Pokroky výzkumu a aplikace fluorescenčních proteinových protilátek: Recenze zaměřená na nanoprotilátky

Abstraktní: Od objevu fluorescenčních proteinů (FP), jejich bohatá fluorescenční spektra a fotochemické vlastnosti podpořily rozsáhlé aplikace biologického výzkumu. FP lze rozdělit na zelený fluorescenční protein (GFP) a jeho deriváty, červený fluorescenční protein (RFP) a jeho deriváty a FP v blízké infračervené oblasti. S neustálým vývojem FP se objevily protilátky zacílené na FP. Protilátka, třída imunoglobulinů, je hlavní složkou humorální imunity, která explicitně rozpoznává a váže antigeny. Monoklonální protilátka, pocházející z jediné B buňky, byla široce používána v imunotestech, in vitro diagnostice a vývoji léků. Nanoprotilátka je nový typ protilátky zcela složený z variabilní domény protilátky s těžkým řetězcem. Ve srovnání s konvenčními protilátkami mohou být tyto malé a stabilní nanoprotilátky exprimovány a funkční v živých buňkách. Kromě toho mohou snadno přistupovat k drážkám, švům nebo skrytým antigenním epitopům na povrchu cíle. Tento přehled poskytuje přehled různých FP, pokrok ve výzkumu jejich protilátek, zejména nanoprotilátek, a pokročilé aplikace nanoprotilátek zaměřených na FP. Tento přehled bude užitečný pro další výzkum nanoprotilátek zaměřených na FP, díky čemuž budou FP cennější v biologickém výzkumu.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Klíčová slova: fluorescenční protein; monoklonální protilátka; nanobody; pokrok ve výzkumu; aplikace

1. Úvod

Fluorescenční protein (FP) je nejběžněji používaným nástrojovým proteinem v biomedicínském vědeckém výzkumu. Po zvýšeném používání FP byly vyvinuty také protilátky proti FP. Ve srovnání s tradiční protilátkou (obrázek 1A), protilátky s těžkým řetězcem (HCAb) z velbloudovitých (obrázek 1B) a imunoglobulinové nové antigenní receptory (IgNAR) ze žraloků (obrázek 1C) přirozeně postrádají lehké řetězce. Jednodoménová protilátka (sdAb) je protilátka zcela složená z variabilních domén HCAb nebo IgNAR. Její molekulová hmotnost je 12–15 kDa, což je asi 1/10 velikosti monoklonální protilátky; proto se také označuje jako nanobody. Nanobody s menší velikostí, vysokou stabilitou vůči kyselinám a teplu, silnou penetrační schopností, snadným genetickým inženýrstvím a expresí a vysokou afinitou, bylo aplikováno v různých oblastech vědeckými výzkumníky. Snadno se dostane do žlábků, švů nebo skrytých antigenních epitopů na povrchu cíle a rozpozná mnoho antigenů, které konvenční protilátky nedokážou rozpoznat [1]. Nanoprotilátky se proto používají jako biomolekuly v organismech a systémech buněčných kultur ve vývojové biologii, krystalické chaperony pro konformační stav ve stabilní biologii, regulátory nebo inhibitory enzymové aktivity, imunohistochemická činidla pro biochemickou analýzu a sekundární protilátky při imunoblotování a imunofluorescenci [2 –6]. Nanoprotilátky, které specificky váží FP, jsou široce používány v subcelulární lokalizaci, studiích intracelulárních signálních drah, zobrazování živých buněk a cílených nanomateriálech [7–9]. Zejména nanoprotilátky mají jedinečné výhody oproti tradičním IgG protilátkám při zobrazování v super vysokém rozlišení.

Obrázek 1. Strukturní diagramy IgG (A), velbloudího HCAb (B) a žraločího IgNAR (C). VH, variabilní oblast těžkého řetězce; VL, variabilní oblast lehkého řetězce; CH/C, konstantní oblast těžkého řetězce; CL, konstantní oblast lehkého řetězce; VHH, variabilní doména HCAb; VNAR, variabilní doména IgNAR.

2. Přehled fluorescenčních proteinů

2.1. Objev fluorescenčních proteinů

Luminiscence je běžný jev u mořských bezobratlých. Koelenteráty, včetně medúz, hydry a korálů, vyzařují zelenou fluorescenci pod ultrafialovým (UV) nebo modrým světlem, zatímco ctenofory emitují modrou fluorescenci. Zelený fluorescenční protein (GFP) byl poprvé identifikován v Aequorea victoria Shimomura et al. v roce 1962 [10] a poté klonován a exprimován v roce 1985 [11]. Jedinečné vlastnosti a stabilní struktura divokého typu GFP (wtGFP) proto přilákaly mnoho výzkumníků k jeho studiu. Od té doby na základě existujících znalostí a její krystalové struktury Tisen a jeho kolegové vytvořili mutací různé proteiny GFP s různými fluorescenčními vlastnostmi a vypracovali mechanismus luminiscence GFP [12]. Pokud jde o výzkum související s GFP, tři vědci (Shimomura, Chalfie a Tsien) získali v roce 2008 Nobelovu cenu za chemii za objev GFP a jejich mimořádný přínos k jeho aplikaci.

Ancestral red fluorescent protein (RFP), konkrétně DsRed, byl klonován z nebioluminiscenčních útesových korálů v roce 1999 [13]. RFP lze použít společně s GFP k řešení vědeckých problémů, které GFP sám vyřešit nedokáže. Nejdůležitější je, že vzhledem k nízkému pozadí RFP v intracelulárním zobrazování je vhodnější pro aplikace v biovědním výzkumu [14,15]. S úsilím mnoha vědců bylo hlášeno, že fluorescenční spektra FP pokrývají celou viditelnou oblast a dokonce i blízkou infračervenou oblast, což poskytuje velké množství nástrojů pro vizualizaci a kvantifikaci proteinů v živých buňkách [16]. Obrázek 2 shrnuje vývoj FP.

Obrázek 2. Vývoj fluorescenčních proteinů. GFP, zelený fluorescenční protein; BFP, modrý fluorescenční protein; EGFP, zesílený zelený fluorescenční protein; YFP, žlutý fluorescenční protein; RFP, červený fluorescenční protein; VHH, variabilní doména těžkého řetězce; VNAR, variabilní nový antigenní receptor. Bledě zelená značka označuje pokrok ve výzkumu aplikace GFP a žlutozelená značka označuje pokrok ve výzkumu protilátky GFP.

2.2. Struktura a funkční vlastnosti GFP

GFP je přirozeně se vyskytující, globulární a rozpustný kyselý FP. Primární struktura GFP se skládá z monomeru složeného z 238 aminokyselinových zbytků s molekulovou hmotností 27–30 kDa. Jeho krystalová struktura zobrazuje střed tvořený 11 antiparalelními řetězci, které tvoří válcovou, těsně sbalenou válcovou strukturu. Střed -barelu je chráněn skupinou vyzařující světlo 4-(p-hydroxybenzyliden)-5-imidazolinonu připojenou k jeho -helixu, přičemž oba konce jsou utěsněny krátkými segmenty -helix [17,18]. Zrání chromoforu nevyžaduje žádný jiný kofaktor než O2 [19]. GFP absorbuje modré světlo nebo UV světlo a emituje zelenou fluorescenci s hlavním excitačním vrcholem při 395 nm, nejnižším excitačním vrcholem při 475 nm a emisním vrcholem při 509 nm. GFP je extrémně stabilní a snadno odolá působení vysokých teplot. Fixace formaldehydem nebo zalití parafínem neovlivňuje jeho fluorescenční vlastnosti. Prostřednictvím hloubkového zkoumání struktury a procesu zrání FP stále více a více výzkumníků přetváří strukturu FP, aby jim poskytlo nové funkce a vlastnosti a dále podporovalo jejich vývoj a aplikaci.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

2.3. Deriváty GFP

Limitujícími faktory v aplikacích GFP jsou pH, citlivost na chloridové ionty a špatná fotostabilita. Cílené modifikace GFP opravují tyto nedostatky a zvyšují jeho kvantový výtěžek, jas, molární extinkční koeficient a fotostabilitu. Kromě toho bylo vytvořeno několik derivátů GFP, aby se rozšířil rozsah vyzařovaných barev, včetně modré, ultramarínové, azurové a žluté.

