Trvalá lokální inhibice trombinu zachovává renální mikroarchitekturu a funkci po nástupu akutního poškození ledvin

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Ian Vargas a kol

Abstraktní

Akutní poškození ledvinManagement (AKI) zůstává převážně podpůrný, protože žádná specifická terapeutická činidla zaměřená na singulární signální dráhy v klinických studiích neuspěla. Zde uvádíme, že inhibice trombinem řízené srážení a zánětlivé signalizace s použitím lokálně působících nanočástic perfluorokarbonů cílených na trombin (PFC NP) chrání renální vaskulaturu a široce moduluje různé zánětlivé procesy, které způsobují renální ischemicko-reperfuzní poškození. Každý PFC NP byl komplexován s ~13 650 kopiemi přímého inhibitoru trombinu, PPACK (prolin-fenylalanin-arginin-chlormethyl-keton). Myši léčené po nástupu AKI pomocí PPACK PFC NP vykazovaly downregulované infiltráty VCAM-1, ICAM-1, PGD2 prostanoid, M-CSF, IL-6 a žírné buňky. Mikrovaskulární architektura, tubulární bazální membrány a komponenty kartáčového lemu byly lépe zachovány. Nereperfuze byla snížena, jak je indikováno sníženým zachycováním červených krvinek a nehemovým železem.ledvinyfunkce a tubulární nekróza se zlepšily za 24 hodin oproti neléčené kontrolní skupině, což naznačuje přínos pro duální inhibici trombózy a zánětu pomocí PPACK PFC NP.

klíčová slova: Akutní poškození ledvin; Trombóza; Zánět; perfluorokarbonové nanočástice; Poškození plavidla

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Akutní poškození ledvin(AKI) je častým klinickým problémem u mladých i starých lidí se vzrůstající incidencí a nepřijatelně vysokou úmrtností, která se v posledních desetiletích podstatně nezlepšila.1,2 Syndrom se typicky rozvíjí po náhlém přechodném poklesu celkového nebo regionálního průtoku krve do aledvinajako důsledek řady inzultů včetně hypotenze, sepse, toxinů atd.3 AKI evokuje komplexní paletu patofyziologických molekulárních hráčů a signalizačních událostí v chorobném procesu, který se v průběhu času vyvíjí ve stádiích.3–6 Selektivní a specifická molekulárně cílená lékařská terapie pro AKI dosud neexistují, a to navzdory naléhavé lékařské potřebě.7 Po letech předklinického a klinického výzkumného úsilí zůstává současná léčba v podstatě podpůrná.

Zde předpokládáme, že terapeutické intervence na bázi nanočástic zaměřené na trombin, které mohou zachovat mikrovaskulární integritu a bariérovou funkci a současně snížit zánětlivou signalizaci, budou přínosem pro výsledky AKI. Trombin je hlavní aterogenní molekula a molekula pro hojení ran pohánějící mnoho dalších zánětlivých molekul, které se účastní endoteliální aktivace po poranění, jako je NF-KB,8 NADPH oxidáza,⁹

a další prostřednictvím proteázou aktivovaných receptorů (PAR-1) na endotelu i makrofázích.10,11 Všechny typy buněk vledvinazaznamenali změny ve vzoru genové exprese, které zahrnují zvýšenou expresi markerů poranění a vývojových genů, jak ukázali Rudman-Melnick et al v časovém průběhu studie jednobuněčného sekvenování na jednostranné ischemii-reperfuziledvinaPoranění.12 Studie sekvenování jednojaderné RNA na hlodavcích u bilaterálního ischemicko-reperfuzního poškození ledvin13 navíc identifikovala specifickou buněčnou populaci proximálního tubulu nadměrně exprimující prozánětlivé a profibrotické geny po teplém ischemicko-reperfuzním poškození. Tyto výsledky ukazují, že zánět by měl představovat užitečný terapeutický cíl. Ačkoli se tvorba pevných intravaskulárních sraženin u AKI jeví jako neobvyklá, dále jsme předpokládali, že zmírnění mikrovaskulární prokoagulační aktivity prostřednictvím lokálně působících silných antagonistů nanočástic antitrombinu14–17 by mohlo zlepšit průtok krve, snížit „no-reflow“ a zeslabit zánětlivou signalizaci, aby se zachovala funkce ledvin.

Mezi kritické problémy, které hovoří proti aplikaci přímých inhibitorů trombinu k prevenci renálního ischemicko-reperfuzního poškození (IRI), patří jejich potenciální toxické vedlejší účinky a riziko systémového krvácení. Co se týče trombózy, konvenční antikoagulační terapeutika nebyla zvláště úspěšná, ačkoli solubilní trombomodulin může vykazovat renoprotektivní účinky,18,19 stejně jako může aktivovat protein C,20,21 a antitrombin III,22 i když s potenciálními komplikacemi nadměrného krvácení.21 Navíc warfarin i dabigatran byly spojovány s renální toxicitou.^23,24Skutečnost, že tyto antikoagulační přístupy dosud klinicky neuspěly, však nesnižuje potenciální hodnotu trombinu jako cíle v důsledku jeho dvojí funkce jak při koagulaci, tak při zánětu. Ačkoli neexistuje žádná klinická studie týkající se léčby AKI VEGF, předklinická studie prokázala, že VEGF je důležitým mediátorem v renoprotekci během AKI,25 což dále podporuje náš navrhovaný hypotetický terapeutický mechanismus zachování renálních cév při ochraně funkce ledvin během AKI.

