Nádorové buňky neprezentují epitopy omezené na MHC-II odvozené z onkogenů do CD4+ T buněk

CD4+ T buňky hrají zásadní roli v protinádorové imunitě prostřednictvím rozpoznávání peptidových antigenů přítomných na MHC třídy II (MHC-II). Ačkoli některé solidní rakoviny mohou být indukovány k expresi MHC-II, rozsah, v jakém to umožňuje přímé rozpoznání nádorově specifickými CD4+ T buňkami, není jasný. Izolovali jsme a charakterizovali jsme antigenní receptory T buněk (TCR) z přirozeně aktivovaných CD4+ T buněk specifických pro 2 onkoproteiny, HPV-16 E6, a aktivační mutaci KRASG12V od pacientů s spinocelulárním karcinomem hlavy a krku a pankreatického duktálního adenokarcinomu, v daném pořadí, a určili jejich schopnost rozpoznávat autologní nebo lidský leukocytární antigen odpovídající antigen-exprimující nádorové buňky. Zjistili jsme v obou případech, že TCR byly schopny rozpoznat cílové buňky nabité peptidem exprimující relevantní buňky prezentující antigen MHC-II nebo B buňky (APC), když byly antigeny endogenně exprimovány a směrovány do endozomální dráhy, ale nedokázaly rozpoznat nádor buňky exprimující zdrojový protein i po indukci povrchové exprese MHC-II pomocí IFN- nebo transdukcí pomocí CIITA. Tyto výsledky naznačují, že primární aktivace a funkční rozpoznávání jak nukleárního (E6), tak membránově asociovaného (KRAS) onkoproteinu je převážně omezeno na křížově prezentující APC spíše než prostřednictvím přímého rozpoznání nádorových buněk indukovaných k expresi MHC-II.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

Úvod

Maligní transformace somatických buněk je iniciována působením aktivovaných onkogenů, které dysregulují dráhy buněčného růstu a vedou k nekontrolované proliferaci (1). V případě rakoviny asociované s HPV přispívá exprese časných genů HPV E6 a E7 k onkogenezi inhibicí tumor supresorových genů p53 a Rb (2). Alternativně může konstitutivní aktivace onkogenu nastat prostřednictvím somatických mutací v genech regulujících buněčný růst a proliferační dráhy, jako je rodina RAS. Aktivující mutace KRAS, jako je KRASG12V, se skutečně běžně vyskytují u pacientů s rakovinou slinivky, tlustého střeva a plic (3). Ačkoli onkogeny podporují onemocnění, mohou také poskytovat cíle pro imunitní systém hostitele. V posledních letech se široce uznává úloha imunitního systému při kontrole rakoviny související s HPV. CD8+ a CD{10}} T buňky rozpoznávající HPV E6 a E7, stejně jako další HPV proteiny, byly identifikovány jak v periferní krvi, tak v lymfocytech infiltrujících tumor (TIL) pacientů s HPV rakoviny (4–6). Imunoterapie zacílené na tyto antigeny, včetně terapeutických vakcín proti rakovině a adoptivní buněčné terapie (ACT) s TIL nebo T-buňkami upravenými TCR, jsou aktivní oblastí preklinického a klinického zkoumání (2). Odpovědi T-buněk proti onkogenním mutacím byly také široce popsány (7–9). Kromě toho existuje přímý klinický důkaz, že ACT s TIL zaměřenými na mutantní KRAS může podporovat objektivní odpovědi (10). Ačkoli CD8+ T buňky rozpoznávající epitopy odvozené od onkogenů zprostředkovávají přímou cytotoxicitu proti nádorovým buňkám (11–13), role CD4+ T buněk v protinádorové imunitě je méně dobře známa. Nedávné studie upozornily na podskupinu CD4+ T buněk exprimujících cytotoxické markery, jako je granzym B (GrzmB), u lidských rakovin (14, 15). Antigenní specifity těchto buněk, a tím i jejich terapeutický potenciál, však zůstávají do značné míry neznámé. Kromě toho, aby tyto cytotoxické CD4+ T buňky rozpoznaly a zabily nádorové buňky, musí nádorová buňka nejen exprimovat MHC-II, ale také příslušné antigeny musí být nasměrovány do vhodné prezentační dráhy. V této studii jsme zkoumali schopnost CD4+ T buněk specifických pro onkoproteiny HPV-16 E6 a KRASG12V rozpoznat nádorové buňky exprimující antigen. Ačkoli oba TCR byly schopny přímo rozpoznat endogenně zpracované a prezentované antigeny namířené do endozomálního kompartmentu HLA-shodných B buněk, ani jeden nebyl schopen rozpoznat antigen-exprimující nádorové buňky s indukovanou expresí MHC-II. Celkově naše výsledky naznačují, že pouze určité antigeny jsou přítomny přímo na nádorových buňkách MHC-II+, což může omezit zásobu CD4+ T buněk schopných přímo rozpoznávat a eliminovat nádorové buňky.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Výsledek

Identifikace HPV-16 E6-specifických CD4+ a CD8+ T buněčných odpovědí z TIL spinocelulárního karcinomu hlavy a krku. Provedli jsme screening série jednotlivých kultur TIL izolovaných z 2 až 4 mm nádorových fragmentů od pacienta (Hu-56) s HPV-16+ spinocelulárním karcinomem hlavy a krku (HNSCC) (doplňková tabulka 1; doplňkový materiál dostupné online v tomto článku; https://doi.org/10.1172/jci.insight.165570DS1) pomocí testů IFN-ELISPOT k identifikaci odpovědí T buněk namířených proti HPV-16 virovým onkoproteinům E6 a E7 pomocí peptidových poolů obsahujících překrývající se 15-mery pokrývající délku proteinů E6 a E7. Je pozoruhodné, že fragmenty TIL 12 a 29 generovaly značný počet skvrn nad pozadím, když byly restimulovány poolem peptidů E6 a obsahovaly jak CD4+, tak CD8+ T buňky (obrázek 1A a doplňkový obrázek 1A). Abychom identifikovali relevantní podskupiny T buněk, analyzovali jsme tyto kultury TIL pomocí testu sekrece cytokinů. To odhalilo TIL fragment 29 (F29) obsahoval E6-reaktivní CD8+ T buňky, zatímco fragment 12 (F12) obsahoval CD4+ i CD8+ T buňky schopné rozpoznání E6 peptidového poolu (obrázek 1B). Žádná z CD4+ T buněk neprodukovala IL-5 v reakci na restimulaci E6, což potvrzuje fenotyp podobný Th{40}}. Abychom určili TCR klonalitu E6-specifických TIL, seřadili jsme jednotlivé CD4+ T buňky vylučující IFN z F12 a CD{45}} T buňky z F12 a F29. Sekvenování TCR odhalilo jeden TCR exprimovaný IFN- – secernujícími CD4+ T buňkami (n=31 z 31 sekvenovaných buněk), stejně jako jeden TCR klon sdílený IFN- – secernující CD{{53 }} T buňky z F12 a F29 (n=40 ze 41 a 37 z 38 sekvenovaných buněk, v tomto pořadí) (doplňková tabulka 2). Tyto výsledky naznačují, že v TIL od tohoto pacienta jsou přítomny monoklonální CD4+ a CD{62}} T buňky reaktivní na E6. HLA-A*02:01–omezené CD8+ T buňky z TIL rozpoznávají E6 prezentovaný nádorovou buněčnou linií pocházející z pacienta. TIL z F29 produkovaly IFN-, když byly restimulovány E629-38 peptidem, což naznačuje, že F29 TCR rozpoznal tento dříve popsaný HLA-A*02:01-omezený epitop (doplňkový obrázek 1B) (11). To bylo potvrzeno studiemi vazby tetrameru pomocí E629-38/HLA-A*02:01 ke značení TCR-deficientních J76 buněk exprimujících lidský CD8 a použitím dříve popsaného E628-38-specifického TCR jako pozitivního ovládání (obrázek 2A) (11). Oba TCR vykazovaly podobné úrovně funkční avidity, jak prokázala upregulace akutního aktivačního markeru CD69 na J76 po stimulaci autologními B lymfoblastoidními buněčnými liniemi (B-LCL) pulzovanými titrovanými koncentracemi E629-38 peptidu (obrázek 2, B a C). Tato data potvrzují přítomnost klonu CD8+ T buněk specifického pro známý epitop E6 s podobnými funkčními charakteristikami jako TCR, který byl testován v klinickém prostředí (16). Dále jsme se snažili zjistit, zda E6-specifický CD8+ TCR dokáže rozpoznat endogenně exprimované antigeny a tím zprostředkovat protinádorovou cytotoxicitu. K tomu jsme použili dobře charakterizovanou HLA-A*02:01+ HPV-16+ nádorovou linii, CaSki, a také autologní nádorovou buněčnou linii, HNSCC{105}}, vytvořenou prostřednictvím buněčné přeprogramování primární nádorové tkáně, jak bylo popsáno dříve (17) pro in vitro testy cytotoxicity. Analýza RNA-Seq potvrdila expresi časných genů HPV{108}}, včetně E6, jak ve vzorku primárního nádoru, tak v autologní buněčné linii (doplňkový obrázek 1C). Primární lidské CD{111}} T buňky exprimující F29 TCR by mohly zprostředkovat buněčné zabíjení CaSki i HNSCC-56 v rozsahu poměrů efektor-cíl in vitro (obrázek 2, D a E). Společně tato data potvrzují, že F29 TCR rozpoznává endogenně exprimovaný antigen E6. Identifikace HLA-DQ-omezené, E{120}}specifické CD4+ T buňky z TIL. K rozšíření E6-specifických TIL pro další funkční analýzu jsme použili dříve popsaný protokol rychlé expanze kultivace s OKT{123}} a ozařovali jsme alogenní PBMC, abychom rozšířili TIL z F12. Ačkoli primární kultura F12 původně obsahovala CD8+ i CD4+ T buňky s reaktivitou E6, konečný buněčný produkt po rychlé expanzi obsahoval 99 % CD{130}} T buněk, z nichž přibližně 38,33 % prokázalo reaktivitu proti E6, jak bylo prokázáno intracelulárním cytokinovým barvením na IFN- (obrázek 3A).