V reakci na nízkou intenzitu fluorescence wtGFP při excitaci modrým světlem a jeho nestabilní expresi v savčích buňkách Zhang et al. vytvořili aminokyselinovou substituci GFP (F64L a S65T), jmenovitě zesílený GFP (EGFP), jehož intenzita fluorescence je 35-krát zvýšena [20]. EGFP zůstává nejběžněji používaným FP mutantem v oblasti zeleného světla, vzhledem k jeho dobré fotostabilitě a vysokému jasu. Kromě toho byly optimalizovány skládací vlastnosti GFP, čímž byla získána supersložka GFP (sfGFP) se schopností super skládání. SfGFP má šest nových mutací, včetně S30R, Y39N, N105T, Y145F, I171V a A206V. sfGFP se může účinně skládat, i když je exprimován ve fúzi s nerozpustnými proteiny, což zajišťuje jas jeho fluorescence [21]. GFPuv, další modifikovaná forma GFP, je optimalizována pro fluorescenci pod UV světlem. V přítomnosti UV světla generuje jasnější zelenou fluorescenci s excitačním vrcholem při 395 nm a emisním vrcholem při 509 nm a lze jej využít k přesnému určení umístění různých intracelulárních proteinů [22,23]. V GFPuv se vyskytují tři substituce aminokyselin, včetně F99S, M153T a V163A. Tyto mutace indukují 18-krát silnější expresi GFPuv než wtGFP v E. coli. Gen GFPuv je syntetický gen, kde je pět nízkofrekvenčních kodonů Arg nahrazeno kodony vhodnými pro E. coli pro zajištění účinné exprese GFPuv.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Místně cílená mutace Y66H vytváří modrý fluorescenční protein (BFP) s excitačním vrcholem při 384 nm a emisním vrcholem při ~445 nm. Jeho excitační spektrum je blízké UV světlu, které při provozu poškozuje buňky, a jeho krátká emisní vlnová délka vyvolává v buňkách autofluorescenci. Enhanced BFP (EBFP) je slabě luminiscenční a málo odolný vůči fotobělení a kyselinám, s vysokým signálem pozadí pro zobrazování buněk. Byly vyvinuty tři jasnější mutanty EBFP, včetně Azurite [24], EBFP2 [25] a mTagBFP [26], což jsou 1.6-, 2.0- a 3.{{13} }krát jasnější než EBFP, resp. mTagBFP, nejjasnější BFP, je odvozen z mutantu červeného fluorescenčního proteinu (RFP) TagRFP [27], s extinkčním koeficientem 52,000 M−1 cm−1 a kvantovým výtěžkem {{19 }}.63, což výrazně zlepšuje jeho odolnost vůči fotobělení. Výsledkem mutace Y66F ve wtGFP je ultramarínový fluorescenční protein s emisní vlnovou délkou 442 nm [28]. Nízký kvantový výtěžek fluorescence varianty GFP-Y66F však výrazně omezuje její použitelnost při zobrazování. Další mutace GFP-Y66F se substitucemi aminokyselin T65Q, Y145G, H148S a T203V vede k ultramarínovému fluorescenčnímu proteinu Sirius, který je 25krát jasnější než GFP-Y66F [29].

Azurový fluorescenční protein (CFP) má excitační vrchol při 449 nm a emisní vrchol při ~482 nm, se spektrálními vlastnostmi v rozmezí mezi BFP a EGFP. Podobně jako u BFP se pro konstrukci CFP používá místně řízená mutace Y66W. CFP má široké uplatnění ve vícebarevném zobrazování a výzkumu lokalizace díky své vynikající fotostabilitě. Například gen kódující CFP byl optimalizován pro preferenci lidských kodonů a je nyní komerčně dostupný pod obchodním názvem AmCyan1 (Clontech). Kromě toho existuje několik mutantů jasnějších než vylepšený CFP (ECFP), jako je Cerulean, mTFP (dvakrát jasnější než Cerulean) a tyrkysový (asi dvakrát jasnější než ECFP) [21,30].

Mutace ve žlutém fluorescenčním proteinu (YFP) nejsou omezeny v motivu jádra chromoforu Y66, ale ve zbytcích strukturně sousedících s Y66. Excitační pík YFP je ~518 nm, s emisním vrcholem ~531 nm. Ve srovnání s GFP se fluorescence YFP posouvá směrem k červenému spektru, což je způsobeno hlavně substitucí Thr za Tyr na pozici 203. Enhanced YFP (EYFP) je jedním z nejvíce fluorescenčních a široce využívaných FP biosenzorů k detekci intracelulárního pH a koncentrace chloridových iontů. Je však velmi citlivý na kyselé a chloridové ionty a je méně fotostabilní než mnoho FP odvozených od medúz [31]. mCitrine a mVenus, vylepšené verze EYFP, jsou v současnosti nejpoužívanějšími YFP [32,33]. Fotofyzikální vlastnosti GFP a jeho derivátů jsou shrnuty v tabulce 1.

Tabulka 1. Fotofyzikální vlastnosti GFP, RFP a jejich derivátů.

Tabulka 1. Pokr.

2.4. Deriváty RFP

RFP je další široce používaný FP. DsRed je tetramer, který má tendenci tvořit multimery při provádění proteinových fúzí a může být toxický, když je exprimován intracelulárně, takže byl navržen tak, aby získal monomery. Nejpozoruhodnější RFP je rodina "mFruit", včetně mCherry, mBanana, mOrange, dTomato, mTangerine a mStrawberry (tabulka 1), z nichž mCherry s mutacemi K163Q a K83L je nejvýhodnější. mCherry má rychlé zrání, dobré monomerní vlastnosti a lepší fotostabilitu, i když je méně jasný [34]. TagRFP ve své monomerní formě je však asi třikrát až čtyřikrát jasnější než mCherry, což z něj činí relativně jasný monomerní RFP, který je v současnosti dostupný [27]. mKate je nový monomerní daleko červený fluorescenční protein odvozený ze čtyřmístné mutace TagRFP s excitačním vrcholem při 588 nm a emisním vrcholem při 635 nm, který je pouze o 45 % tak jasný jako EGFP; jeho dimerizační protein, Katushka, je ze 67 % tak jasný jako EGFP [35]. mKate2, mutant mKate s aminokyselinovými substitucemi V38A, S165A a K238R, má přibližně dvojnásobnou jasnost než mKate [36]. Ve srovnání s GFP a RFP vykazují mKate a Katushka lepší hloubku zobrazení a bohatší optické signály pro intra-objektové fluorescenční zobrazování [35]. Proto je vývoj daleko červeně fluorescenčních proteinů cennější pro biozobrazování in vivo.

2.5. Near-Infrared FPs

Blízké infračervené (NIR) FP jsou velmi žádané jako proteinové značky v zobrazovacích aplikacích. Většina NIR FP je navržena z bakteriálních fytochromových fotoreceptorů (BphPs) [37]. První NIR FP používaný při zobrazování živých zvířat je IFP1.4, fluorescenční protein odvozený z BphP, který fluoreskuje vazbou na biliverdinový (BV) chromofor [38]. Přesouváním DNA a náhodnou mutagenezí se pak vyvine jasnější IFP2.0 [39]. Přestože monomerních IFP1.4 a IFP2.{11}} lze dosáhnout porušením dimerizačního rozhraní BphP, stále mají tendenci dimerizovat při vysokých koncentracích. Přirozený monomerní infračervený fluorescenční protein (IFP), mIFP, byl navržen v roce 2015 [40]. Bylo prokázáno, že mIFP má zvukové zobrazovací účinky u larev a neuronů Drosophila. Shcherbakova a kol. navrhl tři jasné monomerní NIR FP s odlišnými spektry, konkrétně miRFP670, miRFP703 a miRFP709 [41]. NIR FP odvozené od BphP minimálně vyžadují dvě domény, PAS (Per-ARNT-Sim) a GAF (cGMP fosfodiesteráza-adenylátcykláza-FhlA), aby kovalentně navázaly BV chromofor a měly také složitou strukturu „osmiho uzlu“. topologicky spojující domény GAF a PAS, což ovlivňuje jejich skládání. K inženýrství NIR FP se proto používá další třída bakteriálních fotoreceptorů, alofykokyaniny (APC), jako je smURFP [42]. Ačkoli jsou NIR FP na bázi APC menší, vážou BV méně účinně, což vede k výrazně nižšímu jasu v savčích buňkách než NIR FP odvozené od BphP. K překonání defektů NIR FP na bázi BphP a APC byl z cyanobakteriochromu (CBCR) vyvinut jednodoménový NIR FP s názvem miRFP670nano, který představuje první NIR FP odvozený od CBCR, který může účinně vázat endogenní chromofor BV a emitovat jasnou fluorescenci v savčích buněk [43]. Podstatnou výhodou miRFP670nano oproti NIR FP odvozeným od BphP je vysoká fotostabilita. Vylepšený miRFP670nano3 se 14 mutacemi vzhledem k rodičovskému miRFP670nano vykazuje podobnou fotostabilitu jako miRFP670nano [44]. Tabulka 2 shrnuje fotofyzikální vlastnosti NIR FP.

Tabulka 2. Fotofyzikální vlastnosti NIR FP.

Objev a aplikace FP poskytly mocný výzkumný nástroj pro moderní biologii. V dnešní době se FP staly jedním z běžných nástrojů, které vědci používají k rozšíření svých aplikací do mnoha oblastí výzkumu, jako je regulace genové exprese, značení organel, přenos signálu, screening léků a biomolekulární interakce. Většina klonovacích vektorů exprimujících FP byla komerčně využita a jsou dostupné prostřednictvím komerčních společností.