Vyvinuli jsme stabilní, biokompatibilní a nefrotoxickou platformu perfluorokarbonových nanočástic (PFC NP), která inhibuje proteázovou aktivitu trombinu, aniž by způsobovala krvácivou diatézu.14,15 Nativní PFC NP jsou schváleny FDA jako krevní náhrady26 a obsahují kapalný perfluorokarbon jádro a vnější obal fosfolipid-surfaktant a v rozmezí od ~160-250 nm. V nedávných předběžných studiích AKI jsme podali antitrombin PFC NP jako předléčbu, abychom potvrdili, že trombin je cenným cílem pro urychlení obnovy funkce ledvin zčásti zachováním mikrovaskulární integrity a snížením nereperfuze u IRI, když je podán před ischemickou reperfuzí. poranění.16 Antitrombinový PFC NPS také chrání renální aloštěpy před IRI a vykazuje výrazné snížení procenta parenchymální tubulární nekrózy spojené se zvýšenou životností ledvin po transplantaci.27 Není však jasné, zda je tato antitrombózní nanočástice stále účinná po nástupu AKI, což představuje zcela jiný soubor populací pacientů.

Proto jsme se v této práci snažili rozšířit použití tohoto přístupu na zavedenou AKI po IRI, abychom objasnili její potenciál pro klinickou translaci. Pro důkaz konceptu používáme PPACK (Phe[D]-Pro-Arg-chloromethylketon) jako antitrombinovou skupinu pro konjugaci s PFC NP, o které jsme ukázali, že předchází trombinové signalizaci a mikrovaskulární trombóze na modelech aterosklerózy a akutního poškození ledvin ( AKI).14–17 Samotný PPACK je dobře známý přímý a ireverzibilní inhibitor trombinu, jehož volná forma je ledvinami odstraňována příliš rychle na to, aby byla hodnotná jako terapeutické činidlo.14,15 Zde objasňujeme časné patofyziologické reakce na PPACK PFC NP terapie, která omezuje zánětlivé signalizační události v ledvinách i systémově, zachovává renální mikroarchitekturu a zmírňuje vaskulární poškození. Tato data naznačují, že tento terapeutický přístup k probíhající AKI založený na nanočásticích by mohl připravit půdu pro klinický vývoj antitrombinového činidla, které má lokálně omezené pleiotropní účinky a může být bezpečně podáváno v raných fázích AKI.

Metody

Formulace nanočástic

Nanočástice perfluorovaných uhlovodíků byly formulovány tak, jak bylo popsáno dříve.14 Stručně, lipidová směs 98,5 mol procent vaječného L- - fosfatidylcholinu a 1,5 mol procent 1,2-distearoylsnglycero- 3-fosfoethanolaminu-N-[ karboxy(polyethylenglykol)-2000] (sodná sůl) (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL) byl připraven ve směsi chloroform:methanol (3:1), před sušením za vzniku lipidového filmu ve vakuu. Lipidový film (2 procenta (hmotnost/objem)) byl poté spojen s PFOB (20 procent (objem/objem)) (Exfluor Research Corp.) (glycerin 1,7 procenta (hmotnost/objem)) (Sigma, St. Louis, MO ) a vodou MilliQ, před emulgací (Microfluidics Inc) na ledu po dobu 4 minut při 20,000 psi. Pro funkcionalizaci nanočástice pomocí konjugace PPACK jsme použili metodu amin-karboxylové vazby. Nanočástice (1 ml) byly nejprve smíchány s 2 mg EDCI 1-[3-(dimethylamino)propyl]-3-ethylkarbodiimidmethiodid (Sigma, St. Louis, MO) po dobu 1 hodiny před přidáním 12,5 mg PPACK (BACHEM, Torrance, CA) na orbitální třepačce při pokojové teplotě přes noc. Byla provedena dialýza s limitem molekulové hmotnosti 3000-5000 g/mol (Fisher Scientific, Waltham, MA), aby se odstranil přebytek EDCI a PPACK. Podrobný způsob formulace byl zahrnut v doplňkových materiálech.