Čínská bylina cistanche rostlina-Protinádorová

Kromě IFN- mohou stimulované E6-specifické CD4+ TIL vylučovat TNF-, ale ne IL-2 (doplňkový obrázek 2A). Přestože se celková frekvence GrzmB+ buněk se stimulací antigenu nezvýšila, gating na TNF- sekretujících buňkách odhalil, že E6-specifické CD4+ TIL obsahovaly více uloženého intracelulárního GrzmB než nespecifické TIL (doplňkový obrázek 2B ). CD4+ TIL secernující IFN také exprimovaly koinhibiční marker programované buněčné smrti 1 (PD-1), což je v souladu s publikovanými signaturami CD4+ TIL reaktivních s nádorem (doplňkový obrázek 2C) ( 18, 19). E6-specifické CD4+ TIL prokázaly vysokou funkční aviditu, protože tyto buňky mohly vylučovat cytokiny při koncentracích peptidů nižších než 1 ug/ml (obrázek 3B). Abychom určili specificitu kultury F12 TIL, pulzovali jsme autologní B-LCL s individuálními peptidy odpovídajícími každému z 37 peptidů obsažených v původním poolu E6 (doplňková tabulka 3). CD4+ TIL z F12 vylučovaly IFN-, když byly stimulovány peptidy E61-15 a E65-19, které sdílejí 11aminokyselinovou jádrovou sekvenci (doplňkový obrázek 2D). Kokultivační experimenty v přítomnosti HLA-blokujících Abs odhalily významně sníženou sekreci IFN- TIL, když B-LCL byly blokovány anti-HLA-DQ Ab, ale ne anti-HLA-DR nebo izotypovými kontrolními Ab (obrázek 3C). Abychom určili, které alely HLA-DQ jsou zodpovědné za prezentaci tohoto epitopu, pulzovali jsme B-LCL exprimující známé alely HLA-DQ (doplňková tabulka 4) s E61-15 a zjistili jsme, že buňky KAS011 exprimující HLA-DQA1*01 :02 a DQB1*05:02, ale ne Hu{55}} B-LCL exprimující DQA1*05:05 a DQB1*03:01, mohly prezentovat antigen TIL srovnatelným způsobem jako autologní Hu{{63} } B-LCL (obrázek 3D). Nakonec jsme se snažili ověřit, že sekvence TCR identifikovaná dříve byla skutečně zodpovědná za rozpoznání E6. Exprese F12 TCR v CD4+ T buňkách primárního lidského zdravého dárce byla dostatečná k podpoře rozpoznání E61-15 peptidu, jak dokazuje zvýšená regulace CD69 a PD-1 (obrázek 3E ). Dohromady tyto výsledky demonstrují identifikaci HLA-DQ-omezeného epitopu E6 rozpoznávaného monoklonálními CD4+ TIL. E6-specifické CD4+ T buňky nerozpoznají ani nezabíjejí autologní nádorové buňky exprimující MHC-II. Nedávné studie identifikovaly genetické znaky cytotoxických CD4+ TIL u některých lidských rakovin (14, 15). Není však známo, zda cytotoxické CD4+ T buňky hrají roli v rakovinách vyvolaných HPV. Abychom určili, zda E6-specifické CD4+ T buňky z TIL mohou přímo rozpoznat HNSCC-56, nejprve jsme zkoumali její stav exprese MHC-II. Ačkoli nádorové buňky neexprimovaly v kultuře žádný detekovatelný povrchový MHC-II, ošetření IFN- po dobu 72 hodin bylo dostatečné pro indukci upregulace MHC-II (obrázek 4A). Dále jsme kultivovali HNSCC-56 pomocí CD4+ F12 TIL. Důležité je, že nádorové buňky MHC-II+ předkondicionované IFN- nebyly schopny stimulovat CD4+ TIL, jak bylo měřeno sekrecí IFN- (obrázek 4B).

Obrázek 1. Identifikace E6-reaktivních CD4+ a CD8+ TIL z HPV-16+ HNSCC. (A)

Obrázek 2. Funkční charakteristiky HLA-A*02:01-omezeného, ​​E6-specifického TCR z Hu-56 TIL. (A)

Nádorové buněčné linie ošetřené IFN-pulzovanými E61-15 před přidáním TIL však byly schopny stimulovat odpověď T buněk, což naznačuje, že povrchová exprese restrikčních alel HLA-DQ v buněčné linii, která endogenně exprimuje E6 nebyla dostatečná pro rozpoznání nádoru, ale vyžadovala exogenní zatížení cílového peptidu. Stejný požadavek na naložení exogenního cílového peptidu byl pozorován u nádorových buněk transdukovaných CIITA (HNSCC-56 CIITA), které konstitutivně exprimují vysoké hladiny povrchového MHC-II (obrázek 4B). Abychom otestovali, zda CD4+ TIL mohou rozpoznat endogenně zpracovanou a prezentovanou verzi epitopu E6 na APC, retrovirově jsme transdukovali autologní B-LCL expresním konstruktem kódujícím prvních 50 aminokyselin E6 fúzovaných s MHC- I transmembránová doména (E6-MITD), která indukuje lokalizaci fúzované aminokyselinové sekvence do plazmatické membrány a podporuje prezentaci na MHC-II prostřednictvím endosomálního přenosu (20). B-LCL exprimující konstrukt E6-MITD by mohly stimulovat E6-specifické CD4+ TIL, což naznačuje, že peptidový epitop rozpoznávaný těmito TIL může být přirozeně zpracován a prezentován na MHC-II, když nasměrovány do příslušné dráhy (obrázek 4C).

