Vakcína MRNA vyvolává protinádorové imunitní reakce závislé na STING

Abstraktní

Vakcíny RNA formulované v lipidech byly široce používány pro prevenci a léčbu onemocnění, avšak jejich mechanismus účinku a jednotlivé složky přispívající k těmto účinkům zbývá vymezit. Zde ukazujeme, že terapeutická vakcína proti rakovině složená z jádra protamin/mRNA a lipidového obalu je vysoce účinná při podpoře cytotoxických reakcí CD8+ T buněk a zprostředkování protinádorové imunity. Mechanicky jsou jak jádro mRNA, tak lipidový obal potřebné k plné stimulaci exprese interferonů typu I a zánětlivých cytokinů v dendritických buňkách. Stimulace exprese interferonu-b je výlučně závislá na STING a protinádorová aktivita z mRNA vakcíny je u myší s defektním genem Sting významně ohrožena. Vakcína mRNA tedy vyvolává protinádorovou imunitu závislou na STING.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

1. Úvod

Rychlý vývoj a celosvětová aplikace mRNA vakcín pro prevenci infekce SARS-CoV-2 prokázaly sílu léků na bázi mRNA ve zdravotnictví1,2. Vzhledem k jejich velké molekulové hmotnosti a negativnímu náboji musí být molekuly mRNA zabaleny do transportních vehikul, aby mohly účinně vstoupit do savčích buněk. Balení do transportních vehikul o velikosti nanometrů má také výhodu v ochraně molekul mRNA před enzymatickou degradací. Bylo vyvinuto více platforem pro dodávání, aby vyhovovaly účelu, jako jsou lipidové nanočástice4, lipopolyplex (LPP)5, lipozom-protamin-RNA (LPR)6, RNA lipoplex (RNA-LPX)7 a částice vakcíny podobné viru (VLVP )8. Zatímco každá platforma má svou vlastní jedinečnou strukturu a složení, většina vehikul obsahuje molekulu iontového lipidu, která usnadňuje balení mRNA a únik molekul mRNA z endozomů. S úspěchem profylaktických vakcín existuje obecné poznání, že mRNA terapeutika lze použít k léčbě snad většiny, ne-li všech, typů onemocnění9e12. Terapeutické vakcíny proti rakovině založené na mRNA byly skutečně studovány po mnoho let13,14. Nedávné pokroky v klinických studiích také prokázaly jejich aplikační potenciál u vybraných pacientů s rakovinou15e17. Na rozdíl od peptidových vakcín proti rakovině, které jsou připraveny s adjuvantními molekulami18e20, mohou částice mRNA vakcíny sloužit také jako autoadjuvans21.

Například dvousložková vakcína proti rakovině založená na mRNA obsahující volnou mRNA a mRNA v komplexu protaminu může také aktivovat signalizaci Toll-like receptor 7 (TLR7)22. S rostoucím znepokojením nad akutní vrozenou imunitní toxicitou z nahé mRNA však většina výzkumníků a společností používá modifikovanou RNA, aby se vyhnuli vrozenému rozpoznání TLR23. V důsledku toho hrají lipidové složky důležitou roli při zvyšování adjuvantní aktivity v částici vakcíny mRNA, přednostně aktivací non-TLR signalizace. Nedávná studie o lipidově formulované, negativně nabité RNA-LPX tvořené 1,2- di-oktadecenyl-3-trimethylamonium (DOTMA, kationtový lipid)/dioleoylfosfatidylethanolamin (DOPE, pomocný lipid) lipozomem odhalila aktivace osy interleukin 1 (IL1)-antagonista receptoru interleukinu 1 (IL-1ra) při regulaci sekrece prozánětlivých cytokinů a zásadní úloha aktivace dvoustupňové inflamasomové dráhy v monocytech24. Je zajímavé, že další nedávný výzkum BNT162b2 na bázi LNP připravený s ALC-0315 (ionizovaný lipid), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DSPC, pomocný lipid) , polyethylenglykol-2000-N, N-ditetradecylacetamid (PEG2000-DTA) a cholesterol ukázaly klíčovou roli aktivace signalizace MDA5 závislé na interferonu typu I, ale ne TLR nebo zánětlivého onemocnění, při stimulaci obou vrozená a adaptivní imunita vakcíny COVID-1925. Tyto studie poukazují na možnost, že aplikační platformy složené z variabilních lipidových molekul se mohou pro aktivitu vakcíny spoléhat na různé signální transdukční dráhy. Je tedy důležité plně prozkoumat funkci klíčových molekul a jejich kombinací, aby se dále zlepšila terapeutika mRNA.

V současné studii jsme připravili experimenty, abychom rozebrali funkční roli jednotlivých složek v terapeutické vakcíně proti rakovině. Částice vakcíny mRNA (MVP) se skládá z jádra protamin/mRNA, které je zapouzdřeno v lipidovém obalu sestávajícím z kationtového lipidu, pomocného lipidu, pegylovaného lipidu a cholesterolu (obr. 1A). Bylo prokázáno, že zahrnutí nabitého lipidu může usnadnit cílené dodání RNA26, a dioleoylethylfosfatidylcholin (EDOPC) a dioleoyl-3-trimethylamoniumpropan (DOTAP) jsou dva z kationtových lipidů, které byly pro tento účel testovány5,27. Zkoumali jsme stimulaci exprese interferonu-b (IFN-b), IL-1b a tumor nekrotizujícího faktoru-a (TNF-a) jádrem mRNA, vehikulem bez mRNA a celým MVP a korelovaly takové aktivity s TLR7, mitochondriální antivirovou signalizací (MAVS, také známou jako IPS-1), stimulátorem genů IFN (STING) a signalizací IFN-b (TRIF) indukující adaptér obsahující doménu TIR. Následně jsme zkoumali roli protaminu v jádře a kationtového lipidu ve skořápce při stimulaci exprese IFN-b a TNF-a. Nakonec jsme porovnávali protinádorové imunitní reakce z MVP u myší divokého typu a myší s vyřazeným genem.

