Zkoumání role nového homologu interleukinu-17 z bezobratlých mořských mušlí Mytilus Coruscus ve vrozené imunitní odpovědi: je negativní regulace podle Mc-Novel_miR_145 klíčem?

Abstraktní: Interleukin-17 (IL-17) představuje třídu prozánětlivých cytokinů, které se podílejí na chronických zánětlivých a degenerativních poruchách. Před touto studií se předpokládalo, že IL-17 homolog by mohl být zaměřen na Mc-novel_miR_145, aby se podílel na imunitní odpovědi Mytilus coruscus. Tato studie využívala různé výzkumné metody molekulární a buněčné biologie, aby prozkoumala souvislost mezi Mc-novel_miR_145 a IL-17 homologem a jejich imunomodulačními účinky. Bioinformatická předpověď potvrdila příslušnost IL-17 homologu k rodině mušlí IL-17, následovaly kvantitativní testy PCR v reálném čase (qPCR), aby se prokázalo, že McIL-17-3 byl vysoce exprimován v imunitně asociované tkáně a reagovaly na bakteriální výzvy. Výsledky z luciferázových reportérových testů potvrdily potenciál McIL{15}} aktivovat downstream NF-κb a jeho cílení pomocí Mc-novel_miR_145 v buňkách HEK293. Studie také vytvořila antisérum McIL{21}} a zjistila, že Mc-novel_miR_145 negativně reguluje McIL-17-3 prostřednictvím testů western blotting a qPCR. Kromě toho analýza průtokovou cytometrií ukázala, že Mc-novel_miR_145 negativně reguloval McIL-17-3, aby zmírnil apoptózu indukovanou LPS. Souhrnně současné výsledky ukázaly, že McIL-17-3 hrál důležitou roli v imunitní obraně měkkýšů proti bakteriálnímu útoku. Kromě toho byl McIL- 17-3 negativně regulován Mc-novel_miR_145, aby se účastnil apoptózy indukované LPS. Naše zjištění poskytují nový pohled na regulaci nekódující RNA v modelech bezobratlých.

cistanche výhody pro muže-posilují imunitní systém

Klíčová slova: Mytilus kuskus; interleukin-17; mikroRNA; apoptóza; imunita

1. Úvod

Imunitní systém hraje zásadní roli v obraně organismu proti invazi exogenních patogenů. Obvykle se obranný systém dělí na vrozenou imunitu a získanou imunitu. Vrozená imunita představuje první obrannou linii organismu proti patogenům, která dokáže detekovat invazi patogenů a částečně je eliminovat [1]. Vrozená imunita je zprostředkována velkým množstvím buněk, včetně přirozených zabíječských buněk, monocytů, neutrofilů, eozinofilů, bazofilů a cirkulujících dendritických buněk, které jsou souhrnně známé jako vrozené imunitní buňky. Tyto buňky uvolňují velké množství cytokinů, které se účastní buněčné komunikace a pomáhají tak koordinovat imunitní reakce [2]. V případě infekce a zánětu fungují cytokiny jako modulátory: některé cytokiny onemocnění zhoršují (prozánětlivé), jiné podporují zdraví (protizánětlivě) [3]. Cytokiny podléhají vysokým úrovním evolučního tlaku, a proto vykazují sekvenční diverzifikaci [4], zatímco rodina cytokinů IL-17 vykazuje vysokou konzervaci, která se projevuje záhybem cysteinového uzlu ve funkční architektuře vytvořeným prostřednictvím interakcí mezi čtyřmi konzervované cysteinové zbytky [5]. Nedávné studie prokázaly, že IL-17 je třída prozánětlivých cytokinů účastnících se chronických zánětlivých a degenerativních poruch [6]. IL{10}} fungují tak, že se specificky vážou na receptory a podporují rozvoj zánětu, imunitní odmítnutí a krvetvorbu. Rodina cytokinů IL-17 u lidí se skládá ze šesti členů (IL-17A až IL-17F), které jsou produkovány aktivovanými T lymfocyty a dalšími vrozenými buněčnými populacemi v reakci na IL -1 a IL-23 [7,8]. Rostoucí množství důkazů však naznačuje, že rodina IL-17 zaznamenala výrazné rozšíření mořských měkkýšů a druhů ostnokožců. V genomu ježovky nachové Strongylocentrotus purpuratus bylo detekováno asi 30 genů IL-17 [9]. Podobně bylo u kolooidních hlavonožců nalezeno 31 chobotnicových IL-17-genů, přičemž 27 genů má mohutnou expresi v přísavkách a kůži [10]. Saco a kol. [11] získali 379 unikátních IL-17 sekvencí z 15 resekvenovaných genomů mušlí a referenčního genomu M. galloprovincialis [12] a rozdělili je do 23 izoforem pomocí fylogenetické analýzy. Dále zjistili, že izoformy IL-17 z druhů Mytilidae byly zachovány mezi jedinci a sdíleny mezi blízce příbuznými druhy. Kromě druhů Mytilidae byly velké rodiny IL-17 nalezeny také u jiných druhů měkkýšů, včetně Crassostrea gigas, Mizuhopecten yessoensis a Pinctada fucata martensii [13]. Mořská voda se hemží patogeny a mořští měkkýši jsou s nimi v neustálém kontaktu, a proto je zapotřebí silný arzenál imunitních molekul, a proto expanze rodiny IL-17 dává těmto zvířatům účinnější imunitní reakce.

Několik studií naznačovalo významnou roli, kterou IL-17 hrají ve vrozené imunitě měkkýšů. Výzkum například zjistil, že po infekci Vibrio harveyi byla hladina mRNA IL-17D výrazně zvýšena u Tegillarca granulosa [14], zatímco u C. gigas vykazoval CgIL17-5 zřetelná reakce na Vibrio splendidus [15]. Kromě toho se ukázalo, že IL-17 měkkýšů reagují na mnoho molekulárních vzorů spojených s patogeny (PAMP), jako je lipopolysacharid (LPS), polyinosin: kyselina polycytidylová (polyI: C) a peptidoglykan (PGN). LPS je hlavní složkou vnější stěny buněčných stěn gramnegativních bakterií a představuje jeden z nejčastěji používaných stimulantů imunity. Na druhou stranu polyI:C je dvouvláknový analog RNA, který se často používá jako simulátor viru ve vědeckém výzkumu. Po stimulaci LPS byla transkripční exprese genů rodiny IL-17 rychle spuštěna v ústřici tichomořské C. gigas a perlorodce P. fucata [16,17]. Také u perlorodek bylo zjištěno, že PfIL-17 se účastní imunitní odpovědi na stimulaci polyI:C [17].

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Duální luciferázový test navíc ukázal, že PfIL-17 byl schopen aktivovat cílové geny obratlovců obsahující vazebná místa NF-kB a účastnit se signální dráhy NF-kB v buňkách HEK293 [17]. PGN je přítomen v buněčné stěně grampozitivních bakterií a často se používá jako napodobenina grampozitivních bakterií. Bylo prokázáno, že rekombinantní C. gigas IL17-5 má silnou afinitu k PGN, která nebyla nikdy popsána u interleukinů obratlovců [18]. Tyto studie poskytly předehru k odhalení imunomodulační funkce IL-17 u měkkýšů. Jako třída prozánětlivých cytokinů může nadměrná exprese IL-17 vyvolat vážné poškození buněk. Organismy vyvinuly různé mechanismy pro kontrolu nadměrné reakce IL-17, z nichž mikroRNA (miRNA) představují nejúčinnější a dobře prostudovanou třídu nekódujících RNA. MiRNA jsou rodinou krátkých RNA o délce asi 22 nt, které mohou regulovat expresi cílových genů translační represí nebo degradací mRNA [19]. Současný výzkum regulace IL{17}}s pomocí miRNA se zaměřuje především na jejich synergické účinky u lidských autoimunitních onemocnění, jako je roztroušená skleróza, revmatoidní artritida, lupénka a další [20]. Technika vývoje vysoce výkonného sekvenování a biologických výpočtů umožňuje skenovat miRNA měkkýšů na genomické úrovni a velké množství konzervovaných a nových miRNA bylo identifikováno z druhů měkkýšů, jako je plochá ústřice Ostrea edulis, ústřice tichomořská C. gigas , Lymnaea stagnalis, slávka M. galloprovincialis aj. [21–29]. Tyto studie poskytují základní data a velkou podporu pro funkční interpretaci miRNA u měkkýšů. Pokud jde o imunoregulační roli určitých miRNA u měkkýšů, Tian, ​​et al. [30] zjistili, že Pm-miR-29a může pozitivně regulovat IL-17 u Pinctada martensii; po nadměrné expresi Pm-miR-29a byla exprese IL-17 v plášti a žábrách tohoto druhu up-regulována. U C. gigas cgi-miR-2d zvýšil fagocytózu ústřic negativní regulací CgIκB2 [31] a negativní regulací exprese genu podobného cholinovému transportéru v časném stadiu infekce, který se podílel na sofistikované imunomodulaci [32].