Model akutního poškození ledvin

Dospělé myši C57BL/6 (n=22) podstoupily bilaterální renální teplou ischemickou reperfuzi k vyvolání akutního poškození ledvin. Zvířata byla anestetizována koktejlem ketaminu (85 mg/kg) a xylazinu (13 mg/kg) před provedením laparotomie k vyvolání 17 minut teplé ischemie. Byla zavedena střední abdominální incize k obnažení renální tepny i žíly. Renální ischemie byla indukována okluzivními svorkami na tepně i žíle, aby se omezil průtok krve do ledvin. Úspěšné zastavení průtoku krve ledvinami bylo potvrzeno vizuálně změnou barvy ledvin z růžové na tmavě fialovou. Tělesná teplota myší byla udržována na 37 stupních pomocí zahřívacího systému pro malé zvíře. Svorky byly uvolněny po 17 minutách, aby bylo možné obnovit průtok krve ledvinami, což bylo potvrzeno změnou barvy ledvin na růžovou. Operační rána byla poté uzavřena ve vrstvách a zvířata byla monitorována a po volném pohybu vrácena do klece. Po reperfuzi po dobu 2 hodin jedna dávka PPACK

PFC NP ({{0}},5 ml/kg PFC NP; 0,05 mg/kg PPACK) nebo prostý (kontrolní) PFC NP byl podáván intravenózně injekcí do ocasní žíly. Vzhledem k tomu, že naše předchozí studie prokázala, že jedna preventivní dávka PPACK PFC NP vykazovala renální ochranné účinky,16 zde jsme aplikovali léčbu jednou dávkou po nástupu AKI, abychom vyhodnotili její renální ochranný účinek. Postupy a protokoly byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee na University of South Florida.

Sběr a konzervace tkání 24 hodin po podání nanočástic byly myši usmrceny a ledviny byly extrahovány pro analýzu. Před odebráním ledviny pro histologické a molekulární vyhodnocení byla srdeční punkcí odebrána krev pro následnou analýzu séra a poté byla každá myš systémově perfundována normálním fyziologickým roztokem (kat. č.: 23-535435, Fisher Scientific, Waltham, MA) až do rezidua krev byla vypláchnuta z ledvin. K odběru séra byla celá krev srážena při teplotě místnosti po dobu 30 minut a poté byla centrifugována při 2000 x g po dobu 10 minut při 4 stupních. Odebrané sérum bylo skladováno při -80 stupních před vyhodnocením močovinového dusíku a cytokinů v krvi. Pro histologickou analýzu byly vyříznuté ledviny fixovány v 10% formalínu před zpracováním tkáně, zalitím do parafínu a nařezáním. Pro hodnocení eikosanoidů byly vyříznuté ledviny dále rozřezány, aby se oddělila kůra a dřeň, před rychlým zmrazením v tekutém dusíku a uskladněním při teplotě -80 stupňů pro analýzu.

Histologie

Podrobné histologické barvení a metody analýzy dat byly zahrnuty v doplňkových materiálech. Sklíčka byla zbavena parafinu a rehydratována před barvením hematoxylinem a eosinem, barvením periodickou kyselinou Schiff (PAS) (kat. č.: ab150680, Abcam, Cambridge, MA), barvení pruskou modří, imunohistochemické barvení k vizualizaci CD31, VCAM-1, a exprese ICAM-1 a barvení žírných buněk-eosinofilů (kat. č.: 150665, Abcam, Cambridge, MA). Údaje o kontrolním barvení izotypu králičího IgG jsou uvedeny na doplňkových obrázcích 2 a 3, aby se demonstrovala specifita výsledků imunohistochemického barvení. Všechny mikroskopické snímky byly pořízeny při stejném nastavení výkonu a parametrů digitalizace. Mikroskopická hodnocení byla prováděna mikroskopem Olympus ve světlém poli vybaveném digitálním fotoaparátem DP27 pro záznam snímků patologických řezů při 20× nebo 40× zvětšení. U všech snímků byla provedena dvojitě slepá analýza dat.

Dusík močoviny v krvi (BUN)

Měření BUN byla prováděna s Urea Nitrogen (BUN) Colorimetric Detection Kit (kat. č.: K024-H5, Arbor Assays, Ann Arbor, MI) podle pokynů výrobce.

Příprava a analýza eikosanoidů

Eikosanoidy byly extrahovány pomocí modifikovaného extrakčního procesu a analyzovány pomocí UPLC ESI-MS/MS, jak bylo popsáno dříve.28 Podrobné metody použité pro tuto studii byly zahrnuty v doplňkových materiálech.

Hodnocení sérových cytokinů

Upravený soubor cytokinů byl zakoupen od R&D Systems (Minneapolis, MN) a vyhodnocen pomocí Luminex 200 (Northbrook, IL) podle pokynů v uživatelské příručce.

Statistika

Výsledky jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Statistická analýza pro každý experiment je shrnuta v doplňkové tabulce 1. Bylo použito dvoustranné t testování nebo jednocestná ANOVA se Scheffeho testem. Pro výpočet Pearsonovy hodnoty r byly provedeny korelační analýzy pro vybrané dvojice metrik. Statistická významnost rozdílů byla připsána na P <>

Výsledek

Léčba PPACK PFC NP zlepšuje funkci ledvin po nástupuakutní poškození ledvin.