Obrázek 3. Funkční charakteristiky klonálně expandovaných, HLA-DQ omezených, E6-specifických CD4+ TIL. (A)

Dále jsme se snažili zjistit, zda F12 E 6-specifické CD4+ TIL byly schopny přímé cytotoxicity nádoru. V souladu s údaji z našich rozpoznávacích testů nebyly E6-specifické CD4+ TIL schopny omezit růst nádorových buněk HNSCC{5}}, které neexprimují MHC-II (obrázek 4D) . Kromě toho nádorové buňky HNSCC-56 CIITA také rostly bez inhibice v přítomnosti CD4+ TIL. Růst nádorových buněk HNSCC-56 CIITA pulzovaných peptidem E61-15 však byl inhibován způsobem závislým na dávce efektorových buněk. Celkově tato data naznačují, že ačkoli HNSCC-56 může prezentovat E6 epitopy CD8+ T buňkám, E6-specifické CD4+ TIL nejsou schopny přímo rozpoznat a lyžovat MHC- II+ autologní nádorové buňky. Geny zapojené do prezentace antigenu jsou u rakoviny často mutovány, což může bránit rozpoznání T buňkami (21). Abychom určili, zda nádorové buňky HNSCC{21}} obsahovaly nějaké somatické mutace vylučující prezentaci antigenu na MHC-II, provedli jsme celoexomové sekvenování nádorových buněk a PBMC z Hu-56 jako referenčního vzorku. Ze 104 identifikovaných nesynonymních somatických mutací nebyly žádné zjevné mutace v komponentách prezentační dráhy MHC-II, včetně HLADMA, HLADMB a CD74 (doplňková tabulka 5). Identifikace HLA-DRB5*01:01 – omezeného, ​​KRASG12V-specifického TCR z krve pacienta s duktálním adenokarcinomem slinivky břišní. Na základě těchto výsledků jsme se rozhodli zjistit, zda neschopnost nádorových buněk prezentovat antigen na MHC-II byla pravdivá pro jiné onkogeny. Vzhledem k tomu, že cirkulující nádorově specifické T buňky byly identifikovány u lidských pacientů s rakovinou (8, 22), stimulovali jsme PBMC od pacienta (Hu-66) s pankreatickým duktálním adenokarcinomem (doplňková tabulka 1) se souborem peptidů odpovídající běžným onkogenním mutacím (doplňková tabulka 6) po dobu 14 dnů před restimulací jednotlivými peptidy k identifikaci relevantních odpovědí T buněk pomocí ELISPOT. Tyto výsledky naznačovaly přítomnost odpovědi T-buněk namířené proti KRASG12V, o čemž svědčí zvýšený počet IFN-spotů na pozadí v reakci na KRASG12V aminokyseliny 1–15 (obrázek 5A). K identifikaci relevantních TCR spojených s touto odpovědí jsme opět použili test sekrece cytokinů k třídění buněk vylučujících IFN--. Test sekrece cytokinů odhalil specifickou produkci IFN- CD4+ T buňkami v reakci na restimulaci pomocí KRASG12V (obrázek 5B). Porovnání řetězců TCR z vytříděných buněk vylučujících IFN-- s těmi, které jsou přítomny v neexpandovaných PBMC od tohoto pacienta, odhalilo jediný klonotyp TCR přítomný v nejvyšší frekvenci mezi oběma populacemi (obrázek 5C a doplňková tabulka 2). Tyto výsledky naznačují, že frekvence tohoto klonu T buněk byla rozšířena na základní linii v PBMC, což naznačuje přirozeně vznikající odpověď in vivo spíše než in vitro priming v naší expanzní kultuře. Abychom ověřili antigenní specificitu tohoto TCR, exprimovali jsme jej v primárních lidských CD{60}} T buňkách retrovirovou transdukcí a kultivovali jsme tyto buňky s autologními B-LCL pulzovanými buď mutantním KRASG12V nebo odpovídajícím WT peptidem. Upravené T buňky vylučovaly IFN-, když byly stimulovány mutantem, ale ne WT, peptidem KRAS, což ověřovalo, že tento TCR je specifický pro KRASG12V (obrázek 5D). V souladu s našimi výsledky z E6 TCR byly upravené T buňky exprimující KRASG12V-specifický TCR také schopny rozpoznat B-LCL exprimující fragment KRASG12V, ale ne WT KRAS, zaměřené na endozom zahrnutím MITD, což naznačuje, že toto TCR rozpoznává endogenně zpracovaný a prezentovaný antigen (obrázek 5D).

Obrázek 4. Autologní nádorové buňky neprezentují endogenní E61-15 na MHC-II až CD4+ T buňkách. (A)

Obrázek 5. Identifikace HLA-DRB5*01:01-restricted, KRASG12V-specifické TCR z krve pacienta s pankreatickým duktálním adenokarcinomem. (A)

Abychom identifikovali omezující alelu HLA, opakovali jsme tyto experimenty se stimulací peptidů s použitím B-LCL exprimujících různé kombinace genů HLA. B-LCL exprimující běžný haplotyp HLA-B7-DR15-DQ6 by mohly stimulovat upravené T buňky, zatímco B-LCL bez těchto alel nemohly (obrázek 5E). Nakonec stimulace těchto buněk peptidem pulzovaným IHW03304, myší DAP3 buněčnou linií transfekovanou lidskou HLA-DRB5*01:01, to potvrdila jako omezující molekulu HLA (obrázek 5F). Nádorové buňky MHC-II+ NCI-H2444 a DAN-G neprezentují epitop odvozený od KRASG12V pro CD4+ T buňky. Dále jsme zkoumali schopnost nádorových buněk přímo prezentovat epitopy odvozené od KRASG12V na MHC-II. Abychom pro tyto studie vytvořili buněčné linie MHC-II+ odpovídající HLA, transdukovali jsme buněčné linie KRASG12V+ NCI-H2444 a DAN-G, odvozené z lidských plicních a pankreatických rakovin, s CIITA a konstruktem kódujícím HLA-DRB5*01: 01 se zkráceným CD34 reportérovým genem (obrázek 6A). V souladu s našimi předchozími výsledky nebyly nádorové buňky MHC-II+ exprimující omezující alelu HLA schopny stimulovat T-buňky upravené TCR, pokud nebyly cílové buňky nejprve pulzovány exogenním peptidem (obrázek 6B). Důležité je, že ve veřejně dostupných sekvenačních datech nebyly uvedeny žádné somatické mutace v genech prezentace MHC-II (jmenovitě HLADMA, HLADMB, CD74) ani pro NCI-H2444, ani pro DAN-G (23). Buňky NCI-H2444 CIITA rostly bez inhibice v přítomnosti T-buněk upravených TCR, zatímco buňky NCI-H2444 CIITA pulzované peptidem KRASG12V zaznamenaly opožděný růst nádoru (obrázek 6C). V souladu s výsledky získanými pro HNSCC-56, CD8+ T buňky exprimující HLA-A*03:01– omezený, KRASG12V-specifický TCR (24) byly schopny rozpoznat buňky NCI-H2444, ale ne Buňky CaSki, které exprimují HLA-A*03:01, ale ne KRASG12V (obrázek 6D). Tyto výsledky ukazují, že odlišný onkogen přítomný v cytosolu také nemůže být prezentován MHC-II+ nádorovými buňkami, přestože je účinně prezentován na MHC-I. Exprese koinhibičních ligandů, jako je ligand 1 programované buněčné smrti (PD-L1) nádorovými buňkami omezuje signalizaci TCR v T buňkách (25). Abychom zjistili, zda tento mechanismus může bránit rozpoznání nádorových buněk MHC-II+ CD4+ T buňkami, kultivovali jsme CD4+ T buňky exprimující náš KRASG12V-specifický TCR nebo E{86}}specifický F12 TCR s NCI-H2444 CIITA a HNSCC-56 CIITA, s nebo bez anti-PD-L1-blokujících Abs. Blokování interakcí PD-L1/PD-1 nebylo dostatečné k podpoře rozpoznání nádorových buněk (doplňkový obrázek 3). Podobně přidání anti-CD28 agonisty Ab nemodulovalo rozpoznávání nádorových buněk. Tyto výsledky naznačují, že za tento fenotyp je odpovědná spíše nedostatečná prezentace antigenu než přítomnost nebo nepřítomnost koinhibičních nebo kostimulačních signálů. Některé studie naznačují, že endogenní proteiny internalizované z plazmatické membrány jsou přednostně naneseny na MHC-II pro prezentaci ve srovnání s jinými subcelulárními kompartmenty (26). Ačkoli jsou proteiny KRAS často spojeny s membránami prostřednictvím lipidových modifikací, neexprimují transmembránovou doménu a tyto interakce nejsou stabilní (3, 27). Usoudili jsme proto, že ukotvení imunogenního fragmentu KRASG12V k plazmatické membráně nádorových buněk může umožnit přímé rozpoznání antigenu CD{103}} T buňkami. Nádorové buňky exprimující konstrukt KRASG12V-MITD, jak dokazuje exprese reportéru EGFP spojeného s P2A, však podobně nebyly schopny stimulovat CD{109}} T buňky upravené TCR (doplňkový obrázek 4). Tyto výsledky naznačují, že lokalizace subcelulárního onkogenu není jediným určujícím faktorem přímé prezentace MHC-II nádorovými buňkami. Kromě toho tyto výsledky naznačují, že nadměrná exprese antigenu není dostatečná k podpoře prezentace MHC-II. Naše dosavadní výsledky naznačují, že nádorově specifické CD{114}} T buňky mohou s větší pravděpodobností rozpoznávat antigeny prezentované APC než samotné nádorové buňky. Proto jsme hodnotili kapacitu HLADRB5*01:01+ DC prezentovat antigeny odvozené z exogenních proteinů. DC shodné s HLA generované in vitro byly schopné stimulovat TCR-inženýrské CD4+ T buňky exprimující KRASG12V-specifický TCR, když byly nezralé DC buď pulzovány KRASG12V 20-mer peptidem nebo krmeny celým proteinem KRASG12V, ale nikoliv protein KRAS WT (obrázek 6E). Tyto výsledky naznačují, že ačkoli TCR nedokáže rozpoznat endogenní antigeny prezentované nádorovými buňkami, může rozpoznat křížově prezentované exogenní antigeny v kontextu DC.