3. Pokrok ve výzkumu fluorescenční proteinové protilátky

3.1. Monoklonální protilátka zacílená na fluorescenční proteiny

Protilátka je druh imunoglobulinu vylučovaný B lymfocyty. Monoklonální protilátky se skládají ze dvou těžkých řetězců a dvou lehkých řetězců, přičemž těžký řetězec se skládá z jedné variabilní oblasti (VH) a tří konstantních oblastí (CH), a lehký řetězec se skládá z jedné variabilní oblasti (VL) a jedné konstantní oblasti (CL). ). Těžké řetězce jsou kovalentně spojeny disulfidovými vazbami a CL oblast lehkého řetězce je nekovalentně spojena s doménou CH1 těžkého řetězce za vzniku stabilní molekuly protilátky [45]. Díky své specifické receptorové vazebné kapacitě produkují monoklonální protilátky různé biologické aktivity, jako je klasická blokace, neutralizace, aktivace komplementu, zabíjení cílových buněk prostřednictvím Fc receptoru a regulace imunitní aktivity. Jsou to kritické biologické makromolekuly široce používané v imunotestech, in vitro diagnostice a vývoji léčiv. Polyklonální protilátky jsou směsí heterotypických protilátek odvozených z procesu imunitní odpovědi více B buněk a každá protilátka rozpoznává jiný epitop stejného antigenu [45]. Ve srovnání s polyklonálními protilátkami monoklonální protilátky specificky detekují epitop na antigenu a je u nich méně pravděpodobné, že zkříženě reagují s jinými proteiny, takže produkují nízké signály barvení pozadí. Navíc reprodukovatelnost výsledků týkajících se monoklonálních protilátek je vyšší než u polyklonálních protilátek za stejných experimentálních podmínek.

GFP is a unique in vivo reporter that can be analyzed for gene expression in many species. Gengyoando and Mitani used the glutathione-S-transferase (GST) fusion protein, which contains the full-length GFP coding region and a synthetic peptide corresponding to residues Ser208-His217 of GFP, as an immunogen to create the monoclonal antibody 65B12 against GFP [46]. Immunoblot analysis demonstrates that 65B12 specifically bound the GFP fusion protein. Furthermore, it can recognize the fluorescent cells in transgenic animals expressing the uric-86-gfp reporter construct; hence, it can be applied in immunohistochemistry. Zhuang et al. developed an improved method to purify GFP protein [47]. The monoclonal antibody against GFP, FMU-GFP.5, was prepared by immunizing mice using purified GFP as an antigen. GFP with high purity (>97% homogeneity) and sample yield (>90 %) je purifikováno pomocí jednoduché 2-krokové techniky s použitím mAb FMU-GFP.5-spřažené pryskyřice Sepharose 4B. Kromě toho mohou být všechny funkční rekombinantní cílové proteiny spojené s GFP snadno a přímo izolovány z buněk díky epitopu GFP. Tato data naznačují, že tento způsob je při čištění GFP účinnější než jakýkoli dostupný způsob a řeší problém nízkého výtěžku a čistoty u většiny způsobů čištění GFP.

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

3.2. Nanobody zaměřené na fluorescenční proteiny

3.2.1. Představení Nanobody

Inherentní vlastnosti monoklonálních protilátek, jako je jejich velká molekulová hmotnost, komplexní struktura a omezená biologická aktivita, stále více omezovaly jejich další aplikace. Proto je naléhavé vyvinout alternativy k monoklonálním protilátkám. V roce 1989 Ward a kol. připravili variabilní doménu protilátky pouze s těžkým řetězcem se slabou vazebnou schopností k lysozymu, což zvýšilo zájem o výzkum sdAb [48]. V roce 1993 Hamers Casterman a kol. objevili poprvé v velbloudím séru nový typ protilátky, která je zcela odlišná od tradiční savčí protilátky [49]. Tento typ protilátek se nazývá HCAb kvůli jeho přirozenému nedostatku lehkých řetězců. HCAb se skládá z CH2, CH3, pantové oblasti a variabilní domény HCAb (VHH), ale stále má plnou kapacitu vázat antigen. V roce 1995 Greenberg a kol. objevili pouze protilátky s těžkým řetězcem, známé jako IgNAR, u žraloka [50]. Existuje jak v sekreční formě, tak ve formě vázané na membránu a skládá se z variabilní oblasti, nazývané variabilní nový antigenní receptor (VNAR), a několika konstantních oblastí. Následně byl IgNAR nalezen u žraloka wobbegonga, ostnatého žraloka, rohatého žraloka a žraloka běloskvrnného bambusového, který doplňuje repertoár sdAbs. Nanoprotilátka se vyznačuje nízkou molekulovou hmotností, vysokou afinitou, silnou stabilitou, dobrou rozpustností, silnou penetrací tkání a rozpoznáváním skrytých epitopů antigenu. Přitahuje zvýšenou pozornost v diagnostice onemocnění, imunitních reagenciích, detekci patogenů a vývoji léků [51]. S rozvojem technik molekulární biologie a zdokonalením technologie přípravy protilátek pomocí genetického inženýrství se nanobody staly oblíbeným výzkumným oborem v imunotestech. Obrázek 3 shrnuje dosavadní vývoj nanobody.

Obrázek 3. Vývoj nanobody. Světle modrá značka označuje pokrok ve výzkumu léků s nanobody. FDA, Food and Drug Administration; EMA, Evropská agentura pro léčivé přípravky; NMPA, National Medical Products Administration; HCAb, protilátka těžkého řetězce; IgNAR, Ig nové antigenní receptory; sdAb, jednodoménová protilátka; VHH, variabilní doména HCAb; VNAR, variabilní doména IgNAR; PD-L1, programovaná buněčná smrt 1 ligand 1.

3.2.2. Nanobody zaměřené na fluorescenční proteiny

Fluorescenční proteiny změnily buněčnou biologii a biochemii tím, že nabízejí jednoduše použitelné genově kódované fluorescenční proteinové markery. Syntézou a selekcí knihoven proteinového lešení během paralelního vývoje bylo vyvinuto několik pevných vazebných činidel pro výzkum a cíle léčiv [52]. Příkladem je vývoj nanoprotilátky, kterou lze snadněji vybrat se zlepšenou stabilitou, rozpustností a výtěžkem [53]. Na rozdíl od tradičních protilátek jsou tyto malé a stabilní nanoprotilátky funkční v živých buňkách. Proto je nanobody se specifickou vazebnou aktivitou k FP účinným nástrojem pro fúzi, separaci a buněčné inženýrství FP v různých oblastech biologického výzkumu.

• Nanobody pocházející z Camelidae zacílené na GFP

Různé proteiny s vynikajícími subcelulárními lokalizačními charakteristikami byly fúzovány s GFP, čímž byly vytvořeny vizuální antigeny pro detekci proteinů přímo v různých subcelulárních kompartmentech. V roce 2006 Rothbauer a spol. provedl screening fragmentu GFP-specifické protilátky (cAbGFP4) imunizací alpaky pomocí GFP [54]. Test povrchové plasmonové rezonance (SPR) interakce mezi cAbGFP4 a GFP antigenem ukázal vysokou afinitu (KD=0,23 nM). Navíc byla anti-GFP nanoprotilátka kombinována s monomerním RFP, čímž vznikla viditelná GFP-vazebná protilátka použitá ke zkoumání distribuce anti-GFP nanoprotilátky v živých buňkách. Gelovou filtrací, imunoblotováním a testy konfokální mikroskopie bylo prokázáno, že nanoprotilátka specifická pro GFP je stabilně distribuována v savčích buňkách bez detekovatelné degradace proteinu nebo agregace, která se běžně vyskytuje u jednořetězcových variabilních fragmentů. Dále Kubala et al. charakterizovali komplex GFP:cAbGFP4 (obrázek 4A) pomocí rentgenové krystalografie a izotermické titrační kalorimetrie (ITC) [55], což odhalilo základ pro vysokou afinitu a specificitu nanoprotilátek ve vazbě na proteiny. V roce 2020 byly pomocí fágového displeje identifikovány čtyři odlišné anti-GFP nanoprotilátky, označené A12, B9, D5 a E6 [56]. Nativní PAGE a imunoprecipitační testy odhalily, že tyto nanoprotilátky by mohly vázat GFP in vitro a in vivo.

Obrázek 4. Schéma komplexu GFP-nanobody. (A) cAbGFP4 (PDB:3OGO, oranžová); (B) GBP1 (PDB: 3K1K, světle modrá); (C) GBP4 (PDB: 3G9A, růžová); (D) LaG16 (PDB: 6LR7, žlutá); (E) NbsGFP02 (PDB: 7E53, purpurová). (F) Strukturální superpozice výše uvedených nanoprotilátek s komplexem GFP. GFP je zobrazen v zelené barvě.

Proteinová konformace úzce souvisí s funkcí a je obvykle řízena regulačními faktory. Axel a kol. identifikovali sedm GFP-specifických vazebných látek, konkrétně GFP-binding proteins (GBP) 1–7 [57]. Mezi nimi GBP1 zvýšil fluorescenci GFP 10-krát, zatímco GBP4 vyvolal 5-násobný pokles fluorescence GFP; proto byly označovány jako „vylepšovače“ a „minimizéry“. Strukturální analýzy komplexu GFP-nanobody (obrázek 4B, C) odhalily, že tyto dvě nanoprotilátky způsobily mírné protichůdné změny v prostředí chromoforu a změnily jeho absorpční charakteristiky [58]. Dále bylo identifikováno 25 GFP-specifických nanoprotilátek (LaGs), s hodnotami KD v rozmezí od 0,5 nM do více než 20 uM [59]. Bivalentní nanoprotilátka (LaG-16-LaG-2) vykazovala nejvyšší afinitu s hodnotou KD 36 pM. Kromě toho se maximální intenzita fluorescence GFP zvýšila o ~ 60 % při inkubaci s nadbytkem proteinu LaG. Zhang a kol. uvedli krystalovou strukturu GFPuv v komplexu s LaG16 (obrázek 4D) při rozlišení 1,67 Á [60]. Vazebné místo LaG16 na GFP barelu bylo umístěno na druhé straně zesilovače GFP. LaG16 a GFP-enhancer byly tedy fúzovány s (GS)4 linkerem. Bivalentní nanoprotilátka měla afinitu 0,5 nM, což demonstrovalo proveditelnost návrhu vazebných látek pro cílový protein s ultravysokou afinitou dimerizací 2 nanoprotilátek, které se vážou s různými epitopy.

