, Caifeng Zhu a Jin Yu*

Abstraktní

Pozadí:Podocyty se staly klíčovým cílem pro intervence v proteinuriiledvinanemocí. Mnoho studií uvádí, že nadměrná exprese přechodného receptorového potenciálu kationtového kanálu proteinu 6 (TRPC6) při poškození podocytů zvyšuje intracelulární Ca2 plus influx a stimuluje Ca2 plus-dependentní proteázovou calpain-1 signalizaci. Tradiční čínský lék, tetrandrin, neselektivní blokátor Ca2 plus kanálů, se dlouho používá k léčbě chronických onemocněníledvinachoroba. Cílem tohoto výzkumu bylo prozkoumat možné mechanismy, které jsou základem antiproteinurických vlastností tetrandrinu.

Metody:Zkoumali jsme zapojení tetrandrinu do signalizace Ca2 plus dependentní calpain-1 u myších podocytů a potkanů ​​s nefropatií vyvolanou adriamycinem. Cyklosporin A (CsA) a U73122 byly použity jako pozitivní kontroly. Byla zkoumána buněčná životaschopnost, cytotoxicita, koncentrace Ca2 plus, aktivita calpainu a hladiny exprese mRNA a proteinů signálních drah calpainu-1. Byly měřeny klinické a patologické změny.

Výsledek:Tetrandrin snížil intracelulární Ca2 plus influx v kultivovaných TRPC6-nadměrně exprimujících podocytech. Ve studiích in vitro i in vivo podávání tetrandrinu snížilo aktivitu calpainu a expresi calpainu-1 a obnovilo expresi downstream Talinu-1 a nefrinu. Ve srovnání s CsA vykazovala léčba tetrandrinem lepší inhibiční účinky na aktivitu calpainu a expresi calpainu-1.

Závěry:Tetrandrin má terapeutický potenciál při poškození podocytů tím, že blokuje na Ca2 plus-dependentní aktivaci signalizační dráhy calpain-1. Tetrandrin snížil proteinurii, zlepšil funkci ledvin a zmírnil patologické poškození ledvin.

klíčová slova:Tetrandrin, poškození podocytů, přechodný receptorový potenciál kationtového kanálu protein 6, Calpain-1

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Pozadí

Podocyty jsou předpokladem pro udržení selektivní permeability glomerulární filtrační bariéry a glomerulární strukturální integrity. Poškození podocytů je typicky spojeno s proteinurickými onemocněními ledvin, včetně fokální segmentální glomerulosklerózy (FSGS), membranózní nefropatie, onemocnění s minimálními změnami a diabetickéledvinaonemocnění [1–4]. Ochrana a obnova podocytů před škodlivými faktory představuje hlavní výzvu v úspěšné léčbě onemocnění ledvin.

Podocyty jsou vysoce specializované, terminálně diferencované buňky umístěné mimo glomerulární bazální membránu a charakterizované výběžky nohou. Dysfunkce regulace vápníkové signalizace v podocytech vede k dezorganizaci podocytárního aktinu cytoskeletu, poškození výběžku nohy, narušení štěrbinové bránice a proteinurii. Protein 6 kationtového kanálu s přechodným receptorovým potenciálem (TRPC6), nový protein v podocytech asociovaný s štěrbinovou diafragmou, byl identifikován jako nespecifický Ca2 plus vodivý iontový kanál [5–8]. Glomerulární exprese TRPC6 je zvýšená u mnoha dědičných a získaných proteinurických onemocnění. Předchozí studie uvádějí, že nadměrná exprese TRPC6 v podocytech spouští vynikající zvýšení intracelulárního Ca2 plus influx, o kterém se předpokládá, že je zodpovědný za poškození buněk podocytů. Zvýšená zátěž vápníkem v podocytech aktivuje downstream signální dráhy, včetně calpainu{10}}, Talinu{11}}, nefrinu a kalcineurinu, k modulaci aktivity nebo exprese cílových genů [9–12]. Fangji Huangqi Tang je klasická tradiční čínská medicína (TCM) pro léčbu nefrotického syndromu [13]. Skládá se ze šesti bylin: Radix Stephania Tetrandra (kořeny Stephania tetrandra), Radix Astragali (kořeny Astragalus membranaceus), Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (kořeny Atractylodes macrocephaly), Radix Glycyrrhizae (kořeny Glycyrrhiza Zuralensis), Rhizoma Atractylodis Macrocephaly (kořeny Zingiber Officinale) a Fructus Ziziphi Jujubae (Fructus Ziziphus jujuba) [1]. Tetrandrin, jedna z hlavních aktivních složek Radix Stephania Tetrandra, neselektivní blokátor Ca2 plus kanálů, byl testován v klinických studiích a byl indikován ke zmírnění proteinurie a zlepšení renálních funkcí [14, 15]. Předchozí studie prokázala blokující účinky tetrandrinu na Ca2 plus-dependentní RhoA signalizaci v podocytech [16], ale základní mechanismy nebyly objasněny. V tomto dokumentu byly vyvinuty modely nadměrné exprese TRPC{22}} in vitro a in vivo. Po podání tetrandrinu byly hodnoceny změny v TRPC6-závislé Ca2 plus signalizaci, včetně downstream cílů, calpainu-1, Talinu-1, nefrinu a kalcineurinu. Cyklosporin A (CsA), inhibitor kalcineurinu, široce používaný v léčbě onemocnění s proteinurií) [17] a U73122, inhibitor otevírání kanálu TRPC6 [18] byly použity jako pozitivní kontroly.