Mikroskopické vyšetření celkového vzhledu ledvin 24 hodin po postreperfuzní léčbě antitrombinem (PPACK) PFC NP indikovalo zmírnění poškození u zavedené AKI (obrázek 1, AB). Poranění ve 24. hodině bylo lokalizováno převážně v kortikomedulární junkci ledviny a přednostně byly poškozeny proximální tubuly. Typ poranění byl nekróza koagulačního typu. V 24-hodinovém časovém bodě se objevil menší zánětlivý infiltrát. Kvantifikace tubulárního poškození v řezech obarvených H&E (obrázek 1, C) odhalila, že myši ošetřené PPACK PFC NP vykazovaly celkové snížení akutní tubulární nekrózy (ATN) o 33,95 procenta oproti kontrolním myším léčeným NP (24,44 ± 1,76 procenta oproti 37). 16}} ± 4,96 procent v tomto pořadí; P=0,035). Obrázek 1, D ukazuje, že myši, které dostávaly léčbu, vykazovaly 44,03 procenta snížení BUN za 24 hodin (110,96 ± 6,21 mg/dl vs 62,10 ± 8,71 mg/dl pro kontrolní NP vs PPACK PFC NP; P=0,0002) . Tyto časné příznivé výsledky odrážejí ochranu, kterou jsme dříve pozorovali u antitrombinových režimů před léčbou po 24 hodinách16, což naznačuje, že trombin nadále hraje kritickou roli ve vývoji AKI po počátečním ischemickém poškození.

Obrázek 2 ilustruje regionální odezvy struktur bazální membrány a kartáčového lemu na léčbu antitrombinem na základě semikvantifikace barvení PAS. Obrázek 2, AC ukazuje, že léčba zvýšila procento glomerulů s intaktní bazální membránou z 51,43 procent ± 2,61 procent na 70.{10}} procent ± 3,09 procent (P=0,00033). Obrázek 2, DF ilustruje hlubší poškození, které utrpěly trubicové kartáčkové lemy, kde pouze menšina zachovala plně neporušené kartáčkové lemy po 24 hodinách. Nicméně ošetření zlepšilo integritu kartáčového okraje o 50,79 procent (P=0,015). Léčba snížila celkový rozsah proteinových agregátů o 54,09 procent (P=0,032) (obrázek 2, GI), což by mohlo zabránit tubulární kongesci pro udržení renální funkce.

Léčba PPACK PFC NP zachovala vaskulární integritu po nástupu IRI

Pro kvantifikaci potenciálu PPACK PFC NP chránit vaskulární elementy byly řezy ledvin obarveny na CD31.

Obrázek 3 ilustruje větší prevalenci barvení CD31 po 24 hodinách v kůře a dřeni myší léčených PPACK NP oproti kontrolnímu NP (obrázek 3, A a D versus B a E). V kortikálních oblastech zahrnovalo barvení CD31 4,28 procenta ± 0,62 procenta léčených vs 1,75 procenta ± 0,34 procenta u kontrolních zvířat (P=0.0{{{101} 25}}18), nebo relativní nárůst o 144,57 procent (obrázek 3, C). V medulárních oblastech zahrnovalo barvení CD31 3,24 procenta ± 0,38 procenta u zvířat léčených PPACK NP oproti 1,91 procenta ± 0,29 procenta u zvířat léčených kontrolním NP (P=0,0073) nebo relativní 88,81 procenta zvýšení (obrázek 3, F) . Mikroskopické hodnocení vaskulární integrity neodhalilo žádnou znatelnou arteriolární nekrózu v 24-hodinovém časovém bodě.

Vzhled červených krvinek (RBC) na mikroskopických snímcích se lišil u myší ošetřených PPACK NP a kontrolních myší ošetřených NP po 24 hodinách (obrázek 4). Protože myši byly systémově perfundovány, aby se vymyla krev v perfuzních renálních oblastech, přítomnost RBC indikovala buď agregaci ve špatně perfundovaných mikrovaskulárních konduitech nebo intersticiální extravazaci, případně obojí. V glomerulech (obrázek 4, AB) byly červené krvinky pozorovány ve vaskulárních chomáčích, ale zřídka v Bowmanově pouzdru po 24 hodinách. Léčba snížila prevalenci glomerulárních RBC o 40,78 procent (P=0,007) (obrázek 3, C). V dřeni (obrázek 4, DE) nebylo možné určit definitivní umístění červených krvinek na základě H&E skvrn, ale léčba snížila celkovou prevalenci červených krvinek o 34,92 procent (P=0,049) (obrázek 4, F) .

Pro další vymezení důsledků ukládání a zachycení RBC bylo provedeno barvení nehemovým železem pruskou modří. Skvrny železem byly pozitivní v glomerulárních i tubulárních buněčných strukturách. Léčba snížila prevalenci železa v kůře (44,23 procenta snížení; P=0,022) (obrázek 5, AC) a dřeni (50,50 procenta snížení; P=0,006) (obrázek 5, DF ) po 24 hodinách, v souladu s účinkem léčby antitrombinem na zachycení červených krvinek.