V roce 2014 Twair a spol. připravil sfGFP a imunizoval dospělého velblouda jednohrbého. Bylo izolováno sedm anti-sfGFP nanoprotilátek zacílených na tři epitopy (NbsfGFP01, 02, 03, 04, 06, 07 a 08) [61]. Na základě ELISA a imunoblotovacích testů tyto nanoprotilátky rozpoznaly sfGFP označený jako volný nebo fúzovaný s růstovým hormonem. Kromě toho byla krystalová struktura nanobody NbsfGFP02 v komplexu s sfGFP (obrázek 4E) stanovena s rozlišením 2,2 Á. Afinita mezi NbsfGFP02 a sfGFP byla stanovena na 15,8 nM pomocí interferometrie biovrstvy (BLI). Teplota tání byla 75,6 stupně pro NbsfGFP02 [62]; je tedy potenciálním kandidátem na nanobody GFP v aplikacích, které vyžadují drsné testovací podmínky. Většina nanoprotilátek může být funkčně exprimována in vivo prostřednictvím transfekce plazmidu do eukaryotických buněk. Nanobody jsou tedy vynikajícím nástrojem pro identifikaci strukturálních nebo dynamických vlastností v živých buňkách. V roce 2020 Zhou a kol. navrhli nový způsob exprese zkonstruovaných GFP-binding nanobody (cAbGFP4) jako in vitro transkripční (IVT) mRNA, označované jako nanobody-mCherry [63]. mRNA s netranslatovanými oblastmi a analogy s reverzní čepičkou zakončenými chemicky modifikovanými nukleotidy a poly(A) ocasem byla připravena in vitro a použita pro transfekci. Na rozdíl od nanoprotilátky exprimované pomocí plazmidové DNA byla anti-GFP nanoprotilátka exprimovaná pomocí IVT mRNA identifikována během 3 hodin po transfekci a degradována během 48 hodin. Proto exprese kódované mRNA nanoprotilátky v živých buňkách umožňuje účinné dodání nanoprotilátky.

• Nanobody odvozené ze žraloků zacílené na GFP.

Wei a kol. prokázali, že žraloci bambus vyvolávají účinnou imunitní odpověď proti imunizaci GFP, která se vyznačuje zvýšeným počtem lymfocytů a antigen-specifickými IgNAR [64]. Celkem bylo z imunizovaných bambusových žraloků izolováno 7 anti-GFP nanoprotilátek, včetně BsG3, 73, 80, 89, 93, 98 a 105, s afinitou až 0,3 nM, což znamená, že žraloci bambusové vyrábět vysoce afinitní IgNAR. Kromě toho byly zkonstruovány bi-paratopické VNAR s nejvyšší afinitou k GFP (20,7 pM) a charakter anti-GFP nanoprotilátek jako intrabodies byl ověřen v savčích buňkách. Tato zjištění urychlí výzkum a pokrok bambusových žraloků sdAbs s cílem poskytnout levné a snadno použitelné nanobody pro biomedicínský průmysl.

• Nanoprotilátky zacílené na jiné fluorescenční proteiny.

Masabi je jasný monomerní zelený fluorescenční protein. Li a kol. úspěšně zkonstruoval protilátkovou knihovnu 4 × 107 transformantů imunizací velbloudů mWasabi jako antigenem a provedl screening 3 vysoce afinitních nanoprotilátek specifických pro mWasabi, nazývaných Nb4, Nb6 a Nb27 [65]. Tyto nanoprotilátky rozpoznaly wasabi samotné nebo v kombinaci s programovanou smrtí 1 (PD-1). Celkem bylo identifikováno 6 nanoprotilátek (LaM) zacílených na mCherry s vysokou specificitou, s hodnotami KD v rozmezí od 0,18 nM do 63 nM [59]. Kromě toho byly izolovány tři iRFP713-specifické nanoprotilátky (BSR1, BSR3 a BSR4) s nanomolárními vazebnými afinitami [64]. Tyto údaje naznačují, že imunizace bambusových žraloků může produkovat vysoce afinitní nanoprotilátky. Celkově schopnost nanoprotilátek vázat buněčné proteiny a přitahovat FP fúzní proteiny umožňuje přesné řízení buněčných procesů a struktur v živých buňkách. Tato multifunkční FP-nano past umožňuje mikroskopické, biochemické a funkční analýzy s unikátní kombinací stejného proteinu. Nanoprotilátky zacílené na FP jsou shrnuty v tabulce 3.

Tabulka 3. Souhrn nanoprotilátek zaměřených na FP.

4. Aplikace fluorescenčního proteinového nanobody

4.1. Aplikace v detekci proteinů

4.1.1. Detekce intracelulárních proteinů

Pochopení funkce proteinu vyžaduje spolehlivou a kvantifikovatelnou lokalizaci proteinu s vysokým rozlišením. Ačkoli je použití protilátek ke značení cílových proteinů v molekulární biologii dobře zavedeno, je tato technika omezena velikostí a multivalencí běžných protilátek. Vzhledem k malé velikosti nanoprotilátek je lze použít jako indikátory pro intracelulární zobrazování po ligaci s fluorescenčními molekulami, enzymy, peptidy, receptory, biotinem a dalšími léky. Například nanoprotilátky proti FP byly použity při zobrazování mikroskopií s vysokým rozlišením, když byly označeny organickými barvivy [66,67]. Buňky Ptk2, které nepřetržitě exprimují tubulin YFP, byly zobrazeny pomocí tohoto přístupu a rozlišení bylo zlepšeno na 269 ± 37 Á, na rozdíl od přibližně 450 Á s konvenčními protilátkami.

Značení zprostředkované nanobody nabízí rychlou a všestrannou metodu pro označení téměř jakékoli běžně dostupné fúzní struktury odvozené od FP pro sofistikované zobrazování pomocí lokalizační mikroskopie s jednou molekulou (SMLM). Konkrétně dvoubarevný SMLM může zkoumat subcelulární lokalizaci jakýchkoli funkčních fúzních konstruktů GFP a RFP, když jsou současně použity nanoprotilátky proti GFP a RFP [68]. Mnoho biologických problémů tak lze rychle řešit pomocí dvoubarevného zobrazování SMLM. Ariotti a kol. navrhl modulární přístup pro značení proteinů na bázi enzymů, který umožňuje lepší rychlost a odběr vzorků pro analýzu distribuce subcelulárních proteinů do EM-rozlišení [7]. Navržením GBP4 přímo na značku modifikované sojové askorbátperoxidázy (APEX) bylo prokázáno, že APEX může být nasměrován na jakýkoli požadovaný protein značený GFP. Fúze APEX-GBP4 poskytuje pozoruhodnou lokalizaci proteinu s vysokým rozlišením do subdomén organel a významně zkracuje dobu pro charakterizaci distribuce subcelulárních proteinů. Kromě toho umožňuje EM rozlišení proteinů značených GFP exprimovaných na endogenních úrovních.

Byl vytvořen soubor nástrojů plasmidů kódujících nanobody specifické pro FP a fúzován do funkčních modulů. Tento soubor nástrojů umožňuje vizualizaci a manipulaci s intracelulárními signálními cestami v živých buňkách, čímž významně rozšiřuje jeho použití in vivo [9]. Patří mezi ně fluorescenční senzory pro dynamickou vizualizaci Ca2+, H+ a ATP/ADP a oligomerní nebo heterodimerní moduly, které umožňují získávání proteinů nebo izolaci a rozpoznávání membránových kontaktních míst mezi organelami. V roce 2017 Herce a spol. použili buněčný penetrační peptid (CPP) k transportu protilátek přímo do buněk pro imunoznačení a manipulaci s antigeny [69]. Byl zkonstruován systém, který využil vysoké afinity cyklického CPP bohatého na arginin k RNA v jadérku. Napojením cyklického CPP bohatého na arginin k nanoprotilátce GFP lze přímo v buňkách pozorovat re-lokalizaci GFP v jadérku (obrázek 5A). Proto lze tento vizualizovaný systém použít ke sledování umístění proteinu a ke kvantitativnímu srovnání účinnosti různých CPP.

Technika fluorescenčního rezonančního přenosu energie (FRET) je široce používána ve výzkumu biologických věd, protože umožňuje dynamickou detekci signálních molekul v reálném čase za fyziologických podmínek v živých buňkách. Díky své výjimečné citlivosti a specifičnosti se v biomedicínském výzkumu stává časově rozlišená analýza založená na Försterově rezonančním přenosu energie (TR-FRET) stále populárnější. Metoda TR-FRET založená na nanobody umožňuje snadnou kvantifikaci fluorescenčních (fúzních) proteinů v lyzátech s mnohem vyšší citlivostí než konvenční odečty intenzity fluorescence [70].