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

Kliknutím sem zobrazíte produkty Cistanche Enhance Immunity

【Požádejte o více】 E-mail:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

Během desikace bylo zjištěno, že cgi-miR-365 je indukován noradrenalinem a přímo podporuje expresi CgHSP90AA1 [33]. Nedávné studie ukázaly, že miRNA scaffold659_26519 cílí na kalmodulin, aby reguloval expresi IL-17 v rané fázi imunitní odpovědi C. gigas [34]. Kromě toho byly specifické funkce určitých miRNA popsány u jiných bezobratlých, jako je mořská okurka Apostichopus japonicus [35–39] a kreveta Litopenaeus vannamei [40]. Tyto studie otevřely závoj pro základní mechanismy miRNA u bezobratlých a také poskytly technické a metodologické odkazy pro náš současný výzkum. V naší předchozí studii bylo biologicky vypočítáno 26 miRNA a 667 genů M. coruscus pro diferenciální expresi po expozici Vibrio alginolyticus, z nichž Mcnovel_miR_145 může cílit na homolog IL-17 a zapojit se do imunitní odpovědi na bakteriální infekci [41]. Cílem této studie je identifikovat gen IL-17 a prozkoumat jeho potenciální roli ve vrozené imunitě a jeho regulaci pomocí miRNA Mcnovel_miR_145 v M. coruscus. Prostřednictvím této studie se snažíme lépe porozumět mechanismům imunitní reakce měkkýšů a objasnit molekulární základ jejich imunitní obrany proti patogenům. Tento výzkum může také poskytnout pohled na regulaci nekódující RNA v modelech bezobratlých.

2. Výsledky

2.1. Charakteristika McIL-17-3

McIL-17-3 cDNA sekvence obsahující kompletní ORF, 30 -UTR a částečné 50 - UTR byla in silico klonována z transkriptomu plné délky M. coruscus (přístupové číslo: PRJNA798880, F{ {5}}přepis_12404). McIL-17-3 obsahuje oblast ORF o velikosti 585 bp kódující 194 aminokyselin. Předpokládaná molekulová hmotnost je 21,77 kDa a izoelektrický bod je 5,21. SMART analýza odhalila typickou IL-17 doménu v tomto proteinu (obrázek 1A). Fylogenetický strom byl zkonstruován rekrutováním IL-17 členů obratlovců a druhů Mytilidae a IL2 byly použity jako vnější skupina. Jak je znázorněno na obrázku 1B, tyto IL-17 jsou shromážděny do konkrétní větve, aby se odlišily od IL-2. Uvnitř shluku IL-17 byly ukázány dva zjevné klade, jeden složený z IL-17 obratlovců a druhý složený z IL-17 mušlí. Ve skupině mušlí IL-17 se McIL-17-3 nejprve shlukl s odpovídající molekulou z jiného druhu Mytilus, M. galloprovincialis (obrázek 1B).

2.2. Predikce vícenásobného zarovnání a terciární struktury

Jádro McIL-17-3 se skládá ze dvou párů antiparalelních vláken; jeden pár obsahuje vlákna 1 (zbytky 52–58) a 2 (zbytky 66–72 a 77–79), zatímco druhý obsahuje vlákna 3 (zbytky 89–103) a 4 (zbytky 110–125) (obrázek 2B, C) . Dva disulfidové můstky (Cys97/Cys134 a Cys125/Cys169) spojují vlákna 1 a 3, 2 a 4 (obrázek 2A, C). V souladu s těmito dvěma disulfidickými můstky mezi řetězci 1 a 3, 2 a 4 mají i další IL-17 měkkýšů (obrázek 2A, C). Je pozoruhodné, že ačkoli IL-17 obratlovců mají také dva disulfidové můstky, existují mezi 2 a 4 (obrázek 2A, C).

2.3. Transkripční vyjádření McIL-17-3

Profil tkáňové distribuce McIL{{0}} transkriptů byl hodnocen pomocí qPCR. Transkripty McIL-17-3 byly exprimovány ve všech testovaných tkáních a hladiny exprese v hemocytech a žábrách byly významně vyšší než hladiny v adduktorech (obrázek 3A). Byla také hodnocena časová exprese hemocytových McIL-17-3 transkriptů v reakci na provokační dávku V. alginolyticus. Hladina mRNA McIL-17-3 byla významně zvýšena při 3 a 12 HPC (3.13- nebo 4{11}}násobné zvýšení ve srovnání s 0 HPC, v tomto pořadí), ale nedošlo k žádné zřejmá časová pravidelnost obecně (obrázek 3B).

Obrázek 1. Molekulární charakterizace McIL-17-3. (A) Analýza architektury konzervovaných domén v McIL-17-3 pomocí SMART. Byla zobrazena konzervovaná doména IL-17. (B) Fylogenetická analýza McIL-17-3. Fylogenetický strom byl zkonstruován pomocí softwaru MEGAX s 2000 replikacemi bootstrappingu pomocí metody sousedského spojení. McIL-17-3 byl označen zeleným trojúhelníkem. Všechny druhy zahrnuté ve fylogenetickém stromu byly získány z databáze Genebank a ve stromu byla také uvedena přírůstková čísla. Zelený trojúhelník jménem McIL-17-3. (Pro výklad odkazů na barvu v této legendě obrázku se čtenář odkazuje na webovou verzi tohoto článku.)

2.4. Aktivace downstreamu od McIL-17-3

Jak je znázorněno na obrázku 4, rekombinantní McIL-17-3 zvyšoval luciferázovou aktivitu pGLNF-KB-luc způsobem závislým na dávce. Při 0,5 a 1.0 µg/jamku se luciferázová aktivita pGLNF-κB-luc zvýšila 2.{12}} a 11{14}}krát, v tomto pořadí.

2.5. Potvrzení McIL-17-3 jako cílového genu Mc-novel_miR_145

Prostřednictvím bioinformatické predikce obsahuje gen McIL{{0}} standardní cílovou sekvenci pro Mc-novel_miR_145 ve své 30 UTR (obrázek 5A). Napodobenina Mc-novel_miR_145 a inhibitor byly kotransfekovány reportérovým plazmidem McIL{11}} divokého typu UTR do buněk HEK293, aby se potvrdila jejich korelace. Jak je znázorněno na obrázku 5B, mimic Mc-novel_miR_145 může inhibovat luciferázovou aktivitu McIL-17-3-30 UTR-WT (0.{{2{{58} }}}násobný pokles ve srovnání s kontrolou), zatímco inhibitor Mc-novel_miR_145 pozoruhodně zmírňuje účinky (1.64-násobný nárůst ve srovnání s Mc-novel_ miR_145 mimic jako pouze přidaná skupina). Abychom vyhodnotili, zda Mc-novel{{30}}miR_145 přímo cílí na gen McIL-17-3 prostřednictvím cílového místa v 30 UTR, zkonstruovali jsme mutantní verzi luciferázových reportérových plazmidů. která zmutovala Mc-novel_miR_145 zaměřovací sekvence v McIL-17-3 30 UTR. Jak je znázorněno na obrázku 5C, mimika Mc-novel_miR_145 významně snížila luciferázovou aktivitu buněk transfekovaných McIL-17-3-30 UTR-WT (0.27-násobně) pokles), zatímco u buněk transfekovaných McIL-17-3-30 UTR-MUT nebyla pozorována žádná změna aktivity luciferázy. Navíc na dávce závislé účinky Mc-novela_miR_145 napodobují inhibici aktivity luciferázy McIL-17-3-30 UTR-WT také 24 hodin po transfekci (0 .71-, 0.{59}} a 0.{61}}násobný pokles ve srovnání s kontrolní skupinou, respektive na obrázku 5D).

Obrázek 2. Vícenásobné zarovnání McIL-17-3 s ostatními členy rodiny IL-17. (A) Aminokyselinová sekvence McIL-17-3 byla porovnána se sekvencí ostatních IL-17 získaných z mušlí a obratlovců, včetně myší a zebřiček. Tyto cysteiny, které tvoří kanonický uzel, byly označeny zeleně, s nahrazenými aminokyselinovými zbytky označenými červeně. Cysteinový uzel je označen barevnými čarami, modrá znamená jejich přítomnost u měkkýšů a červená jejich přítomnost u obratlovců. Poznámka: Pro vizualizaci je zachována pouze druhá polovina zarovnání sekvence. (B) Terciární struktura proteinu McIL-17-3 byla předpovězena pomocí švýcarského modelu a softwaru pyMol. Tyto cysteiny, které tvoří kanonický uzel, byly označeny. (C) Kreslená reprezentace kanonického záhybu cysteinového uzlu. Cysteinové zbytky byly označeny plnými kroužky; ty přítomné v IL-17 proteinech byly žluté, zatímco dva chybějící byly šedé. (Pro výklad odkazů na barvu v této legendě obrázku se čtenář odkazuje na webovou verzi tohoto článku.)

Obrázek 3. Analýza expresního profilu McIL-17-3 transkriptů. (A) Distribuce McIL-17-3 transkriptů v běžných tkáních mušlí. (B) Změny časové exprese McIL-17-3 transkriptů v reakci na výzvu V. alginolyticus. Výsledky byly vyjádřeny jako průměr ± SD (n=3, * p < 0.05, ** p < 0,01). (Pro výklad odkazů na barvu v této legendě obrázku se čtenář odkazuje na webovou verzi tohoto článku.)

Obrázek 4. Aktivace reportéru NF-κB pomocí McIL-17-3. Rekombinantní vektor pEGFP-McIL- 17-3 ve třech koncentracích (0.1, 0.5 a 1.{{10}} µg/jamku) byl kotransfekován do buněk HEK293 pomocí Lipo6000TM po dobu 24 hodin. Relativní luciferázové aktivity byly vypočteny normalizací na hodnotu pRLTK. Experimentální výsledky byly vyjádřeny jako násobky změn porovnáním luciferázových aktivit buněk indukovaných rekombinantním vektorem s aktivitami buněk indukovaných prázdnými vektory při stejné koncentraci. Každá hodnota byla uvedena jako průměr ± SD (n=3) a sloupce se symbolem hvězdičky byly významně odlišné (* p < 0,05, ** p < 0,01).