Léčba PPACK PFC NP redukovala lokální a systémový zánět po nástupu AKI

Abychom objasnili úlohu trombinu při udržení endoteliální aktivace a lokálního zánětu v ledvině, kvantifikovali jsme ICAM-1 i VCAM-1. Exprese VCAM-1 v kortexu se léčbou PPACK nezměnila (obrázek 6, AC). Exprese VCAM- 1 v dřeni však byla po léčbě podstatně snížena o 65,25 procent (P=0.011) (obrázek 6, DF). Zvýšená exprese endoteliálního ICAM-1 byla pozorována v kůře i dřeni u kontrolních myší léčených NP (obrázek 7, B a E). ICAM-1 byla snížena léčbou o 36,89 procenta (P=0,0083) v kůře (obrázek 7, AC) a o 31,17 procenta (P=0,030) v dřeni (obrázek 7 , DF).

Abychom vymezili úlohu trombinu při regulaci zánětlivých bioaktivních lipidů v raném vývoji AKI, provedli jsme lipidomické testy na tkáních extrahovaných odděleně z kůry a dřeně po 24 hodinách. Doplňkové tabulky 2 a 3 uvádějí specifické molekulární testy, oblast ledvin a typy subjektů (léčená AKI, neléčená AKI nebo normální bez AKI). Doplňková tabulka 4 uvádí průměrnou procentuální změnu od zdravé normální výchozí hodnoty pro každý lipid v kůře a dřeni. Obecně platí, že jak kortikální, tak medulární oblasti vykazovaly odchylnou expresi téměř všech bioaktivních lipidů hodnocených ve srovnání s normálními ledvinami (doplňkové tabulky 2 a 3) a téměř všechny signalizační lipidy měly tendenci se po antitrombinové terapii posouvat směrem k normálním hladinám. Jako zjednodušená metrika pro regionální zánět (doplňková tabulka 4) byla průměrná procentuální změna pro všechny lipidy 65,13 procent a 38,60 procent pro kůru a 136,42 procent a 90,76 procent pro dřeň v kontrolních NP a PPACK NP skupinách, v tomto pořadí, což naznačuje, že zánět v medulla převyšovala podle lipidomických testů kortex.

Ačkoli byly po léčbě téměř u všech druhů lipidů patrné trendy vymizení, většina nesplňovala statistickou významnost. Pozoruhodná v těchto testech však byla významná odpověď PDG2, která se snížila o 47,62 procent v kortexu (obrázek 8, A) (P=0,012) a o 50,21 procent v dřeni (obrázek 8, B) ( P=0.0249), resp. Na základě tohoto pozorování jsme kvantifikovali prevalenci infiltrujících žírných buněk, které jsou známým významným zdrojem zánětlivého PGD2. Obrázek 8, CE ukazuje, že léčba antitrombinem snížila obsah žírných buněk v celé části ledviny o 54,27 procent (P=0,002) za 24 hodin. To je v souladu s pozorovaným snížením VCAM-1 a ICAM-1 (obrázky 6 a 7) jako aktivovaných žírných buněk exprimujících LFA-1 (antigen 1 spojený s funkcí lymfocytů) a VLA (velmi pozdě antigen) ligují tkáňově specifické adhezní molekuly pro transmigraci do zanícených tkání.29,30 Navíc chemokiny/cytokiny spojené se žírnými buňkami, jako je M-CSF a IL-6, byly současně downregulovány nanočásticemi antitrombinu. Po léčbě PPACK NP se sérový M-CSF a IL-6 snížil o 36,60 procent (P=0,0448) a 27,44 procent (P=0,0454), v tomto pořadí, ve srovnání s neléčená kontrolní skupina (obrázek 8, F).

Ze souboru dat vyplynulo několik zajímavých korelací souvisejících s infiltrací žírných buněk, poškozením cév a funkcí ledvin pro celkové kombinované skupiny léčených a neléčených zvířat v oblastech kůry i dřeně. Mezi BUN a CD31 (r=0.75, P=0.000009) existoval nepřímý vztah, což naznačuje, že zhoršující se selhání ledvin bylo spojeno s větším vaskulárním kompromisem (doplňkový obrázek 1, A). Mezi počty žírných buněk a BUN (r=0.71, P=0}.004) existoval přímý vztah, což ukazuje na progresivní snižování

renální funkce ve spojení s infiltrací žírných buněk (doplňkový obrázek 1, B). Byl pozorován nepřímý vztah mezi počtem žírných buněk a CD31 (r=0 0,59, P=0 0,002), což naznačuje, že vaskulární poškození se zhoršilo se zvýšenou infiltrací žírných buněk (doplňkový obrázek 1, C). Nakonec byl pozorován přímý vztah mezi počtem žírných buněk a globální expresí ICAM-1 (r=0.54, P=0.008), což je v souladu s očekáváním, že upregulované vaskulární adhezní molekuly by podporovat navádění žírných buněk do poraněných tkání (doplňkový obrázek 1, D). Ještě těsnější přímý vztah se týkal medulární exprese VCAM a počtu žírných buněk (r=0 0,69, P=0 0,009; data neuvedena).

