Abstraktní
Prozkoumat synergické inhibiční účinkyCiStanche DeserticolaFenyletanoidní glykosidy (PHG) a glabridin (GLA) Při pigmentaci kůže byl optimální hmotnostní poměr PHG k GLA předběžně prověřenin vitroTesty inhibice aktivity tyrosinázy, 1, 1- difenyl -2- Picrylhydrazyl (dpph) Radical Scavenging a 2,2'-ocino-bis (3- ethylbenzothiazolin -6- {8}} {8}} {8}} (ABTSD) Další hodnocení byla provedena pomocí tří buněčných modelů:

UVB-indukovaný model melanogeneze B16F10 k posouzení inhibice syntézy melaninu prostřednictvím tyrosinázové aktivity a obsahu melaninu;

HACAT zánětlivý model indukovaný lipopolysacharidem (LPS) pro vyhodnocení protizánětlivých účinků měřením interleukinu -6 (il -6) a nádorového nekrózového faktoru- (TNF-) suppers;

AAPh (2,2'-Azobis (2- amidinopropan) model HACAT oxidativního stresu vyvolaný dihydrochloridem pro stanovení antioxidační aktivity prostřednictvím superoxiddismutázy (SOD) a katalázy (CAT) zvýšení.

Optimální poměr hmotnosti PHG/GLA byl prostřednictvím těchto modelů identifikován. Výsledky prokázaly, že roztoky PHG/GLA (připravené ve fosfátu pufrovaném fyziologickém roztoku, PBS, pH 6,8) při hmotnostních poměrech 1: 1, 5: 1 a 10: 1 vykazovaly významné inhibice tyrosinázy a synergické antioxidační účinky. Míra inhibice tyrosinázy byla 94,37%, 92,93%a 88,06%; Míra radikálního úklidu DPPH dosáhla 89,44%, 88,72%a 88,10%; Míra vychytávání ABTS⁺ byla 100,13%, 100,01%a 99,87%. Při 25 ug/ml v DMEM, PHGS/GLA (1: 1, 5: 1, 10: 1) nevykazovaly žádnou cytotoxicitu vůči buňkám B16F10 nebo HACAT. Zobrazeno řešení PHGS/GLA (1: 1)inhibice vynikající tyrosinázy(23,80% zbytkovou aktivitu), významněSnížený obsah melaninu(30,90%) a překonal další poměry a monoterapie při potlačování IL -6/TNF- uvolnění a zvyšování aktivity SOD/CAT. Synergická kombinace PHG a GLA účinně zmírnila sKin hyperpigmentace inhibicí melanogeneze, snižování zánětu aZvyšování antioxidační kapacity.

Klíčová slova
CiStancheDeserticola fenyletanoidní glykosidy;; glabridin; synergický účinek; anti-melanogeneze; Antioxidant; protizánětlivé; Farmaceutické suroviny

 

 

 

CiStancheDeserticola extrahovat sVysoká úroveňfenyletanoidní glykosidy pro bělení kůže

Whatsapp nás pro více podrobností

 

Experimentální část

1.1 Materiály, činidla a nástroje

Mouší melanomové buňkyB16F10 (Katalog č.: STCC20013G -1), Wuhan ServiceBio Technology Co., Ltd.

Lidské nesmrtelizované keratinocytyHACAT (Katalog č.: Icell-H066), Icell Bioscience Inc., Shanghai, Čína.

Cistanche fenyletanoidní glykosidy (PHG)aglabridin (GLA), Shaanxi Tianxingjian Biological Chemical Technology Co., Ltd.

Tyrosináza, Hefei Basf Biotechnology Co., Ltd.

Arbutin (ARB)aL-Tyrosin, Aladdin Biochemical Technology Co., Ltd., Šanghaj, Čína.

1, 1- difenyl -2- Picrylhydrazyl (DPPH), Tokio Chemical Industry Co., Japonsko.

2,2'-azino-bis (3- Ethylbenzothiazolin -6- sulfonová kyselina) Diamonliaová sůl (ABT), Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Kyselina askorbová (VC), Továrna na chemické činidlo Tianjin Damao.