Obrázek 5. Mc-novel_miR_145 zaměřený na McIL-17-3. (A) Sekvence McIL-17-3 30 UTR byla vložena do vektoru pmiR-RB-Report™, respektive zkonstruovaných plasmidů divokého typu a mutantních plasmidů. Sekvence Mcnovel_miR{10}} a cílové místo McIL{11}} UTR a sekvence mutantního místa byly označeny červenými značkami. (B) Plasmid McIL{12}} UTR-WT byl kotransfekován s mimikem Mc-novel_miR_145 nebo Mc-novel_miR{{2{{37} }}} inhibitor do buněk HEK293. (C) Buňky HEK293 byly transfekovány McIL-17-3-30 UTR-WT nebo mutantním typem McIL-17-3-30 UTR-MUT spolu s Mc-novel_miR_145 nebo NC , po dobu 24 hodin. Aktivita luciferázy byla měřena pomocí duálního luciferázového reportérového testovacího systému. (D) Experimenty s koncentračním gradientem byly provedeny pro transfekci Mc-novel_miR_145. Všechna data jsou prezentována jako průměr ± SD z alespoň tří nezávislých triplikovaných experimentů. **, p < 0,01, *, p < 0,05 oproti kontrolám. (Pro výklad odkazů na barvu v této legendě obrázku se čtenář odkazuje na webovou verzi tohoto článku.)

2.6. Mc-novel_miR_145 negativně reguluje vyjádření McIL-17-3

Hemocyty M. coruscus byly transfekovány mimikem Mc-novel_miR_145, inhibitorem Mcnovel_miR_145 a jejich příslušnými kontrolami a změnami v McIL{{ 5}} exprese byly hodnoceny na transkripční a proteinové úrovni. Jak je znázorněno na obrázku 6A, exprese Mc-novel_miR_145 byla výrazně up-regulována (8.{12}}násobný nárůst) jeho mimikou a down-regulována ({{14 }}.41-násobný pokles) jeho represorem v hemocytech, což naznačuje účinné účinky těchto syntetických sloučenin. Na obrázku 6B byla exprese endogenního McIL-17-3 významně inhibována (0.51-násobný pokles) mimikou Mc-novel_miR_145 na transkripční úrovni a významně indukované (2.42-násobné zvýšení) inhibitorem Mcnovel_miR_145. Abychom prozkoumali účinky Mc-novel_miR_145 na expresi McIL-17-3 na proteinové úrovni, byla vyrobena polyklonální protilátka proti McIL-17-3. Jak je ukázáno v drahách 2 a 3 na obrázku 6C, rekombinantní McIL-17-3 protein byl úspěšně exprimován v E. coli. Specificita protilátky byla zkoumána s proteinem z mušlí z hemocytů pomocí Western blotu. Byl pozorován jeden pás přibližně 22 kDa, který odpovídá molekulové hmotnosti McIL-17-3 (dráha 4 na obrázku 6C). Výsledky Western blotu na obrázku 6D ukázaly negativní regulaci McIL-17-3 na úrovni proteinu pomocí Mc-novel_miR_145.

Fobr. 6. Mc-novel_miR_145 inhiboval expresi McIL-17-3 v hemocytech M. coruscus. (A) Exprese Mc-novel_miR_145 byla hodnocena pomocí qPCR v hemocytech transfekovaných 145 napodobeninami, 145 inhibitory a jejich příslušnou kontrolou. (B) Po transfekci po dobu 24 hodin byly pomocí qPCR stanoveny transkripční hladiny McIL{11}}. (C) Rekombinantní exprese, purifikace a antisérový přípravek pro McIL-17-3. Dráha M, standardní marker molekulové hmotnosti proteinu. Dráha 1, negativní kontrola (bez indukce). Dráha 2, indukovaný rekombinantní protein McIL-17-3. Dráha 3, vyčištěný McIL- 17-3. Dráha 4, Western blot s protilátkou anti-McIL{{20}} v hemocytech M. coruscus. (D) Po transfekci po dobu 24 hodin byly hladiny proteinu McIL-17-3 stanoveny Western blotem. ** p < 0,01 oproti kontrolám

2.7. Apoptóza hemocytů

Rychlost apoptózy hemocytů čtyř skupin, tj. NC+LPS, McIL-17-3+LPS, Mcnovel_miR_145+McIL-17-3+LPS a Mc-novel{{6} }miR_145-i+McIL-17-3+LPS byl analyzován průtokovou cytometrií za použití dvojitého barvení. Poté, co byl nadměrně exprimován McIL{10}}, byla míra apoptózy hemocytů vystavených LPS významně zvýšena ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 7A(a,b), B). Když byl McIL-17-3 kotransfekován s Mc-novel_miR_145, míra apoptózy hemocytů indukovaná LPS se významně snížila ve srovnání s mírou apoptózy u McIL-17-3 transfekovaného samostatně (obrázek 7A( b, c), B). Naproti tomu míra apoptózy hemocytů vykázala pozoruhodný nárůst ve skupině Mc-novel_miR_145-i+ McIL-17-3+LPS ve srovnání se skupinou McIL-17-3+LPS (obrázek 7A (b, d), B).

Obrázek 7. Rychlost apoptózy hemocytů byla hodnocena průtokovou cytometrií za použití propidium jodidu (PI) a barvení FITC-Annexin-V

3. Diskuse

IL-17 je považován za jednu z důležitých rodin prozánětlivých cytokinů, které se mohou účinně podílet na patogenezi různých onemocnění [42]. V naší předchozí studii vykazoval homolog IL-17 M. coruscus odlišnou expresi před a po infekci V. alginolyticus prostřednictvím sekvenování transkriptomu [41], což naznačuje jeho potenciální roli ve vrozené imunitní odpovědi na bakteriální výzvu. Zde jsme charakterizovali tento homolog IL-17 a pojmenovali jej McIL-17-3. Predikce funkční domény odhalila typickou IL-17 doménu, která dotuje aktuálně identifikovanou genovou příslušnost k IL-17 cytokinové rodině. Ve fylogenetickém stromě tento nový gen IL-17 vykazoval velmi blízkou příbuznost s IL-17- 3 z jiného druhu Mytilus, M. galloprovincialis. Kromě toho sdíleli velmi vysokou 95% identitu aminokyselin, a proto jsme současný nový gen IL-17 nominovali jako McIL-17-3, aby se řídil konvencí pojmenování používanou u druhů Mytilus. Rodina IL-17 se skládá ze šesti členů a pěti receptorů u lidí [43], ale zaznamenala obrovskou genetickou expanzi u mořských bezobratlých, zejména u mušlí [11]. Na základě toho naše data naznačují, že McIL-17-3 přímo nesouvisí s určitými geny v lidské rodině IL-17. Záhyb cysteinového uzlu umístěný na -listech je typickou charakteristikou rodiny IL-17 [5]. Předpověď terciární struktury podle očekávání odhalila cysteinový uzel v proteinu McIL-17-3, což dále prohlubuje přiřazení McIL-17-3 k rodině cytokinů IL-17. Abychom dále prozkoumali diferenciaci aminokyselinových sekvencí IL-17 mezi různými druhy, některé typické IL-17 mušlí a Mus musculus IL-17-A až IL-17-F a Danio rerio K provedení analýzy vícenásobného zarovnání byly vybrány IL-17-1 až IL-17-3. Výsledky ukázaly zajímavé zjištění, že pozice disulfidové vazby IL-17s u slávek a obratlovců byla nekonzistentní: tyto dvě disulfidové vazby existovaly mezi -vlákny 1 a 3, 2 a 4 v mušlích, ale pouze mezi -vlákna 2 a 4 u obratlovců. Na prvním a čtvrtém místě cysteinu nahrazují IL-17 obratlovců cystein serinem; naopak na druhém místě cysteinu IL-17 mušlí nahrazují cystein threoninenciací na disulfidové vazbě u mušlí a obratlovců a jeho základní mechanismus je nejasný a vyžaduje další studium. Vzhledem k polymorfismu IL-17s v mušlích nemusí být disulfidová vazba mezi řetězci 1 a 3 tak silná jako mezi řetězci 2 a 4, což jim u mušlí propůjčuje větší plasticitu. Analýza funkčních domén a terciární struktury každopádně naznačuje, že aktuálně identifikovaný McIL{50}} je typický pro cytokin IL{51}} mušlí a mohl by hrát podobnou funkční roli jako jeho protějšky u měkkýšů. Exprese genů IL-17 v lidských tkáních se velmi liší, některé jsou exprimovány pouze v několika buňkách a jiné ve velkém počtu tkání [44,45]. Většina studií na měkkýších prokázala, že IL-17 má konstitutivní profil exprese [13,15,17,46,47]. Nicméně Li, Zhang, Zhang, Xiang, Tong, Qu a Yu [47] vykazovali nekonzistentní výsledky v C. gigas IL-17s: CgIL-17-2, -3, {{ 65}} a -6 byly vysoce exprimovány v žábrách, trávicích žlázách a plášti C. gigas, ale v jiných tkáních byly téměř exprimovány. Zde byly McIL-17-3 transkripty nalezeny ve všech zkoumaných tkáních, což naznačuje jeho mnohočetné funkční role v různých fyziologických aktivitách. Nicméně vysoké hladiny exprese McIL-17-3 v některých imunitních tkáních měkkýšů, jako jsou hemocyty, žábry a trávicí žlázy, naznačují jeho užší zapojení do imunitní odpovědi. Následně jeho rychlá reakce na útok V. alginolyticus tento bod prohlubuje. Injekce V. alginolyticus významně upregulovala expresi McIL-17-3 a podobné výsledky byly také pozorovány u jiných IL-17 měkkýšů. Injekce V. anguillarum do C. gigas vyvolala rychlý nárůst množství transkriptů CgIL-17 v hemocytech, což naznačuje, že se jednalo o imunitní gen v rané fázi [46]. Když C. gigas prodělal útok jiného patogenu, V. splendidus, hladina mRNA CgIL-17-5 v hemocytech byla také významně zvýšena [15]. Stimulace LPS, hlavní patogenní složky bakterií, dramaticky zvýšila expresi PfIL-17 v trávicích žlázách perlorodky P. fucata [17]. Kromě toho by LPS mohl indukovat expresi CgIL-17-3 u C. gigas [47] a PmIL-17-2 u P. fucata martensii [13]. Tyto výsledky společně ukázaly, že IL-17 hrál důležitou roli v imunitní obraně měkkýšů proti bakteriálnímu útoku. V této studii McIL-17-3 ukázal aktivační kapacitu downstream NF-κB dráhy. Podobné výsledky byly pozorovány také u některých druhů měkkýšů. U perlorodky P. fucata PfIL-17 také vykazoval aktivaci dráhy NF-κB v buňkách HEK293 pomocí luciferázových reportérových testů [17]. U C. gigas CgIL-17-5 podporoval aktivaci CgMAPK a jadernou translokaci CgRel a CgAP-1 k podpoře mRNA exprese cytokinů a antibakteriálních peptidů [15]. Bylo prokázáno, že způsob účinku IL-17 je založen na jeho spojení do dimerů (homodimerů nebo heterodimerů), jejichž aktivita je vysoce závislá na jejich připojení k receptorům (IL-17Rs), které cílová. Tyto receptory obsahují konzervovanou cytoplazmatickou doménu (SEFIR), která interaguje s adaptorovými proteiny, aby iniciovala downstream signální transdukční dráhy pro aktivaci transkripčních faktorů, jako je NF-κB, a podporu exprese imunitních a prozánětlivých cílových genů, jako jsou cytokiny a antimikrobiální peptidy [ 11,48,49].