Diskuse

Navzdory desetiletím úsilí při hledání efektivního řízeníakutní poškození ledvin, current treatments remain essentially supportive. Failure of single agents tested in numerous AKI clinical trials now prompts a renewed search for agents that might exert more pleiotropic or broad-spectrum therapeutic actions for preserving renal function.3–7 The present data indicate that targeting thrombin with locally acting nanoparticle agents represents one such approach to accelerating functional recovery, preserving vascular and tubular integrity, and modulating inflammation. The exceptional local potency of PPACK PFC NP against thrombin with normal bleeding times and clotting parameters by 30-60 min after injection14,15 is due to the fact that each nanoparticle situates >104 antitrombinových skupin v místech mikrovaskulární trombózy a aktivace PAR-1 (další popis v Supplementary Materials), strategie amplifikace, kterou nelze dosáhnout stechiometrií 1:1 konvenčních volných látek, které inhibují trombin, včetně PPACK.

Současný soubor dat ukazuje, že akutní renální ischemicko-reperfuzní poškození není dokončeno do 2 hodin po reperfuzi a trombin zůstává po reperfuzi vysoce hodnotným cílem v poškozených tkáních. Předchozí úsilí Molitorisových spolupracovníků a dalších podporuje pokračující snahu navrhnout bezpečné metody pro přímou inhibici trombinu v AKI.^18,31–33Z naší předchozí práce na předběžné léčbě AKI pomocí PPACK PFC NP víme, že antitrombinové nanočástice poskytují trvalý dohled proti lokálně aktivovanému trombinu, který udržuje vaskulární integritu, výrazně zmírňuje fenomén no-reflow o ~ 50 procent a rychle zvrátit renální dysfunkci o 24 hod.16 Společně se současnými údaji je jasné, že antitrombinové nanočástice pokračují v získávání přístupu k poškozeným, ale životaschopným renálním tkáním i po reperfuzi, aby se předešlo dalšímu vaskulárnímu a tubulárnímu poškození. Předchozí zprávy, že PAR-1 knockout myši trpí sníženým renálním ischemicko-reperfuzním poškozením, jsou také v souladu s naší strategií silné a trvalé farmakologické inhibice aktivace PAR-1 v AKI prostřednictvím inhibice trombinu.³⁴

Ochrana renálních vaskulárních struktur (obrázek 3), kartáčového lemu a bazální membrány (obrázek 2) poskytovaná antitrombinem PFC NP ve shodě s našimi dřívějšími údaji, které ukazují, že antitrombinová terapie vyvolává 2× zlepšení perfuze v kortikomedulárních oblastech AKI,16 potvrzuje vznikající přínos zlepšení renální mikroangiopatie. Ačkoli přesná povaha poškození peritubulárních kapilár a venul nebyla v těchto časných okamžicích po reperfuzi plně objasněna, je popsána zvýšená permeabilita cév a aktivace endoteliální proapoptotické kaspázy-3, stejně jako snížení signálu pro CD31 (PECAM),35 který reguluje integritu endoteliálního spojení.36 Syntéza a exprese CD31 v buněčných spojeních jsou downregulovány zánětlivými cytokiny, které jsou exprimovány aktivovanými mastocyty (TNF- a IFN-), které zvyšují vaskulární permeabilitu.^37,38Kromě toho je indukce tkáňového faktoru trombinem prostřednictvím aktivace PAR{0}} regulována CD31 a myši s knockoutem CD31 vykazují zvýšenou tubulární epiteliální a endoteliální apoptózu, zvýšenou depozici fibrinu a expresi tkáňového faktoru.³⁹V souladu s tím může být schopnost PPACK PFC NP zachovat expresi CD31 životně důležitá pro omezení probíhající aktivace srážecí kaskády a pro udržení integrity endotelu.

Mezi zánětem a koagulací v rozšířené fázi AKI existuje lokální spojitost, která omezuje vnější medulární kapilární perfuzi a způsobuje prodlouženou regionální ischemii/hypoxii, která pak zhoršuje opravu a regeneraci tubulárních buněk.4 Trvalý pokles počtu mikrocév ve vnitřním pruhu vnější dřeně v AKI ukazuje, že poškození cév pokračuje a signalizace VEGF je potlačena.^40–42Navíc existuje dostatek důkazů, že vaskulární vzácnost vyvolává chronickou hypoxii vedoucí k progresivní tubulointersticiální fibróze.⁴³V modelu akutní ischemie/poranění u potkana jsou proximální tubuly zvláště citlivé na hypoxii, která se projevuje odlupováním buněk tubulů a dokonce úplným rozpadem, což způsobuje nadměrnou mortalitu.44,45 Humphreyho skupina skutečně také ukázala, že renální mikrovaskulární prořezávání je předzvěstí chronické onemocnění ledvin.⁴⁶

Naše data také potvrzují, že vaskulární poškození podporuje zachycení červených krvinek a nehemové ukládání (obrázky 4 a 5), ​​které mohou zhoršit chronické onemocnění ledvin,⁴⁷ale který je přístupný antitrombinové terapii. Zdroj tkáňového železa v glomerulárních i tubulárních buňkách (obrázek 5) nepochybně pocházel z rozpadu červených krvinek v těchto oblastech v důsledku krvácení a/nebo mikrovaskulární trombózy, což je v souladu s obrazem vaskulárního kompromisu, který je zmírněn antitrombinovou terapií. V souladu s tím mohou přístupy, které zachovávají vaskulární integritu, představovat kritický první krok k udržení zásobovacích linek pro výživné substráty, které umožňují rychlejší hojení poškozených tubulárních struktur.