Persulfát draslíkuabezvodý ethanol, Tianjin Zhiyuan Chemical Reagent Co., Ltd.

Hydroxid sodný, Chengdu Huayi Pharmaceutical Ecipientient Manufacturing Co., Ltd.

Fosfát dipotasium, Shanghai Sanpu Chemical Co., Ltd.

L-dopa, Shanghai Yuanye Bio-Technology Co., Ltd.

Kit Cell Counting Kit -8 (CCK8), Peking Sinoinvitrogen Biotechnology Co., Ltd.

Triton X -100, dimethylsulfoxid (DMSO), 2,2'-Azobis (2- methylpropionamidin) dihydrochlorid (aaph), alipopolysacharid (LPS), Peking Solarbio Science & Technology Co., Ltd.

DMEM vysoko-glukózové médium, Thermo Fisher Scientific (Čína).

Sérum hovězího masa (FBS), Sigma-Aldrich (Shanghai) Trading Co., Ltd.

Roztok penicilin-streptomycinu, Shanghai Dashier Bio-Technology Co., Ltd.

Lidský il -6 Kit ELISA, Lidská souprava TNF-ELISA, aSada lidské kočky Elisa, Wuhan Fine Biotech Co., Ltd.

Testovací souprava celkové superoxiddismutázy (SOD), Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute. Všechna činidla byla analytického stupně.

Použité nástroje:

Multiskan FC plná vlnová délka čtečky mikrodestičekaHeracell 371 CO2 Inkubátor, Thermo Fisher Scientific, USA.

KQ -200 VDB Ultrazvukový čistič, Kunshan Ultrasonic Instruments Co., Ltd.

DVKW-D -2 Digitální termostatická vodní lázeň, Peking Yongguangmingová továrna na lékařské nástroje.

Dhg -9246 Elektrická termostatická sušení výbuchu, Shanghai Jinghong Experimental Equipment Co., Ltd.

Ultrafialový záření UVB KN4006B(Intenzita ozáření: 8 MW/CM²), Xuzhou Kenuo Medical Instrument Equipment Co., Ltd.

1.2 Metody

Nejprve byly PHG a GLA rozpuštěny ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS, pH =6. 8) nebo 50% ethanolového roztoku pro přípravu řešení s hmotnostními koncentracemi{{{0}}. 0 0 1, 0. {{1 0}} 05, 0,025, 0,1, 0,4, 0,8, 1,6 a 2,0 g/l. Poté byly PHG a GLA smíchány v poměrechM (PHGS): M (GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1: 5, 1:10, 1:20 a 1:40, pro přípravu roztoků PHGS/GLA s celkovou hmotnostní koncentrací0.4 g/L, označeno jakoPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), respektive.

 

1.3 Biochemické experimenty

1.3.1 test inhibice aktivity tyrosinázy

V desce 96-,50 μl roztoku testovacího vzorku, 50 μl PBS (pH =6. 8), a50 ul roztoku L-tyrosinu (1 g/l)byly postupně přidány. Destička byla inkubována ve 37 stupňové vodní lázni po dobu 10 minut. Pak,5 0 μl roztoku tyrosinázy (0,4 g/l, ekvivalent 200 U/ml)byl přidán a deska byla opět inkubována ve 37 stupňové vodní lázni dalších 10 minut.

Arbutin (ARB)byl použit jako pozitivní kontrola aPBS (ph =6. 8)byl použit jako prázdné ovládání.

Absorbance roztoku na490 nmbyl měřen pomocí čtečky mikrodestiček a in vitro tyrosináza inhibice (%) byla vypočtena pomocí rovnice (1).

 

 

Ve vzorci:

A _ Reakceje absorbance roztoku vzorku obsahujícího L-tyrosinový roztok, roztok PBS a tyrosinázy.

A _ Ovládání reakceje absorbance roztoku vzorku obsahujícího L-tyrosinový roztok a PBS bez roztoku tyrosinázy.

A _ prázdnéje absorbance roztoku obsahujícího L-tyrosinový roztok, PBS a tyrosinázový roztok bez vzorku.

A _ prázdná ovládáníje absorbance roztoku obsahujícího L-tyrosinový roztok a PBS bez roztoku vzorku a tyrosinázy.

