Senescence přepojuje snímání mikroprostředí k usnadnění protinádorové imunity

ABSTRAKTNÍ

Buněčné stárnutí zahrnuje stabilní zastavení buněčného cyklu spojené se sekrečním programem, který v některých případech stimuluje imunitní clearance senescentních buněk. Pomocí imunokompetentního modelu rakoviny jater, ve kterém senescence spouští odmítnutí nádoru zprostředkovaného CD8 T buňkami, ukazujeme, že stárnutí také remodeluje proteom buněčného povrchu, aby se změnilo, jak nádorové buňky vnímají faktory prostředí, jak dokládá interferon typu II (IFN). Ve srovnání s proliferujícími buňkami, senescentní buňky upregulují IFN receptor, stávají se hypersenzibilizovanými na mikroprostředí IFN a robustněji indukují mechanismy prezentující antigen, které jsou také rekapitulovány v lidských nádorových buňkách podstupujících stárnutí vyvolané terapií. Narušení snímání IFN v senescentních buňkách otupuje jejich imunitně zprostředkovanou clearance, aniž by znemožnil stav stárnutí nebo jeho charakteristický sekreční program. Naše výsledky ukazují, že senescentní buňky mají zvýšenou schopnost jak vysílat, tak přijímat signály z prostředí a naznačují, že každý proces je nutný pro jejich efektivní imunitní dohled.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

VÝZNAM:

Naše práce odhaluje souhru mezi programy remodelace tkání a programy snímání tkání, které lze zapojit do stárnutí u pokročilých rakovin, aby byly nádorové buňky lépe viditelné pro adaptivní imunitní systém. Tento nový aspekt stárnutí vytváří reciproční heterotypické signalizační interakce, které mohou být terapeuticky indukovány pro posílení protinádorové imunity.

ÚVOD

Buněčné stárnutí je program stresové reakce charakterizovaný stabilní zástavou buněčného cyklu a sekrečním programem schopným remodelovat tkáňové prostředí (1). V normálních tkáních stárnutí přispívá k tkáňové homeostáze během hojení ran; avšak ve starých nebo poškozených tkáních může aberantní akumulace senescentních buněk způsobit chronický zánět a sníženou schopnost regenerace tkání (2–4). U rakoviny bylo prokázáno, že stárnutí zprostředkovává příznivé i škodlivé účinky na tkáňovou biologii. Na jedné straně poskytuje senescence bariéru pro tumorigenezi iniciovanou onkogeny a přispívá k protinádorové aktivitě některých terapií rakoviny (5, 6). Na druhé straně perzistence senescentních nádorových buněk po terapii může vytvořit tkáňové prostředí, které podporuje relaps a metastázy (7, 8). Molekulární základy těchto protichůdných biologických výstupů zůstávají špatně pochopeny. Jedním aspektem programu stárnutí, který pravděpodobně přispěje k tak rozmanité biologii, je sekreční fenotyp spojený se stárnutím (SASP; odkaz 9). SASP je aktivována prostřednictvím procesu globální remodelace chromatinu, který se vyvíjí a je řízen klíčovými epigenetickými regulátory, jako je BRD4, a prozánětlivými transkripčními faktory, jako jsou NF-κB a C/EBP- (10–12). To zase vede k indukci genů, které kódují tkáňové remodelační proteiny, jako jsou matrixové metaloproteinázy, růstové faktory a fibrinolytické faktory, o kterých je známo, že hrají zásadní roli v procesu hojení ran (3, 13, 14). Další složky SASP zahrnují chemokiny a cytokiny, které mohou změnit složení a stav imunitních buněk v tkáni, což vede k imunitně zprostředkovanému zacílení a clearance samotných senescentních buněk (15, 16). Nicméně aberantní akumulace senescentních buněk v mnoha patologických kontextech naznačuje, že imunitně zprostředkovaná clearance není univerzálním výsledkem stárnutí nebo SASP a vyvolává možnost, že další mechanismy určují paradoxně prospěšné a škodlivé účinky stárnutí v tkáňové biologii a imunitním dozoru. (17–19).

Imunitní dohled spojený se stárnutím může mít jistě silné protirakovinné účinky, i když přesné efektorové mechanismy se liší podle typu tkáně a buňky (10, 15, 16, 20). V myších modelech hepatocelulárního karcinomu (HCC) jsou jaterní nádorové buňky spuštěné k senesci eliminovány imunitně závislými mechanismy zapojenými do divokého typu (WT) p53 (15). Ve shodě s tím, TP53 je často mutován v lidském HCC, zejména u nádorů "proliferační třídy" s nejhorší prognózou (21, 22). I když se imunoterapie a léky zacílené na TP{12}} objevují jako slibné strategie ke zlepšení výsledků onemocnění, molekulární základ odpovědi a rezistence zůstává neznámý (23–25). Pochopení mechanismů, kterými se senescentní buňky jaterního nádoru stávají viditelnými pro imunitní systém, proto může usnadnit strategie k vyvolání protinádorové imunity u TP53-mutovaného HCC, která se může rozšířit i na jiné typy nádorů.

Zde jsme se rozhodli stanovit principy, které modulují imunitní rozpoznávání a clearance senescentních buněk, abychom identifikovali účinné mechanismy stárnutí, které lze využít ke zlepšení imunitní kontroly rakoviny. Za tímto účelem jsme vyvinuli nový "senescencí indukovatelný" model, ve kterém mohou být buňky rakoviny jater selektivně převedeny do senescentního stavu prostřednictvím genetické modulace endogenního p53. Usoudili jsme, že by to napodobovalo účinky terapií, které spouštějí stárnutí (26, 27), a zároveň se vyhneme matoucím účinkům terapií indukujících stárnutí na imunitní buňky nebo jiné složky tkáňového prostředí. Pomocí tohoto modelu a jeho následného rozšíření na další systémy odhalujeme, že kromě SASP pohání stárnutí významnou remodelaci proteomu buněčného povrchu a signalizačních programů způsobem, o kterém se předpokládá, že zásadně změní způsob, jakým buňky vnímají a reagují na okolní prostředí. signály, jejichž příkladem je zde přecitlivělost na mikroprostředí typu II IFN (IFN). Tento proces umožňuje robustnější upregulaci mechanismu zpracování a prezentace antigenu v senescentních nádorových buňkách, což je činí náchylnými k imunitnímu dozoru in vivo. Naše výsledky tedy odhalují přeprogramovaný program snímání tkání v senescentních buňkách, který působí ve shodě s SASP, aby zvýšil jejich imunogenní potenciál, čímž usnadňuje imunitně zprostředkované odmítnutí nádoru.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

VÝSLEDEK

P53-obnovitelný imunokompetentní model nádoru ke studiu sledování stáří

Abychom studovali, jak stárnutí přeprogramuje buněčné a tkáňové stavy, využili jsme techniku ​​hydrodynamické injekce do ocasní žíly (HTVI) (28) k vytvoření modelu rakoviny jater indukovatelného stárnutím řízeného nádorově specifickou, obnovitelnou p53 krátkou vlásenkovou RNA (shRNA). Konkrétně byly dospělé jaterní hepatocyty imunokompetentních myší Bl/6 transfekovány in vivo vektorem transpozázy SB13 spící krásky a dvěma konstrukty transpozonu (kódujícími NrasG12D-IRES-rtTA a TRE-tRFP-shp53 nebo „NSP“), které se integrují do genomu. . V tomto systému Tet-On je endogenní p53 potlačován v přítomnosti doxycyklinu (Dox) prostřednictvím aktivace indukovatelné shRNA spojené s RFP (obr. 1A), což umožňuje genetickou kontrolu stárnutí u zavedených nádorů. V souladu se společným výskytem mutací, které inaktivují TP53 a aktivují signální dráhy buněčné proliferace (např. kaskády PI3K/AKT a RAS/MAPK) u lidských jaterních nádorů, vedla spolupráce mezi onkogenním RAS a supresí p53 k transformaci hepatocytů, přičemž většina u myší se vyvinuly nádory se špatně diferencovanými znaky 5 až 8 týdnů po HTVI. Transkripční profilování odhalilo, že tyto myší nádory se podobají „proliferační“ třídě lidského HCC (doplňkový obr. S1A–S1F), což je typická třída lidského HCC s mutacemi TP53 (21, 22, 29).