Výhody cistanche tubulosa-Antitumor

2. Materiály a metody

2.1. Materiály

1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-ethylfosfocholin (EDOPC) (890704), 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-fosfatidyl-ethanolamin (DOPE) (850725) ), 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-fosfoethanolamin-N-[amino(polyethylenglykol)-2000 (DSPE-PEG2k) (880128), 1,2- dioleoyl-3-trimethylamonium-propan (DOTAP) (890890), 1,{30}} dioleoyl-sn-glycero-3-fosfocholin (DOPC) (850375) byly zakoupeny od Avanti Polar Lipids, Inc. ( Birmingham, AL, USA). Cholesterol (C8667) byl získán od Sigma-Aldrich (Saint Louis, MO, USA). Činidla byla rozpuštěna v ethanolu v koncentraci 2 mg/ml pro DSPE-PEG2k, 10 mg/ml pro cholesterol a DOPC a 20 mg/ml pro EDOPC, DOPE a DOTAP, v daném pořadí. Protamin sulfát (P4020) byl získán od Sigma Aldrich. Molekuly mRNA kódující ovalbumin (OVA-mRNA) (L-7210), eGFP (eGFP mRNA) (L-7201) a luciferázu (Luc-mRNA) (L-7204) byly zakoupeny od TriLink Biotechnologies (San Diego, CA, USA). Voda bez RNázy (W0805-010) byla získána od GeneDEPOT (Baker, TX, USA). Agonista TLR7 imiquimod (tlrimq) a agonista Sting 20 30 - cGAMP (tlrl-nacga23) byly produkty od Invivogen (San Diego, CA, USA). Lipofectamine 2000 (11668019) a testovací souprava Quant-iT™ RiboGreen™ RNA (R11490) byly zakoupeny od Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Rekombinantní myší GM-CSF (554586) byl zakoupen od BD Biosciences (San Diego, CA, USA). 500 Koktejl inhibitoru proteinového transportéru (00-4980-93) byl produktem společnosti Invitrogen. Cytofix/Cytoperm kit (AB_2869010) byl zakoupen od BD Biosciences. EasySep™ Mouse T Cell Isolation Kit (19851) byl získán od STEMCELL Technologies, Inc. (Vancouver, BC, CAN). Následující protilátky byly získány od BioLegend (San Diego, CA, USA): anti-CD80-PE-Cy7 (104734), anti-CD86-FITC (105006), anti-CD11b-APC- Cy7 (101226), anti-CD8-BV510 (100752), anti-CD44-APC (103012), anti-CD69-APC (104514) a anti-H{{89 }}Kb (SIINFEKL)-PE (141604), anti-CD64- PE-Cy7 (139314), anti-B220-APC (103212), anti-MHCII-BV711 (107643) a anti-CD{105}}PE (121406). Anti-CD40-FITC (553723), anti-LY6C-AF700 (557979) a anti-IFN-g-PE (554412) byly od BD Biosciences. OVA257e264-MHCI dextramerPE (JD2163) byl zakoupen od ImmuDex (Fairfax, VA, USA). Soupravy ELISA pro IL-1b (EM2IL1B) a TNF-a (BMS607-3) byly zakoupeny od společnosti Invitrogen a soupravy ELISA pro CCL5 (DY478) a IFN-b (DY8234) byly získány od společnosti R&D Systems , Inc. (Minneapolis, MN, USA). Protilátky pro analýzu Western blot včetně anti-MAVS (4983), anti-STING (13647), anti-TBK1 (3504), antifosfo-TBK1 (5483), anti-b-aktin (4970) a anti-GAPDH (5174) byly zakoupeny od Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA, USA).

Obrázek 1 Příprava a charakterizace částic mRNA. (A) Schematický pohled na přípravu částic vakcíny. (B) Elektroforéza na agarózovém gelu ukazuje, že molekuly mRNA byly zadrženy v jamce pro plnění vzorku ve vzorcích připravených s mRNA/protamin v poměru 1:1 až 1:2. (CeF) Charakterizace částic vakcíny mRNA (MVP) na základě procenta zapouzdření, indexu polydisperzity, zeta potenciálu a velikosti. (G) Reprezentativní TEM snímky částic MVP2, měřítko Z 50 nm. (H) Procento exprese eGFP poté, co byly buňky DC2.4 ošetřeny eGFP-MVP po dobu 16 hodin. (I) Fluorescenční zobrazování buněk DC2.4 exprimujících eGFP, měřítko Z 40}0 mm. (J) Kvantitativní analýza bioluminiscence v BMDC ošetřených MVP zapouzdřenými mRNA kódující luciferázu po dobu 16 hodin. (K) Změny v životaschopnosti BMDC ošetřených PBS, vehikulem bez mRNA, jádrem mRNA/protamin nebo MVP2 zapouzdřeným v mRNA. Léčebné koncentrace byly mRNA-ekvivalentní. Data jsou uvedena jako průměr SEM (nZ 3). *P < 0,05; **P < 0,01.

2.2. Buněčné linie a buněčné kultury

Myší dendritická buněčná linie DC2.4 byla získána od ATCC (Manassas, VA, USA) a byla kultivována v RPMI-1640 obsahujícím 10% fetální bovinní sérum (FBS) a 1% penicilin-streptomycin. Buněčná linie myšího melanomu B16-OVA byla získána od Dr. Kennetha Rocka, Dana-Farber Cancer Institute (Boston, MA, USA). B16-OVA buňky byly kultivovány v DMEM doplněném 10% FBS a 1% penicilin-streptomycin. Buněčná linie myšího adenokarcinomu tlustého střeva MC38 byla zakoupena od ATCC. Buňky byly upraveny s expresí OVA a byly kultivovány v DMEM s 10% FBS a 1% penicilin-streptomycin. Buněčná kultura byla udržována při 37 °C s 5 % C02.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

2.3. příprava částic vakcíny mRNA

Všechny částice vakcíny mRNA byly připraveny pomocí mikrofluidního přístroje NanoAssemblr Benchtop od Precision Nanosystems, Inc., (Vancouver, BC, CAN) smícháním organické fáze a vodné fáze. K přípravě organické fáze byly EDOPC (20 mg/ml), DOPE (20 mg/ml), cholesterol (10 mg/ml) a bis-DSPE-PEG2k (2 mg/ml) rozpuštěny v ethanolu a smíchány při 34 °C. :30:35:1 M poměr s průtokem 9 ml/min. K přípravě jádra mRNA vodné fáze byla mRNA smíchána s protaminsulfátem v poměru 1:1 (hmotn./hmotn.) v mikrofluidním přístroji při průtokové rychlosti 9 ml/min. Po 20 minutách inkubace při 20 °C byla vodná fáze jádra mRNA smíchána s organickou fází za vzniku částic vakcíny mRNA. Po 20 minutách byla suspenze částic vakcíny přenesena do ultraodstředivého filtru Amicon (MWCO 30 kDa) a byla přidána 9-objemová voda molekulární kvality, aby se koncentrace ethanolu zředila z 25 % na 2,5 %. Suspenze částic byla poté zahuštěna odstředěním při 2000 g (Multifuge X4, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) při 4 °C. K koncentrovanému produktu byl přidán stejný objem 2 PBS, aby se upravil osmotický tlak.

2.4. Test gelové retardace

mRNA/protaminové jádro bylo nejprve analyzováno gelovou retardací. Stručně, mRNA/protaminové jádro obsahující 0,5 mg mRNA bylo naneseno do jamky 1% agarózového gelu v 1 roztoku TBE a byla provedena elektroforéza při 120 V po dobu 30 minut (PowerPac™, BioRad Co., Ltd., Hercules, CA). Pásy RNA byly obarveny Gelredem (Biotium, Hayward, CA) a detekovány systémem GelDoc (Gel Doc XRþ, BioRad Co., Ltd.).

2.5. Charakterizace částic vakcíny mRNA

Distribuce velikosti a potenciál zeta byly měřeny pomocí Zetasizer s dynamickým rozptylem světla (Zetasizer Nano, Malvern Pananalytical, Inc., Westborough, MA, USA). Rychlost zapouzdření byla stanovena pomocí testovací soupravy Quant-iT™ RiboGreen™ RNA. Stručně, vzorek vakcínové částice obsahující 0,5 mg mRNA byl zředěn pufrem TriseEDTA (10 mmol/l TriseHCl, 1 mmol/l EDTA, pH 7,5) s nebo bez 2% Triton-X100 v { {10}}jamková destička. Po 10 minutách inkubace při 37 °C byl do každé jamky přidán RiboGreen a byla měřena intenzita fluorescence. Účinnost zapouzdření byla vypočtena, jak je ukázáno v rov. (1): Transmisní elektronová mikroskopie (TEM) částic vakcíny byla provedena podle dříve popsaného postupu9.