cistanche tubulosa-zlepšuje imunitní systém

Tyto výsledky naznačují, že IL-17 měkkýšů mohou mít stejný způsob účinku jako jejich protějšky u obratlovců. To je třeba potvrdit v budoucích studiích. Korelace mezi miRNA a IL-17s byly nalezeny v několika modelech lidských onemocnění. Niimoto a kol. [50] potvrdili pozitivní korelaci mezi expresí miR-146a a IL-17a v mononukleárních buňkách periferní krve a synovii pacientů s revmatoidní artritidou a shrnuli vitální funkci miR{5}}a v diferenciace buněk produkujících IL-17-. U pacientů s psoriázou působí miR-146a jako silný inhibitor zánětu kůže vyvolaného IL{8}}a jeho nízké hladiny mohou u geneticky náchylných jedinců přispět k časnému nástupu onemocnění [51]. MiR{10}}a může zmírnit parodontitidu snížením exprese IL{12}} a inhibicí proliferace kmenových buněk lidských parodontálních vazů [52]. MiR-155 negativně reguluje expresi IL-17, aby se podílel na imunitní odpovědi hostitele na postvirovou bakteriální pneumonii v plicích myší; Myši inhibované miR-155 vykazují silnější expresi IL-17 v plicích, doprovázenou zlepšenou bakteriální clearance [53]. Tyto studie naznačují, že IL-17 je regulován více miRNA a liší se podle onemocnění a typu buněk [20]. V předchozí studii jsme provedli integrovanou analýzu miRNAomu a transkriptomu, abychom prozkoumali interaktivní regulaci miRNA-mRNA pomocí M. coruscus v reakci na infekci V. alginolyticus. Výsledky předpověděly, že Mc-novel_miR_145 by se mohl zaměřit na McIL-17-3, aby se podílel na vrozené imunitní odpovědi na bakteriální infekci [41]. S cílem prozkoumat základní mechanismus Mcnovel_miR_145 regulace McIL-17-3 do hloubky byla v těchto studiích provedena řada laboratorních experimentů. Výpočet předpovídal, že Mc-novel_miR_145 by mohl cílit na 30 UTR McIL-17-3. Následující luciferázové reportérové ​​testy provedené v HEK293 buňkách kotransfekovaných Mc-novel_miR{40}} mimikem, mimikem NC, inhibitorem, inhibitorem NC s McIL-17-3-30 UTR-WT, reportérem -MUT plasmidy dále potvrdily tento bod. Dále byly do hemocytů M. coruscus transfekovány mimika Mc-novel_miR_145, napodobující NC, inhibitor a inhibitor NC, aby se vyhodnotily jejich účinky na expresi McIL-17-3 na transkripční a proteinové úrovni . Exprese McIL-17-3 byla významně snížena ve skupině s mimickou transfekcí Mc-novel_miR_145, zatímco ve skupině s miR_miR podle Mc-novelu byla významně zvýšena _145 skupina inhibitorů transfekce, což naznačuje negativní regulaci McIL-17-3 podle Mc-novel_miR_145. Současné výsledky byly v rozporu s předchozí studií. V Pinctada martensii, Tian, ​​Zheng, Huang, Jiao a Du [30] zjistili, že ačkoli Pm-miR-29a mohl cílit na IL-17, regulace byla pozitivní, protože výraz IL{{ 65}} v plášti a žábrách Pinctada martensii byla zvýšena po nadměrné expresi Pm-miR-29a. Vzhledem k tomu, že P. martensii a M. coruscus oba patří k mlžům a jsou relativně blízcí příbuzní, tyto nekonzistentní výsledky naznačují, že regulace IL-17s u měkkýšů se může lišit v závislosti na miRNA. Kromě toho žádná literatura neuvádí korelaci mezi miRNA a IL-17s u měkkýšů, a proto neexistují žádné další paralelní studie pro srovnání současných výsledků. Několik studií však uvedlo cílené vztahy mezi specifickými miRNA a specifickými geny souvisejícími s imunitou u měkkýšů.

Například cgi-miR-2d zvyšuje fagocytózu hemocytů ústřic negativní regulací CgIκB2 v Crassostrea gigas [31]. Kromě toho cgi-miR-2d také negativně reguluje expresi jednoho genu podobného cholinovému transportéru, který se podílí na sofistikované imunomodulaci hemocytů ústřic během časné fáze infekce [32]. Tyto studie přinejmenším naznačují, že miRNA hrají potenciální roli ve vrozené imunitní signalizaci tím, že cílí na specifické geny u měkkýšů, stejně jako u obratlovců. Dále jsme se snažili prozkoumat potenciální funkci interakce mezi Mcnovel_miR_145 a McIL{{10}} ve vrozené imunitě M. coruscus a jejich roli v Apoptóza indukovaná LPS je středem naší pozornosti. LPS je vysoce prozánětlivá molekula, která je součástí vnějšího obalu všech gramnegativních bakterií. Bylo prokázáno, že LPS indukuje apoptózu v různých buňkách a tkáních, jako jsou makrofágy [54], endoteliální buňky [55] a myší plíce [56]. Předběžný experiment ukázal, že expozice LPS při nominální koncentraci 0,1 mg/ml po dobu 24 hodin významně indukovala apoptózu hemocytů z M. coruscus. Po nadměrné expresi McIL{19}} byla hladina apoptózy hemocytů M. coruscus významně zvýšena ve srovnání s kontrolní skupinou, což naznačuje, že McIL{20}} může posílit apoptózu hemocytů u M. coruscus indukovanou LPS. Současné výsledky byly v souladu s některými předchozími studiemi. U lidských neutrofilů by IL-17A mohl snížit antiapoptotické účinky zprostředkované faktorem stimulujícím kolonie granulocytů a makrofágů [57]. IL-17 indukuje apoptózu vaskulárních endoteliálních buněk, což je potenciální mechanismus akutního koronárního syndromu [58]. Genetická delece IL-17A snižuje apoptózu alveolárních buněk typu II a tím zmírňuje chronickou obstrukční plicní nemoc [59]. Stále však existují některé opačné argumenty. Když jsou myši infikovány virem Theilerovy myší encefalomyelitidy, IL-6 a IL-17 synergicky podporují perzistenci viru inhibicí buněčné apoptózy [60]. Tyto konflikty naznačují, že základní mechanismus IL-17-zprostředkované apoptózy je komplexní a IL-17 mohou hrát opačné funkce v závislosti na typu infekce.