Obrázek 5. Aplikace fluorescenční proteinové nanoprotilátky. (A) Vizualizace interakcí protein-protein. Anti-GFP nanoprotilátka (Nb) navázaná na buněčně penetrující peptidy (CPP) může pronikat do buněčného jádra. Pokud protein značený GFP neinteraguje s proteinem značeným RFP, pouze protein značený GFP se relokalizuje do jadérka prostřednictvím Nb-CPP a vykazuje zelenou barvu. Pokud však tyto dva proteiny interagují, oba proteiny se znovu lokalizují do jadérka a vykazují žlutou barvu. (B) GFP nanobody umožňuje selektivní značení nově exocytovaných vezikulových proteinů. Krok 1: Vezikulární protein je navázán na GFP a inkubován s nefluorescenční nanoprotilátkou (NbGFP), což vede k nedostupnosti GFP s fluorescenčně vázající nanoprotilátkou (NbGFP*). Kroky 2 a 3: Po stimulaci buněčné exocytózy je nový vezikulový protein vystaven plazmatické membráně a může být označen NbGFP*. (C) Schematické znázornění degradovaného. Proteinově selektivní degradace se provádí ubikvitinovou cestou, kterou provádí komplexní řada enzymů. Protein F-box (FBP) v SKP1-CUL1-F-box proteinových ligázových komplexech (SCF) je fúzován s anti-GFP nanobody (Nb), aby rozpoznal fúzní protein GFP a enzym konjugující ubikvitin (E2) kovalentně spojuje více molekul ubikvitinu s cílovým proteinem. Následně je polyubikvitinovaný protein degradován proteazomem. (D) Schematický popis BiCAP. HER protein je fúzován s N-koncovými (GFP1) nebo C-koncovými (GFP2) fragmenty GFP. Když dvě fúze vytvoří dimer, GFP se znovu složí a fluoreskuje. HER dimer a jeho interagující proteiny jsou poté obohaceny pomocí GFP nanoprotilátky, která nemá žádnou vazebnou schopnost vůči GFP fragmentům a umožňuje tak izolaci dimeru. (E) GFP-dependentní transkripční systém. DNA-vazebná doména (DBD) a aktivační doména (AD) jsou fúzovány s GFP nanoprotilátkou 1 (Nb1) a GFP nanolátkou 2 (Nb2). V přítomnosti GFP mohou DBD-Nb1 a AD-Nb2 aktivovat reportérový gen upstream aktivační sekvence (UAS), což vede k upregulaci cílových genů. (F) Rozpoznávání proteinů značených GFP na nanostrukturách DNA. Nanostruktury DNA se dvěma vazebnými místy jsou ligovány na magnetickou pryskyřici, navázány s GFP nanobody (Nb) komplementárním párováním bází a poté inkubovány s proteiny značenými GFP. Proto mohou být proteiny značené GFP přesně připojeny k nanostrukturám.

Obrázek 5. Pokr.

4.1.2. Detekce proteinů na buněčném povrchu

Zobrazení bakteriálního povrchu je slibná technologie pro produkci proteinů ukotvených v buňce a navrhování celobuněčných katalyzátorů. Přestože se pro povrchové zobrazování používají různé proteiny vnější membrány, nejsou k dispozici žádné jednoduché, univerzální a vysoce výkonné kompatibilní metody pro hodnocení a vývoj systémů povrchového zobrazování. Navíc je náročné rozlišovat mezi intracelulárními a povrchově zobrazovanými proteiny. Wendel a kol. zkonstruoval detekční systém povrchového displeje založený na fluorescenci fúzí GFP-nanobody s kotvami vnější membrány [71]. Jako kotvy byly vybrány dva běžně používané proteiny vnější membrány: protein vnější membrány A (OmpA) a autotransportér (C-IgAP). Dva různé zobrazovací moduly jsou tedy konstruovány fúzí OmpA nebo C-IgAP s nanobody specifickými pro GFP, vizualizovanými externím přidáním purifikovaného GFP. Ačkoli samotný GFP může být zobrazen na buněčném povrchu, tato nová metoda se vyhýbá problému falešných pozitiv, protože pouze pokud se GFP naváže na nanobody prezentované na buněčném povrchu, mohou buňky produkovat fluorescenční signál. Test je kompatibilní s mnoha metodami fluorescenční detekce, včetně celobuněčné fluorescenční detekce na destičce, fluorescence v gelu, mikroskopie a průtokové cytometrie. Tato nenákladná a snadno čitelná metoda povrchového zobrazování pomůže demonstrovat transportní mechanismus proteinů na povrch živých buněk, což v budoucnu umožní racionální vývoj bakteriálních povrchových zobrazovacích systémů a robustních celobuněčných biokatalyzátorů.

Uvolnění neurotransmiterů vyžaduje exocytózu, endocytózu a tvorbu nových fúzních vezikul. Co se stane s proteiny vezikuly po exocytóze, když zůstanou na plazmatické membráně, není dobře pochopeno. Tyto proteiny jsou často konjugovány se zbytky GFP citlivými na pH (fluor). Vzhledem k tomu, že zobrazení pHluorinu je obvykle omezeno difrakcí skvrn několikanásobně větších než vezikuly, je použití anti-GFP nanoprotilátek k selektivnímu značení exocytovaných vezikul cenné [72]. Spojením anti-GFP nanoprotilátek s chemickými fluorofory vhodnými pro zobrazování s vysokým rozlišením lze velikost a intenzitu proteinů značených pHluorinem za různých podmínek detekovat způsoby, které nejsou možné se samotným pHluorinem. Po stimulaci exocytózy jsou nové vezikulové proteiny vystaveny plazmatické membráně a poté se fluorescenčně značené nanobody navážou na pHluorin (obrázek 5B). Detekce pHluorinu na bázi nanobody je tedy slibným nástrojem pro studium postexocytózních událostí v neuronech.

4.2. Aplikace při cílené degradaci proteinových molekul

Ve srovnání s editací genů a interferencí RNA je přímá manipulace s biomolekulami na úrovni proteinu účinnější cestou pro studie funkce proteinů, která překonává omezení, jako jsou potenciální účinky mimo cíl, inaktivace genů a ztráta esenciální fenotypové funkce genu. Cílená degradace proteinů je v současnosti hlavní výzkumnou strategií k dosažení ztráty funkce a proteolýzy sledovaných proteinů. Degradátor proteinů na bázi nanobody může pomoci dosáhnout rychlé degradace a reverzibilní regulace sledovaných proteinů. Caussinus a kol. vyvinuli metodu degradace proteinů pro přímou a rychlou depleci cílových fúzních proteinů GFP v jakémkoli eukaryotickém systému [73]. Stručně řečeno, aby se srazil GFP fúzní protein, anti-GFP nanoprotilátka je fúzována s proteinem F-box (FBP) v komplexech E3 ligázy SKP1-CUL1-F-box proteinu (SCF) rozpoznat fúzní protein GFP. Enzym konjugující ubikvitin (E2) kovalentně spojuje více molekul ubikvitinu s cílovým fúzním proteinem GFP. Následně komplex SCF degraduje polyubikvitinovaný protein; takže odstranění cílového proteinu je snadné monitorovat (obrázek 5C). Tato technika, nazývaná degradovaný zelený fluorescenční protein (deGradFP), byla použita pro degradaci GFP a jeho fúzí v savčích buňkách, embryích zebrafish [74] a rostlinách [75].

4.3. Aplikace v afinitním purifikačním systému s bimolekulární komplementací

V roce 2016 Croucher a spol. vyvinuli bimolekulární komplementační afinitní purifikační systém (BiCAP), který dokáže účinně odlišit dimer (homologní a heterologní) receptoru lidského epidermálního růstového faktoru (HER) od monomeru [76]. V tomto systému jsou dva komplementární fragmenty molekuly FP fúzovány se dvěma HER proteiny (HER1, HER2 nebo HER3). Tyto dva fragmenty nelze spontánně sestavit do aktivních fluorescenčních proteinů. Předpokládejme však, že tyto dva proteiny HER na sebe vzájemně působí. V takovém případě budou dva fragmenty prostorově blízko u sebe a budou se doplňovat a rekonstruovat je na kompletní a aktivní fluorescenční protein (obrázek 5D). HER dimer a jeho interagující proteiny mohou být obohaceny pomocí GFP nanobody, která neměla žádnou afinitu pro GFP fragmenty, což umožňuje izolaci a obohacení dimeru. Analýzou identifikovaných proteinů bylo zjištěno, že tyto tři dimery (HER2:HER2, HER2:HER3 a HER1:HER2) mají společné interagující proteiny a jejich specifický interaktom. FAM59A, protein, který specificky interagoval s dimerem HER1:HER3, zprostředkoval aktivaci kinázové dráhy regulované extracelulárním signálem, čímž poskytl nový cíl pro terapii rakoviny prsu.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

4.4. Aplikace v jiných oblastech

Včasná diagnostika onemocnění in vitro a sledování terapeutických účinků je hlavním problémem diagnostiky onemocnění. Ideální kontrastní látka by měla mít dobrou tkáňovou penetraci, vysokou afinitu k antigenu a schopnost rychlé clearance s minimálním poškozením normálních tkání. Nanobody mají potenciál jako ideální zobrazovací činidla, která mohou procházet krevními cévami a vstupovat do tkání pro lepší zobrazování a terapeutické aplikace.