Metody

Buněčná kultura a konstrukce plazmidu

Podmíněně imortalizované buňky myší podocytární buněčné linie (MPC5), získané od profesora Petera Mundela (Mount Sinai School of Medicine, USA), byly udržovány při 33 stupních pro proliferaci a poté posunuty na 37 stupních pro diferenciaci. Expresní plazmid Te TRPC6 byl zkonstruován klonováním celé délky kódující sekvence DNA genu TRPC6 do míst EcoRI/BamHI vektoru pCDH-GFP-PURO a zabalen do lentiviru. Po diferenciaci a kultivaci do přibližně 80% konfluence byly podocyty nasazeny při buněčné hustotě 4×104 na cm2 a inkubovány v kombinaci s lentivirem nadměrně exprimujícím TRPC{11}}. Pro další experimenty byla použita stabilní buněčná linie TRPC6 ověřená pomocí exprese proteinu TRPC6 a mRNA. Tus, MPC5 podocyty byly rozděleny do tří skupin, normální kontrolní (NC) skupina, blank lentivirus (Lv-NC) skupina a TRPC6-nadměrně exprimující (OverTRP) skupina.

In vitro léčba buněčným léčivem a test cytotoxicity

Životaschopnost buněk byla zjišťována pomocí testu Cell Counting kit{{0}} (CCK-8) podle pokynů výrobce. Celkem 5000 MPC5 podocytů na jamku bylo kultivováno v triplikátech na 96-jamkových destičkách. Buňky byly ošetřeny sérií CsA (0–2 μmol/L; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) a tetrandrinem (0–40 μmol/L; Sigma Aldrich) při 37 stupních po dobu 48 hodin. CCK-8 byl poté přidán do destiček (10 μl/jamka), které byly poté inkubovány ve tmě po dobu 2 hodin. Absorbance při 450 nm byla měřena pomocí čtečky mikrodestiček (BioTek Instruments, USA). Cytotoxicita byla testována kvantifikací uvolňování laktátdehydrogenázy (LDH) pomocí Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST (Dojindo Laboratories, Japonsko). Jako pozitivní kontrola byly buňky ošetřeny 10 μmol/LU73122 (Cal biochem, USA) při 37 stupních po dobu 10 minut.

Extrakce RNA a kvantitativní reverzní transkriptáza-polymerázová řetězová reakce (qRT‑PCR)

Celková RNA byla připravena z kultivovaných buněk aledvinatkáně pomocí činidla RNAiso Plus (Takara, Japonsko) a reverzně transkribovány do cDNA PrimeScript™ RT Master Mix kit (Takara) podle protokolu výrobce. qRT-PCR byla provedena pomocí Power SYBR Green PCR Master Mix (Thermo Fisher Scientific, Německo). Sekvence primerů cílových a referenčních genů jsou uvedeny v doplňkové tabulce S1. Data byla shromážděna pomocí systému ABI Prism 7900HT FAST Real-Time PCR. Relativní kvantifikace exprese cílového genu byla normalizována pomocí srovnávací 2-ΔACt metody. Glyceraldehyd 3-fosfátdehydrogenáza (GAPDH) byla použita jako vnitřní kontrola.