1.3.2 Stanovení aktivity DPPH volných radikálů

Nejprve, {{0}}. 0197 G (0,05 mmol) DPPH byl přesně zvážen a rozpuštěn v 250 ml bezvodého ethanolu, aby připravil pracovní roztok DPPH s koncentrací0. 2 mmol/l.

Poté byly PHGS a GLA rozpuštěny v 50% ethanolu, aby se připravily ethanolové roztoky PHG a GLA s hmotnostními koncentracemi{{{0}}. 0 0 1, 0. 0 1, 0,1, 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 a 2,0 g/l. Roztoky Ethanolu VC byly připraveny stejným způsobem.

Následně byly ethanolové roztoky PHG a GLA smíchány v poměrechM (řešení PHGS): M (řešení GLA)=40: 1, 20: 1, 10: 1, 5: 1, 1: 1, 1: 5, 1:10, 1:20, 1:40Získat 9 ethanolových řešení PHGS/GLA s různými hmotnostními poměry, označenými jakoPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40).

Konečně,100 ul každého roztoku vzorkua100 ul pracovního řešení DPPHbyly přidány do desky 96-, rovnoměrně smíchané a inkubovány při teplotě místnosti ve tmě po dobu 30 minut. Absorbance na517 nmbyl měřen pomocí čtečky mikrodestiček. VC byl použit jako pozitivní kontrola a každý experiment byl opakován třikrát.

Rychlost vychytávání volných radikálů DPPH (%) byla vypočtena pomocí rovnice (2).

 

Ve vzorci:

A1je absorbance roztoku vzorku + pracovní roztok DPPH.

A2je absorbance 50% pracovního roztoku ethanolu + DPPH.

A3je absorbance roztoku vzorku + 50% ethanol.

 

1.3.3 Stanovení ABTS⁺ aktivita vychytávání volných radikálů

První,1 g (1,82 mmol) ABTbyl rozpuštěn v deionizované vodě, aby připravil pracovní roztok ABT s konečnou koncentrací7,4 mmol/l. 0. 5 G Persulfátu draslíkubyl rozpuštěn v deionizované vodě, aby připravil pracovní roztok personálu draslíku s konečnou koncentrací2,6 mmol/l. Stejné objemy pracovního roztoku ABTS a pracovní roztok personálu draselného byly smíšeny a ponechány reagovat ve tmě po dobu 12 hodin, aby se připravilo pracovní roztok ABTS⁺.

Poté, ethanolové roztoky PHG, GLA a VC, jakož i ethanolové řešení PHGS/GLA s poměryPHGS/GLA (40: 1) ~ PHGS/GLA (1:40), byly připraveny podle metody popsané v části 1.3.2.

Konečně,40 ul každého roztoku vzorkua160 μl pracovního řešení ABTS⁺byly přidány do desky 96-, rovnoměrně smíchané a reagovaly ve tmě při teplotě místnosti po dobu 6 minut. Absorbance roztoku na734 nmbyl měřen pomocí čtečky mikrodestiček.

Rychlost vychytávání volných radikálů (%) ABTS⁺ byla vypočtena pomocí rovnice (3).

 

 

Ve vzorci:

A1je absorbance roztoku vzorku + ABTS⁺ pracovní roztok.

A2je absorbance deionizované vody + abts⁺ pracovní roztok.

A3je absorbance roztoku vzorku + deionizovaná voda.

1,4 buněčných experimentů

1.4.1 Buněčná kultura

Po oživení buněk B16F10 a HACAT byly nasazeny do DMEM vysoko-glukózového média (obsahující 10% fetální hovězí sérum a 1% roztoku penicilin-streptomycinu) a kultivovány na37 stupňů, 5% CO2, a70% vlhkostv inkubátoru po dobu 24 hodin. Stav růstu buněk byl pozorován pod mikroskopem a na základě stavu růstu buněk byly prováděny změny nebo průchody středních změn nebo průchodů.