FP nejen osvětlují buňky a biologické procesy, ale také vytvářejí vynikající skafoldy kvůli jejich zjevnému nedostatku vazby na četné hostitelské proteinové sítě. Použití GBP a GFP jako lešení k řízení tvorby biologicky aktivních komplexů, Tang et al. vytvořili knihovnu hybridních transkripčních faktorů, které výhradně kontrolují genovou expresi v přítomnosti GFP a jeho derivátů [77]. Produkce GFP řídí expresi buněčně specifických genů (obrázek 5E) a podporuje dysfunkci myší sítnice a mozku. Kromě toho jsou GFP transgenní myši a kmeny zebrafish modifikovány tak, aby bylo dosaženo GFP-dependentní transkripce pro fotogenetické monitorování nervových okruhů. Tato práce zakládá pozici GFP jako všestranného lešení a otevírá dveře k selektivní manipulaci s různými GFP-značenými buňkami v transgenních kmenech. Na základě toho mohou být také vyvinuty další intracelulární produkty jako buněčně specifické lešení v mnohobuněčných organismech.

Nanostruktury DNA se staly nezbytným a účinným nástrojem pro studium enzymové aktivity a funkce proteinů. Vyvinout univerzální strategie pro tvorbu proteinových komplexů na nanostrukturách DNA je však obtížné. Jednou z obtíží je připojení zájmových proteinů k nanostrukturám DNA. Sommese a kol. navrhl nový přístup ke značení nanostruktur DNA [78]. Jejich funkcionalizací pomocí nanobody GFP lze přesně kontrolovat schopnost připojení proteinu (obrázek 5F). Ve srovnání s GFP-specifickými DNA aptamery vykazují nanoprotilátky vyšší specificitu, stabilitu a afinitu vůči GFP. Proto byla aplikace nanostruktur DNA jako programovatelného lešení v biologickém výzkumu výrazně zjednodušena propojením nanostruktur DNA s FP běžně se vyskytujícími v buňkách, vývojové biologii a biochemii proteinů.

5. Diskuse o výhledu do budoucna

Ve srovnání s tradičními protilátkami mají nanoprotilátky lepší fyzikální a chemické vlastnosti a snáze se exprimují a skrínují. Nanoprotilátky mají mnohem jednodušší strukturu než běžné protilátky. Jsou kódovány jediným genem a mohou být snadno produkovány mikroorganismy, což výrazně snižuje výrobní náklady. Přestože nanoprotilátky představují průlom ve výzkumu protilátek, některé problémy je stále třeba vyřešit. Na jedné straně mají nevýhodu nepohodlné obsluhy a vysokých nákladů na imunizaci zvířat. Kromě toho, protože HCAb a IgNAR jsou hojné v monocytech periferní krve, jsou nanoprotilátky zacílené na FP antigeny obvykle skrínovány ze specifických imunitních knihoven Camelidae nebo žraloků. S vyzráváním technologií konstrukce knihoven a vývoje nanotěles je screening nanoprotilátek specifických pro FP ze syntetických knihoven novým směrem, který překoná nepohodlí imunizace zvířat, zkrátí dobu experimentu a výrazně sníží náklady. Na druhou stranu, ačkoliv screening a exprese nanoprotilátek je relativně jednoduchá, získání FP nanoprotilátek s potenciálními aplikačními hodnotami je velmi komplikovaný proces. Screening knihoven fágových nanoprotilátek se nemůže vyhnout falešným pozitivům způsobeným vazbou povrchu filamentózního fága s antigenem, zatímco malá kapacita knihoven kvasinkových a bakteriálních nanoprotilátek je dalším obtížným problémem při screeningu nanobody.

Aplikace nanoprotilátek proti FP bude v budoucnu nadále přibývat. (1) S rozvojem technologie intracelulárních protilátek se detekce intracelulárních molekul v živých buňkách stala dostupnou. Nanoprotilátky mají v tomto ohledu jedinečné výhody v tom, že (i) nanoprotilátka je malá a účinnost vstupu do buňky je mnohem vyšší než u tradičních protilátek; a (ii) nanoprotilátka může být exprimována a funkční v živých buňkách. (2) Bispecifická nanoprotilátka je druh uměle modifikované protilátky, která může specificky vázat dva různé antigeny současně. Lze jej snadno zkonstruovat z monovalentních nanoprotilátek a exprimovat v mikroorganismech. Nanobody proti FP tedy poskytují širokou aplikační vyhlídku pro vývoj bispecifických nanobody.

6. Závěry

Tento článek shrnuje původ, strukturu a vlastnosti FP. Jsou také shrnuty monoklonální protilátky a nanoprotilátky zacílené na FP a jejich aplikace. Ačkoli protilátky jsou cennými nástroji pro zobrazování biologických složek v imobilizovaných buňkách, použití tradičních protilátek v živých buňkách je omezeno neefektivním skládáním a sestavováním jejich variabilních těžkých a lehkých řetězců. Přímá mikroinjekce protilátek je primární metodou používanou v intracelulárních aplikacích protilátek, což je technicky náročné a zatěžující buňky. Jednodoménové protilátky pocházející z velblouda nebo žraloka rozpoznávají antigeny prostřednictvím svých variabilních domén těžkých řetězců. Tyto malé a stabilní nanoprotilátky mohou být exprimovány a funkční v živých buňkách. Proto generování nanoprotilátek zaměřujících se na FP je učiní cennějšími v biologickém výzkumu.

Reference

1. Muyldermans, S. Nanobodies: Natural Single-Domain Antibodies. Annu. Biochem. 2013, 82, 775–797. [CrossRef] [PubMed]

2. Helma, J.; Cardoso, MC; Muyldermans, S.; Leonhardt, H. Nanobodies a rekombinantní pojiva v buněčné biologii. J. Cell Biol. 2015, 209, 633–644. [CrossRef] [PubMed]

3. Ashour, J.; Schmidt, FI; Hanke, L.; Cragnolini, J.; Cavallari, M.; Altenburg, A.; Brewer, R.; Ingram, J.; švec, C.; Ploegh, HL Intracelulární exprese jednodoménových protilátek velbloudovitých specifických pro nukleoprotein viru chřipky odhaluje charakteristické rysy jeho jaderné lokalizace. J. Virol. 2015, 89, 2792–2800. [CrossRef] [PubMed]

4. Manglik, A.; Kobilka, BK; Steyaert, J. Nanobody to Study G Protein-Coupled Receptor Structure and Function. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 2017, 57, 19–37. [CrossRef]

5. Harmansa, S.; Hamaratoglu, F.; Affolter, M.; Caussinus, E. Šíření Dpp je vyžadováno pro mediální růst, ale ne pro růst disku na bočním křídle. Příroda 2015, 527, 317–322. [CrossRef]

6. Yamagata, M.; Sanes, JR Reporter – fúze nanobody (RANbody) jako všestranná, malá, citlivá imunohistochemická činidla. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 2018, 115, 2126–2131. [CrossRef]

7. Ariotti, N.; Hall, TE; Rae, J.; Ferguson, C.; McMahon, K.-A.; Martel, N.; Webb, RE; Webb, RI; Teasdale, RD; Parton, RG Modulární detekce GFP-značených proteinů pro rychlý screening elektronovou mikroskopií v buňkách a organismech. Dev. Buňka 2015, 35, 513–525. [CrossRef]

8. Früholz, S.; Fäßler, F.; Kolukisaoglu, Ü.; Pimpl, P. Uzamčení VSR spouštěné nanobody odhaluje opětovné načtení ligandu v Golgi. Nat. Commun. 2018, 9, 643. [CrossRef]

9. Prole, DL; Taylor, CW Geneticky kódovaná sada funkcionalizovaných nanoprotilátek proti fluorescenčním proteinům pro vizualizaci a manipulaci s intracelulární signalizací. BMC Biol. 2019, 17, 41. [CrossRef]

10. Shimomura, O.; Johnson, FH; Saiga, Y. Extrakce, čištění a vlastnosti ekvorinu, bioluminiscenčního proteinu ze světelného hydromedusanu, Aequorea. J. Cell. Comp. Physiol. 1962, 59, 223–239. [CrossRef]

11. Prasher, D.; McCann, RO; Cormier, MJ Klonování a exprese cDNA kódující ekvorin, bioluminiscenční protein vázající vápník. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985, 126, 1259–1268. [CrossRef]

12. Heim, R.; Prasher, DC; Tsien, RY Mutace vlnové délky a posttranslační autooxidace zeleného fluorescenčního proteinu. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 1994, 91, 12501–12504. [CrossRef]

13. Matz, M.; Fradkov, AF; Labas, YA; Savitsky, A.; Zaraský, AG; Markelov, ML; Lukyanov, SA Fluorescenční proteiny z nebioluminiscenčních druhů Anthozoa. Nat. Biotechnol. 1999, 17, 969-973. [CrossRef]

14. Park, N.; Song, J.; Jeong, S.; Tran, TT; Ko, HW; Kim, EY Kináza 3 související s vakcinií (VRK3) nastavuje cirkadiánní periodu a amplitudu ovlivněním subcelulární lokalizace hodinových proteinů v savčích buňkách. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2017, 487, 320–326. [CrossRef]

15. Zhao, D.; Xue, C.; Lin, S.; Shi, S.; Li, Q.; Liu, M.; Cai, X.; Lin, Y. Notch Signaling Pathway reguluje angiogenezi prostřednictvím endoteliálních buněk v 3D modelu společné kultury. J. Cell. Physiol. 2016, 232, 1548–1558. [CrossRef]

16. Rodriguez, EA; Campbell, RE; Lin, JY; Lin, MZ; Miyawaki, A.; Palmer, AE; Shu, X.; Zhang, J.; Tsien, RY The Growing and Glowing Toolbox of Fluorescent and Photoactive Proteins. Trends Biochem. Sci. 2017, 42, 111–129. [CrossRef]