Western blotting

vzorky celkového proteinu byly extrahovány z kultivovaných buněk aledvinapapírové kapesníky. Koncentrace proteinu byly stanoveny pomocí soupravy pro stanovení proteinu BCA (Thermo Fisher Scientific). Vzorky byly separovány na 10% dodecylsulfát-polyakrylamidovém gelu a přeneseny na polyvinylidendifluoridovou membránu. Membrána byla poté přes noc blokována při 4 stupních primárními protilátkami, jmenovitě anti-TRPC6 (Santa Cruz, USA), anti-cal pain-1 (Abcam, UK), anti-Talin-1 (Abcam) , anti-nefrin (Santa Cruz) a anti-kalcineurin (Abcam). Po promytí byla membrána inkubována s kozím antikráličím IgG (H plus L; Jackson ImmunoResearch Laboratories, USA). Membrána byla také zpracována pro detekci GAPDH (Abcam) pro rovnoměrné zatížení. Pásy Te rozpoznávané primární protilátkou byly vizualizovány a optické hustoty proteinových pásů byly analyzovány pomocí softwaru TanonImage (Tanon, Čína).

Stanovení cytosolického Ca2 plus v kultivovaných podocytech Podocyty MPC5 byly naočkovány a ošetřeny tetrandrinem, CsA a U73122 po dobu 48 hodin, 48 hodin a 10 minut, v daném pořadí. Podocyty byly poté inkubovány s RPMI-1640 doplněným 10μM Fluo{8}}AM (Dojindo Laboratories) po dobu 30 minut ve tmě. Poté byly okamžitě promyty fyziologickým roztokem pufrovaným fosfátem, ve kterém byly udržovány a excitovány při 488 nm. Relativní koncentrace cytosolického Ca2 plus iontu byla hodnocena měřením intenzity fluorescence pomocí laserového konfokálního zobrazovacího systému Zeiss (Zeiss, USA).

Měření aktivity calpainu

Aktivita calpainu byla stanovena pomocí soupravy Calpain Activity Assay Kit od Abcam Inc., podle protokolu výrobce. Supernatant (150 ul) podocytů neboledvinatkáně byly odebrány ve vhodném pufrovém roztoku (145 mmol/l Nacl, 100 mmol/l Tris-HCL, pH 7,3) a 0,15mLN-sukcinyl-Leu-Tyr-AMC (500 umol/l). Po 1-hodinové inkubaci při 37 stupních ve tmě byly vzorky odečteny pomocí fluorometru vybaveného 360nm excitačním filtrem a 440nm emisním filtrem.

Model potkanů ​​Adriamycinem indukované nefropatie (ADRN) Na základě Fermiho aproximace velikosti vzorku [19] a rozdílu proteinurie mezi kontrolní a modelovou skupinou v našich předběžných experimentech byl stanoven celkový počet potkanů ​​potřebných v naší studii. Celkem 56 zdravých samců potkanů ​​Sprague–Dawley o hmotnosti přibližně 200 g a stáří přibližně 8 týdnů (Zhejiang Institute of TCM) bylo náhodně rozděleno do sedmi skupin (n =8 potkanů/skupina), konkrétně do skupiny ADR, ADR plus skupina s nízkou dávkou tetrandrinu (4 mg/kg/den), skupina ADR plus tetrandrin se střední dávkou (8 mg/kg/den), skupina ADR plus tetrandrin s vysokou dávkou (16 mg/kg/d), skupina léčená ADR plus CsA (30 mg /kg/d), ADR plus střední dávka tetrandrinu (8 mg/kg/d) v kombinaci se skupinou CsA (30 mg/kg/d) a skupinou NC. Potkani v modelové skupině a skupinách léčených léčivem byli anestetizováni intraperitoneální injekcí hydrochloridu ketaminu (50 mg/kg) a dvě dávky ADR (4 mg/kg) byly injikovány do ocasní žíly, aby se vyvinul model potkana FSGS. Po 12 týdnech byly krysám odebírány vzorky moči po dobu 24 hodin pomocí metabolických klecí, poté následoval odběr krve a sklizeňledviny. Byla pozorována klinická účinnost a pomocí komerčně dostupných diagnostických souprav s automatickým chemickým analyzátorem (HITACHI 7180) byly měřeny změny 24-h bílkovin v moči, plazmatického albuminu, sérového kreatininu (Scr) a dusíku v krvi v moči (BUN) ).

Všechny experimentální postupy zahrnující použití zvířat byly schváleny Etickou komisí pro pokusy na zvířatech v Zhejiang Institute of TCM (Tianmushan Road č. 132) a byly přísně prováděny podle zásad uvedených v NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. .