cistanche tubulosa - zlepšení imunitního systému

Diskuse

Cílem této studie bylo zjistit, zda TCR izolované z přirozeně aktivovaných T buněk získaných od pacientů s rakovinou mohou rozpoznat nádorové buňky exprimující onkogeny. S ohledem na třídu I (HLA-A*02:01) – omezenou, HPV-16 E629-38 TCR získanou z HNSCC TIL, bylo, možná nepřekvapivě, potvrzeno uznání pro obě autologní nádorové buněčné linie a dobře charakterizovaná nádorová buňka CaSki odpovídající HLA a exprimující E{7}} (důležité, viz obrázek 2). Stejné TIL (obrázek 1) také obsahovaly významný počet E6-specifických CD{12}} T buněk produkujících IFN (obrázek 3), které naopak E6- nerozpoznaly exprimující nádorové buňky, i když byly indukovány k expresi dostatečného množství povrchového MHC třídy II správné prezentující alely (DQA1*01:02/DQB1*05:02) ošetřením IFN- nebo CIITA transdukcí (obrázek 4). Exprese CIITA indukuje nejen povrchovou expresi MHC-II proteinů, ale také HLA-DM a molekul invariantního řetězce, které jsou nutné pro zpracování a prezentaci antigenu (28). Naproti tomu B-buňky odpovídající HLA byly rozpoznávány tímto TCR, když byl antigen nasměrován do dráhy MHC-II. Podobná situace byla pozorována v případě KRASG12V-specifického, HLA-DRB5*01:01-omezeného TCR, který dokázal rozpoznat HLA-shodné B buňky, ale ne MHC-II-exprimující nádorové buňky, když byl antigen namířen proti prezentační dráha MHC-II. Oba TCR měly dostatečnou funkční aviditu ke zprostředkování rozpoznání endogenně exprimovaných antigenů za podmínek popsaných výše a oba mohly zprostředkovat cytotoxicitu cílových buněk s nasyceným peptidem. Toto poslední pozorování odráží okolnost prezentovanou v několika zprávách o cytotoxických CD4+ T buňkách, ačkoli naše data rozšiřují kontext tohoto pozorování tím, že ukazují, že endogenní exprese zdrojového antigenu a indukce MHC-II pomocí IFN- je nepravděpodobná k získání fyziologického cíle na nádorových buňkách odvozených z epitelu pro TCR proti jaderným nebo membránově asociovaným antigenům. Nedávné studie rakoviny močového měchýře a melanomu u lidí identifikovaly genetické znaky odpovídající cytotoxickým CD4+ T buňkám mezi TIL (14, 15). Funkčně jsou tyto cytotoxické CD4+ TIL schopny přímého rozpoznání nádoru závislého na MHC-II, což nakonec vede k cílové lýze granzymy podobným způsobem jako jejich protějšky CD{47}}. Terapeutická translace těchto nálezů však může být omezena skutečností, že jen málo solidních nádorů exprimuje MHC-II. Výsledky 2 nezávislých studií skutečně naznačují, že pouze přibližně jedna třetina pacientů s melanomem má nějaké nádorové buňky MHC-II+ a frekvence těchto buněk v nádoru je často nižší než 10 % (15, 29). Místo toho se zdá, že převládajícím buněčným zdrojem MHC-II v mikroprostředí nádoru jsou infiltrující leukocyty (26).

Obrázek 6. Nádorové buňky MHC-II+ KRASG12V+ neprezentují epitopy odvozené od KRASG12V CD4+ T buňkám. (A)