1.4.2 Experimentální seskupení

Logaritmické fáze B16F10 a HACAT buňky byly naočkovány do desek studny 96- při vhodné hustotě buněk a kultivovány po dobu 24 hodin, aby se umožnila dodržování buněk. Roztoky vzorků s různými koncentracemi byly připraveny pomocí DMEM média.

Experimentální skupiny byly následující:

Normální skupina

Modelová skupina

PHGS nízkodávková skupina(125 ug/ml)

Skupina střední dávky PHGS(250 ug/ml)

PHGS vysokodávková skupina(500 ug/ml)

Skupina GLA s nízkou dávkou(6,25 ug/ml)

Skupina GLA střední dávka(12,5 ug/ml)

GLA vysokodávková skupina(25 ug/ml)

Skupina PHGS/GLA (1: 1)(25 ug/ml)

Skupina PHGS/GLA (5: 1)

Skupina PHGS/GLA (10: 1)

ProModel pigmentace indukovaný UVB v buňkách B16F10, buňky modelové skupiny byly ošetřeny30 μl PBS (pH =7. 4)a ozářené pod UVB ultrafialovým zářením3 cm pod zařízenímpro110 sekund. Experimentální skupiny byly předem ošetřeny100 ul různých řešení vzorkůpřed přidáním 1 hodinu30 ul PBSa ozáření pod zařízením UVB po dobu 110 sekund. Normální skupina byla kontinuálně ošetřena vysoko-glukózovým DMEM médiem a skupina Blank neobsahovala buňky, ale byla nahrazena stejným množstvím média.

ProLPS-indukovaný zánětlivý model v HACAT buňkách, skupina modelu byla ošetřena20 UG/ML LPS PBS Řešenípo dobu 24 hodin. Experimentální skupiny byly předem ošetřeny100 ul různých řešení vzorkůpo dobu 24 hodin před přidáním20 UG/ML LPS Řešenípo dobu dalších 24 hodin. Normální skupina byla kontinuálně ošetřena vysoko-glukózovým DMEM médiem a skupina Blank neobsahovala buňky, ale byla nahrazena stejným množstvím média.

ProAAPH indukovaný model oxidačního stresu v HACAT buňkách, skupina modelu byla ošetřena25 mmol/l aaph řešenípo dobu 24 hodin. Experimentální skupiny byly předem ošetřeny100 ul různých řešení vzorkůpo dobu 24 hodin před přidáním25 mmol/l aaph řešenípo dobu dalších 24 hodin. Normální skupina byla kontinuálně ošetřena vysoko-glukózovým DMEM médiem a skupina Blank neobsahovala buňky, ale byla nahrazena stejným množstvím média.

Každá skupina byla zřízena3 Replikujte studnya kultivoval na37 stupňů, 5% CO2, a70% vlhkostv inkubátoru.

1.4.3 Test cytotoxicity

Cytotoxicita byla měřena pomocíMetoda CCK8. Logaritmické fáze B16F10 a HACAT byly stráveny s0. 25% trypsinpo dobu 3 minut. Poté, co bylo trávení zastaveno médiem, byly buňky opakovaně pipetovány, aby se připravila suspenze buněk s hustotou1 × 10⁴ buňky/ml. Buňky byly rovnoměrně nasazeny do 96- Well Deska na100 μl na jamku, a PBS byl přidán do periferních jamek. Po dodržování buněk byly přidány různé koncentrace roztoků vzorku, s3 replikujte studny na skupinua buňky byly kultivovány na37 stupňů, 5% CO2, a70% vlhkostpro24, 48 a 72 hodinpřed vyřazením média.

Pro všechny skupiny,100 μl vysoko-glukózového média CCK8 DMEM (obsahující 10% CCK8)byl přidán a inkubován pro60 minut. Absorbance roztoku na450 nmbyl měřen pomocí čtečky mikrodestiček.

Životaschopnost buněk (%) byla vypočtena pomocí rovnice (4).

 

Ve vzorci:

A _ ošetřenoje absorbance buněk obsahujících studnu, roztoku CCK8 a roztoku vzorku.

A _ prázdnéje absorbance roztoku obsahujícího studnu obsahující médium a CCK8, ale bez buněk.

A0je absorbance buněk obsahujících studnu a roztoku CCK8, ale bez roztoku vzorku.