Histologické barvení, elektronová mikroskopie a analýza

Krysaledvinybyly fixovány v paraformaldehydu, dehydratovány s použitím odstupňované série ethanolu a zalité v parafínu. Řezy (5-μm silné) byly obarveny hematoxylinem a eosinem (H&E) a Massonovým trichromem a zkoumány pod optickým mikroskopem. Ledviny byly perfundovány a fixovány glutaraldehydem a poté rozřezány na 1-mm3 tkáňové bloky pro zalití epoxidem. Elektronová mikroskopie byla provedena za použití standardních postupů. Z každého vzorku bylo náhodně získáno pět ultramikrografií. Rychlost fúze výběžků podocytárních nohou (PFR) byla vypočtena pomocí následujícího vzorce: PFR ( procenta )=∑LFP / ∑LBM×100 procent , kde ∑LFP je celková délka srostlého výběžku nohy a ∑LBM je celková délka bazální membrány periferní kapiláry (BM).

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní chyba měření a analyzována pomocí SPSS 20.0 (IBM Statistics SPSS, USA) a GraphPad Prism 6 pro Windows (GraphPad Software Inc., USA). Normální rozdělení bylo hodnoceno pomocí qq grafů a SW testu. Data ukázala normální rozdělení. Když byly porovnány dvě skupiny dat, byl použit t-test nezávislých vzorků. Rozdíly mezi třemi nebo více nezávislými skupinami byly porovnány pomocí jednosměrné analýzy rozptylu následované Tukeyho post hoc testem. Statistická významnost byla stanovena na str<>

Výsledek

Výběr optimálních koncentrací a cytotoxicity tetrandrinu, CsA a U73122

K detekci viability buněk byl použit test CCK{{0}}. Jak je znázorněno na obr. 1a a b, maximální koncentrace 10μmol/l tetrandrinu a 0,1μmol/l CsA neovlivnila životaschopnost podocytů MPC5. Test uvolňování LDH dále potvrdil, že 10 μmol/L tetrandrin a 0,1 μmol/L CsA po dobu 48 hodin nevykazovaly žádnou toxicitu, zatímco 10 μmol/LU73122 po dobu 10 minut vykazovaly očekávanou toxicitu (obr. 1c). Proto následné buněčné experimenty využívaly tetrandrin a CsA v koncentraci 10 μmol/l a 0,1 μmol/l.

Tetrandrin snížil intracelulární Ca2 plus infux v kultivovaných MPC5 buňkách nadměrně exprimujících TRPC6

Pomocí plasmidové transfekce byl úspěšně vytvořen buněčný model nadměrné exprese TRPC6 v podocytech MPC5. qRT-PCR a analýza western blot prokázala, že úrovně exprese TRPC6 ve skupině Over-TRP se významně zvýšily ve srovnání s úrovněmi ve skupinách NC a Lv-NC (p<0.05; fig.="" 2a="" and="" b).="" and="" full-length="" gel="" and="" blot="" of="" trpc6="" were="" included="" in="" supplementary="" fig.="">

Fluorescenční zobrazování (obr. 2c) a semikvantitativní analýza (obr. 2d) ukázaly, že nadměrná exprese TRPC6 zvýšila intracelulární příliv Ca2 plus, zatímco mezi skupinami NC a Lv-NC nebyly žádné zjevné rozdíly. Deset buněk skupiny OverTRP bylo poté ošetřeno experimentálními léky. Skupiny předléčebných léků (tetrandrin, CsA a U73122) měly inhibiční účinky na intracelulární Ca2 plus influx (P<0.05), while="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" among="" the="" three="" groups="" of="">

Účinky tetrandrinu na aktivitu a expresi kalpainu-1, kalcineurinu, Talinu-1 a nefrinu v buňkách MPC5

Ukázalo se, že intracelulární Ca2 plus aktivuje calpain, cysteinovou proteázu závislou na Ca2 plus, a kalcineurin, protein fosfatázu závislou na Ca2 plus/kalmodulinu. V souladu s předchozími pozorováními byly hladiny aktivity a exprese calpainu a kalcineurinu ve skupině Over TRP všechny vyšší než ve skupinách NC a Lv-NC (p<0.05; fig.="" 3a-e,="" h="" and="" i).="" drop="" intervention="" in="" cultured="" trpc6-overexpressing="" podocytes="" established="" that="" tetrandrine="" inhibited="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" expression.="" te="" calpain="" activity="" and="" calpain-1="" mrna="" levels="" were="" significantly="" reduced="" in="" the="" tetrandrine-exposed="" group="" than="" in="" the="" csa="" intervention="" group=""><0.05; fig.="" 3a="" and="" d).="" western="" blotting="" results="" demonstrated="" a="" considerable="" decrease="" in="" calpain-1="" protein="" levels="" because="" of="" tetrandrine=""><0.05; fig.="" 3c="" and="" h).="" in="" addition,="" calcineurin="" activity="" was="" significantly="" reduced=""><0.05; fig.="" 3b)="" after="" tetrandrine="" exposure,="" but="" the="" mrna="" and="" protein="" expression="" levels="" of="" calcineurin="" remain="" unchanged="" (fig.="" 3e="" and="" i).="" treatment="" with="" csa="" did="" not="" block="" calpain="" activation="" (fig.="" 3a),="" and="" the="" effect="" was="" not="" as="" robust="" as="" that="" of="" tetrandrine="" in="" calpain-1="" mrna="" expression=""><0.05; fig.="" 3d).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 3b,="" e="" and="">