2.6. Zvířata

Všechny operace se zvířaty byly schváleny Výborem pro péči a použití zvířat Houston Methodist Hospital (číslo protokolu AUP06200042). Myši byly umístěny v prostředí, které zcela splňovalo regulační standardy National Institute of Health a American Association of Laboratory Animal Care standardy. C57BL/6J myši divokého typu a geneticky upravené myši včetně myší Tlr7/, Sting/, Mavs/ a Trif/ byly zakoupeny od Jackson Laboratory.

2.7. Generování myších dendritických buněk derivovaných z kostní dřeně (BMDC)

Buňky kostní dřeně byly vypláchnuty z femuru a tibie kompletním RPMI 1640. Červené krvinky byly lyžovány ACK lyzačním pufrem a nezralé buňky kostní dřeně byly kultivovány v RPMI 1640 doplněném 20 ng/ml rekombinantního myšího GM-CSF po dobu 10 dnů při 37 C s 5% CO2. Buněčné kultivační médium bylo obnoveno ve dnech 3, 6 a 8 a neadherentní dendritické buňky byly odebrány v den 10.

2.8. Měření cytokinů a chemokinů

BMDC byly nasazeny na 24-jamkovou destičku v hustotě 5  105 buněk/jamku. Po 1 hodině usazení byly buňky ošetřeny 1 mg/ml imichimodu, 20 mg/ml 20 30 -cGAMP, (1 mg/ml ekvivalent mRNA) vakcínovými částicemi nebo kontrolami. Buněčná kultivační média byla shromážděna o 24 hodin později a hladiny TNF-a, CCL5, IFN-b a IL-1b byly měřeny pomocí souprav ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) podle postupů doporučených výrobcem.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

2.9. Analýzy DC transfekce, DC zrání a stimulace

Pro analýzu účinnosti transfekce DC in vitro byly buňky DC2.4 nasazeny v množství 2 5 105 buněk/jamku na 24-jamkovou destičku. Buňky byly ošetřeny částicemi zapouzdřenými mRNA kódujícími eGFP nebo luciferázu v konečné koncentraci 1 mg mRNA/ml. Buňky byly sklizeny o 24 hodin později, promyty 2% FBS v roztoku PBS a poté resuspendovány ve stejném roztoku předtím, než byly aplikovány na analýzu průtokovou cytometrií pomocí průtokového cytometru BD LSR II (LSR II, BD Biosciences, San Jose, CA) . Pro měření zrání DC a prezentace antigenu in vitro byly BMDC nasazeny v množství 2 5  105 buněk/jamku na 24-jamkovou destičku a ošetřeny 1 mg/ml OVA-MVP po dobu 24 hodin. BMDC byly barveny po dobu 30 minut protilátkami specifickými pro CD11c, MHC I, MHC II, CD40, CD80 a CD86 pro zrání DC a anti-H-2Kb (SIINFEKL) pro prezentaci antigenu. Pro stanovení stimulační účinnosti in vivo byly myši C57BL/6J očkovány jednou 10 mg OVA-MVP na myš do tlapky a odvodňující popliteální LN byly sklizeny 24, 48 a následující markery buněčného povrchu: CD11c, MHC I, CD11b, B220 , LY6C, CD64, CD8, CD103, CD86.

2.10. Průtoková cytometrická analýza aktivace a proliferace T buněk

Pro měření aktivace T buněk in vivo byly myši očkovány jednou 10 mg OVA-MVP a popliteální LN byly izolovány po 24 nebo 48 hodinách. T buňky byly obarveny následujícími protilátkami: CD45, CD3, CD4, CD8 a CD69. Pro detekci antigen-specifických T buněk byly 5 dnů po druhé vakcinaci odebrány nádory, slezina a popliteální lymfatické uzliny. Tkáně byly zpracovány za účelem vytvoření jednobuněčných suspenzí a buňky byly obarveny protilátkami specifickými pro T buňky a dextramerem OVA257e264-MHCI podle pokynů výrobce. Pro měření intracelulární hladiny IFN-g byly 2  106 splenocyty nebo buňky izolované z popliteálních LN a nádorů stimulovány 10 mg/ml peptidu OVA257e264 v kompletním médiu RPMI 1640 doplněném 55 mmol/l b-merkaptoethanolu a 1 inhibitorem proteinového transportéru koktejl na 18 hodin. Buňky byly sklizeny a obarveny protilátkami specifickými pro T buňky. Po fixaci a permeabilizaci soupravou Cytofix/Cytoperm byly buňky obarveny protilátkou anti-IFN-g a aplikovány pro analýzu na průtokovém cytometru BD LSR II (BD Biosciences). Pro měření proliferace T lymfocytů byly T lymfocyty izolovány ze slezin OT-I transgenních myší pomocí soupravy pro izolaci myších T lymfocytů. Byly obarveny 1 mmol/l CFSE v RPMI 1640 obsahujícím 200 mg/ml BSA po dobu 10 minut při 37 °C. CFSE značené T buňky byly dvakrát promyty 5 objemy studeného kompletního RPMI 1640. Mezitím byly zralé BMDC ošetřeny 2 mg/ml MVP zapouzdřeného OVA mRNA po dobu 24 hodin před izolací T buněk. Jakmile byly T buňky připraveny, BMDC a T buňky byly společně kultivovány v poměru 1:5 (DC:T) po dobu 72 hodin. Buňky byly shromážděny a obarveny povrchovými protilátkami pro T buňky, proliferace byla testována pomocí průtokového cytometru BD LSR II (BD Biosciences) a analyzována. Všechny výsledky průtokové cytometrie byly analyzovány pomocí softwaru FlowJo v10 (Ashland, OH, USA).

2.11. Sledování exprese proteinů u živých myší

Myši BALB/c byly ošetřeny injekcí do tlapky 10 mg MVP zapouzdřeného Luc mRNA. O 6, 12, 24 nebo 48 hodin později jim bylo intraperitoneálně injikováno 30 mg RediJect D-luciferinu na myš a bioluminiscence byla měřena zobrazovacím systémem Xenogen IVIS-200 (Caliper Life Sciences, Inc., Hopkinton, MA, USA).

2.12. Test ELISpot

IP filtrační destičky byly předem propláchnuty 50 ml 35% ethanolu a důkladně promyty 3krát PBS, než se ethanol odpařil. Destičky byly následně potaženy anti-IFN-g capture protilátkami při 4 °C přes noc. Destičky byly blokovány kompletním médiem RPMI 1640 obsahujícím 55 mmol/l b-merkaptoethanolu po dobu 2 hodin při 37 °C. Do každé jamky byly nasazeny buňky (1  105 splenocyty, 1  105 buňky z popliteální LN) a stimulována po dobu 36 hodin 10 mg/ml peptidu OVA257e264. Média byla odstraněna a buňky byly 4krát promyty PBST (PBS obsahující 0,05 % Tween 20) a dvakrát PBS. Po posledním promytí byla přidána anti-IFN-g detekční protilátka a inkubována po dobu 2 hodin při teplotě místnosti ve tmě. Destičky byly promyty 4krát PBST a dvakrát PBS a byl přidán avidin-HRP a inkubovány dalších 45 minut při teplotě místnosti ve tmě. Nakonec byly destičky znovu promyty PBST a PBS, jak je popsáno výše, a bylo aplikováno 50 ml AEC substrátu a sledováno, zda nedochází k bodové reakci. Když se skvrny staly viditelnými, reakce byla zastavena vyhozením substrátu AEC a jeho propláchnutím dvakrát destilovanou vodou 5krát. Po sušení na vzduchu přes noc byly destičky skenovány a analyzovány pomocí CTL ImmunoSpot SeriesS5 Versa ELISpot Analyzer (S5Versa-02- 9038, CTL Inc., Cleveland, OH, USA).