Na základě předchozí práce (15) jsme předpokládali, že reaktivace p53 ve výše uvedeném systému spustí senescenci a aktivuje protinádorovou imunitu. V souladu s tím vysazení Dox spustilo dramatickou regresi nádoru během několika týdnů, což vedlo k prodlouženému přežití zvířat (obr. 1B a C). Analýza nádorů 14 dní po vysazení Dox odhalila očekávanou downregulaci p53 shRNA (jak bylo vizualizováno připojeným reportérem RFP) a akumulaci galaktozidázy spojené se stárnutím (SA- -gal) bez jakýchkoliv znatelných účinků na RAS-efektor p-ERK (obr. 1D). Podobně bylo u explantovaných nádorových buněk 6 až 8 dní po obnovení p53 pozorováno zvýšení aktivity SA- -gal a transkripčních profilů spojených s SASP spolu se současnou proliferativní zástavou (doplňkový obrázek S2A– S2H). Je třeba poznamenat, že přihojení těchto kultur (udržovaných na Dox, aby se zachovalo umlčení p53) do imunokompetentních myší krmených Dox produkovalo synchronní a fokální sekundární nádory, které regredovaly s podobnou kinetikou jako primární nádory po vysazení Dox (obr. 1B; doplňkový obr. S3A– S3E). Kontrolní experimenty s použitím systému Tet-Off nebo začleněním konstitutivní p53 shRNA vyloučily možnost, že by samotný Dox měl nějaký vliv na chování nádoru v našem modelu (doplňkový obrázek S3F a S3G). Proto tento systém umožňuje účinnou indukci stárnutí v nádorových buňkách bez použití terapií, které mohou také změnit imunitní systém hostitele. Vzhledem k jeho větší flexibilitě jsme použili ortotopický transplantační model (dále označovaný jako "NSP") pro mnoho mechanistických studií popsaných níže. Jak se očekávalo, výrazné regrese nádoru uvedené výše byly imunitně zprostředkované. Nádory NSP, které vznikly po transplantaci do imunokompromitovaných nahých a Rag2-/-Il2rg-/- (R2G2) myší, podstoupily výraznou cytostatickou odpověď, ale nepodařilo se jim regredovat, přičemž zvířata R2G2 vykazovala nejzávažnější defekty (obr. 1E-G; doplňkové Obr. S3H a S3I). Protože nahé myši jsou defektní v adaptivní imunitě a R2G2 je také kompromitován pro aspekty vrozené imunity, tyto výsledky naznačují, že adaptivní imunitní systém je nezbytný pro účinnou regresi nádoru v modelu a vytváří dobře kontrolovaný experimentální kontext pro prozkoumání mechanistického základu pro tyto účinky.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

Senescence spouští přechod z nádorové imunity k imunitnímu rozpoznání

Abychom charakterizovali tumor-supresivní parakrinní účinky stárnutí, dále jsme charakterizovali imunitní mikroprostředí tumorů obsahujících p53-potlačený (označovaný jako „proliferující“) a p53-obnovený (označovaný jako „senescentní“ ) nádorové buňky po 1 týdnu vysazení Dox, což je doba, kdy se ustaví stárnutí, ale nádory ještě neustoupily (doplňkové obrázky S2, S3 a S4A). Léze obsahující senescentní nádorové buňky vykazovaly ~1,{8}}násobný nárůst celkového počtu CD45+ imunitních buněk ve srovnání s proliferujícími kontrolami (obr. 2A; odkazy 15, 16). Imunofenotypové a histologické analýzy (9. den po vysazení Dox) odhalily, že šlo o výrazné zvýšení procenta lymfocytů (B buněk, CD4 T buněk a CD8 T buněk) a snížení procenta Gr1+ supresorové buňky/neutrofily odvozené od myeloidu (CD11b+Gr1+Ly6Clo; obr. 2B; doplňkové obr. S4B). Přestože podíl makrofágů jako procento celkové populace CD45 zůstal nezměněn, absolutní čísla se výrazně zvýšila (obr. 2A a B; doplňkový obr. S4C–S4E). V populaci T-buněk vykazovaly akumulující se CD8 T-buňky markery antigenní zkušenosti (CD44+, CD69+) a obsahovaly zvýšenou populaci efektorových buněk (CD44+CD62L−; Obr. 2C; odkaz 30). Tato celková remodelace imunitního prostředí vedla k významnému zvýšení poměru CD3:neutrofily u nádorů obsahujících senescentní buňky (doplňkový obrázek S4F), což jsou účinky konzistentní s podobným zvýšením poměru CD3:neutrofily, které byly spojeny s imunitní reaktivitou u lidí. nádory jater (31). Remodelaci bylo možné vizualizovat pomocí 3D zobrazování po vyčištění tkáně (obr. 2D; doplňkový obr. S4G a S4H; doplňkové video S1; odkaz 32).

Obrázek 1. P53-obnovitelný model nádoru pro studium imunitního dozoru stárnutí. A, Generování p53-obnovitelného modelu rakoviny jater myší řízeného NRAS pomocí transposonového systému spící krásky dodávaného prostřednictvím HTVI. (Vytvořeno pomocí BioRender.com.) B, Reprezentativní ultrasonogram HTVI a ortotopických injekčních modelů rakoviny jater v uvedené době po obnovení p53. C, Analýza přežití myší v modelu HTVI. D, Reprezentativní hematoxylin a eosin (H&E), imunofluorescence (IF) a barvení p53-galaktosidázy spojené se stárnutím (SA- -gal) potlačeno (p53 vypnuto) a obnoveno (p53 zapnuto pro 14 dní) nádorové řezy generované z modelu HTVI. Měřítko, 5{{30}}} μm. E–G, Ortotopická injekce GFP-luciferázou vektorem transdukovaných nádorových buněk NSP do jater imunokompetentních a imunodeficientních myších kmenů. E, Změna velikosti nádoru měřená ultrazvukem po obnovení p53. Myš R2G2, Rag{19}}Il2rg s dvojitým knockoutem. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. n Větší nebo rovno 9 pro každý kmen. F, Reprezentativní makroskopické snímky po 21 dnech p53 na nebo koncový bod p53 mimo nádor. G, Reprezentativní IHC barvení nádorových buněk značených GFP v den 21 po obnovení p53. Měřítko, 100 μm. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Abychom určili specifické typy imunitních buněk odpovědné za imunitní dohled nad senescentními nádorovými buňkami, vytvořili jsme paralelní kohorty myší s ortotopickými nádory NSP a zkoumali jsme dopad vyčerpání různých populací imunitních buněk na regresi nádorů po vysazení Dox. Zatímco blokující protilátky zacílené na neutrofily/monocyty (Gr1), přirozené zabíječe (NK) buňky (NK1.1) a CD4 T buňky (GK1.5) neměly žádný účinek, deplece CD8 T buněk (2.43) a makrofágů (pomocí lipozomálního klodronátu , který selektivně cílí na makrofágy (CD11b+F4/80+), ale ne na klasické dendritické buňky (CD11b−CD11c+MHC−II+CD103+; odkazy 33, 34) výrazně zhoršil regresi nádoru (obr. 2E; Doplňkový obr. S4I). Abychom charakterizovali, jak p53-řízené stárnutí nádoru vede k produktivní protinádorové imunitě, provedli jsme jednobuněčnou analýzu RNA-seq (scRNA-seq) čerstvě izolovaných buněk CD45 z proliferujících a senescentních NSP nádory brzy po vysazení Dox (8 dní; doplňkový obr. S5A a S5B) a použil algoritmus pro testování diferenciální hojnosti Milo (35) k zachycení posunů buněčného stavu v rámci typů imunitních buněk zprostředkovávajících tento proces (doplňkový obr. S5C–S5F). linii s jejich přispěním k regresi nádoru vykazovaly subpopulace CD8 T-buněk a makrofágů výrazné změny v množství a stavu. Pokud jde o T buňky, proliferující (p53-suprimované) nádory byly významně obohaceny o stavy CD8 T vykazující vysokou expresi obou dysfunkčních markerů (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 a Cd160) a aktivačních markerů (Prf1 obr. 2F a G; doplňkový obr. S5G; doplňková tabulka SI). Tyto CD8 T buňky také vykazovaly vysoké hladiny Tnfrsf9, markeru, o kterém je známo, že vymezuje podskupiny T-buněk, které mají schopnost znovu se oživit u lidských HCC a jiných typů rakoviny (36, 37). Naproti tomu v senescentních (p53-reaktivovaných) lézích se populace CD8 T jevily jako vysoce aktivované, vykazující nízké hladiny dysfunkčních markerů a vysokou expresi efektorových cytokinů (např. Ifng, Tnf; doplňková tabulka S1). V souladu s tím transkripční profilování hromadných nádorových tkání ukázalo imunitní aktivní a cytotoxické podpisy u senescentních nádorů podstupujících regresi (doplňkový obr. S5H; ref. 38).

Obrázek 2. Senescence spouští přepnutí nádoru imunitním únikem na rozpoznání imunitního systému. A, Reprezentativní snímky barvení CD45 a GFP značící imunitní buňky a nádorové buňky v p53-potlačených a p{5}}obnovených nádorech (7 dní po obnovení p53). Vpravo, kvantifikace oblasti barvení CD45+ byla vypočtena ze 3 náhodných polí na myš. Každá tečka představuje myš. B, Analýza průtokové cytometrie globální imunitní krajiny v modelu ortotopického NSP jaterního nádoru. Imunofenotypizace senescentních nádorů se provádí 9 dní po vysazení Dox, což je časový bod, kdy se senescentní stav plně ustaví, avšak předchází masivní regresi nádoru. G-MDSC, supresorové buňky odvozené od granulocytárních myeloidů; M-MDSC, monocytární myeloidní supresorové buňky. Data jsou shromážděna ze 2 nezávislých experimentů, s n=7 v proliferující skupině a n=9 v senescentní skupině. Všimněte si, že jak se absolutní počet CD45+ buněk zvyšuje v senescentních nádorových lézích NSP (A), zvyšuje se i celkový počet uvedených typů buněk. C, Analýza průtokovou cytometrií CD8 T buněk. Data jsou shromážděna ze 2 nezávislých experimentů, s n=11 v proliferujících a n=10 v senescentních skupinách. Experimenty byly provedeny 9 dní po vysazení Dox. D, Reprezentativní snímky čištění tkání ortotopických nádorů jater NSP. T buňky, neutrofily a vaskulatura jsou značeny barvením CD3, MPO a CD31, v daném pořadí. Vzorky byly odebrány 9 dní po odebrání Dox. E, Změna velikosti nádoru měřená ultrazvukem po obnovení p53 u myší po vyčerpání specifických typů imunitních buněk pomocí protilátek nebo léků. F, Vlevo, graf aproximace a projekce jednotného potrubí (UMAP) CD8 T buněk izolovaných z p53-suprimovaných proliferujících (PRO) a p{{30}}reaktivovaných senescentních (SEN) nádorů. Vpravo, analýza obohacení genové sady markerových genů vyčerpání T-buněk v CD8+ T buňkách z proliferujících (p53-potlačených) versus senescentních (p53-reaktivovaných) nádorů. NES, normalizované skóre obohacení; Pval, hodnota P. G, UMAP graf exprese vybraných genů (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox a Fasl) mezi CD8 T buňkami izolovanými ze senescentních (p{{40}}reaktivovaných) a proliferujících (p{ {41}}potlačené) nádory. H, Reprezentativní imunofluorescenční snímky CD8 T buněk a F4/80-pozitivní barvení makrofágů v ortotopickém nádoru jater NSP. Vzorky nádoru byly odebrány 9 dní po odebrání Dox. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Všechny stupnice, 100 μm. Byl použit dvoustranný Studentův t-test. *, P < 0,05; **, P < 0,01.