Když byly McIL-17-3 kotransfekovány s Mc-novel_miR_145, úroveň apoptózy indukované LPS byla významně snížena ve srovnání s jediným transfekovaným McIL-17-3 skupině, odpovídajícím způsobem byla hladina apoptózy významně zvýšena poté, co byl McIL-17-3 kotransfekován s inhibitorem Mc-novel_miR{12}}. Ukázalo se, že Mc-novel_miR_145 negativně reguluje McIL-17-3, a proto jsme došli k závěru, že McIL{17}} zhoršuje apoptózu hemocytů indukovanou LPS, zatímco Mc-novel _miR_145 účinky zmírnil. V posledních letech bylo u měkkýšů identifikováno několik miRNA, u kterých bylo prokázáno, že se podílejí na apoptóze lidských a myších buněk. Například miR-125b a miR- 335 byly nalezeny v ploché ústřici Ostrea edulis [21], miR-184 byl nalezen v hemocytech ústřice Crassostrea gigas [23] a miR{{ 26}}, -29, -96, -182 a -193 byly nalezeny v regenerujícím se centrálním nervovém systému L. stagnalis [25]. Tyto miRNA související s apoptózou identifikované pomocí vysoce výkonného sekvenování a biologických výpočtů potvrzují existenci apoptózy zprostředkované miRNA u měkkýšů. Chen a kol. popsali up-regulaci miR-2d po expozici Vibrio splendidus v hemocytech Crassostrea gigas. Nadměrná exprese miR-2d byla korelována s knock-down expresí IκB2 a významným zvýšením míry fagocytózy hemocytů, spojené se supresí apoptózy [31]. Výsledky byly v souladu s naší současnou studií, společně, zdá se, že miRNA mají inhibiční funkci na buněčnou apoptózu u měkkýšů. Ve skutečnosti většina miRNA souvisejících s apoptózou u lidí vykazovala inhibiční účinky na apoptózu. MiR-146 chrání buňky A549 a H1975 před apoptózou indukovanou LPS a zánětlivým poškozením prostřednictvím up-regulace Sirt1, čímž blokuje dráhy NF-κB a Notch [61]. Kromě toho miR-146 zeslabuje apoptózu hepatocytů indukovanou ozářením a LPS prostřednictvím inhibice dráhy TLR4 [62]. MiR-93 inhibuje apoptózu chondrocytů u osteoartrózy cílením na signální dráhu TLR4/NF-κB [63]. MiR-129-5p zmírňuje poranění míchy u myší potlačením apoptózy prostřednictvím dráhy HMGB1/TLR4/NF-κB [64]. Stále však existují některé specifické miRNA, které vykazují posilující účinky na apoptózu. Bylo například zjištěno, že miR-203 urychluje apoptózu indukovanou LPS cílením PIK3CA v alveolárních epiteliálních buňkách [65]. Tyto výsledky naznačují složitost základního mechanismu apoptózy zprostředkované miRNA.

4. Materiály a metody

4.1. Experimentální design

Nejprve byl pomocí bioinformatické analýzy identifikován a charakterizován McIL-17-3 z M. coruscus. Následně byla tkáňová distribuce McIL-17-3 transkriptů hodnocena stejně jako její reakce na bakteriální expozici pomocí kvantitativních testů PCR v reálném čase (qPCR). Dále byla stanovena asociace mezi McIL-17-3 a Mc-novel_miR_145 luciferázovou reportérovou analýzou provedenou v buňkách HEK293 a hemocytech M. coruscus. Kromě toho byla jejich funkční úloha v apoptóze indukované LPS hodnocena průtokovou cytometrií.

4.2. Umělá mořská voda

Po třech dnech provzdušňování obecní vodovodní vody byl přidán instantní mořský krystal (Haiding LTD, Ji'an, Čína), důkladně promíchán a roztaven, aby dosáhl slanosti 30‰. Nakonfigurovaná umělá mořská voda musí být před použitím provzdušňována po dobu 2 hodin.

4.3. Zvířata

Slávka s tlustou skořápkou M. coruscus (délka skořápky, 9,82 ± 0,53 cm; šířka skořápky, 4,68 ± 0,45 cm; vlhká hmotnost, 71,2 ± 2,7 g) byla zakoupena na trhu Donghe v Zhoushan, provincie Zhejiang, Čína. Všechny mušle byly drženy v nádržích naplněných ASW asi 25 ◦C a slaností 30‰ po dobu delší než týden před následujícími experimenty.

4.4. McIL-17-3 identifikace cDNA

Homolog IL-17 (McIL-17-3) byl in silico klonován z úplného transkriptomu M. coruscus (přístupové číslo: PRJNA798880, F01_transkript_12404). Blastova procedura byla provedena k predikci domnělé McIL-17-3 aminokyselinové sekvence, následovala analýza funkční domény pomocí SMART a posouzení fylogenetického vztahu pomocí MEGA-X. Vícenásobné zarovnání bylo provedeno pomocí postupu ClustalW. Švýcarský model a pool byly použity k predikci terciární struktury proteinu McIL-17-3. Podrobný postup byl podle naší předchozí studie [66].

4.5. Kvantitativní PCR v reálném čase

Kvantitativní testy PCR v reálném čase (qPCR) jsou výkonným nástrojem pro detekci a měření úrovní genové exprese. Zde byla tkáňová distribuce McIL-17-3 hodnocena pomocí metody qPCR. Kromě toho byly pomocí qPCR také detekovány změny v expresi McIL-17-3 mRNA v reakci na bakteriální infekci. Profil tkáňové distribuce McIL-17-3 byl stanoven v žábrách, plášti, trávicích žlázách, pohlavních žlázách, adduktorech a hemocytech pomocí qPCR naprogramované na 95 ◦C po dobu 10 minuty, po které následovalo 40 cyklů po 95 ◦C po dobu 10 s, 60 ◦C po dobu 45 s. Tyto tkáně byly vyříznuty z devíti jedinců mušlí a spojeny dohromady, aby se zmírnila individuální diferenciace. V experimentu s bakteriální provokací byl jako imunitní stimul použit živý V. alginolyticus. Objem 100 µl bakterií rozpuštěných v mořské vodě (1 x 108 CFU ml-1 ) byl injikován do adduktoru slávek. Jako kontrola nebyly použity žádné injikované mušle. Z každé skupiny bylo náhodně odebráno devět mušlí 0, 3, 6, 12, 24 a 36 hodin po provokaci (hpc). Hemocyty ze tří mušlí byly spojeny dohromady, aby byly považovány za jeden vzorek, a pro každý časový bod byly tři vzorky. MikroRNA byly extrahovány pomocí miRNA Extraction Kit (HaiGENE, kat. č.: B1802) a cDNA byla syntetizována pomocí miRcute Plus miRNA First-Strand cDNA Kit (Tiangen, kat. č.: 4992786) a qPCR byla provedena pomocí miRcute Plus miRNA qPCR Kit (Tiangen, kat. č.: 4992887). U6 a -aktinové geny byly použity jako interní reference pro qPCR a miRNAs qPCR, v daném pořadí. Specifické páry primerů použité v tomto experimentu jsou uvedeny v tabulce 1. Relativní úrovně exprese byly měřeny pomocí metody 2−∆∆Ct [67].

Tabulka 1. V této studii byly použity páry PCR primerů.

4.6. Buněčná kultura

Savčí buňky HEK293 (RiboBio Ltd., Guangzhou, Čína) byly použity k provedení luciferázových reportérových testů ke stanovení downstream aktivace pomocí McIL- 17-3 a také asociace mezi Mc-novel_miR{{ 4}} a McIL-17-3. Buňky HEK293 byly kultivovány v médiu OPTI-MEM (GIBCO) při 37 °C, 5 % CO2. Aby bylo možné dále prozkoumat regulaci McIL-17-3 pomocí Mc-novel_miR{14}} a jejich funkční roli v apoptóze indukované LPS, byly hemocyty M. coruscus získány z adduktorového svalu každého mušle s 0 0,5 mm průměrem (25 G) jednorázovou jehlou obsahující 0,5 ml antikoagulantu. Hemocyty byly shromážděny centrifugací po dobu 5 minut při 3000 rpm, 4 °C a byl přidán 0,25% trypsin (Solarbio). Hemocyty byly suspendovány v L-15 médiu obsahujícím 15% fetální bovinní sérum (Solarbio) a kultivovány při 26 °C s 5% CO2.

4.7. Syntéza miRNA mimika a inhibitoru

Mc-novel_miR_145 napodobující, inhibitorové a kontrolní nukleotidy byly složeny společností GenePharma (Shanghai). Jejich sekvence je následující: Mc-novel_miR_145 mimic, 52032- UCCAGAAAAGCGCUUCGGACG-30; Mc-novel_miR{10}} inhibitor, 50 -CGUCCGAAGCG CUUUUCUGGA-30 (chemicky modifikovaný 20 Ome); negativní kontrolní napodobenina, 50 -UUGUA CUACACAAAAGUACUG-30; a inhibitor negativní kontroly, 50 -CAGUACUUUUGUGU AGUACAA-30 (chemicky modifikovaný 20 Ome).