2.13. Western blot analýza

BMDC odvozené od divokého typu, Mavs KO nebo Sting KO myší byly shromážděny a buňky byly lyžovány v RIPA buněčném lyzačním pufru doplněném o inhibitory proteázy a fosfatázy. Koncentrace proteinu v buněčném lyzátu byla měřena pomocí soupravy pro stanovení proteinu BCA. Vzorky proteinů byly separovány elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) a přeneseny na polyvinylidendifluoridovou (PVDF) membránu. Exprese MAVS a STING byla detekována poté, co byla membrána inkubována s protilátkou anti-MAVS nebo anti-STING v ředění 1:2000, po které následovala imunodetekce pomocí SuperSignal West Pico a chemiluminiscenčního substrátu Femto. Pro měření aktivace dráhy STING byly BMDC odvozené od myší divokého typu ošetřeny vehikulem nebo MVP zapouzdřeným OVA mRNA v uvedené koncentraci po dobu 2 hodin. Buňky byly lyžovány a podrobeny analýze Western blot s protilátkami anti-TBK1 a antifosfo-TBK1 v ředění 1:2000.

2.14. Protinádorový test

Modely myších nádorů byly vytvořeny subkutánní inokulací 2  105 buněk B16-OVA melanomových buněk nebo 5  105 MC38- buněk na myš subkutánně do levého boku 6 až {{5} }týdenní samice myší C57BL/6J. Myši byly náhodně rozděleny do léčebných skupin a ošetřeny dvakrát s odstupem 7 dnů 10 mg OVA MVP nebo kontrolám do tlapky. Růst nádoru byl monitorován každé 2 dny. Objem nádoru byl vypočten podle Eq. (2):

Myši byly usmrceny 5 dní po druhé vakcinaci a byla zaznamenána hmotnost nádorových tkání.

2.15. Statistická analýza

Všechny výsledky jsou uvedeny jako průměr SEM. Statistiky byly hodnoceny jednocestným testem ANOVA s použitím Tukeyho korekce pro srovnání více skupin a nepárovým dvoustranným t-testem pro srovnání dvou skupin. Data byla analyzována pomocí softwaru GraphPad Prism v8.0.2. P < 0.{{10}}5 bylo považováno za statisticky významné (*P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001).

3. Výsledky

3.1. MVP zprostředkovává robustní expresi mRNA v dendritických buňkách (DC)

Připravili jsme částice vakcíny s jádrem a obalem dvoustupňovým mikrofluidním přístupem (obr. 1A) a systematicky vyhodnocovali jednotlivé složky v nanočásticích, abychom sestavili částici vakcíny s vysokou stabilitou, vysokým buněčným vychytáváním a vysokým expresním potenciálem v DC. Gelová elektroforéza odhalila, že stabilní jádro mRNA by se mohlo vytvořit, jakmile byl poměr mRNA k protaminu 1 nebo nižší (obr. 1B). S použitím mRNA kódující eGFP jako náhradního markeru jsme zjistili, že lipidové složení v molárním poměru 34 % EDOPC/30 % DOPE/35 % cholesterolu/1 % DSPEPEG2k poskytuje ideální míru zapouzdření a nejlepší účinnost exprese (tabulka 1, Podpůrné informace Obr. S1AeS1D). Změna poměru náboje významně nezměnila rychlost zapouzdření, index polydisperzity nebo povrchový náboj částic (tabulka 2, obr. 1CeE); velikost výsledných částic však byla mezi 70 a 80 nm v průměru, když byl poměr mezi 12 a 16, ve srovnání s průměrem 120 až 130 nm, jakmile poměr vypadl z rozsahu (obr. 1F a G). Nejlepší exprese byla detekována v buňkách DC2.4 ošetřených MVP2, které měly nábojový poměr 12 (obr. 1H a I). Podobný vzor byl pozorován, když byly částice připraveny s mRNA kódující luciferázu, a byla detekována exprese závislá na dávce (obr. 1J). mRNA-zapouzdřené částice prokázaly žádoucí stabilitu, protože neztratily aktivitu po lyofilizaci nebo zmrazení-rozmrazení (obr. S1E a S1F). Kromě toho nedošlo k žádné cytotoxicitě poté, co byly dendritické buňky derivované z kostní dřeně (BMDC) ošetřeny samotným jádrem mRNA, částicí vehikula připravenou bez molekul mRNA nebo MVP2 obsahujícím mRNA (obr. 1K). MVP2 tedy vykazoval nejlepší expresní potenciál. Byl použit pro všechny další experimenty ve studii a ve zbytku textu označen jako MVP. Částice MVP mohly účinně dodat molekuly mRNA in vivo a na základě změn tělesné hmotnosti nebyla zjištěna žádná detekovatelná toxicita z mRNA zapouzdřeného MVP (obr. S1GeS1I).

3.2. MVP účinně indukuje prezentaci antigenu a aktivaci T buněk in vitro a in vivo

Připravili jsme jádro mRNA, vehikulum bez mRNA a OVA mRNA zapouzdřený MVP a aplikovali jsme je k testování zrání DC a prezentace antigenu (obr. 2A). BMDC ošetřené MVP vykazovaly na dávce závislou nadměrnou expresi markerů zrání DC včetně CD40, CD80 a CD86 (obr. 2BeD). Ošetření buď vehikulem bez mRNA nebo MVP zapouzdřeným do mRNA spustilo nadměrnou expresi MHC I (obr. 2E), což ukazuje, že účinek byl spojen spíše s vehikulem než s komplexem mRNA. Ošetření MVP navíc vedlo k zobrazení na povrchu buněk komplexu OVA257e264 antigen epitop-MHC I (SIINFEKL-MHC I), který byl detekován protilátkou anti-SIINFEKL-MHCI (obr. 2F), což prokázalo účinné zpracování a prezentaci antigenu pomocí BMDC . Kromě toho koinkubace BMDC ošetřených MVP s B3Z, linií CD8+ T buněk, která specificky rozpoznávala epitop OVA257e264, nebo T buňkami izolovanými ze sleziny OT-I myši, která exprimovala OVA257e264-specifickou T buňku IL-2 sekreci, což je výsledek, který nebyl pozorován u T buněk koinkubovaných s DC ošetřenými samotným vehikulem nebo samotným mRNA/protaminovým jádrem (obr. 2G). Analýza průtokovou cytometrií detekovala 32,5 % proliferativních CD8+ T buněk po společné inkubaci s MVP (obr. 2H a I). Částice MVP zapouzdřené OVA mRNA byly také aplikovány k léčbě myší intradermální injekcí. Vyšetření buněk v drenážních lymfatických uzlinách odhalilo stálý nárůst exprese CD86 mezi klasickými DC (CD8+ DC, CD11b+ DC, CD103+ DC) a plazmacytoidními DC (pDC) během prvních 48 hodin, což ukazuje na stimulaci DC zrání (obr. 2J). Léčba také podpořila obohacení CD8+ T buněk v lymfatických uzlinách s významným zvýšením populace CD69+CD8+ T buněk (obr. 2K a L), což ukazuje na aktivaci T buněk léčbou. Pro stanovení aktivace T buněk jsme shromáždili buňky v drenážních lymfatických uzlinách 3, 5 nebo 7 dnů po léčbě MVP a provedli jsme analýzy ELISpot poté, co byly buňky vystaveny antigennímu peptidu OVA257e264 (podpůrná informace obr. S2). Léčba MVP spustila velký skok v buňkách sekretujících IFN-g během doby s maximální aktivitou v den 5 (obr. 2M). Tyto výsledky prokázaly silnou DC stimulaci, prezentaci antigenu a aktivaci T-buněk po léčbě MVP.