Změny v makrofágovém kompartmentu poskytly další důkaz, že stárnutí nádorových buněk spustilo přepnutí imunitního úniku na sledování. Proto scRNA-seq, imunofenotypizace a histologie ukázaly, že fenotypy makrofágů asociované s nádorem přešly z F4/80lo; stavy CD11chi (shluk 8), včetně imunosupresivních PD-L1+ populací (charakteristické pro lidské nádory HCC se špatnou prognózou; odkazy 39, 40) až F4/80hi; Stavy CD11c− (shluk 0), definované vysokou expresí podpisu genu prezentace antigenu (doplňkové obrázky S5E–S5J a S6A a S6B; doplňková tabulka S1). Za zmínku stojí tyto F4/80hi spojené se stárnutím; CD11c− makrofágy byly zvláště citlivé na léčbu lipozomálním klodronátem (doplňkový obrázek S6C–S6E), což také vedlo k významnému snížení frakce aktivních CD8, ale ne CD4 T buněk (doplňkový obrázek S6F a S6G), což naznačuje CD8 T-dependentní imunitní odpověď zahrnující spolupráci s makrofágy. V souladu s tím histologické analýzy potvrdily, že akumulující se CD8 T buňky a F4/80+ makrofágy byly často společně obohaceny po indukci stárnutí v nádorech (obr. 2H; doplňkový obr. S4D). Souhrnně tyto biologické a molekulární analýzy podporují model, ve kterém stárnutí nádorových buněk indukuje náhlý přechod z imunitního úniku na imunitní dozor zprostředkovaný změnami v makrofázích a stavech CD8 T-buněk, což vede k produktivní protinádorové imunitě a nakonec k odmítnutí nádoru.

Senescence remodeluje programy tkáňového snímání a buněčnou povrchovou krajinu

Dále jsme se rozhodli využít výše uvedený model k pochopení molekulárních mechanismů odpovědných za zviditelnění senescentních nádorových buněk imunitnímu systému. Indukce Senes cence zahrnuje program remodelace chromatinu, který umlčuje proliferativní geny a aktivuje mnoho genů kódujících SASP faktory, přičemž druhý program je do značné míry závislý na zesilovači BRD4 (10). Proto jsme provedli experimenty s transkripčním profilováním na buňkách NSP za proliferujících (p53-potlačených) versus senescentních (p53-obnovených) podmínek v nepřítomnosti a přítomnosti JQ1, léku, který inhibuje funkci BRD4 (doplňková tabulka S2 ). V souladu s očekáváním obnova p53 dramaticky snížila expresi proliferativních genů a vyvolala expresi dobře známých faktorů SASP (obr. 3A; doplňkový obr. S7A; odkaz 7), včetně několika cytokinů, o nichž je známo, že stimulují T buňky (Cxcl16, 1118 ) nebo aktivace a náboru makrofágů (Csf2, kódující protein GM-CSF) nebo dříve spojené se stárnutím (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Jak se očekávalo z předchozí práce (10), mnoho z upregulovaných přepisů kódování SASP (~65 %) bylo závislých na BRD4- (doplňkový obrázek S7B). Podobně byla ze senescentních buněk vylučována řada růstových faktorů a imunitních modulátorů, jak bylo hodnoceno pomocí multiplexních cytokinových testů, včetně atraktantů T-buněk a makrofágů CCL5, CXCL9 a GMCSF, stejně jako faktoru remodelace cév VEGF (doplňkový obr. S7C). Senescence v p53-obnovených nádorových buňkách NSP je tedy spojena s robustním SASP, což je v souladu s výraznou remodelací imunitního ekosystému charakterizovanou výše.

Překvapivě, zkoumání subcelulární lokalizace pro odlišně exprimované geny (DEG) odhalilo, že senescentní nádorové buňky nejen zvýšily svou expresi sekretovaných („extracelulárních“, EC) SASP faktorů, ale také vykazovaly velké změny v hladinách exprese transkriptů kódujících povrchové proteiny. ("plazmatická membrána", PM; obr. 3B). Ve skutečnosti 25 % celkových upregulovaných DEG kódovalo PM proteiny, což je významné obohacení, které se odchylovalo od náhodné distribuce (15 %; obr. 3B). Dynamické PM-DEG byly spojeny se signální transdukcí protein tyrosinkinázy (Nrp1, Egfr), aktivitou cytokinového receptoru (Ifngr1), receptory extracelulární matrice (Itgb3, Cd44) a iontovými transportéry (Slc12a1, Slc24a3) a zachyceny známé molekuly spojené se stárnutím ( Cd44, Vcam1 a Itgb3), což naznačuje, že senescentní buňky mohou mít zvýšenou schopnost interagovat a vnímat své prostředí (obr. 3C; doplňkový obr. S7D; odkazy 41–43). Je zajímavé, že zvýšení exprese mnoha těchto PM proteinů spojené se stárnutím bylo otupeno JQ1, což naznačuje, že jejich indukce může být součástí širšího programu remodelace chromatinu spojeného s SASP (obr. 3D; odkaz 10). Je třeba poznamenat, že hluboké změny v transkripci genů kódujících PM proteiny se vyskytly také v p53-deficientních NSP nádorových buňkách léčených kombinací léků vyvolávajících senescenci trametinibem a palbociklibem (doplňkový obrázek S7E, horní panel; doplňková tabulka S2; ref. 20) a v sérii 13 geneticky odlišných lidských rakovinných linií TP53 WT a TP53- odvozených z rakoviny jater, prsu, plic a tlustého střeva indukovaných ke stárnutí různými spouštěči (obr. 3E; doplňkový obr. S7F; ref. 44). To bylo zvláště robustní pro upregulované (ale ne downregulované) PM-DEG, připomínající účinky pozorované u faktorů EC SASP (obr. 3E; doplňkový obr. S7E, spodní panel). Výrazně změněná exprese proteinů buněčného povrchu, kterou jsme pozorovali v našem modelu, tedy přesahuje p53-indukovanou senescenci a může být charakteristickým znakem senescentního stavu.

Obrázek 3. Senescence remodeluje programy tkáňového snímání a krajinu buněčného povrchu. A, Analýza obohacení genové sady (Reactome) dat RNA-seq z proliferujících (PRO, p53 vypnuto) versus senescentních (SEN, p53 zapnuto po dobu 8 dnů) NSP jaterních nádorových buněk in vitro. NES, normalizované skóre obohacení. B, Subcelulární lokalizace DEGs (P < 0,05; násobná změna > 2) ve všech detekovaných genech [transkripty na milion kilobází (TPM) > 1] z RNA-sekv. C, Analýza genové ontologie (GO) DEGs kódujících PM proteiny upregulované v senescentních buňkách. TM, transmembránový. D, Transkriptomická analýza všech DEG (proliferující vs. senescentní) v přítomnosti nebo nepřítomnosti léčby JQ1. Klastr C1 (červeně) obsahuje geny specifické pro stárnutí citlivé na JQ1 a shluk C4 (modře) obsahuje geny specifické pro proliferaci citlivé na JQ1. E, Metaanalýza datového souboru RNA-seq ze SENESCopedia provedením subcelulární lokalizace DEG (stejné jako Obr. 2D) a Fisherův exaktní test pro prozkoumání relativního obohacení upregulovaných a downregulovaných EC/PM-DEGs odchylujících se od náhodné distribuce. Viz také doplňkový obrázek S7E a S7F. F, Hmotnostní spektrometrie (MS) analýza proteomu obohaceného PM v proliferujících a senescentních buňkách. Hladina proteinu je normalizována na střední expresi proteinu všech vzorků. Kontroly jsou vzorky bez biotinového značení sloužící jako pozadí. Červené a modré rámečky představují proteiny obohacené o senescentní a proliferující buňky. n=6 pro senescentní i proliferující experimentální skupiny a n=3 a 4 pro jejich kontrolu. G, Distribuce upregulovaných a downregulovaných PM proteinů anotovaných GeneCards profilovaných MS. NC, žádná změna. H, Volcano plot proteinů PM anotovaných GeneCards profilovaných pomocí MS.