17. Yang, F.; Moss, LG; Phillips, GN, Jr. Molekulární struktura zeleného fluorescenčního proteinu. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 1246–1251. [CrossRef]

18. Ormö, M.; Cubitt, AB; Kallio, K.; Gross, LA; Tsien, RY; Remington, SJ Krystalová struktura zeleného fluorescenčního proteinu Aequorea victoria. Science 1996, 273, 1392–1395. [CrossRef]

19. Reid, BG; Flynn, GC Chromophore Formation in Green Fluorescent Protein. Biochemistry 1997, 36, 6786–6791. [CrossRef]

20. Zhang, G.; Gurtu, V.; Kain, SR Vylepšený zelený fluorescenční protein umožňuje citlivou detekci přenosu genů v savčích buňkách. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996, 227, 707-711. [CrossRef]

21. Pédelacq, J.-D.; Cabantous, S.; Tran, T.; Terwilliger, T.; Waldo, GS Inženýrství a charakterizace superfolderu zeleného fluorescenčního proteinu. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 79–88. [CrossRef] [PubMed]

22. Crameri, A.; Whitehorn, EA; Tate, E.; Stemmer, WP vylepšený zelený fluorescenční protein molekulární evolucí pomocí míchání DNA. Nat. Biotechnol. 1996, 14, 315–319. [CrossRef] [PubMed]

23. Miura, H.; Inoko, H.; Inoue, I.; Tanaka, M.; Sato, M.; Ohtsuka, M. Jednoduchá klonovací strategie využívající gen GFPuv jako pozitivní/negativní indikátor. Anální. Biochem. 2011, 416, 237–239. [CrossRef] [PubMed]

24. Mena, MA; Treynor, TP; Mayo, SL; Daugherty, PS Blue fluorescenční proteiny se zvýšenou jasností a fotostabilitou ze strukturně cílené knihovny. Nat. Biotechnol. 2006, 24, 1569–1571. [CrossRef] [PubMed]

25. Ai, H.; Shaner, N.; Cheng, Z.; Tsien, RY; Campbell, RE Průzkum nových chromoforových struktur vede k identifikaci vylepšených modrých fluorescenčních proteinů. Biochemie 2007, 46, 5904–5910. [CrossRef]

26. Subach, OM; Gundorov, IS; Yoshimura, M.; Subach, FV; Zhang, J.; Grüenwald, D.; Souslová, EA; Chudakov, DM; Verkhusha, VV Přeměna červeného fluorescenčního proteinu na jasně modrou sondu. Chem. Biol. 2008, 15, 1116–1124. [CrossRef]

27. Merzlyak, E.; Goedhart, J.; Shcherbo, D.; Bulina, ME; Shcheglov, AS; Fradkov, AF; Gaintzeva, A.; Lukyanov, K.; Lukyanov, S.; Gadella, T.; a kol. Jasně monomerní červený fluorescenční protein s prodlouženou životností fluorescence. Nat. Metody 2007, 4, 555–557. [CrossRef]

28. Cubitt, AB; Heim, R.; Adams, SR; Boyd, AE; Gross, LA; Tsien, RY Pochopení, zlepšení a použití zelených fluorescenčních proteinů. Trends Biochem. Sci. 1995, 20, 448–455. [CrossRef]

29. Tomosugi, W.; Matsuda, T.; Tani, T.; Nemoto, T.; Kotera, I.; Saito, K.; Horikawa, K.; Nagai, T. Ultramarínový fluorescenční protein se zvýšenou fotostabilitou a necitlivostí na pH. Nat. Metody 2009, 6, 351–353. [CrossRef]

30. Goedhart, J.; van Weeren, L.; Hink, MA; Vischer, NOE; Jalink, K.; Gadella, TWJ Jasně azurové fluorescenční proteinové varianty identifikované fluorescenčním celoživotním screeningem. Nat. Metody 2010, 7, 137–139. [CrossRef]

31. den, RN; Davidson, MW Fluorescenční proteinová paleta: Nástroje pro zobrazování buněk. Chem. Soc. Rev. 2009, 38, 2887–2921. [CrossRef]

32. Griesbeck, O.; Baird, GS; Campbell, RE; Zacharias, DA; Tsien, RY Snížení environmentální citlivosti žlutého fluorescenčního proteinu. J. Biol. Chem. 2001, 276, 29188–29194. [CrossRef]

33. Nagai, T.; Ibata, K.; Park, ES; Kubota, M.; Mikoshiba, K.; Miyawaki, A. Varianta žlutého fluorescenčního proteinu s rychlým a účinným zráním pro buněčné biologické aplikace. Nat. Biotechnol. 2002, 20, 87–90. [CrossRef]

34. Shaner, NC; Campbell, RE; Steinbach, PA; Giepmans, BN; Palmer, AE; Tsien, RY Vylepšené monomerní červené, oranžové a žluté fluorescenční proteiny odvozené z Discosoma sp. červený fluorescenční protein. Nat. Biotechnol. 2004, 22, 1567–1572. [CrossRef]

35. Shcherbo, D.; Merzlyak, EM; Chepurnykh, TV; Fradkov, AF; Ermáková, GV; Solovieva, EA; Lukyanov, KA; Bogdanova, EA; Zaraský, AG; Lukyanov, S.; a kol. Jasně červený fluorescenční protein pro zobrazení celého těla. Nat. Metody 2007, 4, 741–746. [CrossRef]

36. Shcherbo, D.; Murphy, CS; Ermáková, GV; Solovieva, EA; Chepurnykh, TV; Shcheglov, AS; Verkhusha, V.; Pletněv, VZ; Hazelwood, KL; Roche, PM; a kol. Far-červené fluorescenční značky pro zobrazování proteinů v živých tkáních. Biochem. J. 2009, 418, 567–574. [CrossRef]

37. Oliinyk, OS; Černov, KG; Verkhusha, VV Bakteriální fytochromy, cyanobakteriochromy a alofykokyany jako zdroj blízkých infračervených fluorescenčních sond. Int. J. Mol. Sci. 2017, 18, 1691. [CrossRef]

38. Shu, X.; Royant, A.; Lin, MZ; Aguilera, TA; Lev-Ram, V.; Steinbach, PA; Tsien, RY Savčí exprese infračervených fluorescenčních proteinů vytvořených z bakteriálního fytochromu. Science 2009, 324, 804–807. [CrossRef]

39. Yu, D.; Gustafson, WC; Han, C.; Lafaye, C.; Noirclerc-Savoye, M.; Ge, W.-P.; Thayer, DA; Huang, H.; Kornberg, TB; Royant, A.; a kol. Vylepšený monomerní infračervený fluorescenční protein pro zobrazování neuronů a nádorů mozku. Nat. Commun. 2014, 5, 3626. [CrossRef]

40. Yu, D.; Baird, MA; Allen, JR; Howe, ES; Klassen, poslanec; Reade, A.; Makhijani, K.; Song, Y.; Liu, S.; Murthy, Z.; a kol. Přirozeně monomerní infračervený fluorescenční protein pro značení proteinů in vivo. Nat. Metody 2015, 12, 763–765. [CrossRef]

41. Shcherbakova, DM; Balaban, M.; Emeljanov, AV; Brenowitz, M.; Guo, P.; Verkhusha, VV Jasné monomerní blízké infračervené fluorescenční proteiny jako značky a biosenzory pro víceúrovňové zobrazování. Nat. Commun. 2016, 7, 12405. [CrossRef] [PubMed]

42. Rodriguez, EA; Tran, GN; Gross, LA; Crisp, JL; Shu, X.; Lin, JY; Tsien, RY Dalekočervený fluorescenční protein se vyvinul z fykobiliproteinu sinic. Nat. Metody 2016, 13, 763–769. [CrossRef] [PubMed]

43. Oliinyk, OS; Shemetov, AA; Pletnev, S.; Shcherbakova, DM; Verkhusha, VV Nejmenší blízký infračervený fluorescenční protein se vyvinul z cyanobakteriochromu jako univerzální značka pro spektrální multiplexování. Nat. Commun. 2019, 10, 279. [CrossRef]

44. Oliinyk, OS; Balaban, M.; Clark, CL; Carey, E.; Pletnev, S.; Nimmerjahn, A.; Verkhusha, VV Jednodoménový blízký infračervený protein poskytuje lešení pro fluorescenční nanobody závislé na antigenu. Nat. Metody 2022, 19, 740–750. [CrossRef] [PubMed]

45. Tiller, KE; Tessier, PM Pokroky v designu protilátek. Annu. Rev. Biomed. Ing. 2015, 17, 191–216. [CrossRef]

46. ​​Gengyo-Ando, ​​K.; Mitani, S. 1020 Výroba a charakterizace monoklonální protilátky proti zelenému fluorescenčnímu proteinu (GFP). Neurosci. Res. 1997, 28, S122. [CrossRef]

47. Zhuang, R.; Zhang, Y.; Zhang, R.; Song, C.; Yang, K.; Yang, A.; Jin, B. Purifikace GFP fúzních proteinů s vysokou čistotou a výtěžkem pomocí afinitní kolonové chromatografie s monoklonální protilátkou. Protein Expr. Purif. 2008, 59, 138–143. [CrossRef]