Tabulka 1 Složení nanočástic zapouzdřených s eGFP-kódující mRNA.

Tabulka 2Lipidové složení a nábojový poměr MVPčástice.

3.3. MVP vyvolává silnou protinádorovou imunitu u myších modelů kolorektálního nádoru a melanomu

MVP byl aplikován k léčbě myší s rakovinou tlustého střeva MC38 a melanomem B16. V obou modelech léčba OVA mRNA zapouzdřeným MVP dvakrát úplně blokovala růst nádoru subkutánně; ve srovnání s eGFP mRNA zapouzdřeným MVP nebo samotným vehikulem nemělo žádný detekovatelný inhibiční účinek na růst nádoru (obr. 3AeD, podpůrná informace obr. S3). V souladu se vzorem posunu CD4 k CD8 v lymfatických uzlinách (obr. 2) jsme pozorovali zvýšení poměru CD8+/CD4+ T buněk v nádorech z myší léčených MVP zapouzdřeným OVA mRNA (obr. 3E). Kromě toho jsme detekovali zvýšené hladiny v IFN-gþCD8þ T buňkách ve slezinách, lymfatických uzlinách a nádorech u myší léčených MVP zapouzdřeným OVA mRNA, ale nikoli samotným vehikulem nebo MVP zapouzdřeným v GFP mRNA (obr. 3FeH, podpůrné informace Obr. S4). Kromě toho došlo k významnému zvýšení OVA257e264-MHCI dextramer-pozitivních CD8+ T buněk v nádorech ze skupiny léčené MVP zapouzdřenou OVA mRNA, což ukazuje na proliferaci antigen-specifických CD8+ T buněk (obr. 3I). Test ELISpot s buňkami izolovanými ze sleziny a lymfatických uzlin poskytl další podporu aktivace T buněk (obr. 3JeM).

3.4. MVP stimuluje vrozené imunitní reakce aktivací signalizace závislé na STING

Použili jsme jádro mRNA, vehikulum bez mRNA a MVP zapouzdřený mRNA k léčbě BMDC, abychom identifikovali klíčové faktory a dráhy odpovědné za stimulaci IFN typu I a expresi zánětlivých cytokinů. Je zajímavé, že MVP byl při spouštění sekrece IFN-b stejně účinný jako agonista Tlr7 imichimod a samotné vehikulum také vykazovalo aktivitu při podpoře sekrece IFN-b, ačkoli jeho účinnost nebyla tak vysoká jako MVP; avšak samotné jádro mRNA bylo neúčinné při stimulaci sekrece IFN-b (obr. 4A). Výsledek naznačoval, že jak mRNA, tak složky ve vehikulu byly potřebné k maximalizaci exprese IFN-b. Mezitím imichimod a vehikulum vykazovaly podobnou aktivitu při podpoře exprese TNF-a a IL-1b, zatímco MVP byl mnohem účinnější než kterýkoli z nich (obr. 4B a C). Exprese CCL5, cytokinu běžně spojeného s regulačními faktory NF-kB a IFN, byla stejně stimulována v buňkách ošetřených imichimodem, pouze vehikulem nebo MVP (obr. 4D). TLR7, MAVS, STING a TRIF jsou klíčové faktory v hlavních signálních transdukčních drahách, které zprostředkovávají buněčné odpovědi na virovou RNA a poškozenou DNA28e30. Vytvořili jsme BMDC z myší s vyřazením genu Tlr7, Mavs, Sting nebo Trif (KO) a buňky jsme ošetřili jádrem mRNA, vehikulem bez mRNA nebo MVP zapouzdřeným v mRNA, abychom prozkoumali expresi IFN-b a TNF-a.

Obrázek 2 Stimulace imunitních odpovědí pomocí MVP. (A) Schematický pohled na jádro mRNA/protamin, vehikulum bez mRNA a kompletní MVP. (BeD) Zrání BMDC po ošetření OVA-MVP po dobu 24 hodin. (E a F) MHC I exprese a komplex OVA257e264 antigen epitop-MHC I v BMDC po ošetření OVA-MVP po dobu 24 hodin. (G) Hladina IL-2 z ošetřených BMDC koinkubovaných s B3Z nebo OT-I T buňkami. (H a I) Analýza průtokovou cytometrií proliferativních T buněk. Jsou ukázány reprezentativní chromatogramy T buněk. (J) Zrání DC po ošetření MVP in vivo. Myši C57BL/6J byly ošetřeny OVA-MVP a byly analyzovány DC v popliteálních lymfatických uzlinách. (K a L) Analýza populace T buněk. Myši C57BL/6J byly ošetřeny vehikulem nebo OVA-MVP a T buňky v popliteálních lymfatických uzlinách byly analyzovány průtokovou cytometrií. (M) ELISpot test. Myši C57BL/6J byly ošetřeny OVA-MVP a lymfatické uzliny byly odebrány v uvedených časových bodech. Izolované buňky byly použity pro měření buněk exprimujících IFN-g. Data jsou uvedena jako průměr SEM (nZ 3). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, není významné.

Obrázek 3 Protinádorová aktivita MVP. (A) Inhibice růstu nádoru MC38-OVA. Samice myší C57BL/6J byly subkutánně naočkovány 5  105 MC38-nádorovými buňkami OVA/myš v den 0 a ošetřeny kontrolou PBS, kontrolou vehikulem, GFP-MVP nebo OVA-MVP dne Dny 3 a 10. (B) Inhibice růstu nádoru B16-OVA. Samice myší C57BL/6J byly subkutánně naočkovány 2  105 B16- OVA nádorovými buňkami/myš v den 0 a ošetřeny kontrolou PBS, kontrolou s vehikulem, GFP-MVP nebo OVA-MVP ve dnech 3 a 10. (C a D) Obrázek a hmotnost nádorů B16-OVA v den 17. (E) Populace T buněk v nádorech myší po léčbě. (FeH) IFN-gþCD8þ T buňky ve slezinách, lymfatických uzlinách (LN) a nádorech myší po léčbě. (I) OVA-specifické CD8+ T buňky v nádorech myší po léčbě. (JeM) Obrázky a kvantitativní analýza testu ELISpot slezinných a LN buněk z myší po léčbě. Data jsou uvedena jako průměr SEM (nZ 5). *P < 0.05; **P < 0,01; ***P < 0,005; ****P < 0,001.