1.4.4 Test aktivity tyrosinázy

Metoda L-DOPA byla použita k měření aktivity tyrosinázy. Po ošetření buněk pro48 hodinJak je popsáno v části 1.4.2, supernatant byl vyřazen a studny byly dvakrát promyty PBS (pH =7. 4). Pak,50 μl 1% Triton X -100 řešeníbyl přidán ke každé studni a okamžitě umístěn do mrazničky –80 stupňů pro30 minut. Buňky byly rozmrazeny při teplotě místnosti, aby se vyvolala lýzu.

Po předběžném oteplování na37 stupňůpro5 minut, 10 μl roztoku 10 mmol/l l-dopabyl přidán ke každé studni a inkubován na37 stupňů, 5% CO2 a 70% vlhkostipro1 hodina. Absorbance na475 nmbyl měřen pomocí čtečky mikrodestiček. Každý experiment byl opakovántřikrát, a aktivita tyrosinázy (%) byla vypočtena pomocí rovnice (5).

Ve vzorci:

A _ experimentje absorbance buněk obsahujících studnu a roztok vzorku pod ozářením UVB.

A _ normálníje absorbance buněk obsahujících studnu a roztoku vzorku bez ozáření UVB.

A _ prázdnéje absorbance média obsahujícího studnu, ale bez buněk.

 

1.4.5 Měření obsahu melaninu

Metoda lýzy NaOH byla použita k měření obsahu melaninu. Po ošetření buněk pro72 hodinJak je popsáno v části 1.4.2, supernatant byl vyřazen a jamky byly dvakrát promyty PBS.100 ul vodného roztoku NaOH obsahujícího 10% DMSO (1 mol/l)byl přidán ke každé jamce a deska byla umístěna do a90 stupňů troubypro1 hodina. Absorbance na490 nmbyl měřen pomocí čtečky mikrodestiček. Každý experiment byl opakovántřikrát, a obsah melaninu (%) byl vypočítán pomocí rovnice (5).

 

1.5 Měření zánětlivých faktorů a indikátorů oxidačního stresu

Po ošetření buněk pro48 hodinJak je popsáno v části 1.4.2,HACAT buňkyZ každé skupiny byly shromážděny pomocí buněčné škrabky, odstředěné a supernatant byl odebrán. Koncentrace IL -6 a TNF- byly měřeny podle pokynů souprav ELISA.

Po ošetření buněk pro48 hodinBuňky HACAT byly shromážděny pomocí buněčné škrabky, které byly podrobeny opakovaným cyklům zmrazení a rozmrazení, aby vyvolaly lýzu buněk a odstředěny na12, 000 RPM po dobu 10 minut při 4 stupňů. Byl shromážděn supernatant a činnostiDRNa koncentraceKOČKAbyly měřeny pomocí instrukcí pro soupravu ELISA.

 

1.6 Měření kombinace indexu

TheMetoda kombinovaného indexu (CI)[20] byl použit k vyhodnocení, zda kombinace PHG a GLA při různých hmotnostních poměrech vykazovala synergické účinky při inhibici aktivity tyrosinázy a antioxidace. Kombinovací index byl vypočítán pomocí rovnice (6).

 

Ve vzorci:

D1aD2představují příslušné koncentrace (g/l) obou léků v kombinované léčbě potřebné k dosaženíx% aktivita.

Dxpředstavuje koncentraci (g/l) každé jednotlivé látky, pokud je použita samostatně k dosaženíx% aktivita.

TheCompusyn Softwarebyl použit pro výpočty:

CI> 1označuje antagonistický účinek.

CI=1označuje aditivní efekt.

CI <1Označuje synergický účinek.

 

1.7 Analýza dat

Všechna data byla vyjádřena jako"Průměrná ± standardní odchylka (x̄ ± s)"a diskuse byly založeny na průměrných hodnotách.

Statistická analýza byla provedena pomocíGraphPad Prism 9.5. 0. Pro srovnání mezi více skupinami byla použita jednosměrná ANOVA (analýza rozptylu). AP-hodnota <0. 05byl považován za statisticky významný.