Abychom ověřili globální remodelaci PM faktorů v senescenci na úrovni proteinů, provedli jsme povrchovou proteomiku na izogenních proliferujících a senescentních NSP nádorových buňkách pomocí metody obohacení biotinem, ve které byly proteiny buněčného povrchu značeny biotinem nepropustným pro membránu, purifikován a podroben hmotnostní spektrometrii (obr. 3F; doplňkový obr. S7G; ref. 45). Byla pozorována silná korelace mezi biologickými replikacemi za každé podmínky (doplňkový obr. S7H), přičemž detekované proteiny byly obohaceny o anotované PM proteiny o 60 % po indukci p53-indukované senescence. Z 887 proteinů, které byly reprodukovatelně detekovány, bylo více než 50 % exprimováno odlišně. Většina odlišně exprimovaných proteinů dobře korelovala se směrovostí pozorovanou v našich datech transkripčního profilování, ačkoli některé byly odlišně exprimovány bez odpovídající změny v hladinách transkriptu (doplňkový obr. S7I).

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Anotované proteiny buněčného povrchu detekované hmotnostní spektrometrií po indukci senescence zahrnovaly několik dříve spojených se stárnutím (např. CD44 a VCAM1), různé receptory růstových faktorů a cytokinů (např. EGFR, ICAM1 a IFNGR1) a další méně charakterizované faktory (obr. 3F–H; Doplňkový obr. S7J a S7K). Je třeba poznamenat, že soubor proteinů obohacených buněčným povrchem identifikovaných v našem modelu vykazoval omezené překrývání s proteiny identifikovanými v lidských fibroblastech podstupujících onkogenem indukovanou senescenci (46), což naznačuje heterogenitu mezi buněčnými typy nebo spouštěči stárnutí. Bez ohledu na to tyto výsledky ukazují, že kromě přepojení ve svém sekrečním programu procházejí senescentní buňky hlubokými změnami v obsahu a množství proteinů buněčného povrchu a naznačují, že senescentní buňky získávají charakteristické rysy snímání mikroprostředí, které mohou ovlivnit jejich stav a osud in vivo. .

Senescentní buňky jsou připraveny ke snímání IFNg a zesílení IFNg signalizace

Abychom identifikovali cesty, které by mohly funkčně ovlivnit, jak senescentní buňky vnímají své prostředí, vytěžili jsme transkripční a proteomické datové soubory pro změny související se stárnutím spojené s protinádorovou imunitou. Je zajímavé, že analýza genové ontologie (GO) odhalila, že odpověď typu II na interferon gama (IFN ) (47) patřila mezi 5 nejlepších anotovaných drah obohacených během stárnutí a závislých na programech zesilovačů specifických pro buněčný stav (tj. JQ1-senzitivní tj. „Cl" z obr. 3D; doplňkový obr. S8A). Mezi změněnými transkripty jsme zaznamenali několik pozitivních regulátorů IFN signalizace, včetně IFN receptorové podjednotky IFNGR1 (jeden z nejvýznamnějších upregulovaných proteinů z našich proteomických dat) a mnohočetných interferonových efektorů (Irf1, Irf7 a Irf9; odkazy 47, 48 obr. 4A–C, doplňkový obr. S8B a S8C). Kromě těchto Brd4-senzitivních-upregulovaných genů byly významně sníženy transkripty kódující negativní regulátory IFN signalizace (Ptpn2, Socs1 a Socs3) (obr. 4C; odkazy 49, 50). Podobné změny byly zaznamenány v nádorových buňkách NSP léčených různými induktory stárnutí (obr. 4C; doplňkový obr. S8D–S8G) a v širším měřítku v panelu 13 lidských karcinomů prsu, plic, jater a tlustého střeva. buněčné linie spuštěné k senesci (obr. 4D; odkaz 44). Proto jsou změny v expresi signálních složek IFN typu II obecným rysem senescentních buněk, nezávislým na buněčném typu, buněčném genotypu, druhu a povaze induktoru stárnutí. Současné zvýšení signalizačních efektorů IFN a snížení negativních regulátorů nás vedlo k hypotéze, že senescentní buňky se stanou připravené pro snímání IFN ve svém prostředí. Abychom tuto hypotézu přímo otestovali, ošetřili jsme proliferující a senescentní buňky NSP rekombinantním IFN a provedli jsme imunoblotovací analýzy aktivace signalizace JAK–STAT. Ačkoli IFN dramaticky zvýšil základní hladiny STAT1 v obou stavech, senescentní buňky akumulovaly více fosforylovaného STAT1, bez ohledu na spouštěč stárnutí (obr. 4E; doplňkový obr. S8H). Kromě toho jsme také našli zvýšenou hladinu fosforylované JAK1 v p53- obnovených senescentních buňkách, což dále podporuje naše zjištění o aktivnější signální dráze JAK–STAT u senescentních buněk snímajících IFN (doplňkový obrázek S8I). Jak bylo předpovězeno z transkripčních analýz, stárnutí také vyvolalo pokles proteinu PTPN2 (51), bez ohledu na přítomnost exogenního IFN (obr. 4E). Senescentní buňky tedy účinněji aktivují IFN signalizaci v reakci na limitující koncentraci IFN v prostředí.

Senescence a EC IFNg kooperativně upregulují strojní zařízení pro zpracování a prezentaci antigenu

Abychom lépe porozuměli funkčnímu příspěvku snímání IFN k programu stárnutí, dále jsme porovnali fenotypové a transkripční stavy proliferujících a p53-obnovených senescentních nádorových buněk NSP ošetřených rekombinantním IFN při nízké (50 pg/ml) resp. vyšší (1 ng/ml) dávka. Ačkoli přidání exogenního IFN k proliferujícím nebo senescentním nádorovým buňkám mělo zanedbatelný účinek na životaschopnost, proliferaci nebo expresi genu SASP obou typů buněk v testovaných dávkách (obr. 5A; doplňkový obr. S9A–S9D), výrazné změny v Byla pozorována genová exprese IFN dráhy spojená se senescentním stavem. Konkrétně kontrolované shlukování Hallmark "podpisu odezvy IFN" napříč proliferujícími a senescentními buňkami odhalilo tři moduly DEG: (i) geny, které jsou downregulovány během stárnutí bez ohledu na IFN (včetně výše uvedených negativních regulátorů); (ii) geny, které jsou upregulovány během stárnutí bez ohledu na IFN; a je zajímavé, (iii) podstatnou sadu stupňů, které jsou kooperativně indukovány kombinací stárnutí a IFN (obr. 5B). Senescence tedy spouští kvantitativní a kvalitativní změny v transkripční odpovědi na IFN. Jedním dobře zavedeným výstupem IFN signalizace regulující citlivost buněk k adaptivnímu imunitnímu dozoru je zvýšená kapacita pro prezentaci antigenu zprostředkovanou molekulami MHC I. třídy (MHC-I; odkazy 47, 52). Ve skutečnosti mnoho genů upregulovaných v senescentních buňkách (geny třídy ii) nebo superindukovaných v přítomnosti exogenního IFN (geny třídy iii) zahrnovalo složky mechanismu prezentace antigenu. Mezi geny indukované během stárnutí (geny třídy ii) byly Tap1, transportéry spojené se zpracováním antigenu, a Psme1, proteazomový faktor spojený se zpracováním antigenu (53). Ti přecitlivělí na exogenní IFN (geny třídy iii) zahrnovali Nlrc5, transkripční koaktivátor genů MHC-I (54); montážní faktor MHC-I Tapbp; a MHC-I podjednotka B2m. Dva další geny třídy iii byly složkami imunoproteazomu (Psmb8 a Psmb9), jejichž působení může změnit repertoár prezentovaných peptidů při nadměrné expresi a je spojeno se zlepšenou odpovědí nádoru na blokádu imunitního kontrolního bodu (55). Tento zesílený výstup IFN v senescentních buňkách byl potvrzen RT-qPCR a byl zachován na ještě vyšších hladinách exogenního IFN (obr. 5C; doplňková tabulka S3). V souladu s výše popsaným multifaktoriálním procesem nebyl tento účinek pozorován u proliferujících nádorových buněk, a to ani u těch, které nadměrně exprimují cDNA IFNGR1 a/nebo jsou léčeny IFN (doplňkový obr. S10A–S10D).

Obrázek 4. Senescentní buňky jsou připraveny pro snímání a amplifikaci IFN signalizace. A a B, hladina IFNGR1 na proliferujících a senescentních buňkách profilovaná hmotnostní spektrometrií (A) a validovaná průtokovou cytometrií (B). AU je libovolná jednotka. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. n=6 pro proliferující i senescentní skupiny. C, Transkriptomická analýza vybraných genů regulujících signalizaci IFN z dat RNA-seq 3 nezávislých p53-obnovitelných buněčných linií (NSP, NSM2 a NSP5) obnovujících p53 spolu s buňkami NSP ošetřenými dvěma dalšími spouštěči stárnutí. SEN/PRO, senescentní/proliferující; T + P, trametinib plus palbociklib. D, mRNA exprese vybraných genů zapojených do IFN signalizace v lidských buněčných liniích spuštěných k senesci. Léčba: Ali, alisertib; Eto, etoposid; číslo udává délku léčby (dny). Data jsou získávána z veřejného datového souboru SENESCopedia (44). E, Nahoře, imunoblotová analýza buněk NSP pod různými senescentními spouštěči v přítomnosti nebo nepřítomnosti IFN (1 ng/ml). Dole, kvantifikace intenzity signálu z imunoblotu. p-STAT1, fosfo-STAT1 (Tyr701).