Stav KO Mavs a Sting v BMDC byl potvrzen analýzou Western blot (podpůrná informace obr. S5A). Překvapivě Sting KO vymazal stimulační aktivitu na sekreci IFN-b ze samotného vehikula i MVP (obr. 4E), což ukazuje, že MVP aktivoval expresi IFN typu I prostřednictvím STING. Na podporu této představy jsme detekovali fosforylaci tank-vazebné kinázy 1 (TBK1) (obr. S5B), kinázy, která je běžně spojována s aktivitou STING31. Kromě toho byla tato dráha nezávislá na signalizaci TLR7, protože exprese IFN-b nebyla ohrožena v buňkách ošetřených imichimodem (obr. 4E). Pro srovnání, Trif nebo Mavs KO měly minimální dopad na expresi IFN-b podporovanou MVP. Jak se očekávalo, imichimod byl neúčinný při stimulaci sekrece IFN-b v BMDC odvozených z Tlr7 KO; avšak Tlr7 KO měl negativní dopad na stimulační účinek z MVP (obr. 4E). Je zajímavé, že byl pozorován odlišný profil sekrece TNF-a ze stejné léčby. Knockout Sting, Trif nebo Tlr7 neměl žádný nebo minimální dopad na expresi cytokinů stimulovanou MVP. Knockout Mavs na druhé straně dramaticky snížil hladiny TNF-a v buňkách ošetřených buď samotným vehikulem nebo MVP (obr. 4F). Výsledek ukazuje, že MAVS je klíčovým regulátorem exprese TNF-a v DC po léčbě MVP.

3.5. MVP stimuluje dráhy STING a MAVS k podpoře sekrece IFN-I a zánětlivých cytokinů

Abychom identifikovali komponenty ve vozidle zodpovědné za stimulaci STING a MAVS signalizace, připravili jsme vozidla a MVP nahrazením nebo vynecháním klíčových komponent a použili jsme je k léčbě BMDC. Stingův agonista cyklický GMP-AMP (cGAMP) sloužil jako pozitivní kontrola při stimulaci sekrece IFN-b. Nahrazení kationtového lipidu EDOPC ve vehikulu jiným kladně nabitým lipidem, DOTAP, zcela vyhladilo sekreci IFN-b. Pro srovnání, stimulační účinek z vehikula a MVP byl zachován s nebo bez protaminu a taková stimulační aktivita byla závislá na intaktním genu Sting (obr. 4G). Je zajímavé, že BMDC ošetřené jednotlivými složkami lipidového obalu včetně EDOPC nepodporovaly silnou sekreci IFN-b (Podpůrná informace Obr. S6). EDOPC byl tedy nezbytný pro aktivaci STING a jeho aktivita je závislá na tvorbě lipidové nanočástice (tj. vehikula nebo MVP). Vehikulum a MVP připravené s EDOPC nebo DOTAP byly také aplikovány k léčbě BMDCS odvozených od myší divokého typu a Mavs KO myší a byly stanoveny hladiny TNF v buněčném růstovém médiu. Jak se očekávalo, nahrazení EDOPC za DOTAP nebo DOPC eliminovalo stimulační úsilí z vehikula a MVP. Kromě toho byla hladina TNF-a významně snížena v buňkách Mavs KO ve srovnání s buňkami divokého typu, ale nesnížila se (obr. 4H), což naznačuje, že do zprostředkování exprese TNF-a stimulované MVP se mohou podílet další faktory.

3.6. Dráha STING je nezbytná pro protinádorové imunitní reakce zprostředkované MVP

Myši divokého typu i knockout myši byly ošetřeny MVP zapouzdřeným OVA mRNA a byla zkoumána maturace DC a proliferace T buněk. Sting KO významně snížilo procento CD80þ a CD86þ DC buněk a CD69þ T buněk (obr. 5AeD). Test ELISpot odhalil významně snížené množství buněk produkujících IFN-g ve slezinách a lymfatických uzlinách myší Sting KO ve srovnání s myšmi divokého typu poté, co byly ošetřeny stejnou dávkou MVP (obr. 5EeH). Dopad Mavs KO byl minimální, protože nebyl sledován žádný rozdíl na CD44+CD8+ paměťových T buňkách, OVA257e264-MHCI dextramer-pozitivních CD8+ T buňkách nebo počtu buněk produkujících IFN-g v lymfatických uzlinách ve srovnání s divokými typu myší (obr. 5IeL). Výsledek posiluje názor, že na expresi zánětlivých cytokinů stimulovaných MVP mohou být kromě MAVS zapojeny další faktory. Jak myši divokého typu, tak myši Sting KO byly aplikovány k inokulaci B16-OVA nádorů a myši byly léčeny PBS kontrolou nebo MVP zapouzdřeným OVA mRNA. Analýza průtokovou cytometrií vzorků lymfatických uzlin a nádorů odebraných od očkovaných myší odhalila významně snížený počet CD8+ T buněk produkujících IFN-g u myší Sting KO (obr. 6A a B). V důsledku toho byl růst nádoru zcela inhibován u myší divokého typu léčených MVP ve srovnání s pouze částečnou inhibicí u myší Sting KO (obr. 6C).

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

4. Diskuze

V současné studii jsme systematicky zkoumali funkční role jednotlivých složek v MVP na stimulaci protinádorových imunitních odpovědí. Naše studie založená na buňkách jasně prokázala, že jak molekuly mRNA, tak vehikulum bez RNA v MVP jsou potřebné pro jeho plnou aktivitu při podpoře exprese IFN-b a řady zánětlivých cytokinů včetně IL-1b a TNF -a v dendritických buňkách. Ukázalo se, že takové cytokiny hrají zásadní roli v aktivaci dendritických buněk a vakcínou zprostředkované protinádorové imunitě20. Naše studie také odhalila, že stimulace produkce cytokinů je závislá na řadě klíčových signálních transdukčních drah zapojených do přirozeného imunitního snímání, včetně těch zprostředkovaných STING a MAVS. Zatímco STING je nezbytný pro expresi IFN-b, MAVS se podílí hlavně na regulaci exprese TNF-a (obr. 6D). Význam signalizace STING na protinádorovou imunitu zprostředkovanou MVP je dále demonstrován sníženou aktivitou T buněk a následně sníženou inhibicí růstu nádoru u myší Sting KO. Tento výsledek je v souladu s dalšími zprávami, že aktivace STING určuje protinádorovou imunitu zprostředkovanou cytotoxickými T buňkami32. MAVS je klíčovým zprostředkovatelem v signalizaci RIG-I-receptoru (RLR) v reakci na virovou infekci. Aktivace této dráhy vede ke kaskádě zánětlivých odpovědí33. Je zajímavé, že aktivita T buněk není u Mavs KO myší ohrožena, vzhledem k tomu, že MAVS signalizace jasně hraje velkou roli při regulaci exprese zánětlivých cytokinů včetně TNF-a. Možným důvodem je, že stimulace takových cytokinů pomocí MVP je zprostředkována více cestami a narušení dráhy MAVS nesnižuje expresi cytokinů na dostatečně nízkou úroveň, aby způsobila významný dopad. Alternativně je ztráta MAVS signalizace kompenzována jinými cestami. K identifikaci těchto cest jsou zapotřebí další studie, aby bylo možné dále porozumět mechanismu účinku vakcíny MVP. Ačkoli TLR7 byl tradičně spojován s mRNA terapeutiky21, nezdá se, že by signalizace TLR7 hrála hlavní roli při zprostředkování aktivity MVP. Použití plně methylovaných molekul mRNA v současné studii mohlo způsobit, že signalizace TLR7 bude méně relevantní. Bylo dobře prokázáno, že methylace RNA potlačuje rozpoznávání TLR23. TRIF je klíčový adaptorový protein pro signalizaci TLR3/7/828. Knockout of Trif neovlivňuje ani aktivitu MVP, což posiluje názor, že výše uvedené TLR včetně TLR7 nehrají hlavní roli při zprostředkování buněčných odpovědí na MVP. Při vývoji vakcín proti rakovině bylo použito více agonistů Sting, včetně cyklických dinukleotidů a malých a velkých molekulárních sloučenin34e37. Takové Sting agonisty je třeba přidávat jako externí adjuvans během přípravy vakcíny, což přidává další vrstvu složitosti do vakcínové kompozice. Kromě toho může externě přidaný Sting agonista způsobit nežádoucí nepříznivé účinky, jakmile se oddělí od komplexu mRNA. Pro srovnání, náš MVP slouží jako self-adjuvans a funguje v kontextu vakcíny proti rakovině, protože žádná z jednotlivých složek vakcíny včetně EDOPC nemůže podporovat expresi cytokinů. Je zajímavé, že kationtový fosfolipid EDOPC nemůže být nahrazen nefosfolipidovým DOTAP, který je také kladně nabitý. Je zajímavé spekulovat o potenciálním mechanismu rozdílu mezi těmito dvěma kationtovými lipidy. Bylo však zdokumentováno, že další vlastnosti složky lipidové molekuly, jako je hydrofobnost, mohou mít hluboký dopad na celkovou funkci nanočástice a její účinnost dodání pro nukleové kyseliny38. Proto je třeba věnovat pozornost výběru správných molekul pro přípravu plně funkční mRNA vakcíny. Stručně řečeno, vyvinuli jsme účinnou terapeutickou vakcínu proti rakovině na bázi mRNA a přiřadili jsme jednotlivým komponentám vakcíny jejich funkčnost. Jeho mechanismus účinku je zcela odlišný od jiných platforem mRNA používaných pro profylaktické a terapeutické intervence. Poznatky získané ze současné studie budou určitě vodítkem budoucího vývoje dalších mRNA terapeutik.