48. Ward, ES; Güssow, D.; Griffiths, AD; Jones, PT; Winter, G. Vazebné aktivity repertoáru jednotlivých variabilních domén imunoglobulinu sekretovaných z Escherichia coli. Příroda 1989, 341, 544–546. [CrossRef]

49. Hamers-Casterman, C.; Atarhouch, T.; Muyldermans, S.; Robinson, G.; Hammers, C.; Songa, EB; Bendahman, N.; Hammers, R. Přirozeně se vyskytující protilátky bez lehkých řetězců. Příroda 1993, 363, 446–448. [CrossRef]

50. Greenberg, AS; Avila, D.; Hughes, M.; Hughes, A.; McKinney, EC; Flajnik, MF Nová genová rodina antigenního receptoru, která prochází přeskupením a rozsáhlou somatickou diverzifikací u žraloků. Nat. Cell Biol. 1995, 374, 168–173. [CrossRef]

51. De Meyer, T.; Muyldermans, S.; Depicker, A. Produkty založené na nanobody jako výzkumné a diagnostické nástroje. Trends Biotechnol. 2014, 32, 263–270. [CrossRef]

52. Skerra, A. Alternativní neprotilátkové skafoldy pro molekulární rozpoznávání. Curr. Opin. Biotechnol. 2007, 18, 295–304. [CrossRef]

53. Muyldermans, S.; Baral, T.; Retamozzo, VC; De Baetselier, P.; De Genst, E.; Kinne, J.; Leonhardt, H.; Magez, S.; Nguyen, V.; Revets, H.; a kol. Technologie velbloudích imunoglobulinů a nanobody. Veter. Immunol. Imunopathol. 2009, 128, 178–183. [CrossRef]

54. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Tillib, S.; Nowak, D.; Schermelleh, L.; Gahl, A.; Backmann, N.; Conrath, K.; Muyldermans, S.; Cardoso, MC; a kol. Cílení a sledování antigenů v živých buňkách s fluorescenčními nanobody. Nat. Methods 2006, 3, 887–889. [CrossRef]

55. Kubala, MH; Kovtun, O.; Alexandrov, K.; Collins, BM Strukturální a termodynamická analýza GFP: komplex GFP-nanobody. Protein Sci. 2010, 19, 2389–2401. [CrossRef]

56. Fang, Z.; Cao, D.; Qiu, J. Vývoj a výroba nanoprotilátek specificky proti proteinu zelené fluorescence. Appl. Microbiol. Biotechnol. 2020, 104, 4837–4848. [CrossRef]

57. Kirchhofer, A.; Helma, J.; Schmidthals, K.; Frauer, C.; Cui, S.; Karcher, A.; Pellis, M.; Muyldermans, S.; Casas-Delucchi, CS; Cardoso, MC; a kol. Modulace vlastností proteinů v živých buňkách pomocí nanoprotilátek. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2009, 17, 133–138. [CrossRef]

58. Rothbauer, U.; Zolghadr, K.; Muyldermans, S.; Schepers, A.; Cardoso, MC; Leonhardt, H. Všestranná nanotrap pro biochemické a funkční studie s fluorescenčními fúzními proteiny. Mol. Buňka. Proteom. 2008, 7, 282–289. [CrossRef]

59. Fridy, P.; Li, Y.; Keegan, S.; Thompson, MK; Nudelman, I.; Scheid, JF; Oeffinger, M.; Nussenzweig, MC; Fenyö, D.; Chait, BT; a kol. Robustní potrubí pro rychlou produkci všestranných repertoárů nanobody. Nat. Metody 2014, 11, 1253–1260. [CrossRef]

60. Zhang, Z.; Wang, Y.; Ding, Y.; Hattori, M. Strukturální inženýrství anti-GFP nanobody tandemů jako ultra-vysokoafinitních činidel pro purifikaci. Sci. Rep. 2020, 10, 6239. [CrossRef]

61. Twair, A.; Al-Okla, S.; Zarkawi, M.; Abbady, AQ Charakterizace velbloudích nanoprotilátek specifických pro superfolder GFP fúzní proteiny. Mol. Biol. Rep. 2014, 41, 6887–6898. [CrossRef] [PubMed]

62. Zhong, P.; Wang, Z.; Cheng, S.; Zhang, Y.; Jiang, H.; Liu, R.; Ding, Y. Strukturální pohledy na dvě odlišné nanobody rozpoznávající stejný epitop zeleného fluorescenčního proteinu. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2021, 565, 57–63. [CrossRef] [PubMed]

63. Zhou, X.; Hao, R.; Chen, C.; Su, Z.; Zhao, L.; Luo, Z.; Xie, W. Rychlé dodání nanoprotilátek/VHH do živých buněk prostřednictvím exprese in vitro transkribované mRNA. Mol. Ther.-Methods Clin. Dev. 2020, 17, 401–408. [CrossRef] [PubMed]

64. Wei, L.; Wang, M.; Xiang, H.; Jiang, Y.; Gong, J.; Su, D.; Al Azad, MAR; Dong, H.; Feng, L.; Wu, J.; a kol. Bambusový žralok jako model malého zvířete pro produkci jednodoménové protilátky. Přední. Bioeng. Biotechnol. 2021, 9, 792111. [CrossRef]

65. Li, S.; Shan, H.; Wang, T.; Zheng, X.; Shi, M.; Chen, B.; Lu, H.; Zhang, Y.; Zhao, S.; Hua, Z. Generation of mWasabi fluorescent protein-binding nanobody. Anální. Biochem. 2020, 608, 113875. [CrossRef]

66. Ries, J.; Kaplan, C.; Platoňová, E.; Eghlidi, HM; Ewers, H. Jednoduchá, všestranná metoda pro mikroskopii s vysokým rozlišením na bázi GFP prostřednictvím nanobodies. Nat. Metody 2012, 9, 582–584. [CrossRef]

67. Beghein, E.; Gettemans, J. Technologie nanobody: Všestranná sada nástrojů pro mikroskopické zobrazování, analýzu interakce protein–protein a zkoumání funkce proteinu. Přední. Immunol. 2017, 8, 771. [CrossRef]

68. Platoňová, E.; Winterflood, CM; Junemann, A.; Albrecht, D.; Faix, J.; Ewers, H. Jednomolekulární mikroskopie molekul značených deriváty GFP nebo RFP v savčích buňkách pomocí pojiv nanobody. Metody 2015, 88, 89–97. [CrossRef]

69. Herce, HD; Schumacher, D.; Schneider, AF; Ludwig, AK; Mann, FA; Fillies, M.; Kasper, M.-A.; Reinke, S.; Krause, E.; Leonhardt, H.; a kol. Nanobody propustné pro buňky pro cílené imunoznačení a manipulaci s antigeny v živých buňkách. Nat. Chem. 2017, 9, 762–771. [CrossRef]

70. Payne, NC; Mazitschek, R. Tiny Titans: Nanobody as Powerful Tools for TR-FRET Assay Development. Anální. Sens. 2022, 2, e202200020. [CrossRef]

71. Wendel, S.; Fischer, EC; Martínez, V.; Seppälä, S.; Nørholm, MHH Nanobody: GFP bakteriální platforma, která umožňuje funkční enzymové zobrazení a snadnou kvantifikaci zobrazovací kapacity. Microb. Cell Factory 2016, 15, 71. [CrossRef]

72. Seitz, KJ; Nanobody Rizzoli, SO GFP odhalují nedávno exocytované molekuly pHluorinu. Sci. Rep. 2019, 9, 7773. [CrossRef]

73. Caussinus, E.; Kanča, O.; Affolter, M. Knokaut fluorescenčního fúzního proteinu zprostředkovaný anti-GFP nanobody. Nat. Struktura. Mol. Biol. 2011, 19, 117–121. [CrossRef]

74. Shin, YJ; Park, SK; Jung, YJ; Na Kim, Y.; Kim, KS; Park, OK; Kwon, S.-H.; Jeon, SH; Trinh, LA; Fraser, S.; a kol. Komplex E3-ubikvitin ligázy cílený na nanobody degraduje jaderné proteiny. Sci. Rep. 2015, 5, 14269. [CrossRef]

75. Baudisch, B.; Pfort, I.; Sorge, E.; Conrad, U. Specifická degradace proteinů řízená nanobody 26S-proteazomem v rostlinách. Přední. Plant Sci. 2018, 9, 130. [CrossRef]

76. Croucher, DR; Iconomou, M.; Hastings, JF; Kennedy, SP; Han, JZR; Shearer, RF; McKenna, J.; Wan, A.; Lau, J.; Aparicio, S.; a kol. Bimolekulární komplementační afinitní purifikace (BiCAP) odhaluje dimerově specifické proteinové interakce pro ERBB2 dimery. Sci. Signál. 2016, 9, 436. [CrossRef]

77. Tang, JC; Szikra, T.; Kozorovitskiy, Y.; Teixeira, M.; Sabatini, BL; Roska, B.; Cepko, CL Systém založený na nanobody využívající fluorescenční proteiny jako lešení pro manipulaci s geny specifickou pro buňky. Cell 2013, 154, 928–939. [CrossRef]

78. Sommese, RF; Hariadi, RF; Kim, K.; Liu, M.; Tyska, MJ; Sivaramakrishnan, S. Vzorování proteinových komplexů na nanostrukturách DNA pomocí nanobody GFP. Protein Sci. 2016, 25, 2089–2094. [CrossRef]