Je zajímavé, že PPACK PFC NP zřejmě nabízí časnou ochranu vaskulárních struktur a zmírňuje různé markery zánětu (obrázky 6 a 7; doplňkové tabulky 2-4) v kůře i dřeni. V tradičních experimentálních studiích AKI se předpokládá, že kůra je odolnější vůči poškození než dřeň kvůli nižší metabolické náročnosti, přesto se zdá, že aktivace endotelu a patofyziologický zánět jsou rozšířené, jak dokazují naše lipidomické a histochemické testy. Navíc široké ukládání nehemového železa jako vedlejšího produktu rozkladu zachycených červených krvinek v kůře i dřeni – a jeho zmírnění antitrombinovými nanočásticemi – je v souladu s obecným vzorcem zánětu a poškození, i když se kůra může ukázat jako více přechodně a mírně postižená než dřeň v průběhu onemocnění.

Překvapivá časná reakce infiltrace žírných buněk během 24 hodin (obrázek 8) naznačuje důležitou roli pro zánětlivé buňky jiné než tradiční hráče, jako jsou neutrofily a makrofágy. Žírné buňky jsou typicky považovány za mediátory alergických reakcí, ale existuje množství literatury týkající se jejich patofyziologických důsledků při akutním a chronickém poškození ledvin.^48–52 Ačkoli neutrofily jsou časnými odpověďmi na poškození tkáně, makrofágy se dostanou do obrazu až později v zánětlivém procesu, což naznačuje, že mastocyty hrají důležitou roli v časné fázi AKI. Danelli et al skutečně prokázali, že k degranulaci žírných buněk dochází časně u AKI a že vyčerpání žírných buněk v době indukce AKI, ale ne o 48 hodin později, poskytuje dlouhodobý příznivý účinek na renální funkci, atrofii a fibrózu.⁵³K podobným závěrům dospěli Tong et al v procedurách žírných buněk stabilizovaných kromolynem prováděných před reperfuzí.54 Summers ukázal, že myši s deficitem žírných buněk (KitW-sh/W-sh) trpí méně ischemickým poškozením než divoké typy a že vyvolávají snížené hladiny leukocytárních chemoatraktantů.⁵⁵

Žírné buňky exprimují proteázou aktivované receptory Žírné buňky exprimují proteázou aktivované receptory (PAR), které mohou být aktivovány trombinem, aby degranulovaly a uvolnily řadu předem vytvořených chemokinů, cytokinů a bioaktivních lipidů.56–58 Trombin také způsobuje adhezi žírných buněk k matrici proteiny (např. fibronektin) a exprese interleukinu (např. IL-6) prostřednictvím PAR- 1 interakcí.⁵⁹Po inhibici trombinu jsme pozorovali snížené hladiny PGD2, které jsou v souladu s relativní deplecí žírných buněk, protože PGD2 je hlavní bioaktivní eikosanoid vylučovaný žírnými buňkami při reakcích alergického typu.60 Navíc downregulace ICAM-1 a VCAM-1 po ošetření antitrombinovými nanočásticemi je konzistentní se sníženou infiltrací žírných buněk, protože exprimují LFA-1 a VLA a využívají adhezní molekuly k získání vstupu do tkáně.^29,30

Specifická patogenní role samotného PGD2 v evoluci renální IRI dosud nebyla podle našich znalostí popsána, ale slouží jako jasný biomarker pro aktivaci žírných buněk.⁵²U plicního zánětu se ukázalo, že PDG2 zvyšuje expresi prozánětlivých cytokinů makrofágů prostřednictvím svých receptorů (DP1 a DP2), které pak aktivují příliv neutrofilů.61 Naše pozorování zvýšeného M-CSF a IL-6 (obrázek 8) u AKI které jsou downregulovány PPACK PFC NP prostřednictvím suprese žírných buněk by byly v souladu s takovým domnělým mechanismem. Jelikož je však známo, že žírné buňky uvolňují řadu faktorů potenciálně škodlivých pro funkci ledvin,51,52 může být předmětem budoucích studií jakýkoli počet odpovědných determinantů pro kontrolu pomocí inhibice trombinu nebo jiných molekulárně cílených látek. V souladu s tím by zásahy, které zpomalují časnou přitažlivost a degranulaci žírných buněk, mohly vysoce chránit vaskulární integritu a funkci ledvin, jak se v předkládaných datech projevuje lokální inhibicí trombinu.