The podocyte cytoskeleton-associated anchoring protein Talin-1 and the slit diaphragm protein nephrin are two specific targets of calpain-1. When treated with tetrandrine, there was an increasing trend in mRNA and protein expression of Talin-1 (p >0.05) a nefrin (str<0.05), compared="" with="" that="" in="" the="" overtrp="" group,="" but="" this="" finding="" was="" not="" statistically="" significant="" among="" the="" three="" treatment="" groups="" (p="">0.05; Obr. 3f, g, ja k).

Gely a bloty plné délky byly zahrnuty v doplňkovém obr. S1.

Experimenty in vivo s použitím krysího modelu ADRN Pro charakterizaci odpovědi na tetrandrinem zprostředkovanou inhibici signalizace TRPC6/calpain{2}} in vivo byl vyvinut model ADRN na krysách. Profily exprese mRNA a proteinu TRPC6 byly významně zvýšeny ve skupině ADRN ve srovnání s těmi u potkanů ​​krmených normálním krmivem (skupina NC; p<0.05; fig.="" 4a="" and="" b).="" consistent="" with="" the="" above="" studies="" in="" cell-based="" models,="" the="" activity="" and="" expression="" levels="" of="" calpain="" and="" calcineurin="" increased="" remarkably="" in="" the="" adrn="" group=""><0.05; fig.="" 4c-g,="" j,="" and="" k)="" than="" in="" the="" nc="">

Léčba CsA neblokovala aktivaci calpainu indukovanou nadměrnou expresí TRPC6 (obr. 4c) a účinek nebyl tak silný jako účinek tetrandrinu na expresi proteinu cal pain-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="" k).="" the="" tetrandrine="" group="" was="" down="" compared="" to="" the="" adr="" group="" (fig.="">

Léčba CsA neblokovala aktivaci calpainu indukovanou nadměrnou expresí TRPC6 (obr. 4c) a účinek nebyl tak silný jako účinek tetrandrinu na expresi proteinu calpain-1 (p<0.05; fig.="" 4j).="" in="" addition,="" the="" inhibiting="" effect="" on="" the="" activity="" and="" expression="" of="" calcineurin="" was="" more="" obvious="" in="" the="" csa-treated="" group="" than="" in="" the="" tetrandrine-treated="" group=""><0.05; fig.="" 4d,="" g,="" and="">

Dále byla hodnocena exprese Talinu-1 a nefrinu (obr. 4h, i, l a m). Hladiny Talinu-1 i nefrinu byly u ADRN potkanů ​​sníženy ve srovnání s hladinami ve skupině NC (p<0.05). upon="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" mrna="" levels="" and="" protein="" expression="" of="" talin-1="" and="" nephrin="" were="" visibly="" increased.="" the="" high-dose="" group="" of="" tetrandrine="" recovered="" the="" expression="" of="" the="" two="" structural="" components,="" similar="" to="" the="" adr+csa="" group="" (p="">0.05).

Gely a bloty plné délky byly zahrnuty v doplňkovém obrázku S2.