4.8. Luciferázová reportérová analýza

Luciferázové reportérové ​​testy se široce používají ke studiu genové exprese a regulační aktivity. Množství generovaného světla je úměrné množství produkovaného enzymu luciferázy, což zase odráží aktivitu regulačního prvku. Aktivita luciferázy se poté měří pomocí luminometru a výsledky se analyzují a interpretují za účelem stanovení regulační aktivity studovaného prvku. Luciferázové reportérové ​​testy byly použity k analýze následné aktivace McIL{{0}}. V tomto experimentu byl použit plazmid pEGFP-McIL-17-3 (0.1, 0.5 a 1.{11}} µg/jamku) spolu s pGLNF-κb- luc reportérový plazmid (0,25 ug/jamka) byly kotransfekovány do buněk HEK293 pomocí Lipo6000TM po dobu 24 hodin. Jako kontrola byl použit blank pEGFP-N1 plazmid. Luciferázová aktivita byla měřena pomocí Dual-Luciferase® Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, USA) podle specifikace, s Renilla luciferázou použitou jako mezikontrola. Mc-novel_miR_145 cílený na McIL-17-3 byl také potvrzen luciferázovými reportérovými testy. Bioinformatický výpočet předpověděl, že Mc-novel_miR_145 může cílit na 30 -UTR of McIL-17-3, a následně naklonoval 30 -UTR of McIL{{ 29}} do pmiR-RB-ReportTM luciferázového reportérového vektoru pro konstrukci divokého McIL-17-3-30 UTR-WT reportérového plazmidu. UTR-MUT reportérový vektor McIL-17-3-30 mutantního typu byl zkonstruován mutací nukleotidu na 1023–1040 místech: TCCGAAGCGCTTTTCTGG na AGGCTTCGCGAAGACC. RNA oligo (Mc-novel_miR_196 NC, napodobenina, NCi, inhibitor) byla transfekována spolu s McIL-17-3- 3 0 UTR-WT nebo McIL{44}} UTR-MUT do HEK293 buňky pomocí Lipo6000TM.

4.9. Rekombinantní exprese, purifikace a příprava antiséra

Pro posouzení účinku Mc-novel_miR_145 na expresi proteinu McIL-17-3 bylo připraveno antisérum McIL-17-3. Fragment cDNA pokrývající otevřený čtecí rámec (ORF) McIL-17-3 byl amplifikován jedním specifickým párem primerů (tabulka 1) a vložen do vektoru pET-32a. Rekombinantní plazmid pET-32a-McIL{{10}} byl transformován do Escherichia coli (DE3) (Takara) a inkubován v LB médiu (obsahujícím 50 mg L-1 kanamycin) při 37 ◦C s třepáním při 130 otáčkách za minutu po dobu 4 hodin. Poté, co optická hustota dosáhla absorbance 0.6 při 600 nm, byla k bakteriálnímu roztoku přidána isopropyl-beta-D-thiogalaktopie (IPTG) s konečnou koncentrací 1 mM k indukci exprese rekombinantního McIL{ {24}} protein (rMcIL-17-3). Po inkubaci při 37 °C po dobu 6 hodin bylo médium centrifugováno při 8000 otáčkách za minutu po dobu 30 minut, aby se shromáždily bakterie, následovaná suspenze v TBS pufru (20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 8,0). rMcIL-17-3 byl purifikován afinitní chromatografií na kyselině Ni-nitrilotrioctové (NI-NTA) a purifikovaný protein byl dialyzován z imidazolu po dobu 24 hodin. Výsledný protein byl izolován redukcí elektroforézou na 12% SDS-polyakrylamidovém gelu (SDS-PAGE). Purifikovaný protein byl znovu složen v gradientovém pufru močovina-TBS glycerol (50 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 2 mM redukovaný glutathion, 10 % glycerol, 0,2 mM oxid glutathion, gradientová koncentrace močoviny 6, 4, 3, 2 , 1 a 0 M močovina v každém gradientu, pH 7,4, každý gradient při 4 °C po dobu 12 hodin). Poté byl výsledný protein použit k imunizaci 6-týdenních myší, aby získaly polyklonální protilátky.

4.10. Western blotting

Vzorky proteinů byly extrahovány z hemocytů pomocí RIPA lyzačního pufru (Beyotime) a poté byla koncentrace detekována pomocí BCA soupravy. Po izolaci pomocí SDS-PAGE byl protein přenesen na PVDF membrány s utěsněním pomocí 5% sušeného odstředěného mléka v TBST (20 Mm Tris-HCl, 150 mM NaCl, 1% Tween-20, pH 8.0), po níž následovala inkubace protilátky proti McIL-17-3 přes noc. Následně byly membrány inkubovány se zředěným roztokem kozí anti-myší IgG protilátky a konjugátu alkalické fosfatázy (Thermo Fisher Scientific, kat. č.: 31324) v sekundárním ředicím pufru protilátky (Beyotime, P0258) po dobu 3 hodin. Nakonec byly imunoreaktivní proteiny detekovány detekčním systémem ECL.

4.11. Apoptóza

Apoptóza hemocytů byla hodnocena pomocí průtokové cytometrie podle manuálu FITC-Annexin-V Apoptosis Detection Kit (Beyotime). Stručně řečeno, shromážděné hemocyty byly ošetřeny po dobu 24 hodin LPS (0,1 mg/ml), 20 nM plasmidu pEGFP-McIL-17-3, Mc novel_miR{{9} } mimika a Mc-novel_miR_145 inhibitor. Po promytí PBS byly buňky resuspendovány v médiu L15 na konečnou koncentraci 1 x 106 buněk ml-1 a ​​byly obarveny FITC-Annexin-V a PI inkubací při teplotě místnosti po dobu 25 minut ve tmě . Nakonec byl k detekci buněčné apoptózy použit přístroj průtokové cytometrie (Beckman CytoFLEX FCM) a data byla analyzována pomocí softwaru FlowJoTM 10. 4.12. Statistická analýza Experimentální výsledky byly prezentovány jako průměr ± standardní odchylka (SD). Výsledky byly zpracovány pomocí dvoucestné analýzy rozptylu ANOVA s Tukeyho testem vícenásobného srovnání a k analýze dat a konstrukci čísel byl použit software Origin2021.

rostlina cistanche zvyšující imunitní systém

5. Závěry

V této studii byl z M. coruscus identifikován nový homolog IL-17, McIL{1}}, a bylo zjištěno, že hraje klíčovou roli v imunitní obraně měkkýšů proti bakteriálnímu útoku. Navíc bylo zjištěno, že McIL-17-3 je negativně regulován Mc-novel_miR_145, což přispívá k jeho účasti na apoptóze indukované LPS. Výsledky této studie poskytují cenné poznatky o regulační roli IL-17 v imunitní odpovědi slávek a zdůrazňují potenciál nekódující RNA při regulaci imunitních obranných mechanismů bezobratlých. Je však důležité poznamenat, že v této studii existují určitá omezení. Konkrétně mechanismus, který je základem akčního režimu McIL-17-3, nebyl studován a vyžaduje další zkoumání. Tato studie se navíc zaměřila pouze na interakci mezi Mc-novel_miR_145 a McIL-17-3 a nezkoumala možné zapojení jiných miRNA do imunitní odpovědi. Celkově tato studie zdůrazňuje důležitou roli nekódující RNA v imunitních obranných mechanismech a naznačuje, že jejich modulace by mohla sloužit jako potenciální strategie pro cílené terapie různých onemocnění.

Reference

1. Medzhitov, R.; Janeway, C., Jr. Vrozená imunita. N. Engl. J. Med. 2000, 343, 338–344. [CrossRef] [PubMed]

2. Lacy, P.; Stow, JL Uvolňování cytokinů z vrozených imunitních buněk: Spojení s různými cestami přenosu membrán. Blood J. Am. Soc. Hematol. 2011, 118, 9–18. [CrossRef] [PubMed]

3. Dinarello, CA Prozánětlivé cytokiny. Hrudník 2000, 118, 503–508. [CrossRef] [PubMed]

4. Rauta, PR; Nayak, B.; Das, S. Imunitní systém a imunitní odpovědi u ryb a jejich role ve srovnávací studii imunity: Model pro vyšší organismy. Immunol. Lett. 2012, 148, 23–33. [CrossRef]

5. Hymowitz, SG; Filvaroff, EH; Yin, J.; Lee, J.; Cai, L.; Risser, P.; Maruoka, M.; Mao, W.; Foster, J.; Kelley, RF IL-17s adoptují cystinový uzel: Struktura a aktivita nového cytokinu, IL-17F, a důsledky pro vazbu receptoru. EMBO J. 2001, 20, 5332–5341. [CrossRef]

6. Buckley, KM; Ho, ECH; Hibino, T.; Schrankel, CS; Schuh, NW; Wang, GZ; Rast, JP Faktory IL17 jsou časnými regulátory ve střevním epitelu během zánětlivé reakce na Vibrio u larvy mořského ježka. eLife 2017, 6, e23481. [CrossRef]

7. Cua, DJ; Tato, CM Innate IL-17-produkující buňky: Strážci imunitního systému. Nat. Rev. Immunol. 2010, 10, 479–489. [CrossRef]

8. Mills, KH IL-17 a IL-17-produkující buňky v ochraně versus patologie. Nat. Rev. Immunol. 2022, 10, 479–489. [CrossRef]

9. Hibino, T.; Loza-Coll, M.; Messier, C.; Majeske, AJ; Cohen, AH; Terwilliger, DP; Buckley, KM; Brockton, V.; Nair, SV; Berney, K. Repertoár imunitních genů je zakódován v genomu ježovky nachové. Dev. Biol. 2006, 300, 349–365. [CrossRef]

10. Albertin, CB; Simakov, O.; Mitros, T.; Wang, ZY; Pungor, JR; Edsinger-Gonzales, E.; Brenner, S.; Ragsdale, CW; Rokhsar, DS Genom chobotnice a evoluce neurálních a morfologických novinek hlavonožců. Příroda 2015, 524, 220–224. [CrossRef]