Také v souladu se změnami genové exprese popsanými výše, senescentní nádorové buňky silněji upregulovaly MHC-I v reakci na nízké hladiny exogenního IFN ve srovnání s proliferujícími protějšky. Tudíž, zatímco hladiny MHC-I na buněčném povrchu jak proliferujících, tak senescentních buněk byly na počátku nízké a indukované exogenním IFN, senescentní buňky vykazovaly významné zvýšení exprese proteinu MHC-I (obr. 5D). Podobné synergie byly pozorovány u exprese HLA na buněčném povrchu (identické s MHC-I u myší) v lidských rakovinných buňkách z jater a jiných typů rakoviny spouštěných do stárnutí s Butlinem, který zapojuje a{7}}závislý program stárnutí (56) nebo trametinib/palbociklib, který přednostně cílí na nádorové buňky s aktivovanou dráhou MAPK (doplňkový obr. S11A–S11D; ref. 20). Je třeba poznamenat, že kombinační účinky léčby léky a IFN na expresi HLA vyžadovaly indukci stárnutí a nevyskytovaly se v buňkách jaterního nádoru, které selhaly v důsledku spontánní nebo uměle vytvořené mutace p53 (nereagující na obrys) nebo nehyperaktivované dráhy MAPK (nereagující na trametinib/palbociklib). Navíc, i když dráhy odezvy IFN typu I a II zahrnují překrývající se složky, léčba exogenním IFN nemůže nahradit IFN při produkci robustní indukce MHC-I v senescentních buňkách ani silně rozdílné indukce mezi proliferujícími a senescentními buňkami v našem modelu obnovy p53 ( Doplňkový obr. S11E a S11F). Tato data naznačují , že myší a lidské buňky spuštěné k senesci získávají zvýšenou kapacitu pro zpracování a prezentaci antigenu v přítomnosti omezených množství IFN .

Senescentní nádorové buňky hyperaktivují IFNg signální dráhu in vivo

Abychom určili in vivo důsledky přepojení IFN signalizace identifikované v senescentních buňkách, dále jsme upravili reportérový systém IFN sensing (IGS) pro přímou vizualizaci aktivace intracelulární IFN signalizace v reálném čase (57). Tento reportér se skládá ze série konsenzuálních IFN-aktivovaných sekvencí, které mají specifitu k IFN typu II oproti jiným signálům (57), následuje cDNA sekvence kódující fluorescenční protein ZsGreen1 a je spojena s konstitutivně exprimovaným RFP transgenem pro vizualizaci transdukovaných buněk ( Obr. 6A). Nádorové buňky NSP exprimující tento konstrukt byly RFP pozitivní a vykazovaly na dávce závislé zvýšení signálu ZsGreen1 po léčbě IFN in vitro, které se zvýšilo po indukci p53 nebo po léčbě léky indukujícími senescenci (obr. 6B; doplňkový obr. S12A a S12B) .

Dále jsme tento systém použili k monitorování signalizační aktivity po indukci stárnutí v nádorech. Reportérem transdukované nádorové buňky (na Dox) exprimující konstitutivní RFP byly injikovány do jater syngenních příjemců krmených Dox a po manifestaci nádoru byl Dox odstraněn, aby se indukovala exprese p53 a spustil senescenci, jak je uvedeno výše (viz obr. 1 a 2). Regresivní nádory byly izolovány 9 dní po vysazení Dox pro 3D zobrazení reportérové ​​aktivity a paralelní hodnocení IFN signalizace ve srovnání s proliferujícími kontrolami (z myší udržovaných na Dox). Jak je znázorněno na obr. 6C, proliferující nádorové buňky vykazovaly malou, pokud vůbec nějakou, reportérovou expresi, zatímco nádorové buňky spuštěné k senesci in vivo vykazovaly výraznější signál ZsGreen1 (obr. 6C a D; doplňkové video S2). Tento účinek se shodoval se specifickým zvýšením hladin proteinu IFN (ale ne IFN typu I) v extraktech nádorové tkáně (obr. 6E; doplňkový obr. S12C).

Abychom otestovali, zda změněné složení imunitních buněk v senescentních nádorech (obr. 2; doplňkové obr. S5–S6) přispělo k zesílenému signálu reportéra IGS, provedli jsme in vitro kokultivační testy umožňující vystavení senescentních nebo proliferujících nádorových buněk stejný počet aktivovaných CD8 T buněk, které jsme identifikovali pomocí scRNA-seq dat jako převládající buněčný zdroj IFN in vivo (obr. 6F–H). Senescentní buňky stále vykazovaly významné zvýšení signálu ZsGreen1 ve srovnání s proliferujícími kontrolami (obr. 61). V souladu s nebuněčnou autonomní signalizační aktivací nebyl IFN detekován v kondicionovaném médiu z nádorových buněk NSP za proliferativních nebo senescentních podmínek (doplňkový obr. S12D), přesto byl IFN snadno detekován při společné kultivaci s CD8 T buňkami, což byl účinek, který byl dále posílena přidáním makrofágů a spojena se zvýšenou MHC I. třídy na senescentních buňkách a také zvýšenou aktivací CD8 T buněk (doplňkový obrázek S12E–S12J). Souhrnně tato data podporují model, kdy heterotypické interakce mezi senescentními nádorovými buňkami a imunitními buňkami senzibilizují nádor k exogennímu IFN, což vede ke zvýšené prezentaci antigenu a účinnému imunitnímu dohledu.

Obrázek 5. Senescence a EC IFN spolupracují na zvýšení regulace zpracování a prezentace antigenu. A a B, mRNA exprese genů v proliferujících a senescentních NSP buňkách in vitro v přítomnosti nebo nepřítomnosti ošetření IFN (50 pg/ml). hladina mRNA je normalizována na střední expresi genu ve všech vzorcích. A, DEG-kódování SASP faktorů v našem modelu. B, geny odezvy na IFN z databáze signatur Hallmark. C, RT-qPCR vybraných genů dráhy prezentace antigenu v proliferujících a senescentních buňkách ošetřených nízkou (50 pg/ml) nebo vysokou (1 ng/ml) koncentrací IFN. Vzorky jsou ze 2 biologických replikátů. D, hladina MHC-I proliferujících a senescentních buněk ošetřených IFN po dobu 24 hodin měřená průtokovou cytometrií. MFI, střední intenzita fluorescence. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM.

Obrázek 6. Senescence zvyšuje IFN-zprostředkovanou heterotypickou signalizaci z aktivovaných imunitních buněk do nádorových buněk. Grafické znázornění reportéra IGS. (Vytvořeno pomocí BioRender.com.) B, Vlevo, reprezentativní grafy průtokové cytometrie měření signálů ZsGreen1 v proliferujících a senescentních buňkách NSP ošetřených 1 ng/ml IFN. Vpravo, kvantifikace procenta ZsGreen1-pozitivních buněk po léčbě IFN. MFI, střední intenzita fluorescence. C a D, Reprezentativní 3D zobrazení tkáňově vyčištěných nádorů z ortotopicky injikované jaterní buněčné linie NSP exprimující reportér IGS (C). Kvantifikace 3 náhodně vybraných polí z nádoru jater každé myši (D). n=5 a n=3 pro proliferující a senescentní skupiny (9 dní po obnovení p53), v tomto pořadí. Měřítko, 100 μm. E, Top, test cytometrických kuliček pro hladinu IFN ze vzorků lyzátu nádorové tkáně in vivo (7 dní po obnovení p53). Dole, transkripty indikovaných genů z RNA-seq hromadných vzorků in vivo nádorů generovaných HTVI (PRO, p53 off; SEN, p53 obnova po dobu 12 dnů). TPM, přepisy na milion kilobází. Poznamenaný klastr Ifna/b obsahuje 14 podtypů Ifna a 1 gen Ifnb. F a G, Exprese Ifng v imunitních buňkách infiltrujících nádor profilovaných pomocí scRNA-seq v NSP transplantovatelném modelu (jako na Obr. 2, vzorek odebraný v den 8 po obnovení p53). H, Jednotná aproximace a projekce exprese Havcr2 (kódující TIM3) a Ifng v CD8 T buňkách získaných z proliferující (P) a senescentní (S) nádorové léze. Horní panel je replikován z obr. 2F (vlevo) pro označení buněk odpovídajících každému stavu. I, Kvantifikace intenzity ZsGreen1 nádorových buněk NSP v experimentu s kokultivací nádorových buněk exprimujících OT-I T-buňky a SIINFEKL (poměr efektor-cíl, 5:1) po 20 hodinách společné kultivace. Signál měřen průtokovou cytometrií. T + P, trametinib plus palbociklib. Viz experimentální podrobnosti na doplňkovém obrázku S12E. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Byl použit dvoustranný Studentův t-test. *, P < 0,05; **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

IFNg signalizace v senescentních nádorových buňkách je nezbytná pro imunitní sledování

Naše výsledky naznačují, že imunitně zprostředkovaná clearance senescentních nádorových buněk NSP zahrnuje kombinované účinky SASP, o kterých je známo, že stimulují nábor imunitních buněk (10, 20, 58), spolu s dříve nedoceněnou kapacitou senescentních buněk pro lepší snímání a reakci na EC signály, jak je zde ukázáno s IFN . Abychom otestovali příspěvek programu snímání IFN spojeného se stárnutím k imunitnímu dohledu nad senescentními nádorovými buňkami, zkoumali jsme, jak narušení IFNGR v nádorových buňkách nebo deplece IFN v hostiteli ovlivňuje clearance nádorových buněk NSP po indukci stárnutí. . Regrese nádoru (ale ne stárnutí per se; doplňkový obr. S13A–S13D) byla narušena po knockoutu (KO) IFNGR1 (obr. 7A a B; doplňkový obr. S14A–S14C), efekt, který byl ještě výraznější pro IFNGR-intaktní nádory naroubované do Ifng-/- myší (obr. 7C a D) a spojené s očekávanou ztrátou povrchového MHC-I v nádorových buňkách (doplňkový obr. S14D a S14E).