Obrázek 4 Podpora vrozených imunitních odpovědí pomocí MVP. (AeD) BMDC ošetřené 1 mg/ml imichimodu, 1 mg/ml mRNA-ekvivalentního jádra, vehikula nebo MVP po dobu 24 hodin. Hladiny IFN-b, TNF-a, IL-1b a CCL5 byly měřeny pomocí ELISA. (E a F) Exprese IFN-b a TNF-a BMDC odvozených od myší divokého typu a myší s knockoutem genu (KO). BMDC byly ošetřeny uvedenými činidly po dobu 24 hodin. IFN-b a TNF-a byly měřeny pomocí ELISA. (G) IFN-b v BMDC odvozených od divokého typu a Sting knockout myší. BMDC byly ošetřeny 20 mg/ml cGAMP, 1 mg/ml mRNA-ekvivalentního jádra, vehikula nebo MVP po dobu 24 hodin. Vozidlo (DOTAP): připraveno nahrazením EDOPC za DOTAP; vehikulum (bez protaminu): připraveno vynecháním protaminu. ND: nezjistitelné. (H) TNF-a v BMDC odvozených od divokého typu a Mavs knockout myší. BMDC byly ošetřeny 1 mg/ml mRNA-ekvivalentního jádra, vehikula nebo MVP po dobu 24 hodin. Vozidlo (DOTAP): připraveno nahrazením EDOPC za DOTAP; vozidlo (DOPC): připraveno nahrazením EDOPC za DOPC. Data jsou uvedena jako průměr SEM (nZ 3). ***P < 0.005; ****P < 0,001; ns, není významné.

Obrázek 5 Protinádorové imunitní reakce u myší Sting a Mavs knockout. (AeD) Snížená aktivace DC a T buněk u Sting knockout myší. Myši divokého typu i myši Sting knockout byly ošetřeny MVP zapouzdřeným OVA mRNA a lymfatické uzliny byly odebrány o 48 hodin později pro měření DC a T buněk. (EeH) Snížené T buňky exprimující IFN-g ve slezině a lymfatických uzlinách od Sting knockout myší. Jsou zobrazeny jak obrazy skvrn, tak kvantitativní analýzy. (IeL) Žádný dopad na aktivitu T buněk u Mavs knockout myší. Knokautované myši divokého typu i Mavs byly ošetřeny PBS kontrolou nebo MVP zapouzdřeným OVA mRNA a lymfatické uzliny byly odebrány o 48 hodin později pro měření CD44+CD8+ paměťových T buněk (I), OVA257e264-MHCI dextramer-pozitivních CD8+ T buňky (J) a počet buněk produkujících IFN-g (K a L). Data jsou prezentována jako průměr SEM (nZ 3 nebo 5). *P < 0.05; **P < 0.01; ***P < 0,005; ****P < 0,001; ns, není významné.

Obrázek 6 Protinádorová imunita závislá na bodnutí. (A a B) Analýza T-buněk exprimujících IFN-g v lymfatických uzlinách a nádorových tkáních po myších divokého typu a Sting knockout myší nesoucích B16-OVA nádory byly ošetřeny MVP zapouzdřeným OVA mRNA. Myši byly ošetřeny ve dnech 3 a 10 a lymfatické uzliny a nádory byly odebrány v den 15. Jednotlivé buňky byly analyzovány průtokovou cytometrií. (C) Inhibice růstu nádoru u myší divokého typu a myší s knockoutem Sting. Myši byly ošetřeny PBS kontrolou nebo MVP ve dnech 3 a 10. Data jsou uvedena jako průměr SEM (nZ 5). *P < 0,05; ****P < 0,001; ns, není významné. (D) Schematický pohled na MVP stimulaci signálních transdukčních drah vedoucích k produkci cytokinů v DC. Zatímco stimulace exprese IFN-b je zprostředkována výhradně STING, existuje několik faktorů včetně MAVS, které zprostředkovávají expresi TNF-a a IL-1b.

Reference

1. El Sahly HM, Baden LR, Essink B, Doblecki-Lewis S, Martin JM, Anderson EJ, et al. Účinnost vakcíny mRNA-1273 SARS-CoV-2 po dokončení zaslepené fáze. N Engl J Med 2021;385:1774e85.

2. Moreira Jr ED, Kitchin N, Xu X, Dychter SS, Lockhart S, Gurtman A, et al. Bezpečnost a účinnost třetí dávky vakcíny BNT162b2 Covid-19. N Engl J Med 2022;386:1910e21.

. Dowdy SF. Překonávání buněčných bariér pro RNA terapeutika. Nat Biotechnol 2017;35:222e9.

4. Cullis PR, Hope MJ. Systémy lipidových nanočástic pro umožnění genových terapií. Mol Ther 2017;25:1467e75.

5. Persano S, Guevara ML, Li Z, Mai J, Ferrari M, Pompa PP a kol. Lipopolyplex potencuje protinádorovou imunitu vakcinace na bázi mRNA. Biomateriály 2017;125:81e9.

6. Wang Y, Su HH, Yang Y, Hu Y, Zhang L, Blancafort P a kol. Systémové dodávání modifikované mRNA kódující thymidinkinázu viru herpes simplex 1 pro cílenou genovou terapii rakoviny. Mol Ther 2013;21:358e67.

7. Kranz LM, Diken M, Haas H, Kreiter S, Loquai C, Reuter KC a kol. Systémové dodávání RNA do dendritických buněk využívá antivirovou obranu pro imunoterapii rakoviny. Příroda 2016;534:396e401.

8. Meng C, Chen Z, Mai J, Shi Q, Tian S, Hinkle L a kol. Vakcína mRNA napodobující virus pro léčbu rakoviny. Adv Ther 2021;4:2100144.