Ačkoli některé buňky se solidním nádorem exprimují buď konstitutivní nebo indukovatelný MHC-II, naše výsledky naznačují, že navzdory přítomnosti CD4+ T buněk specifických pro onkogen mezi TIL a PBMC tyto buňky nemohou přímo rozpoznat a lyžovat antigen exprimující Nádorové buňky MHC-II+, zatímco epitopy ze stejného proteinu mohou být účinně prezentovány CD8+ T buňkám na MHC-I (13). To naznačuje, že pouhá exprese cílového antigenu nemusí být dostatečná k tomu, aby CD4+ T buňky rozpoznaly podskupinu nádorů, které exprimují MHC-II. Kromě toho se zdá, že tyto výsledky jsou konzistentní u různých typů nádorů, protože buněčné linie zkoumané v této studii zahrnují linie odvozené z HNSCC, plicního adenokarcinomu a rakoviny pankreatu. Přímé rozpoznání melanomových buněčných linií CD4+ T buňkami exprimujících MHC-II přirozeně nebo po transdukci CIITA bylo popsáno ve 2 studiích (30, 31). V obou těchto studiích však významná část testovaných TCR nerozpoznala přímo nádorové buňky. Není jasné, zda tyto TCR představují "přihlížející" klonotypy, které nerozpoznají nádorové antigeny nebo nádorově specifické TCR, které nejsou schopny rozpoznat svůj příbuzný antigen kvůli nedostatkům v prezentaci antigenu, jako jsou ty, které jsou zdůrazněny v této studii. Oliveira a kol. (31) prokázali, že přímé rozpoznání CD4+ T buňkami bylo omezeno na 2 melanomy s extrémně vysokou mutační zátěží nádoru, což naznačuje, že tento fenotyp může poskytnout další nezbytné změny umožňující MHC-II prezentaci nádorových antigenů. Ačkoli připojení MITD k imunogennímu fragmentu KRASG12V nevedlo k přímému rozpoznání nádorových buněk CD4+ T buňkami, studie popsaly zkreslení pro endogenní peptidy odvozené z membránově vázaných proteinů eluovaných z MHC-II, pravděpodobně díky membránové recyklaci (26, 32). Melanomový antigen Trp1 existuje v plazmatické membráně, což může usnadnit přímou prezentaci CD4+ T buňkám nádorovými buňkami B16 (33). Další antigen asociovaný s melanomem, gp100, je prezentován nádorovými buňkami CD4+ T buňkám způsobem závislým na transmembránové doméně gp100 (34). V nedávné práci zkoumající roli neoantigen-specifických CD4+ T-buněk v modelu myšího sarkomu byly z MHC-II na nádoru transdukovaném CIITA eluovány epitopy odvozené z mutované podjednotky integrinu, rovněž proteinu vázaného na membránu. buňky (35). Naše výsledky naznačují, že ačkoli proteiny vázané na membránu mohou být přednostně směrovány do endozomů pro přímou prezentaci na MHC-II, samotná přítomnost imunogenního membránového proteinu nestačí k podpoře této prezentace. Byly popsány další neklasické prezentační cesty, které mohou umožnit cytosolovým nebo nukleárním proteinům přístup k MHC-II, včetně prezentace intracelulárních proteinů asociované s autofagií a transportéru spojeného s prezentací CD4+ T-buňkám závislou na zpracování antigenu, přičemž antigenní peptidy jsou pravděpodobně přeneseny z MHC-I na MHC-II během membránové recyklace (36, 37). Bylo publikováno přímé rozpoznání autologních nádorových buněk CD4+ T buňkami specifickými pro epitopy E7 závislé na MHC-II (38, 39); obě tyto studie se však týkaly proteinů E7 exprimovaných méně rozšířenými onkogenními subtypy HPV (jmenovitě HPV-33 a HPV-59) prezentovanými buňkami rakoviny děložního čípku na molekulách HLA-DR. Je proto možné, že podtyp HPV, histologie nádoru a restriktivní alely HLA mohou být také relevantními faktory v rozdílné prezentaci jaderných antigenů HPV na nádorových buňkách MHC-II+. Ačkoli naše data naznačují, že přímá nádorová cytotoxicita není pravděpodobným mechanismem E6- a KRASG12V-specifických CD4+ T buněk, byly popsány další protinádorové mechanismy CD4+ T buněk a adoptivní přenos nádorově specifických CD4+ T buněk u pacientů s rakovinou prokázal protinádorovou aktivitu (7, 40, 41). Proto mohou být TCR omezené na MHC-II, jako jsou ty, které byly identifikovány v této studii, užitečné pro ACT u lidských pacientů, vzhledem k tomu, že takové TCR jsou zacíleny na epitopy odvozené z hnacích onkoproteinů omezených na HLA haplotypy odhadované na 1,27 % a 16,10 % US White populace pro HLADQA1*01:02/DQB1*05:02 a HLA-DRB5*01:01 (42). CD4+ T buňky pomáhají při aktivaci nádorově specifických CD8+ T buněk tím, že licencují DC nesoucí antigen způsobem závislým na CD40L (43–45). Ukazujeme, že TCR specifický pro KRASG12V identifikovaný v této studii rozpoznává zkříženě prezentované antigeny v kontextu DC, což naznačuje, že tyto buňky mohou být schopny přispívat k protinádorové imunitě prostřednictvím této funkce. CD{101}} T-buňky mohou také poskytovat lokální pomoc CD{101}} T-buňkám v nádorech vylučováním cytokinů, jako je IL{102}} a IFN- , čímž podporují přežití CD{104} T buněk a náboru do nádoru (46). Kromě toho mohou CD{106}} TIL rozpoznávat antigeny v mikroprostředí nádoru na myeloidních buňkách, jako jsou makrofágy. Předklinické studie skutečně prokázaly, že v nepřítomnosti MHC-II na nádorových buňkách mohou adoptivně přenesené Trp1 CD{109}} T buňky stále vykazovat protinádorovou imunitu závislou na IFN- a korelovat se zvýšenou cytotoxickou aktivitou makrofágů (47). Zdá se však, že tento jev je závislý na sekreci nádorového antigenu, o které bychom také spekulovali, že je v případě většiny onkogenů minimální. Celkově naše studie zdůrazňuje selektivitu přímé prezentace endogenních antigenů nádorovými buňkami MHC-II+ a prokazuje, že ani exprese CIITA, ani přítomnost antigenu vázaného na membránu nejsou samy o sobě dostatečné k podpoře přímého rozpoznání nádorových buněk pomocí CD{{115} } T buňky. Je zapotřebí více studií, aby bylo možné charakterizovat, které antigeny mohou být prezentovány přímo nádorovými buňkami MHC-II+ za jakých podmínek, abychom plně porozuměli kontextově závislým úlohám CD4+ T buněk v rakovině.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