Tetrandrin potlačil progresi ADRN a zachránil histopatologii Te efekt tetrandrinu naledvinaNásledně byla vyhodnocena funkce u potkanů ​​Sprague-Dawley léčených ADRN (obr. 5a-d). Mezi skupinami nebyly žádné počáteční významné rozdíly v 24-h proteinurii, Scr a BUN. O 12 týdnů později byly hladiny 24h-proteinurie, Scr a BUN ve skupině ADRN statisticky zvýšeny, zatímco hladiny plazmatického albuminu byly výrazně sníženy ve srovnání s hladinami ve skupině NC (P<0.05). after="" treatment="" with="" tetrandrine,="" the="" levels="" of="" proteinuria,="" scr,="" and="" bun="" were="" markedly="" decreased,="" whereas="" the="" level="" of="" albumin="" was="" significantly="" improved="" compared="" to="" those="" in="" the="" adr="" group=""><0.05). among="" the="" three="" dose-response="" subgroups="" of="" tetrandrine,="" a="" significant="" difference="" was="" observed:="" the="" middle="" dose="" demonstrated="" considerably="" better="" efficacy="" than="" the="" other="" two="" doses=""><0.05). there="" was="" no="" significant="" difference="" in="" the="" levels="" of="" serum="" alanine="" aminotransferase,="" before="" and="" after="" treatment="" among="" groups="" (p="">0.05; údaje nejsou uvedeny).

Změny v histomorfologii jsou ukázány na obr. 6. U ADRN potkanů ​​barvení H&E a Masson ukázalo FSGS, tubulointersticiální fibrózu a renální intersticiální zánětlivou buněčnou infiltraci. Zobrazování glomerulů elektronovou mikroskopií navíc odhalilo vysoce vymazané, ztučněné a srostlé výběžky podocytové nohy s 80–100% PFR podocytů. Potkani v podskupinách tetrandrinu (skupiny se střední dávkou a vysokou dávkou) vykazovali méně lézí než skupina ADR s různým rozsahem a zlepšení ve skupině s vysokou dávkou překonalo zlepšení ve skupině se střední dávkou. Ve skupinách léčených nízkou, střední a vysokou dávkou tetrandrinu byly PFR podocytů 70 – 80 procent, 50 – 60 procent, respektive 30 – 40 procent. Tato data naznačují, že tetrandrin chránil před strukturálním poškozením renálních glomerulů vyvolaným podáváním ADR. Mezi skupinami nebyly signifikantní rozdíly v patologických změnách pod světelným mikroskopem (vysokodávkovaný tetrandrin, CsA a tetrandrin v kombinaci s CsA). Navíc PFR podocytů ve skupině ADRN léčené CsA byla stejná jako ve skupinách léčených vysokou dávkou tetrandrinu.

Diskuse

Podocyty se stávají stále důležitějšími cíli pro intervence u FSGS a souvisejících nefrotických onemocnění [20, 21]. Zde na základě údajů in vitro a in vivo to bylo

prokázali, že ochrana podocytů a antiproteinurický účinek tetrandrinu, neselektivního blokátoru Ca2 plus kanálů, byly zprostředkovány inhibicí intracelulárního Ca2 plus influxu a Ca2 plus závislé signalizační kaskády calpain-1, včetně Talinu-1 , nefrin a kalcineurin. Tetrandrin byl účinnější než v zabránění inhibici calpainu-1.

Podle předchozích zjištění je podocyt TRPC6 kanálem, který se za normálních a patologických podmínek podílí především na změnách Ca2 plus influxu [7, 22]. Je všeobecně známo, že aktivita kalpainu je závislá na hladinách vápníku a je s nimi spojenaledvinaporanění, zejména renální antiglomerulární poranění BM [10, 23]. Mezi 15 identifikovanými izoformami kalpainu se nedávno ukázalo, že kalpain-1 spojuje aktivitu TRPC6 s poškozením podocytů [24]. Uvádí se, že calpain-1 štěpí kotevní protein Talin-1 spojený s cytoskeletem podocytů a protein štěrbinové diafragmy, nefrin, což narušuje integritu podocytů a vyvolává závažnou proteinurii [8–12, 16]. Kalcineurin je Ca2 plus-dependentní fosfatáza, u které bylo dříve prokázáno, že hraje roli v podocytech aledvinafunkce. Hromadící se důkazy stále více naznačují, že calpain může štěpit a aktivovat kalcineurin proteolytickým způsobem [25, 26]. Tato studie vytvořila modely nadměrné exprese TRPC6 virovou infekcí v kultivovaných podocytech a injekcí adriamycinu u SD potkanů. V souladu s tím jsme ukázali, že TRPC6-zprostředkovaný přítok Ca2 plus aktivoval aktivitu calpainu a expresi calpainu-1 člena rodiny calpainu. Zvýšený calpain-1 následně štěpil spodní Talin-1 a nefrin.