V souladu se známým příspěvkem signalizace IFN a nádorových buněk MHC-I k zapojení CD8+ (59), nádory, které postrádaly IFNGR1 nebo které se vyvinuly u příjemců Ifng−/−, obsahovaly méně CD8 T buněk než jejich protějšky WT v obou případech proliferující a senescentní stavy (doplňkový obr. S14F), přičemž stále vyvolávají robustní imunitní infiltrát včetně hojných makrofágů (obr. 7E a F; doplňkový obr. S14G). Bez ohledu na to, zhoršený fenotyp sledování stáří nebyl pouze výsledkem tohoto poklesu CD8 T buněk. Testy kokultivace poskytující jednotnou expozici nádorových buněk IFNGR1 KO a WT CD8 T buňkám a makrofágům stále ukazovaly na IFNGR1-závislé zabíjení senescentních nádorových buněk (doplňkový obrázek S15A–S15E) – závislost, která vyžadovala přítomnost obou T Buňky a makrofágy, a to nebylo pozorováno u proliferujících nádorových buněk za stejných podmínek. Celkově tato data naznačují, že zvýšená schopnost senescentních buněk snímat mikroprostředí IFN působí ve shodě s náborem imunitních buněk stimulovaným SASP, aby umožnila vzájemně se posilující heterotypické interakce mezi nádorovými buňkami, makrofágy a aktivovanými T buňkami, které zlepšují prezentaci antigenu a imunitní dohled. což vede k silné regresi nádoru.

DISKUSE

Povoleno modelem myšího nádoru, ve kterém je imunitní únik proti rakovině proti stárnutí pod dohledem pod přísnou genetickou kontrolou, odhalujeme, jak senescentní buňky dramaticky mění svou schopnost vysílat i přijímat signály z prostředí (doplňkový obr. S16). V souladu se známými programy stárnutí, p53-řízená indukce stárnutí vedla k umlčení proliferativních genů a indukovala SASP. Pozorovali jsme však také hluboký účinek na genovou expresi pro PM proteiny, včetně řady receptorů růstových faktorů a cytokinových receptorů, u kterých se předpokládá, že drasticky změní, jak senescentní buňky reagují na signály prostředí. Důležité je, že ačkoli jsme jako náš primární experimentální systém použili model rakoviny jater, podobné přepojení v expresi senzorů na buněčném povrchu a genových programů senzibilizujících na signály z prostředí bylo pozorováno u široké škály myších a lidských nádorových buněk ošetřených látkami vyvolávajícími stárnutí. agentů, což naznačuje, že změněný snímací program je obecným znakem senescentního stavu.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Jedna z prominentních snímacích drah změněných v senescentních buňkách zahrnuje signalizaci IFN typu II. V našem modelu rakoviny jater a napříč všemi senescentními stavy, které jsme zkoumali, je stárnutí doprovázeno změnami transkripce a proteinové exprese vnitřních buněk, o kterých se předpokládá, že zvýší signalizaci z exogenního IFN. Senescentní buňky ve skutečnosti silněji aktivovaly IFN efektory v reakci na IFN in vitro a in vivo a jak intaktní IFN efektorová dráha, tak IFN v prostředí jsou vyžadovány pro účinnou clearance senescentních nádorových buněk zprostředkovanou CD8 T buňkami. Ačkoli analýza dráhy transkriptomů senescentních buněk vždy identifikuje signalizaci IFN typu II jako obohacenou vlastnost, překrývání mezi složkami signalizace typu I a II a skutečnost, že IFN není typicky detekován jako faktor SASP, zanechaly mechanické otázky týkající se signalizace IFN typu II v senescenci z velké části neprozkoumané. Naše studie ukazují, že takové obohacení IFN signalizačních signatur senescentních buněk odráží zvýšenou kapacitu pro snímání IFN, jehož výstup je nejvýznamnější in vivo.

Obrázek 7. Signalizace IFN v senescentních nádorových buňkách je nezbytná pro imunitní dohled. A, Ifngr1 KO proliferujících i senescentních NSP buněk ověřených průtokovou cytometrií. B, nádorový regresní fenotyp Ifngr1 KO nebo kontrolní nádorové buňky transfekované sgRNA ortotopicky injikované do myší Bl/6N po obnovení p53. Kontrolní sgRNA cílící na genovou poušť umístěnou na Chr8 (Ctrl KO) slouží jako kontrola. C, Fenotyp regrese nádoru rodičovských nádorových buněk NSP ortotopicky injikovaných do myší WT nebo Ifng KO po obnovení p53. D, Reprezentativní makroskopické obrazy nádoru shromážděné v den 21 po obnovení p53 z C. E, Analýza množství CD45 v nádoru z uvedených skupin průtokovou cytometrií. F, Reprezentativní imunofluorescence u p{{10}}suprimovaného (proliferujícího) a p53-obnoveného (senescentního, 7 dní po obnovení p53) nádoru z uvedeného hostitele. Nádorové buňky NSP byly transdukovány vektorem exprimujícím GFP pro vizualizaci. Měřítko, 50 μm. Data jsou uvedena jako průměr ± SEM. Byl použit dvoustranný Studentův t-test. **, P < 0,01; ***, P < 0,001.

Snad nejlépe zavedený výstup signalizace IFN typu II zahrnuje její schopnost indukovat mechanismus prezentace antigenu. IFN skutečně indukoval buněčnou povrchovou expresi MHC-I (nebo HLA v lidských buňkách) v našem modelu za podmínek proliferace i stárnutí. IFN-indukovaná upregulace MHC-I však byla výraznější u senescentních buněk, což je účinek, který koreloval se zvýšenou expresí transportéru spojeného se zpracováním antigenu, dalšími faktory zpracování antigenu a strukturálními složkami MHC-I. Podobná přecitlivělost na IFN při indukci MHC-I/HLA byla pozorována u lidských buněčných linií rakoviny jater a plic, které se spustily senesce. Tyto výsledky naznačují, že program stárnutí může zlepšit prezentaci antigenu v neimunních buňkách, a tím usnadnit imunosurveillanci nádoru. Naše výsledky podporují model, podle kterého je konečný dopad senescentních buněk na tkáňovou biologii diktován kombinovanými účinky toho, jak vysílají a přijímají signály z prostředí. Senescentní buňky nejen indukují SASP, který spouští tkáňovou remodelaci a mění buněčný stav a složení imunitních buněk v prostředí, ale také dramaticky mění svůj povrch, což vede k rozdílné schopnosti snímat faktory prostředí, zde příkladem IFN. Důležité je, že narušení signalizace IFN nemělo žádný vliv na indukci stárnutí nebo SASP v našem systému, ale narušilo následné regrese nádoru, což naznačuje, že změněné snímání prostředí působí ve shodě s SASP a určuje konečný výstup programu stárnutí - v tomto případě, imunitní dozor. Tyto účinky se zdají být součástí koordinovaného epigenetického programu, protože jak SASP, tak snímací programy vykazují výraznou závislost na faktoru remodelace chromatinu BRD4.

Ačkoli mechanismus imunitního dozoru v našem modelu závisí na kooperativních účincích populací CD8 T-buněk a makrofágů odrážejících přechod z „imunitního nachlazení“ do „imunitně horkého“ nádorového mikroprostředí, jiné typy vrozených nebo adaptivních imunitních buněk mohou rozpoznat a jasné senescentní buňky v různých kontextech, nebo alternativně nemusí vůbec dojít k imunitnímu dohledu (18, 19). Některé z těchto rozdílů nepochybně odrážejí heterogenitu v sekreci faktoru SASP (13, 14), i když naše výsledky zvyšují možnost, že rozsah a povaha změněného snímání prostředí může také ovlivnit, jak senescentní buňky ovlivňují tkáňovou biologii. Ačkoli knockout snímání IFN (prostřednictvím Ifngr1 KO) a delece MHC-I (B2M KO) v senescentních nádorových buňkách narušilo jejich imunitní dohled in vivo, zcela nezrušilo regresi nádoru po indukci stárnutí, což naznačuje, že snímání IFN v senescentních buňkách je není jedinou cestou přispívající k regresi nádoru. Bez ohledu na to, že senescentní buňky mohou reagovat odlišně na signály prostředí, znamená, že jejich konečný molekulární stav v tkáních bude jiný než v buněčné kultuře, což zdůrazňuje potřebu lépe charakterizovat proces in vivo.