11. Saco, A.; Rey-Campos, M.; Rosani, U.; Novoa, B.; Figueras, A. Evoluce a diverzita interleukinu-17 zdůrazňují expanzi u mořských bezobratlých a jeho konzervovanou roli ve slizniční imunitě. Přední. Immunol. 2021, 12, 692997. [CrossRef] [PubMed]

12. Gerdol, M.; Moreira, R.; Cruz, F.; Gómez-Garrido, J.; Vlasová, A.; Rosani, U.; Venier, P.; Naranjo-Ortiz, MA; Murgarella, M.; Greco, S. Masivní variace přítomnosti-absence genu formuje otevřený pan-genom ve středomořských mušlích. Genome Biol. 2020, 21, 1–21. [CrossRef]

13. Cao, Y.; Yang, S.; Feng, C.; Zhan, W.; Zheng, Z.; Wang, Q.; Deng, Y.; Jiao, Y.; Du, X. Evoluční a funkční analýza genu interleukin-17 z Pinctada fucata martensii. Fish Shellfish Immunol. 2019, 88, 102–110. [CrossRef] [PubMed]

14. Wang, Q.; Xiao, G.; Obejmout.; Chen, R.; Li, M.; Teng, S. Interleukin-17D zprostředkovává změny související s infekcí Vibrio harveyi u Tegillarca granulosa prostřednictvím aktivace aktivátorového proteinu 1 in vivo. Akvakultura 2023, 566, 739178. [CrossRef]

15. Lv, X.; Sun, J.; Li, Y.; Yang, W.; Wang, L.; Leng, J.; Yan, X.; Guo, Z.; Yang, Q.; Wang, L. CgIL17-5 reguluje mRNA exprese imunitních efektorů prostřednictvím indukce fosforylace CgMAPK a jaderné translokace CgRel a CgAP-1 v tichomořské ústřici Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2022, 127, 104263. [CrossRef] [PubMed]

16. Wang, L.; Sun, J.; Wu, Z.; Lian, X.; Han, S.; Huang, S.; Yang, C.; Wang, L.; Song, L. AP-1 reguluje expresi IL17-4 a IL17-5 v pacifické ústřici Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2020, 97, 554–563. [CrossRef]

17. Wu, S.-Z.; Huang, X.-D.; Li, Q.; On, M.-X. Interleukin-17 v ústřici perlorodé (Pinctada fucata): Molekulární klonování a funkční charakterizace. Fish Shellfish Immunol. 2013, 34, 1050–1056. [CrossRef]

18. Xin, L.; Zhang, H.; Zhang, R.; Li, H.; Wang, W.; Wang, L.; Wang, H.; Qiu, L.; Song, L. CgIL17-5, starověký zánětlivý cytokin v Crassostrea gigas vykazující funkce heterogenity ve srovnání s molekulami interleukinu17 obratlovců. Dev. Comp. Immunol. 2015, 53, 339–348. [CrossRef]

19. Denli, AM; Topy, BB; Sádra, RH; Ketting, RF; Hannon, GJ Zpracování primárních mikroRNA komplexem mikroprocesorů. Příroda 2004, 432, 231–235. [CrossRef]

20. Khan, D.; Ansar Ahmed, S. Regulace IL-17 u autoimunitních onemocnění pomocí transkripčních faktorů a mikroRNA. Přední. Genet. 2015, 6, 236. [CrossRef]

21. Martín-Gómez, L.; Villalba, A.; Kerkhoven, RH; Apollo, E. Role mikroRNA v imunitním procesu ploché ústřice Ostrea edulis proti bonamióze. Infikovat. Genet. Evol. 2014, 27, 40–50. [CrossRef] [PubMed]

22. Xu, F.; Wang, X.; Feng, Y.; Huang, W.; Wang, W.; Li, L.; Fang, X.; Que, H.; Zhang, G. Identifikace konzervovaných a nových mikroRNA v tichomořské ústřici Crassostrea gigas pomocí hlubokého sekvenování. PLoS ONE 2014, 9, e104371. [CrossRef]

23. Zhou, Z.; Wang, L.; Píseň, L.; Liu, R.; Zhang, H.; Huang, M.; Chen, H. Identifikace a charakteristiky imunitně souvisejících mikroRNA v hemocytech ústřice Crassostrea gigas. PLoS ONE 2014, 9, e88397. [CrossRef] [PubMed]

24. Burgos-Aceves, MA; Cohen, A.; Smith, Y.; Faggio, C. Potenciální mikroRNA regulace imunitních genů v hemocytech bezobratlých. Sci. Totální prostředí. 2018, 621, 302–307. [CrossRef]

25. Walker, SE; Spencer, GE; Nečákov, A.; Carlone, RL Identifikace a charakterizace mikroRNA během regenerace centrálního nervového systému měkkýšů indukované kyselinou retinovou. Int. J. Mol. Sci. 2018, 19, 2741. [CrossRef] [PubMed]

26. Abo-Al-Ela, HG; Faggio, C. Stresová reakce zprostředkovaná mikroRNA u druhů mlžů. Ekotoxikol. Environ. Saf. 2021, 208, 111442. [CrossRef] [PubMed]

27. Huang, S.; Yoshitake, K.; Asaduzzaman, M.; Kinoshita, S.; Watanabe, S.; Asakawa, S. Objev a funkční porozumění miRNA u měkkýšů: přístup k profilování celého genomu. RNA Biol. 2021, 18, 1702–1715. [CrossRef]

28. Rosani, U.; Bortoletto, E.; Bai, C.-M.; Novoa, B.; Figueras, A.; Venier, P.; Fromm, B. Kopání do miRNAomů mlžů: Mezi ochranou a inovací. Philos. Trans. R. Soc. B 2021, 376, 20200165. [CrossRef]

29. Slunce, X.; Zhang, T.; Li, L.; Tu, K.; Yu, T.; Wu, B.; Zhou, L.; Tian, ​​J.; Liu, Z. MikroRNA expresní podpis v příčně pruhovaných a hladkých adduktorech Yesso hřebenatky Patinopecten yessoensis. Genomics 2022, 114, 110409. [CrossRef]

30. Tian, ​​R.; Zheng, Z.; Huang, R.; Jiao, Y.; Du, X. miR-29a se podílel na tvorbě perleti a imunitní odpovědi cílením na Y2R v Pinctada martensii. Int. J. Mol. Sci. 2015, 16, 29436–29445. [CrossRef]

31. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, H.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, R.; Qiu, L.; Song, L. MikroRNA specifická pro bezobratlé a citlivá na imunitu zvyšuje fagocytózu hemocytů ústřic zacílením na CgIκB2. Sci. rep. 2016, 6, 1–10. [CrossRef] [PubMed]

32. Chen, H.; Zhou, Z.; Wang, L.; Wang, H.; Liu, R.; Zhang, H.; Song, L. MiRNA specifická pro bezobratlé živočichy se zaměřila na starověký cholinergní neuroendokrinní systém ústřic. Otevřete Biol. 2016, 6, 160059. [CrossRef]

33. Chen, H.; Xin, L.; Píseň, X.; Wang, L.; Wang, W.; Liu, Z.; Zhang, H.; Wang, L.; Zhou, Z.; Qiu, L. miRNA reagující na norepinefrin přímo podporuje expresi CgHSP90AA1 v hemocytech ústřic během vysychání. Fish Shellfish Immunol. 2017, 64, 297–307. [CrossRef] [PubMed]

34. Han, Z.; Li, J.; Wang, W.; Li, J.; Zhao, Q.; Li, M.; Wang, L.; Song, L. Calmodulin cílený miRNA scaffold659_26519 reguluje expresi IL-17 v časné imunitní odpovědi ústřice Crassostrea gigas. Dev. Comp. Immunol. 2021, 124, 104180. [CrossRef] [PubMed]

35. Lv, Z.; Li, C.; Zhang, P.; Wang, Z.; Zhang, W.; Jin, C.-H. miR-200 moduluje antibakteriální aktivity coelomocytů a primární aktivaci LPS prostřednictvím cílení na Tollip u Apostichopus japonicus. Fish Shellfish Immunol. 2015, 45, 431–436. [CrossRef]

36. Li, C.; Zhao, M.; Zhang, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Duan, X.; Xu, W. miR210 moduluje respirační vzplanutí v coelomocytech Apostichopus japonicus prostřednictvím cílení na Toll-like receptor. Dev. Comp. Immunol. 2016, 65, 377–381. [CrossRef]

37. Lv, M.; Chen, H.; Shao, Y.; Li, C.; Zhang, W.; Zhao, X.; Jin, C.; Xiong, J. miR-92a reguluje apoptózu coelomocytů v mořských okurkách Apostichopus japonicus prostřednictvím cílení Aj14-3-3ζ in vivo. Fish Shellfish Immunol. 2017, 69, 211–217. [CrossRef]

38. Shao, Y.; Li, C.; Xu, W.; Zhang, P.; Zhang, W.; Zhao, X. miR-31 spojuje metabolismus lipidů a buněčnou apoptózu u bakterií Apostichopus japonicus prostřednictvím cílení na CTRP9. Přední. Immunol. 2017, 8, 263. [CrossRef]

39. Guo, M.; Wang, Y.; Fu, X.; Tao, W.; Li, C. circRNA1149 z Apostichopus japonicus potlačuje apoptózu coelomocytů a působí jako miR-92houba regulující expresi Bax v reakci na infekci Vibrio splendidus. Akvakultura 2023, 562, 738812. [CrossRef]