Metody

Buněčná kultura. TIL byly sklizeny a kultivovány, jak bylo popsáno dříve (48). Stručně řečeno, primární nádorová tkáň byla rozřezána na 2–3 mm fragmenty, které byly umístěny do 24-jamkové destičky a kultivovány v RPMI-1640 doplněném 1{{1{117}}2}}% lidské AB sérum, penicilin-streptomycin, HEPES, gentamicin a 6,000 IU/ml IL-2. Extravazované TIL byly kultivovány výměnou poloviny média každé 2–3 dny. Primární lidské T-buňky z periferní krve byly kultivovány v médiu 5{119}}:50 obsahujícím 50 % AIM V plus 50 % RPMI-1640 doplněném 10 % lidským AB sérem, penicilin-streptomycin (100 U/ ml každý; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 300 IU/ml IL-2, 5 ng/ml IL-7 a 5 ng/ml IL-15. Nádorové buněčné linie odvozené od pacienta byly vytvořeny a kultivovány, jak bylo popsáno dříve (17). Stručně, primární nádorová tkáň byla nařezána na fragmenty menší než 2 mm a disociována pomocí GentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec). Nádorové buňky byly resuspendovány v F-Media obsahujícím 5 uM inhibitoru Rho kinázy a naneseny na lože ozářených fibroblastů 3T3 (30 Gy). Po počáteční kultivaci byly nádorové buňky propagovány ve směsi 3:1 ozářeného 3T3-kondicionovaného média a F-média obsahujícího 5 uM inhibitoru Rho kinázy. CaSki (ATCC), NCI-H2444 (ATCC), DAN-G (ATCC), J76 Jurkat (ATCC), 3T3-CD40L a B-LCL byly udržovány v médiu RPMI doplněném l-glutaminem a HEPES ( 10 mM; Gibco, Thermo Fisher Scientific), 10 % FBS, 1 mM pyruvát sodný (Gibco, Thermo Fisher Scientific), 1× MEM neesenciální aminokyseliny (Gibco, Thermo Fisher Scientific) a penicilin-streptomycin (100 U/ ml každý; Gibco). Udržovali jsme 293GP (ATCC) v doplňku média DMEM s 10% FBS a penicilin-streptomycin (100 U/ml každý; Gibco, Thermo Fisher Scientific). Buňky IHW03304, GM3107, KAS011, D8 a D66 byly dary od Alessandra Sette (La Jolla Institute for Immunology). ELISPOT testy. TIL nebo PBMC byly naneseny v množství 100000 buněk na jamku na destičky ELISPOT potažené antiIFN–Abs (1-D1K, Mabtech). Buňky byly restimulovány HPV-16 E6 a E7 PepMix (JPT) peptidovými pooly, peptidovými pooly reprezentujícími vybrané onkogenní mutace nebo indikovanými jednotlivými peptidy v 5 ug/ml pro pooly nebo 10 ug/ml pro peptidy po dobu 22 hodin před vývojem Destičky ELISPOT podle pokynů výrobce (Mabtech). Pro pozitivní kontrolu bylo použito 5 ug/ml fytohemaglutininu-L. Ex vivo expanzní kultura. PBMC byly naneseny na plotnu s peptidovým poolem představujícím vybrané onkogenní mutace v 5 ug/ml. Čerstvé médium obsahující 10 IU/ml IL-2 bylo přidáno ve dnech 4, 7 a 10. V den 14 byly PBMC restimulovány pro použití buď v ELISPOT nebo v testech sekrece cytokinů. TCR sekvenování. TIL nebo PBMC byly restimulovány pomocí 5 ug/ml HPV-16 E6 PepMix (JPT) nebo KRASG12V peptidu a buňky sekretující IFN- byly fluorescenčně označeny pomocí sady Human IFN-Secretion Assay podle pokynů výrobce (Miltenyi Biotec) . Jednotlivé IFN- + buňky byly roztříděny do 96-jamkové destičky pomocí FACSAria (BD Biosciences) a RNA-Seq byla provedena pomocí Illumina Miseq k identifikaci spárovaných TCR a řetězců. Pro identifikaci E6-specifického CD4+ TCR klonu byly buňky sekretující IFN roztříděny, jak je uvedeno výše, a sekvence TCR a TCR byly amplifikovány pomocí vnořené, multiplexní PCR, jak bylo popsáno dříve (49). Produkty PCR byly podrobeny Sangerovu sekvenování (ETON Biosciences). Pro analýzu frekvence TCR byly PBMC před a po 14-denní ex vivo expanzi s uvedenými peptidy zaslány společnosti Adaptive Biotechnologies. Analýza exprese HPV. RNA byla izolována z Hu-56 primárních nádorových buněk a nádorové buněčné linie a podrobena hromadnému RNA-Seq. Čtení párového sekvenování byla mapována pomocí BWA (v0.7.12) (50) do kompletního genomu HPV (GenBank přístupové č. NC_001526.2) a jeho odpovídajícího transkriptomu. Výsledný soubor mapy zarovnání sekvencí byl převeden na seřazenou binární mapu zarovnání a indexován, po čemž následovalo počítání mapovaných čtení pomocí SAMtools (v1.2) (50). Sekvenování celého exomu. Sekvenování celého exomu a RNA-Seq byly provedeny v La Jolla Institute for Immunology Sequence Core za použití souprav Agilent pro zachycení celého exomu a Illumina. Biovzorky FFPE byly distribuovány Moores Cancer Center společnosti Tempus pro sekvenování nové generace spolu s odpovídající referenční DNA pomocí vzorků periferní krve. Odečty sekvencí z exomového sekvenování nádoru a normálních vzorků byly porovnány s referenčním genomem GRCh38 pomocí SpeedSeq Align (v0.1.0) (51). Varianty Exome byly identifikovány pomocí SpeedSeq Somatic a varianty byly označeny pomocí SNPeff (v4.3i) (52). Data RNA-Seq a sekvenování celého exomu pro tento rukopis byla nahrána do NCBI BioProject, přístupové číslo PRJNA924789. Retrovirová transdukce T buněk. Nukleotidové sekvence TCR byly syntetizovány a klonovány v páteři retroviru MSGV1 za použití BioXP 3200 (Codex). Sekvence byla kodonově optimalizována pro expresi v lidských buňkách. Lidské konstantní oblasti TCR byly vyměněny za myší konstantní oblasti TCR se substitucemi, aby se zvýšila povrchová exprese a podpořilo se preferenční párování (53, 54). Lidské PBMC byly izolovány z buffy coats. CD4+ nebo CD8+ T buňky byly odstraněny magnetickou selekcí a negativní frakce obsahující všechny zbývající lymfocyty byla kultivována v médiu T buněk s 50 ng/ml anti-CD3 Ab (OKT3) po dobu 2 dní.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