Omezení

Tyto studie nebyly navrženy tak, aby objasnily trvalé přínosy inhibice trombinu, protože model AKI je zaměřen na včasnou ochranu proti IRI a souvisejícím mechanismům. To, zda by dlouhodobé přínosy jedné dávky antitrombinových nanočástic mohly omezit progresi chronického onemocnění ledvin, je mimo rozsah této zprávy a vyžadovalo by to jiný experimentální model a hypotézu. Navíc časové okno příležitosti pro dosažení funkčního zotavení inhibicí trombinu v prodloužené fázi AKI zde není řešeno, ale je předmětem zájmu pro budoucí studie. Do jaké míry jsou hlavní prospěšné účinky lokální inhibice trombinu u AKI způsobeny supresí aktivace žírných buněk, zůstává spekulativní, ale bylo by testovatelné v následných podrobných mechanistických studiích. Ačkoli však významné lineární korelace mezi počtem žírných buněk, CD31 a BUN nutně neurčují příčinu a účinek, jejich shoda podporuje silný vztah mezi žírnými buňkami a vaskulárním poškozením v časných stádiích IRI ledvin. Konečně, použití PPACK jako antitrombinové skupiny je pouze jedním příkladem konjugovatelné terapeutické složky, kterou lze bezpečně a lokálně dodávat na nanostrukturu, aby se potlačila signalizace trombinu.

1. Benoit SW, Devarajan P. Akutní poškození ledvin: objevující se farmakoterapie v současných klinických studiích. Pediatr Nephrol 2018;33:779-87.

2. Chen H, Busse LW. Nové terapie pro akutní poškození ledvin. Kidney Int Rep 2017;2:785-99.

3. Bonventre JV, Yang L. Buněčná patofyziologie ischemického akutního poškození ledvin. J Clin Invest 2011;121:4210-21.

4. Sharfuddin AA, Molitoris BA. Patofyziologie ischemického akutního poškození ledvin. Nat Rev Nephrol 2011;7:189-200.

5. Bonventre JV. Patofyziologie AKI: zranění a normální a abnormální reparace. Contrib Nephrol 2010;165:9-17.

6. Zuk A, Palevsky PM, Fried L, Harrell Jr FE, Khan S, McKay DB, et al. Překonávání translačních bariér u akutního poškození ledvin: zpráva z dílny NIDDK. Clin J Am Soc Nephrol 2018;13:1113-23.

7. Zuk A, Bonventre JV. Nedávné pokroky v akutním poškození ledvin a jeho důsledky a dopad na chronické onemocnění ledvin. Curr Opin Nephrol Hypertens 2019;28:397-405.

8. Rahman A, Fazal F. Blokování NF-kappaB: zánětlivý problém. Proc Am Thorac Soc 2011;8:497-503.

9. Jagadeesha DK, Takapoo M, Banfi B, Bhalla RC, Miller Jr FJ. Nox1 transaktivace receptoru epidermálního růstového faktoru podporuje uvolňování N-cadherinu a migraci buněk hladkého svalstva. Cardiovasc Res 2012;93:406-13.

10. Lopez ML, Bruges G, Crespo G, Salazar V, Deglesne PA, Schneider H, et al. Trombin selektivně indukuje transkripci genů v lidských monocytech zapojených do zánětu a hojení ran. Thromb Haemost 2014;112:992-1001.

11. Borissoff JI, Spronk HM, Heeneman S, ten Cate H. Je trombin klíčovým hráčem v bludišti „koagulace-aterogeneze“? Cardiovasc Res 2009;82:392-403.

12. Rudman-Melnick V, Adam M, Potter A, Chokshi SM, Ma Q, Drake KA, et al. Jednobuněčné profilování AKI na myším modelu odhaluje nové transkripční podpisy, profibrotický fenotyp a přeslechy mezi epitelem a stromem. Journal of the American Society of Nephrology: JASN 2020;31:2793-814.

13. Kirita Y, Wu H, Uchimura K, Wilson PC, Humphreys BD. Buněčné profilování myšího akutního poškození ledvin odhaluje konzervované buněčné reakce na poškození. Proc Natl Acad Sci USA 2020;117:15874-83.

14. Myerson J, He L, Lanza G, Tollefsen D, Wickline S. Perfluorokarbonové nanočástice inhibující trombin poskytují novou strategii pro léčbu a zobrazování akutní trombózy magnetickou rezonancí. Journal of thrombosis and hemostasis: JTH 2011;9:1292-300.

15. Myerson JW, He L, Allen JS, Williams T, Lanza G, Tollefsen D, et al. Nanočástice inhibující trombin rychle tvoří všestranné a detekovatelné povrchy proti srážení. Nanotechnologie 2014;25:395101.

16. Chen J, Vemuri C, Palekar RU, Gaut JP, Goette M, Hu L a kol. Antitrombinové nanočástice zlepšují reperfuzi ledvin a chrání funkci ledvin po ischemicko-reperfuzním poškození. Am J Physiol Renal Physiol 2015;308:F765-73