Tetrandrin je alkaloid extrahovaný z tradiční čínské léčivé rostliny a je to neselektivní blokátor Ca2 plus kanálů. Zde bylo znovu potvrzeno, že tetrandrin inhiboval nadměrnou expresi TRPC6 a snižoval přítok Ca2 plus jak u buněk, tak u potkanů ​​nadměrně exprimujících TRPC6, jak bylo zdokumentováno dříve [16]. Ještě důležitější je, že tato studie se zaměřuje na intervenující účinek tetrandrinu na kalciově závislou downstream signální dráhu. Bylo pozorováno, že na rozdíl od CsA tetrandrin snižoval kalciem aktivovanou aktivitu neutrální proteázy (calpain). Kromě toho tetrandrin snížil expresi kalciem aktivované proteázové rodiny, calpainu{9}}, a obnovil sníženou expresi Talinu{10}} a nefrinu. Ve srovnání s CsA podávání tetrandrinu vykazovalo lepší účinky na inaktivaci calpainu a downregulovanou expresi calpainu-1. Tyto výsledky ukázaly, že tetrandrin má terapeutický potenciál při poškození podocytů blokováním TRPC6-závislé aktivace calpain{13}} signalizační dráhy.

Fosfolipáza C (PLC) byla identifikována jako TRPC6-vazebný partner [27]. U73122 inhibuje PLC, takže se generuje méně diacylglycerolu a redukuje se otevření kanálu TRPC6 [18, 24]. U73122 byl tedy použit paralelně jako pozitivní kontrola a vykazoval znatelný účinek na snížení intracelulárního Ca2 plus influx, inhibici aktivity calpainu a expresi calpainu-1 v podocytech nadměrně exprimujících TRPC6. In vitro testy cytotoxicity však ukázaly zjevnou toxicitu pro podocyty.

V této studii byla po 12 týdnech injekce ADR u potkanů ​​léčených ADR-- evidentní závažná proteinurie, hypoalbuminémie a zvýšené hladiny BUN a Scr. Světelná mikroskopie odhalila FSGS, tubulointersticiální fibrózu a renální intersticiální zánětlivou buněčnou infiltraci u ADRN potkanů. Elektronová mikroskopie prokázala rozsáhlé vymazání chodidel. Údaje in vivo dále prokázaly, že terapie tetrandrinem může snížit proteinurii, zlepšit funkci ledvin a zmírnit progresi glomerulosklerózy. Po léčbě tetrandrinem byly patologické změny pod světelným mikroskopem a elektronovým mikroskopem, 24-h proteinurie, plazmatický albumin, Scr a BUN u ADRN potkanů ​​významně zlepšeny ve srovnání se změnami ve skupině NC.

Inhibitor kalcineurinu, CsA, se dlouho používá k léčbě proteinuriíledvinaonemocnění [28]. Kalcineurin je klinicky významný jako přímý cíl imunosupresivního léku CsA [17, 29]. CSA snižuje expresi kalcineurinu a snižuje kalcineurinem zprostředkovaný jaderný faktor aktivovaných T-buněk [30–32]. Nedávné důkazy podporují stabilizační účinek CsA na aktinový cytoskelet podocytů, jako je synaptopodin, blokováním defosforylace synaptopodinu zprostředkované kalcineurinem [17]. Bylo také prokázáno, že calpain může štěpit a aktivovat kalcineurin proteolytickým způsobem [25, 26]. Údaje z této studie znovu potvrdily, že CsA inhiboval aktivitu a expresi kalcineurinu silněji než tetrandrin. Jak bylo uvedeno dříve, nezdá se, že by CsA přímo ovlivnil aktivitu calpainu.

Hlavním omezením studie bylo neprokázání účinku závislého na dávce mezi podskupinami tetrandrinu (skupiny s nízkou dávkou, střední dávkou a vysokou dávkou). Jedním z možných vysvětlení by mohlo být, že rozsah dávek, který jsme použili, byl pro krysy příliš vysoký. Kromě toho mohou být individuální rozdíly v experimentu na zvířatech podstatně větší než rozdíly v dávce. Relativně malá velikost vzorku může snížit statistickou sílu. Proto jsou potřebné další studie zahrnující podstatně menší dávky a vhodnou velikost vzorku, aby se zjistilo přesné rozmezí dávek a účinek tetrandrinu u ARDN potkanů.

Stručně řečeno, při regulaci kalciových signálních drah tetrandrin vykazoval zřejmý inhibiční účinek na kalpain-1, zatímco CsA přímo ovlivňoval inhibici kalcineurinu. Tato zjištění naznačují, že kombinovaná léčba tetrandrinem a CsA může ovlivnit více cílů kalciové signalizační sítě pro zlepšení klinických výsledků. Potvrzující studie jsou nezbytné k ověření těchto pozorování a také k objasnění mechanismů synergických účinků.