Retrovirové supernatanty TCR byly vytvořeny kotransfekcí buněk 293GP vektorem MSGV1 obsahujícím relevantní sekvenci TCR a plasmid RD113. Dva dny po transfekci byly retrovirové supernatanty sklizeny a použity buď čerstvé, nebo zmrazené na –80 stupňů. Transdukce byly prováděny na destičkách potažených RetroNectinem (Takara), jak bylo popsáno dříve (5). Exprese konstantní oblasti myšího TCR byla hodnocena průtokovou cytometrií pro stanovení účinnosti transdukce. T-buňky upravené pomocí TCR nebyly použity dříve než 7. den po počáteční stimulaci. Funkční testy T buněk. Kokultivovali jsme 5 × 1 04 TIL, transdukované T buňky nebo J76 Jurkat buňky s 1 × 105 B-LCL pulzovanými přes noc s uvedenými koncentracemi peptidu nebo 5 × 103 nádorových buněk nasazených předchozí den v {{16} } destičky s U-dnem nebo plochým dnem. Tam, kde to bylo indikováno, byly ke kokulturám T buněk a nádorových buněk přidány protilátky proti agonistům CD28 (klon CD28.2, BioLegend) nebo anti-PD-L1 blokující (klon 29E.2A3, BioLegend) v množství 5 a 10 ug/ml, v daném pořadí. Pro testy cytokinů a aktivačních markerů byl jako pozitivní kontrola použit 1× Cell Activation Cocktail (BioLegend) obsahující PMA a ionomycin. Pro studie blokování HLA bylo k peptidem pulzovaným B-LCL alespoň 2 hodiny před přidáním T buněk přidáno 20 ug/ml následujících Ab: anti-HLA-DQ (Tü169, BioLegend), anti-HLA-DR (L243, BioLegend), nebo myší izotypová kontrola IgG2a (MOPC-173, BioLegend). Tam, kde je to indikováno, byly nádorové buňky kultivovány po dobu 72 hodin s 10 ng/ml rekombinantního IFN- před přidáním T buněk. Supernatanty byly sklizeny po 18–24 hodinách, IFN- byl měřen pomocí ELISA (Thermo Fisher Scientific) a buněčné pelety byly obarveny pro průtokovou cytometrii. Testy cytotoxicity byly prováděny kokultivací T buněk s nádorovými buňkami v uvedených poměrech efektor-cíl. Stručně řečeno, 5 x 103 nádorových buněk bylo nasazeno a kultivováno přes noc před přidáním T buněk v uvedených poměrech. Lýza cílových buněk byla stanovena pomocí xCELLigence Real-Time Cell Analyzer (ACEA Biosciences), který hodnotil elektrickou impedanci v důsledku přilnavosti buněk každých 30 minut až do konce experimentu. Data byla analyzována pomocí softwarového balíku xCELLigence RTCA a výsledky byly uvedeny jako buněčný index normalizovaný na 1 v době, kdy byly přidány T buňky. Test prezentace MHC-II. Syntetické konstrukty DNA kódující následující byly vytvořeny a klonovány do MSGV1 pomocí BioXP 3200 (Codex): N-koncových 25 aminokyselin lidského genu HLA-B, následovaných prvních 50 aminokyselin HPV-16 E6 nebo 25 aminokyselin KRASG12V fúzovaných s C-koncovými 55 aminokyselinami lidského HLA-B, T2A samoštěpícím elementem a kódující sekvencí EGFP. Virové supernatanty byly vytvořeny, jak je popsáno výše, a autologní B-LCL byly transdukovány na destičkách potažených RetroNectinem po stimulaci přes noc na lůžku ozářených (0,5 Gy) 3T3 buněk exprimujících lidský CD40L (3T3-CD40L). Účinnost transdukce byla hodnocena průtokovou cytometrickou kvantifikací exprese EGFP. Transdukované B-LCL byly stimulovány 3T3-CD40L v přítomnosti 200 IU/ml rekombinantního lidského IL-4 (PeproTech) po 2 po sobě jdoucí kola 2–3 dny před kokultivací s autologními TIL. Generování DC pro testy prezentace antigenu. DC byly vytvořeny pomocí metody plastické adherence. Zmrazené PBMC byly rozmraženy a naneseny na médium DC (RPMI-1640 doplněné l-glutaminem, 5% teplem inaktivovaným lidským AB sérem a 100 U/ml každého penicilin-streptomycin) po dobu 2 hodin při 37 stupních. Neadherentní buňky byly odstraněny promytím teplým PBS a adherentní buňky byly kultivovány v DC médiu doplněném 800 U/ml GM-CSF (Tonbo, Cytek Biosciences) a 500 U/ml IL-4 (PeproTech) po dobu 6 dnů . Přidali jsme 1 ug/ml peptidu KRASG12V nebo 20 ug/ml proteinu KRASG12V nebo WT KRAS (Abcam) přímo k nezralým DC přes noc. Následující den byly DC sklizeny a kokultivovány s TCR upravenými T buňkami v poměru 1:1 přes noc před hodnocením upregulace CD137 průtokovou cytometrií. Retrovirová transdukce nádorových buněk. Kódující sekvence lidské CIITA byla syntetizována (Integrated DNA Technologies) a klonována do MSGV1 pomocí Gibson Assembly. Kódující sekvence HLADRB5*01:01 a řetězce oddělené sekvencí P2A byly syntetizovány (Integrated DNA Technologies) a klonovány do modifikovaného lentivirového vektoru pHAGE upstream od sekvence T2A následované zkrácenou reportérovou sekvencí CD34 pomocí Gibson Assembly. Retrovirové supernatanty byly vytvořeny pomocí MSGV1, jak je popsáno výše. Lentivirové supernatanty byly vytvořeny kotransfekcí 293T buněk s plasmidy pHAGE, tat, rev, gag/pol a vsv-g. Virové supernatanty byly shromážděny o 24 hodin později a koncentrovány centrifugací ve zkumavkách Amicon Ultra 5 (MilliporeSigma). Nádorové buňky byly naneseny na plotny a o 1 den později bylo médium nahrazeno retrovirovým nebo lentivirovým supernatantem doplněným 10 ug/ml polybrenu. O čtyři hodiny později byl supernatant obsahující virus odsát a nahrazen kultivačním médiem. Nádorové buňky MHC-II+ a CD34+ byly tříděny pomocí FACS Fusion cell sorter (BD Biosciences). Průtoková cytometrie. Buňky byly značeny monoklonálními Ab konjugovanými s fluorochromem na následující antigeny: anti-humánní CD3–PE (OKT3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD4–PE–Cyanine7 (SK3, Tonbo, Cytek Biosciences), CD8–APC (Hit8a, Tonbo , Cytek Biosciences), CD34–Alexa Fluor 647 (581, BioLegend), CD69–PerCP– Cyanine5.5 (FN50, BioLegend), CD137–PE (4B4-1, Miltenyi Biotec), PD{145}} –BV650 (EH12.2H7, BioLegend), HLA-II–APC (Tü39, BioLegend) a anti-myší TCR-APC (H57-597, Tonbo, Cytek Biosciences). Mrtvé buňky byly obarveny buď DAPI nebo LIVE/DEAD Fixable Aqua (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific). E629-38– HLA-A*02:01–PE tetramer byl sestaven a označen NIH Tetramer Core Facility. Buňky byly barveny 1 ug/ml tetrameru po dobu 1 hodiny na ledu. Barvení Ab na povrchové antigeny bylo prováděno po dobu 15 minut na ledu. Pro intracelulární barvení cytokinů (ICS) byly T buňky kokultivovány s peptidem pulzovanými APC po dobu 4–6 hodin v přítomnosti Brefeldinu A. Buňky byly permeabilizovány a barveny na intracelulární cytokiny pomocí sady Cytofix/Cytoperm Kit (BD Biosciences) po povrchovém barvení , podle pokynů výrobce. Pro barvení cytokinů byly použity následující protilátky konjugované s fluorochromem: IFN- –APC (4S.B3, BioLegend), IL-2-FITC (MQ1- 17H12, BioLegend), TNF- –BV785 (Mab11 , BioLegend) a Granzyme B–PE (QA16A02, BioLegend). Data byla získána průtokovým cytometrem FACSCelesta (BD Biosciences) a analyzována pomocí softwaru FlowJo v10.7. Statistika. Statistické analýzy byly provedeny pomocí Prism 8 (GraphPad Software). Pro srovnání ICS byl použit nepárový 2-tailed t-test. Pro srovnání HLA blokující Ab–Ab zprostředkované potlačení signalizace T buněk byl použit 2-způsob ANOVA. P < 0,05 bylo považováno za statisticky významné. Schválení studie. Deidentifikované lidské vzorky použité v této studii byly získány na základě informovaného souhlasu prostřednictvím protokolu UCSD IRB 101391CX, "Tumor Environment Phenotyping and Cell Isolation." Jednotlivci ve studii poskytli písemný informovaný souhlas.

Reference

1. Hanahan D, Weinberg RA. Charakteristické znaky rakoviny: příští generace. Buňka. 2011;144(5):646–674.

2. Shamseddine AA, et al. Nádorová imunita a imunoterapie rakoviny související s HPV. Cancer Discov. 2021;11(8):1896–1912.

3. Simanshu DK, et al. Špičkový přehled Proteiny RAS a jejich regulátory u lidských onemocnění. Buňka. 2017;170(1):17–33. 4. De Vos Van Steenwijk PJ, et al. Neočekávaně velký polyklonální repertoár HPV-specifických T buněk je připraven pro působení u pacientek s rakovinou děložního čípku. Cancer Res. 2010;70(7):2707–2717.

5. Stevanović S, a kol. Krajina imunogenních nádorových antigenů v úspěšné imunoterapii virově indukovaného epiteliálního karcinomu. Věda. 2017;356(6334):200–205.

6. Bhatt KH, a kol. Profilování HPV-16-specifických T-buněčných odpovědí odhaluje široké antigenní reaktivity u pacientů s rakovinou orofaryngu. J Exp Med. 2020;217(10):e20200389.

7. Veatch JR, et al. CD4 + T buňky specifické pro BRAF V600E infiltrující nádor korelovaly s kompletní klinickou odpovědí u melanomu. J Clin Invest. 2018;128(4):1563–1568.

8. Veatch JR, et al. Endogenní CD4+ T buňky rozpoznávají neoantigeny u pacientů s rakovinou plic, včetně rekurentních onkogenních mutací KRAS a ERBB2 (Her2). Cancer Immunol Res. 2019;2(13):910–922.

9. Cafri G, a kol. Paměťové T buňky zacílené na onkogenní mutace detekované v periferní krvi pacientů s epiteliální rakovinou. Nat Commun. 2019;10(1):449.

10. Tran E, a kol. Terapie přenosem T-buněk zaměřená na mutantní KRAS u rakoviny. N Engl J Med. 2016;375(23):2255–2262.

11. Draper LM a kol. Cílení na HPV-16+ epiteliální rakovinné buňky TCR genově upravenými T buňkami namířenými proti E6. Clin Cancer Res. 2015;21(19):4431–4439.

12. Jin BY, a kol. Upravené T buňky zacílené na E7 zprostředkovávají regresi rakoviny lidského papilomaviru na myším modelu. JCI Insight. 2018;3(8):e99488.

13. Medvěd AS a kol. Biochemická a funkční charakterizace mutantních epitopů KRAS potvrzuje tento onkoprotein pro imunologické cílení. Nat Commun. 2021;12(1):4365.

14. Oh DY, a kol. Intratumorální CD4+ T buňky zprostředkovávají protinádorovou cytotoxicitu u lidského karcinomu močového měchýře. Buňka. 2020;181(7):1612–1625.

15. Cachot A, a kol. Nádorově specifické cytolytické CD4 T buňky zprostředkovávají ochrannou imunitu proti lidské rakovině. Sci Adv. 2021;7(9):eabe3348.

16. Doran SL, a kol. Genová terapie T-buněčných receptorů pro epiteliální karcinomy spojené s lidským papilomavirem: první studie fáze I/II u člověka. J Clin Oncol. 2019;37(30):2759–2768.