40. Zuo, H.; Weng, K.; Luo, M.; Yang, L.; Weng, S.; He, J.; Xu, X. A MicroRNA-1 – zprostředkovaná inhibice dráhy NF-κB cestou JAK-STAT u bezobratlých Litopenaeus vannamei. J. Immunol. 2020, 204, 2918–2930. [CrossRef]

41. Yang, H.; Xu, Z.; Guo, B.; Zhang, X.; Liao, Z.; Qi, P.; Yan, X. Integrovaná analýza miRNAomu a transkriptomu odhaluje regulaci sítě miRNA-mRNA u slávky Mytilus coruscus infikované Vibrio alginolyticus. Mol. Immunol. 2021, 132, 217–226. [CrossRef] [PubMed]

42. de Morales, JMGR; Puig, L.; Daudén, E.; Cañete, JD; Pablos, JL; Martín, AO; Juanatey, CG; Adán, A.; Montalbán, X.; Borruel, N. Kritická role interleukinu (IL)-17 při zánětlivých a imunitních poruchách: Aktualizovaný přehled důkazů zaměřených na kontroverze. Autoimunitní. Rev. 2020, 19, 102429. [CrossRef] [PubMed]

43. Kawaguchi, M.; Adachi, M.; Oda, N.; Kokubu, F.; Huang, S.-K. IL-17 rodina cytokinů. J. Allergy Clin. Immunol. 2004, 114, 1265–1273. [CrossRef] [PubMed]

44. Starnes, T.; Broxmeyer, HE; Robertson, MJ; Hromas, R. Cutting edge: IL-17D, nový člen rodiny IL-17, stimuluje produkci cytokinů a inhibuje hemopoézu. J. Immunol. 2002, 169, 642–646. [CrossRef] [PubMed]

45. Gaffen, SL; Kramer, JM; Jeffrey, JY; Shen, F. Rodina IL-17 cytokinů. Vitam. Horm. 2006, 74, 255–282. [PubMed]

46. ​​Roberts, S.; Gueguen, Y.; de Lorgeril, J.; Goetz, F. Rychlá akumulace transkriptu homologu interleukinu 17 v hemocytech Crassostrea gigas po bakteriální expozici. Dev. Comp. Immunol. 2008, 32, 1099–1104. [CrossRef] [PubMed]

47. Li, J.; Zhang, Y.; Zhang, Y.; Xiang, Z.; Tong, Y.; Qu, F.; Yu, Z. Genomická charakterizace a analýza exprese pěti nových IL-17 genů v pacifické ústřici Crassostrea gigas. Fish Shellfish Immunol. 2014, 40, 455–465. [CrossRef]

48. Gaffen, SL Struktura a signalizace v rodině IL-17 receptorů. Nat. Rev. Immunol. 2009, 9, 556–567. [CrossRef]

49. Haťa, K.; Andoh, A.; Shimada, M.; Fujino, S.; Bamba, S.; Araki, Y.; Okuno, T.; Fujiyama, Y.; Bamba, T. IL-17 stimuluje zánětlivé reakce prostřednictvím kináz NF-κB a MAP v lidských myofibroblastech tlustého střeva. Dopoledne. J. Physiol. - Gastrointestinální test. Fyziol jater. 2002, 282, G1035–G1044. [CrossRef]

50. Niimoto, T.; Nakasa, T.; Ishikawa, M.; Okuhara, A.; Izumi, B.; Deie, M.; Suzuki, O.; Adachi, N.; Ochi, M. MicroRNA-146a se exprimuje v T buňkách produkujících interleukin-17 u pacientů s revmatoidní artritidou. BMC Muskuloskelet. Porucha. 2010, 11, 1–11. [CrossRef]

51. Srivastava, A.; Nikamo, P.; Lohcharoenkal, W.; Li, D.; Meisgen, F.; Landén, NX; Ståhle, M.; Pivarcsi, A.; Sonkoly, E. MicroRNA- 146a potlačuje zánět kůže zprostředkovaný IL-17 a je geneticky spojen s psoriázou. J. Allergy Clin. Immunol. 2017, 139, 550–561. [CrossRef] [PubMed]

52. Zhao, S.; Cheng, Y.; Kim, JG microRNA-146a downreguluje IL-17 a IL-35 a inhibuje proliferaci kmenových buněk lidských parodontálních vazů. J. Cell. Biochem. 2019, 120, 13861–13866. [CrossRef] [PubMed]

53. Podsiad, A.; Standiford, TJ; Ballinger, MN; Eakin, R.; Park, P.; Kunkel, SL; Moore, BB; Bhan, U. MicroRNA-155 reguluje imunitní odpověď hostitele na postvirovou bakteriální pneumonii cestou IL-23/IL-17. Dopoledne. J. Physiol. -Plicní buňka. Mol. Physiol. 2016, 310, L465–L475. [CrossRef]

54. Xaus, J.; Comalada, M.; Valledor, AF; Lloberas, J.; López-Soriano, F.; Argilés, JM; Bogdan, C.; Celada, A. LPS indukuje apoptózu v makrofázích většinou prostřednictvím autokrinní produkce TNF-. Blood J. Am. Soc. Hematol. 2000, 95, 3823–3831.

55. Bannerman, DD; Goldblum, SE Mechanismy bakteriální apoptózy endotelu indukované lipopolysacharidy. Dopoledne. J. Physiol.-Lung Cell. Mol. Physiol. 2003, 284, L899–L914. [CrossRef]

56. Mosaz, DM; Hollingsworth, JW; Cinque, M.; Li, Z.; Potts, E.; Toloza, E.; Foster, WM; Schwartz, DA Chronická inhalace LPS způsobuje změny podobné emfyzému v plicích myší, které jsou spojeny s apoptózou. Dopoledne. J. Respir. Cell Mol. Biol. 2008, 39, 584–590. [CrossRef]

57. Drak, S.; Saffar, AS; Shan, L.; Gounni, AS IL-17 zeslabuje antiapoptotické účinky GM-CSF v lidských neutrofilech. Mol. Immunol. 2008, 45, 160–168. [CrossRef] [PubMed]

58. Zhu, F.; Wang, Q.; Guo, C.; Wang, X.; Cao, X.; Shi, Y.; Gao, F.; Ma, C.; Zhang, L. IL-17 indukuje apoptózu vaskulárních endoteliálních buněk – potenciální mechanismus pro lidský akutní koronární syndrom. Clin. Immunol. 2011, 141, 152–160. [CrossRef]

59. Chang, Y.; Al-Alwan, L.; Audusseau, S.; Chouiali, F.; Carlevaro-Fita, J.; Iwakura, Y.; Baglole, CJ; Eidelman, DH; Hamid, Q. Genetická delece IL-17A snižuje zánět způsobený cigaretovým kouřem a apoptózu alveolárních buněk typu II. Dopoledne. J. Physiol. -Plicní buňka. Mol. Physiol. 2014, 306, L132–L143. [CrossRef]

60. Hou, W.; Jin, Y.-H.; Kang, HS; Kim, BS Interleukin-6 (IL-6) a IL-17 synergicky podporují perzistenci viru inhibicí buněčné apoptózy a funkce cytotoxických T buněk. J. Virol. 2014, 88, 8479–8489. [CrossRef]

61. Wang, Q.; Li, D.; Han, Y.; Ding, X.; Xu, T.; Tang, B. MicroRNA-146 chrání buňky A549 a H1975 před apoptózou indukovanou LPS a zánětlivým poškozením. J. Biosci. 2017, 42, 637–645. [CrossRef] [PubMed]

62. Chen, Y.; Wu, Z.; Yuan, B.; Dong, Y.; Zhang, L.; Zeng, Z. MicroRNA-146a-5p zeslabuje ozářením indukovanou a LPS indukovanou aktivaci jaterních hvězdicových buněk a apoptózu hepatocytů prostřednictvím inhibice dráhy TLR4. Cell Death Dis. 2018, 9, 1–16. [CrossRef] [PubMed]

63. Ding, Y.; Wang, L.; Zhao, Q.; Wu, Z.; Kong, L. MicroRNA-93 inhibuje apoptózu chondrocytů a zánět u osteoartrózy cílením na signální dráhu TLR4/NF-κB. Int. J. Mol. Med. 2019, 43, 779–790. [CrossRef]

64. Wan, G.; An, Y.; Tao, J.; Wang, Y.; Zhou, Q.; Yang, R.; Liang, Q. MicroRNA-129-5p zmírňuje poranění míchy u myší potlačením apoptózy a zánětlivé reakce prostřednictvím dráhy HMGB1/TLR4/NF-κB. Biosci. Rep. 2020, 40, BSR20193315. [CrossRef] [PubMed]

65. Ke, X.-F.; Fang, J.; Wu, X.-N.; Yu, C.-H. MicroRNA-203 urychluje apoptózu v LPS-stimulovaných alveolárních epiteliálních buňkách cílením PIK3CA. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2014, 450, 1297–1303. [CrossRef] [PubMed]

66. Qi, P.; Tang, Z. Molekula Nrf2 spouští antioxidační obranu proti akutní expozici benzo(a)pyrenu u slávky Mytilus coruscus. Aquat Toxicol 2020, 226, 105554. [CrossRef]

67. Schmittgen, TD; Livak, KJ Analýza dat PCR v reálném čase srovnávací metodou CT. Nat. Protoc. 2008, 3, 1101–1108. [CrossRef]