Zkratky

FSGS: fokální segmentální glomerulární skleróza; MCD: onemocnění s minimální změnou; MN: Membranózní nefropatie; DKD: Diabetikledvinachoroba; TRPC6: protein 6 kationtového kanálu přechodného receptorového potenciálu; Ca2 plus : vápník; TCM: Klasická tradiční čínská medicína; Tet: Tetrandrin; CsA: cyklosporin A; Scr: Sérový kreatinin; BUN: dusík z krve moči; PFR: Rychlost fúze procesů; BM: Bazální membrána; ADRN: Adriamycinem indukovaná nefropatie; PLC: Fosfolipáza C.

rozhodčínces

1. Garg P. Přehled biologie podocytů. Am J Nephrol. 2018;47(Suppl 1):3–13.

2. Khalilpourfarshbaf M, Hajiaghaalipour F, Selvarajan KK a kol. Terapie založené na mezenchymálních kmenových buňkách proti poškození podocytů u diabetické nefropatie. Tissue Eng Regen Med. 2017;14:201–10.

3. Nagata M. Poranění podocytů a jeho následky. Kidney Int. 2016;89:1221–30.

4. Pavenstädt H, Kriz W, Kretzler M. Buněčná biologie glomerulárního podocytu. Physiol Rev. 2003;83:253–307.

5. Riehle M, Büscher AK, Gohlke BO, et al. TRPC6 G757D mutace ztráty funkce souvisí s FSGS. J Am Soc Nephrol. 2016;27:2771–83.

6. Ilatovskaya DV, Blass G, Palygin O, et al. Dráha NOX4/TRPC6 v regulaci vápníku v podocytech a poškození ledvin u diabetického onemocnění ledvin. J Am Soc Nephrol. 2018;29:1917–27.

7. Reiser J, Polu KR, Möller CC, a kol. TRPC6 je kanál spojený s glomerulární štěrbinou a bránicí, který je nezbytný pro normální funkci ledvin. Nat Genet. 2005;37:739–44.

8. Huang H, You Y, Lin X a kol. Inhibice signální dráhy TRPC6 zmírňuje poškození podocytů indukované TGF- 1. Cell Physiol Biochem. 2017;41:163–72.

9. Verheijden KAT, Sonneveld R, Bakker-van Bebber M, et al. Na vápníku závislá proteáza Calpain-1 spojuje aktivitu TRPC6 s poškozením podocytů. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2099–109.

10. Peltier J, Bellocq A, Perez J, et al. Aktivace a sekrece calpainu podporuje glomerulární poškození u experimentální glomerulonefritidy: důkaz z calpastatin-transgenních myší. J Am Soc Nephrol. 2006;17:3415–23.

11. Tian X, Kim JJ, Monkley SM a kol. Talin1 spojený s podocyty je kritický pro udržování bariéry glomerulární filtrace. J Clin Investig. 2014;124:1098–113.

12. Jiang L, Ding J, Tsai H a kol. Nadměrná exprese přechodného receptorového potenciálu kationtového kanálu 6 v podocytech indukuje přeuspořádání cytoskeletu zvýšením intracelulární aktivace Ca2 plus a RhoA. Exp Biol Med (Maywood). 2011;236:184–93.

13. Liu X, Zhou QG, Zhu XC a kol. Screening potenciálních aktivních složek Fangji Huangqi tang při léčbě nefrotického syndromu pomocí integrované metabolomiky založené na „korelacích mezi chemickými a metabolickými profily“. Front Pharmacol. 2019;10:1261.

14. Liu KC, Lin YJ, Hsiao YT a kol. Tetrandrin indukuje apoptózu v buňkách lidského nazofaryngeálního karcinomu NPC-TW 039 stresem endoplazmatického retikula a cestami Ca2 plus/Calpain. Anticancer Res. 2017;37:6107–18.

15. Wang YJ, He LQ, Sun W, a kol. Optimalizovaný projekt tradiční čínské medicíny v léčbě chronického onemocnění ledvin stadia 3: multicentrická dvojitě zaslepená randomizovaná kontrolovaná studie. J Ethnopharmacol. 2012;139:757–64.

16. Yu J, Zhu C, Yin J, et al. Tetrandrin potlačuje přechodný potenciál receptoru poškození podocytů vyvolané nadměrnou expresí proteinu 6 kationtového kanálu prostřednictvím blokování signalizace RhoA/ROCK1. Drug Des Devel Ther. 2020;14:361–70.