17. Liu X, a kol. Podmíněné přeprogramování a dlouhodobá expanze normálních a nádorových buněk z lidských biovzorků. Nat Protoc. 2017;12(2):439–451.

18. Veatch JR, et al. Neoantigen-specifické CD4+ T buňky v lidském melanomu mají různé stavy diferenciace a korelují s funkcí CD8+ T buněk, makrofágů a B buněk. Cancer Cell. 2022;40(4):393–409.

19. Lowery FJ, et al. Molekulární podpisy protinádorových neoantigen-reaktivních T buněk z metastatických lidských rakovin. Věda. 2022;375(6583):877–884.

20. Kreiter S, a kol. Zvýšená účinnost prezentace antigenu spojením antigenů s transportními signály MHC I. třídy. J Immunol. 2008;180(1):309–318.

21. Zaretsky JM, et al. Mutace spojené se získanou rezistencí k blokádě PD-1 u melanomu. N Engl J Med. 2016;375(9):819–829.

22. Gros A, et al. Rozpoznání neoantigenů lidské gastrointestinální rakoviny cirkulujícími PD-1+ lymfocyty. J Clin Invest. 2019;129(11):4992–5004.

23. Scholtalbers J, et al. TCLP: online katalog rakovinných buněčných linií integrující typ HLA, předpokládané neoepitopy, virovou a genovou expresi. Genome Med. 2015;7(1):118.

24. Juneja V, Choi J, vynálezci; BioNTech US Inc., nabyvatel. Konstrukce receptoru T buněk a jejich použití. Patent USA č. US202103040215A1. 4. listopadu 2021.

25. Sharpe AH, Pauken KE. Různé funkce inhibiční dráhy PD1. Nat Rev Immunol. 2018;18(3):153–167.

26. Abelin JG a kol. Definování pravidel zpracování a vazby HLA-II ligandu pomocí hmotnostní spektrometrie zlepšuje predikci epitopu rakoviny. Imunita. 2019;51(4):766–779.

27. Silvius JR, et al. K-ras4B a prenylované proteiny postrádající „druhé signály“ se dynamicky spojují s buněčnými membránami. Mol Biol Cell. 2006;17(1):192–202.

28. Chang CH, Flavell RA. Transaktivátor třídy II reguluje expresi více genů zapojených do prezentace antigenu. J Exp Med. 1995;181(2):765–767.

29. Rodig SJ, et al. MHC proteiny udělují rozdílnou citlivost k CTLA-4 a PD-1 blokádě u neléčeného metastatického melanomu. Sci Transl Med. 2018;10(450):eaar3342.

30. Ahmadzadeh M, et al. Tumor-infiltrující lidské CD4+ regulační T buňky vykazují odlišný repertoár TCR a vykazují nádorovou a neoantigenní reaktivitu. Sci Immunol. 2019; 4(31): eaao4310.

31. Oliveira G, a kol. Krajina pomocných a regulačních protinádorových CD4+ T buněk u melanomu. Příroda. 2022;605(7910):532–538.

32. Rock KL a kol. Prezentujte se! Molekuly MHC třídy I a MHC třídy II. Trends Immunol. 2016;37(11):724–737.

33. Takechi Y, a kol. Protein melanosomální membrány je buněčný povrchový cíl pro terapii melanomu. Clin Cancer Res. 1996;2(11):1837–1842.

34. Lepage S, Lapointe R. Melanosomální zaměřovací sekvence z gp100 jsou nezbytné pro prezentaci endogenního epitopu omezeného na MHC II. třídy a mobilizaci do endozomálních kompartmentů. Cancer Res. 2006;66(4):2423–2432.

35. Alspach E, a kol. Neoantigeny MHC-II formují nádorovou imunitu a odpověď na imunoterapii. Příroda. 2019;574(7780):696–701.

36. Dengjel J, et al. Autofagie podporuje prezentaci peptidů MHC třídy II z intracelulárních zdrojových proteinů. Proč Natl Acad Sci USA A. 2005;102(22):7922–7927.

37. Matsuzaki J, et al. Neklasické dráhy zpracování antigenu jsou vyžadovány pro přímé rozpoznání nádoru omezeného na MHC třídy II pomocí NY-ESO-1- specifických CD4+ T buněk. Cancer Immunol Res. 2009;2(4):341–350.

38. Höhn H, a kol. CD4+ tumor-infiltrující lymfocyty u rakoviny děložního čípku rozpoznávají HLA-DR-omezené peptidy poskytované lidským papilomavirem-E7. J Immunol. 1999;163(10):5715–5722.

39. Höhn H, a kol. Peptidy E7 lidského papilomaviru typu 33 prezentované HLA-DR*0402 T buňkám infiltrujícím nádor u rakoviny děložního čípku. J Virol. 2000;74(14):6632–6636.

40. Lu YC, a kol. Léčba pacientů s metastatickým zhoubným nádorem pomocí hlavního histokompatibilního komplexu omezeného receptoru T-buněk třídy II zaměřeného na zárodečný antigen MAGE-A3. J Clin Oncol. 2017;35(29):3322–3329.

41. Tran E, a kol. Imunoterapie rakoviny založená na mutačně specifických CD4+ T buňkách u pacienta s epiteliální rakovinou. Věda. 2014;344(6184):641–645.

42. Gonzalez-Galarza FF, et al. Aktualizace databáze alelových frekvencí (AFND) 2020: klasifikace dat podle zlatého standardu, data genotypu s otevřeným přístupem a nové nástroje pro dotazy. Nucleic Acids Res. 2020;48(d1): D783–D788.

43. Schoenberger SP, et al. Pomoc T-buněk pro cytotoxické T lymfocyty je zprostředkována interakcemi CD40-CD40L. Příroda. 1998;393(6684):480–483.

44. Ahrends T, a kol. CD4+ T lymfocyty pomáhají zajistit cytotoxický efektorový program T lymfocytů včetně koinhibičního snížení receptorů a zvýšené invazivity tkání. Imunita. 2017;47(5):848–861.

45. Ferris ST, a kol. cDC1 prime a jsou licencovány CD4+ T buňkami k navození protinádorové imunity. Příroda. 2020;584(7822):624–629.

46. ​​Bos R, Sherman LA. Pomoc CD4+ T-buněk v prostředí nádoru je nezbytná pro nábor a cytolytickou funkci CD8+ T lymfocytů. Cancer Res. 2010;70(21):8368–8377.

47. Haabeth OAW a kol. CD4+ T buňkami zprostředkované odmítnutí MHC třídy II pozitivních nádorových buněk závisí na sekreci antigenu a nepřímé prezentaci na hostitelských APC. Cancer Res. 2018;78(16):4573–4585.

48. Dudley ME, et al. Vytváření kultur lymfocytů infiltrujících nádor pro použití v adoptivní transferové terapii u pacientů s melanomem. J Immunother. 2003;26(4):332–342.

49. Dash P, a kol. Jednobuněčná analýza repertoáru T-buněčných receptorů. Metody Mol Biol. 2015;1343:181–197.

50. Li H, a kol. Sekvenční zarovnání/formát mapy a nástroje SAM. Bioinformatika. 2009;25(16):2078–2079.

51. Chiang C, a kol. SpeedSeq: ultra rychlá analýza a interpretace osobního genomu. Metody Nat. 2015;12(10):966–968.

52. Cingolani P, a kol. Program pro anotaci a predikci účinků jednonukleotidových polymorfismů, SnpEff: SNP v genomu Drosophila melanogaster kmene w1118; iso-2; iso-3. Fly (Austin). 2012;6(2):80–92.

53. Haga-Friedman A, et al. Začlenění transmembránových hydrofobních mutací do TCR zvyšuje jeho povrchovou expresi a funkční aviditu T buněk. J Immunol. 2012;188(11):5538–5546.

54. Cohen CJ, et al. Zvýšená protinádorová aktivita T buněk upravených tak, aby exprimovaly receptory T buněk s druhou disulfidovou vazbou. Cancer Res. 2007;67(8):3898–3903.