9. Pardi N, Hogan MJ, Porter FW, Weissman D. mRNA vakcíny nová éra ve vakcinologii. Nat Rev Drug Discov 2018;17:261e79.

10. Rurik JG, Tombacz I, Yadegari A, Mendez Fernandez PO, Shewale SV, Li L, et al. CAR T buňky jsou produkovány in vivo k léčbě srdečního poškození. Science 2022;375:91e6.

11. Esteban I, Pastor-Quinones C, Usero L, Plana M, Garcia F, Leal L. Existuje v době mRNA vakcín nějaká naděje na funkční léčbu HIV? Viry 2021;13:501.

12. Krienke C, Kolb L, Diken E, Streuber M, Kirchhoff S, Bukur T a kol. Nezánětlivá mRNA vakcína pro léčbu experimentální autoimunitní encefalomyelitidy. Science 2021;371:145e53.

13. Miao L, Zhang Y, Huang L. mRNA vakcína pro imunoterapii rakoviny. Mol Cancer 2021;20:41.

14. Van Hoecke L, Verbeke R, Dewitte H, Lentacker I, Vermaelen K, Breckpot K, a kol. mRNA v imunoterapii rakoviny: mimo zdroj antigenu. Mol Cancer 2021;20:48.

15. Sahin U, Derhovanessian E, Miller M, Kloke BP, Simon P, Lower M, et al. Personalizované RNA mutanomové vakcíny mobilizují polyspecifickou terapeutickou imunitu proti rakovině. Příroda 2017;547:222e6.

16. Sahin U, Oehm P, Derhovanessian E, Jabulowsky RA, Vormehr M, Gold M a kol. RNA vakcína pohání imunitu u melanomu léčeného inhibitorem kontrolního bodu. Příroda 2020;585:107e12.

17. Hilf N, Kuttruff-Coqui S, Frenzel K, Bukur V, Stevanovic S, Gouttefangeas C, et al. Aktivně personalizovaná vakcinační studie pro nově diagnostikovaný glioblastom. Příroda 2019;565:240e5.

18. Carreno BM, Magrini V, Becker-Hapak M, Kaabinejadian S, Hundal J, Petti AA, et al. Imunoterapie rakoviny. Vakcína s dendritickými buňkami zvyšuje šíři a rozmanitost melanomových neoantigen-specifických T buněk. Science 2015;348:803e8.

19. Keskin DB, Anandappa AJ, Sun J, Tirosh I, Mathewson ND, Li S, et al. Neoantigenní vakcína generuje intratumorální T buněčné odpovědi ve fázi Ib studie glioblastomu. Příroda 2019;565:234e9.

20. Mai J, Li Z, Xia X, Zhang J, Li J, Liu H a kol. Synergická aktivace protinádorové imunity částicovou terapeutickou vakcínou. Adv Sci 2021;8:2100166.

21. Kobiyama K, Ishii KJ. Vytváření vrozeného smyslu pro adjuvancii mRNA vakcíny. Nat Immunol 2022;23:474e6.

22. Fotin-Mleczek M, Duchardt KM, Lorenz C, Pfeiffer R, Ojkic-Zrna S, Probst J, et al. Vakcíny na bázi Messenger RNA s duální aktivitou indukují vyvážené TLR-7-závislé adaptivní imunitní reakce a poskytují protinádorovou aktivitu. J Immunother 2011;34:1e15.

23. Kariko K, Buckstein M, Ni H, Weissman D. Potlačení rozpoznávání RNA Toll-like receptory: dopad modifikace nukleosidů a evoluční původ RNA. Imunita 2005;23:165e75.

24. Tahtinen S, Tong AJ, Himmels P, Oh J, Paler-Martinez A, Kim L a kol. IL-1 a IL-1ra jsou klíčovými regulátory zánětlivé odpovědi na RNA vakcíny. Nat Immunol 2022;23:532e42.

25. Li C, Lee A, Grigoryan L, Arunachalam PS, Scott MKD, Trisal M a kol. Mechanismy vrozené a adaptivní imunity vůči vakcíně PfizerBioNTech BNT162b2. Nat Immunol 2022;23:543e55.

26. LoPresti ST, Arral ML, Chaudhary N, Whitehead KA. Nahrazení pomocných lipidů nabitými alternativami v lipidových nanočásticích usnadňuje cílené dodání mRNA do sleziny a plic. J Control Release 2022;345:819e31.

27. Charbe NB, Amnerkar ND, Ramesh B, Tambuwala MM, Bakshi HA, Aljabali AAA a kol. Malá interferující RNA pro léčbu rakoviny: překonávání překážek při porodu. Acta Pharm Sin B 2020;10:2075e109.

28. Fuertes MB, Woo SR, Burnett B, Fu YX, Gajewski TF. Odpověď na interferon typu I a vrozené imunitní snímání rakoviny. Trends Immunol 2013;34:67e73.

29. Harding SM, Benci JL, Irianto J, Discher DE, Minn AJ, Greenberg RA. Mitotická progrese po poškození DNA umožňuje rozpoznání vzorů v mikrojádrech. Příroda 2017;548:466e70.

30. Hartlová A, Erttmann SF, Raffi FA, Schmalz AM, Resch U, Anugula S, et al. Poškození DNA aktivuje interferonový systém typu I prostřednictvím cytosolického DNA senzoru STING, aby se podpořila antimikrobiální vrozená imunita. Imunita 2015;42:332e43.

31. Zhang Z, Yuan B, Bao M, Lu N, Kim T, Liu YJ. Helikáza DDX41 snímá intracelulární DNA zprostředkovanou adaptérem STING v dendritických buňkách. Nat Immunol 2011;12:959e65.

32. Sivick KE, Desbien AL, Glickman LH, Reiner GL, Corrales L, Surh NH a kol. Velikost terapeutické aktivace STING určuje protinádorovou imunitu zprostředkovanou CD8+ T buňkami. Cell Rep 2018;25: 3074e3085 e5.

33. Reikine S, Nguyen JB, Modis Y. Rozpoznávání vzorů a signalizační mechanismy RIG-I a MDA5. Front Immunol 2014;5:342.

34. Fu J, Kanne DB, Leong M, Glickman LH, McWhirter SM, Lemmens E, et al. Vakcíny proti rakovině formulované jako agonista STING mohou vyléčit zavedené nádory odolné vůči blokádě PD-1. Sci Transl Med 2015;7: 283ra52.

35. Corrales L, Glickman LH, McWhirter SM, Kanne DB, Sivick KE, Katibah GE a kol. Přímá aktivace STING v mikroprostředí nádoru vede k silné a systémové regresi nádoru a imunitě. Cell Rep 2015;11:1018e30.

36. Miao L, Li L, Huang Y, Delcassian D, Chahal J, Han J a kol. Dodání mRNA vakcín s heterocyklickými lipidy zvyšuje protinádorovou účinnost aktivací imunitních buněk zprostředkovanou STING. Nat Biotechnol 2019;37:1174e85.

37. Luo M, Wang H, Wang Z, Cai H, Lu Z, Li Y a kol. Aktivační nano vakcína STING pro imunoterapii rakoviny. Nat Nanotechnol 2017;12:648e54.

38. Wang L, Koynova R, Parikh H, MacDonald RC. Transfekční aktivita binárních směsí kationtových o-substituovaných derivátů fosfatidylcholinu: hydrofobní jádro silně moduluje fyzikální vlastnosti a účinnost přenosu DNA. Biophys J 2006;91:3692e706.