Naše výsledky mohou pomoci vysvětlit paradoxní účinky biologie stárnutí ve fyziologii a onemocnění a mít důsledky pro efektivní použití terapeutik modulujících stárnutí. Například v našem modelu byl rozdíl mezi clearance nádorových senescentních buněk a perzistencí stanoven, alespoň částečně, přítomností environmentálního IFN a integritou signalizace IFN typu II v senescentních buňkách. To naznačuje, že variace ve schopnosti senescentních buněk získávat a snímat imunitní buňky vylučující IFN nebo jiné typy imunitních buněk by mohly hluboce ovlivnit clearance senescentních buněk, takže snížená environmentální IFN nebo snížená signalizace IFN typu II by mohla umožnit přetrvávání senescentních buněk v tkáních. V kontextu rakoviny mohou terapie, které indukují stárnutí nádorových buněk – cytostatický program – vyvolat imunitně zprostředkovanou regresi nádoru nebo resenzibilizovat nádory na blokádu imunitního kontrolního bodu, ale tyto nejsou univerzálními výsledky. Jako taková může ovlivnit heterogenita v SASP (která se může lišit mezi typy nádorových buněk a induktory stárnutí) nebo snímání a výstup IFN [pravděpodobně ovlivněné delecí nebo mutací IFN dráhy nebo složek HLA (60) nebo zde odhalenými reverzibilními transkripčními mechanismy]. účinnost takových terapií u pacientů. V souladu s touto představou terapií řízená indukce specifických profilů SASP predikuje výsledky pacientů v podskupině pacientek s karcinomem vaječníků (61). Naproti tomu strategie pro posílení imunitního dohledu nad senescentními buňkami zvýšením jejich citlivosti na IFN (např. s inhibitory PTPN2) mohou pomoci zkreslit výstup programu směrem k odmítnutí nádorových buněk. Předpokládáme, že zkoumání tohoto a dalších programů remodelace a snímání tkání v biopsiích nádorů před a po léčbě (např. prostřednictvím transkriptomických nebo proteomických profilů) může odhalit nové biomarkery odezvy a/nebo kombinované strategie ke zlepšení klinického managementu rakoviny.

REFERENCE

1. Di Micco R, Krizhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. Buněčné stárnutí ve stárnutí: od mechanismů k terapeutickým příležitostem. Nat Rev Mol Cell Biol 2021;22:75–95.

2. Munoz-Espin D, Serrano M. Buněčné stárnutí: od fyziologie k patologii. Nat Rev Mol Cell Biol 2014;15:482–96.

3. Demaria M, Ohtani N, Youssef SA, Rodier F, Toussaint W, Mitchell JR a kol. Zásadní role senescentních buněk při optimálním hojení ran prostřednictvím sekrece PDGF-AA. Dev Cell 2014;31:722–33.

4. Xu M, Pirtskhalava T, Farr JN, Weigand BM, Palmer AK, Weivoda MM a kol. Senolytika zlepšují fyzické funkce a prodlužují délku života ve stáří. Nat Med 2018;24:1246–56.

5. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Onkogenní Ras vyvolává předčasné stárnutí buněk spojené s akumulací p53 a p16INK4a. Cell 1997;88:593–602.

6. Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G, Jarrard DF. Terapií indukované stárnutí u rakoviny. J Natl Cancer Inst 2010;102:1536–46.

7. Coppe JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. Senescence-asociovaný sekreční fenotyp: temná strana suprese tumoru. Annu Rev Pathol 2010;5:99–118.

8. Demaria M, O'Leary MN, Chang J, Shao L, Liu S, Alimirah F a kol. Stárnutí buněk podporuje nepříznivé účinky chemoterapie a relapsu rakoviny. Rakovina Discov 2017;7:165–76.

9. Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Senescence-asociované sekreční fenotypy odhalují buněčné neautonomní funkce onkogenního RAS a supresoru tumoru p53. PLoS Biol 2008;6:2853–68.

10. Tasdemir N, Banito A, Roe JS, Alonso-Curbelo D, Camiolo M, Tschaharganeh DF a kol. BRD4 spojuje remodelaci zesilovače se senescence imunitním dozorem. Rakovina Discov 2016;6:612–29.

11. Chien Y, Scuoppo C, Wang X, Fang X, Balgley B, Bolden JE a kol. Kontrola sekrečního fenotypu spojeného se stárnutím pomocí NF-kappaB podporuje stárnutí a zvyšuje chemosenzitivitu. Genes Dev 2011;25:2125–36.

12. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LC, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ a kol. Senescence vyvolaná onkogeny přenášená interleukin-dependentní zánětlivou sítí. Cell 2008;133:1019–31.

13. Basisty N, Kale A, Jeon OH, Kuehnemann C, Payne T, Rao C, et al. Proteomický atlas sekretomů spojených se stárnutím pro vývoj biomarkerů stárnutí. PLoS Biol 2020;18:e3000599.

14. Hernandez-Segura A, de Jong TV, Melov S, Guryev V, Campisi J, Demaria M. Odmaskování transkripční heterogenity v senescentních buňkách. Curr Biol 2017;27:2652–60.

15. Xue W, Zender L, Miething C, Dickins RA, Hernando E, Krizhanovsky V, et al. Senescence a vymizení nádoru je spuštěno obnovením p53 u myších karcinomů jater. Příroda 2007;445:656–60.

16. Kang TW, Yevsa T, Woller N, Hoenicke L, Wuestefeld T, Dauch D a kol. Senescence sledování premaligních hepatocytů omezuje rozvoj rakoviny jater. Příroda 2011;479:547–51.

17. Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, Vadai E, Gal H, Biran A, et al. Narušený imunitní dohled urychluje hromadění senescentních buněk a stárnutí. Nat Commun 2018;9:5435.

18. Lujambio A. Čistit, či nečistit (senescentní buňky)? To je ta otázka. Bioessays 2016;38 Suppl 1:S56–64. 19. Di Mitri D, Toso A, Chen JJ, Sarti M, Pinton S, Jost TR a kol. Nádor infiltrující Gr-1+ myeloidní buňky antagonizují stárnutí u rakoviny. Příroda 2014;515:134–7.

20. Ruscetti M, Leibold J, Bott MJ, Fennell M, Kulick A, Salgado NR a kol. Cytotoxicita zprostředkovaná NK buňkami přispívá ke kontrole nádoru kombinací cytostatických léčiv. Věda 2018;362:1416–22.

21. Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, Singal AG, Pikarsky E, Roayaie S, et al. Hepatocelulární karcinom. Nat Rev Dis Primers 2021;7:6.

22. Chiang DY, Villanueva A, Hoshida Y, Peix J, Newell P, Minguez B a kol. Fokální zisky VEGFA a molekulární klasifikace hepatocelulárního karcinomu. Cancer Res 2008;68:6779–88.

23. Llovet JM, Castet F, Heikenwalder M, Maini MK, Mazzaferro V, Pinato DJ a kol. Imunoterapie pro hepatocelulární karcinom. Nat Rev Clin Oncol 2022;19:151–72.

24. Sangro B, Sarobe P, Hervas-Stubbs S, Melero I. Pokroky v imunoterapii hepatocelulárního karcinomu. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021;18:525–43.

25. Levine AJ. Cílení na protein P53 pro léčbu rakoviny: translační dopad výzkumu P53. Cancer Res 2022;82:362–4.

26. Xiao Y, Chen J, Zhou H, Zeng X, Ruan Z, Pu Z a kol. Kombinace monoterapie p53 mRNA s blokádou imunitního kontrolního bodu přeprogramuje imunitní mikroprostředí pro účinnou léčbu rakoviny. Nat Commun 2022;13:758.

27. Demir O, Barros EP, Offutt TL, Rosenfeld M, Amaro RE. Integrovaný pohled na dynamiku, funkci a reaktivaci p53. Curr Opin Struct Biol 2021;67:187–94.

28. Suda T, Liu D. Hydrodynamické dodávání genů: jeho principy a aplikace. Mol Ther 2007;15:2063–9.

29. Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, Chan JA, Brunet JP, Chiang DY, et al. Integrativní transkriptomová analýza odhaluje běžné molekulární podtřídy lidského hepatocelulárního karcinomu. Cancer Res 2009;69:7385–92.

30. Kaech SM, Hemby S, Kersh E, Ahmed R. Molekulární a funkční profilování diferenciace paměťových CD8 T buněk. Cell 2002;111:837–51.

31. Bruix J, Cheng AL, Meinhardt G, Nakajima K, De Sanctis Y, Llovet J. Prognostické faktory a prediktory přínosu sorafenibu u pacientů s hepatocelulárním karcinomem: analýza dvou studií fáze III. J Hepatol 2017;67:999–1008.

32. Adrover JM, Aroca-Crevillen A, Crainiciuc G, Ostos F, Rojas-Vega Y, Rubio-Ponce A, et al. Naprogramované „odzbrojení“ neutrofilního proteomu snižuje rozsah zánětu. Nat Immunol 2020;21: 135–44.

33. Zeisberger SM, Odermatt B, Marty C, Zehnder-Fjallman AH, Ballmer-Hofer K, Schwendener RA. Klodronát-lipozomem zprostředkovaná deplece makrofágů asociovaných s nádorem: nový a vysoce účinný přístup antiangiogenní terapie. Br J Cancer 2006;95:272–81.

34. De Simone G, Andreata F, Bleriot C, Fumagalli V, Laura C, Garcia-Manteiga JM, et al. Identifikace podskupiny Kupfferových buněk schopné zvrátit dysfunkci T buněk indukovanou hepatocelulárním primingem. Imunita 2021;54:2089–100.

35. Dann E, Henderson NC, Teichmann SA, Morgan MD, Marioni JC. Diferenciální testování četnosti na datech jedné buňky pomocí grafů k-nejbližšího souseda. Nat Biotechnol 2022;40:245–53.

36. Kim HD, Park S, Jeong S, Lee YJ, Lee H, Kim CG a kol. 4–1BB vymezuje odlišný stav aktivace vyčerpaných tumor-infiltrujících CD8(+) T buněk u hepatocelulárního karcinomu. Hepatologie 2020;71:955–71.

37. Li Y, Wang Z, Jiang W, Zeng H, Liu Z, Lin Z a kol. Tumor infiltrující TNFRSF9(+) CD8(+) T buňky definují různé podskupiny jasnobuněčného renálního karcinomu s prognózou a imunoterapeutickou odpovědí. Onkoimunologie 2020;9:1838141.

38. Bindea G, Mlecnik B, Tosolini M, Kirilovsky A, Waldner M, Obenauf AC, et al. Časoprostorová dynamika intratumorálních imunitních buněk odhaluje imunitní krajinu u lidské rakoviny. Imunita 2013;39:782–95.

39. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C a kol. Aktivované monocyty v peritumorálním stromatu hepatocelulárního karcinomu podporují imunitní privilegia a progresi onemocnění prostřednictvím PD-L1. J Exp Med 2009;206:1327–37.

40. Lu LG, Zhou ZL, Wang XY, Liu BY, Lu JY, Liu S a kol. Blokáda PD-L1 uvolňuje vnitřní protinádorové vlastnosti glykolytických makrofágů u hepatocelulárního karcinomu. Střevo 2022;71:2551–60.

41. Milanovic M, Fan DNY, Belenki D, Dabritz JHM, Zhao Z, Yu Y, et al. Přeprogramování spojené se stárnutím podporuje rakovinné kmeny. Příroda 2018;553:96–100.

42. Yousef H, Czupalla CJ, Lee D, Chen MB, Burke AN, Zera KA, et al. Stárnutá krev narušuje aktivitu hipokampálních nervových prekurzorů a aktivuje mikroglie prostřednictvím mozkové endoteliální buňky VCAM1. Nat Med 2019;25:988–1000.

43. Rapisarda V, Borghesan M, Miguela V, Encheva V, Snijders AP, Lujambio A, et al. Integrin beta 3 reguluje stárnutí buněk aktivací dráhy TGF-beta. Cell Rep 2017;18:2480–93.

44. Jochems F, Thijssen B, De Conti G, Jansen R, Pogacar Z, Groot K a kol. Rakovina SENESCopedia: vymezení stárnutí rakovinných buněk. Cell Rep 2021;36:109441.

45. Perna F, Berman SH, Soni RK, Mansilla-Soto J, Eyquem J, Hamieh M, et al. Integrace proteomiky a transkriptomiky pro systematickou kombinatorickou terapii AML chimérickým antigenním receptorem. Rakovinová buňka 2017;32:506–19.

46. ​​Hoare M, Ito Y, Kang TW, Weekes MP, Matheson NJ, Patten DA a kol. NOTCH1 zprostředkovává změnu mezi dvěma odlišnými sekretomy během stárnutí. Nat Cell Biol 2016;18:979–92.

47. Castro F, Cardoso AP, Goncalves RM, Serre K, Oliveira MJ. Interferon-gama na křižovatce nádorového imunitního dozoru nebo úniku. Front Immunol 2018;9:847.

48. Platanias LC. Mechanismy signalizace zprostředkované interferonem typu I a typu II. Nat Rev Immunol 2005;5:375–86.

49. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD, Brown FD, Yates KB, Miller BC a kol. In vivo screening CRISPR identifikuje Ptpn2 jako cíl imunoterapie rakoviny. Příroda 2017;547:413–8.

50. Song MM, Shuai K. Supresor cytokinové signalizace (SOCS) 1 a SOCS3, ale ne SOCS2 proteiny inhibují interferonem zprostředkované antivirové a antiproliferativní aktivity. J Biol Chem 1998;273:35056-62.

51. Kleppe M, Soulier J, Asnafi V, Mentens N, Horňáková T, Knoops L, et al. PTPN2 negativně reguluje onkogenní JAK1 u akutní lymfoblastické leukémie T-buněk. Krev 2011;117:7090–8.

52. Zhou F. Molekulární mechanismy IFN-gama pro up-regulaci zpracování a prezentace antigenu MHC I. třídy. Int Rev Immunol 2009;28:239–60.

53. McCarthy MK, Weinberg JB. Imunoproteazom a virová infekce: komplexní regulátor zánětu. Přední Microbiol 2015; 6:21.

54. Yoshihama S, Vijayan S, Sidiq T, Kobayashi KS. NLRC5/CITA: klíčový hráč v imunitním dohledu nad rakovinou. Trendy rakoviny 2017;3:28–38.

55. Kalaora S, Lee JS, Barnea E, Levy R, Greenberg P, Alon M, et al. Exprese imunoproteazomu je spojena s lepší prognózou a odpovědí na terapie kontrolními body u melanomu. Nat Commun 2020; 11:896.

56. Efeyan A, Ortega-Molina A, Velasco-Miguel S, Herranz D, Vassilev LT, Serrano M. Indukce p53-závislého stárnutí antagonistou MDM2 nutlin-3a v myších buňkách fibroblastů původ. Cancer Res 2007;67:7350–7.

57. Hoekstra ME, Bornes L, Dijkgraaf FE, Philips D, Pardieck IN, Toebes M a kol. Dálková modulace okolních nádorových buněk pomocí CD8(+) T lymfocytů sekretovaných IFNgama. Nat Cancer 2020;1:291–301.

58. Ruscetti M, Morris JPt, Mezzadra R, Russell J, Leibold J, Romesser PB a kol. Cévní remodelace vyvolaná stárnutím vytváří terapeutická zranitelnost u rakoviny slinivky břišní. Cell 2020;181:424–41.

59. Dighe AS, Richards E, Old LJ, Schreiber RD. Zvýšený in vivo růst a odolnost vůči odmítnutí nádorových buněk exprimujících dominantní negativní IFN gama receptory. Imunita 1994;1:447–56.

60. Gao J, Shi LZ, Zhao H, Chen J, Xiong L, He Q, et al. Ztráta genů IFN gama dráhy v nádorových buňkách jako mechanismus rezistence na anti-CTLA-4 terapii. Cell 2016;167:397–404.

61. Paffenholz SV, Salvagno C, Ho YJ, Limjoco M, Baslan T, Tian S, et al. Indukce senescence určuje odpověď na chemoterapii a imunoterapii v preklinických modelech rakoviny vaječníků. Proč Natl Acad Sci USA 2022;119:e2117754119.

62. Shao DD, Xue W, Krall EB, Bhutkar A, Piccioni F, Wang X a kol. KRAS a YAP1 se sbíhají, aby regulovaly EMT a přežití nádoru. Cell 2014;158:171–84.

63. Zhu C, Kim K, Wang X, Bartolome A, Salomao M, Dongiovanni P a kol. Aktivace hepatocytárního Notch indukuje jaterní fibrózu u nealkoholické steatohepatitidy. Sci Transl Med 2018;10:eaat0344.

64. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Yukinaga H, Kuno A, Ueda HR. Pokročilé protokoly CUBIC pro pročištění a zobrazení celého mozku a celého těla. Nat Protoc 2015;10:1709–27.

65. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: flexibilní trimr pro sekvenční data Illumina. Bioinformatika 2014;30:2114–20. 66. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: ultrarychlý univerzální zarovnávač RNA-seq. Bioinformatika 2013;29:15–21.

67. Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-a Pythonův rámec pro práci s vysoce výkonnými sekvenačními daty. Bioinformatika 2015;31:166–9.

68. Love MI, Huber W, Anders S. Moderovaný odhad násobné změny a disperze pro data RNA-seq s DESeq2. Genome Biol 2014;15:550.

69. Chen EY, Tan CM, Kou Y, Duan Q, Wang Z, Meirelles GV a kol. Enrichr: interaktivní a kolaborativní nástroj pro analýzu obohacení seznamu genů HTML5. BMC Bioinf 2013;14:128.

70. Foroutan M, Bhuva DD, Lyu R, Horan K, Cursons J, Davis MJ. Hodnocení jednotlivých vzorků molekulárních fenotypů. BMC Bioinf 2018;19:404.

71. Binder JX, Pletscher-Frankild S, Tsafou K, Stolte C, O'Donoghue SI, Schneider R, et al. ODDĚLENÍ: sjednocení a vizualizace důkazů o subcelulární lokalizaci proteinů. Databáze (Oxford) 2014;2014:bau012.

72. Výzkumná síť genomového atlasu rakoviny. Komplexní a integrativní genomová charakterizace hepatocelulárního karcinomu. Cell 2017; 169:1327–41.

73. Colaprico A, Silva TC, Olsen C, Garofano L, Cava C, Garolini D a kol. TCGAbiolinks: balíček R/Bioconductor pro integrativní analýzu dat TCGA. Nucleic Acids Res 2016;44:e71.

74. Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: analýza variace genové sady pro data microarray a RNA-seq. BMC Bioinf 2013;14:7.

75. Bankhead P, Loughrey MB, Fernandez JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD a kol. QuPath: open-source software pro analýzu obrazu digitální patologie. Sci Rep 2017;7:16878.

76. Bernstein NJ, Fong NL, Lam I, Roy MA, Hendrickson DG, Kelley DR. Solo: identifikace dubletu v jednobuněčné RNA-Seq prostřednictvím polořízeného hlubokého učení. Cell Syst 2020;11:95–101.

77. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Prostorová rekonstrukce dat jednobuněčné genové exprese. Nat Biotechnol 2015;33:495–502.

78. McInnes L, Healy J, Melville J. UMAP: aproximace a projekce uniformní manifoldy pro redukci rozměrů. arXiv: 1802.03426 [Předtisk]. 2018. Dostupné z: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. Traag VA, Waltman L, van Eck NJ. Z Louvain do Leidenu: záruka dobře propojených komunit. Sci Rep 2019;9:5233.

80. Korsunsky I, Millard N, Fan J, Slowikowski K, Zhang F, Wei K, et al. Rychlá, citlivá a přesná integrace dat jedné buňky s Harmony. Nat Methods 2019;16:1289–96.