R. Vesicarius L. má nefroprotektivní účinek proti cisplatinou indukovanému oxidačnímu stresu
Mar 26, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Md. Mahmudul Hasan1, Většina. Sayla Tasminová2, Ahmed M. El-Shehawi3, Mona M. Elseehy4, Md. Abu Reza1a Ariful Haque2*
Abstraktní
Pozadí:Cisplatina je vynikající protirakovinné léčivo, ale její použití se výrazně snížilo kvůli těžké nefrotoxicitě. R. vicarious L. je listová zelenina, která má antiangiogenní, protizánětlivý, antiproliferativní, hepatoprotektivní a nefroprotektivní potenciál. Proto byla tato studie navržena tak, aby zkontrolovala jeho methanolový extrakt (RVE) na možný nefroprotektivní účinek.
Metody:Primárně byla in vitro potvrzena antioxidační aktivita RVE na základě schopnosti 2, 2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) pohlcovat volné radikály. Poté byli samci myší Swiss Albino léčeni cisplatinou (2,5 mg/kg) po dobu 5 po sobě jdoucích dnů, aby se vyvolala nefrotoxicita. Zotavení z nefrotoxicity bylo zkoumáno ošetřením zvířat RVE (25, 50 a 100 mg/kg) intraperitoneálně (ip) po dalších 5 po sobě jdoucích dnů. Po dokončení léčby byly myši usmrceny a byly odebrány ledviny. Část byla homogenizována v pufru fosforečnanu sodného pro hodnocení hladiny malondialdehydu (MDA), další část byla použita k hodnocení exprese genů (NQO1, p53 a Bcl-2). Kromě toho byla v buňkách HK-2 in vitro hodnocena neutralizační kapacita RVE vůči peroxidu vodíku (H2O2). Nakonec byly bioaktivní fytochemikálie v RVE stanoveny pomocí plynové chromatografie-hmotnostní spektrometrie (GC-MS).
Výsledek:RVE vykazovala in vitro antioxidační aktivitu v závislosti na dávce s hodnotou IC50 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Léčba pomocí RVE pozoruhodně (p < {{0}}.05)="" snížila="" obsah="" mda="" v="" tkáni="" ledvin.="" kromě="" toho="" byla="" exprese="" genů="" nqo,="" p53="" a="" bcl{3}}="" významně="" (p="">< 0,05)="" zmírněna="" v="" závislosti="" na="" dávce="" v="" důsledku="" podávání="" rve.="" rve="" významně="" (p="">< 0,05)="" zvrátila="" hladinu="" h2o2="" v="" buňkách="" hk-2="" na="" téměř="" normální="" hodnotu.="" z="" gc-ms="" deset="" sloučenin="" včetně="" tří="" známých="" antioxidantů="" „4h-pyran-4-one,="" 2,="" 3-dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl-“="" byly="" detekovány="" "hexadekanová="" kyselina"="" a="" "skvalen".="" extrakt="" byl="" bohatý="" na="" alkaloid="">
Závěr:Celkově má RVE ochranný účinek proti poškození ledvin vyvolanému cisplatinou.
klíčová slova:Cisplatina, R. vicarious, myši, ledviny, buňky HK-2, oxidační stres, gen NQO1
Cistanche deserticola zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek
Úvod
Oxidační stres je důsledkem nepoměru mezi tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS) a pravidelnými antioxidačními obrannými mechanismy [1]. Pravidelné biochemické reakce, častá expozice nepříznivému prostředí a zvýšený příjem xenobiotik mají za následek produkci ROS [1]. ROS interagují s cysteinovými zbytky redox-senzitivních signálních molekul včetně transkripčních faktorů, proteinových tyrosinfosfatáz a proteinkináz; v důsledku toho oxidace thiolových skupin na těchto zbytcích vede ke změnám cílových proteinů, biologických účinků, signalizačních kapacit, imunity a doplňkových paradigmat živých/mrtvých buněk [2]. Chemické látky obsahující kyslík s reaktivními vlastnostmi jsou známé jako ROS, které zahrnují volné radikály a neradikálové molekuly, jako je superoxid a H2O2, v daném pořadí [3]. Oxidační stres vyvolaný ROS je spojen s etiologií řady onemocnění včetně rakoviny. Akutní myeloidní leukémie (AML) je rakovinné bujení krevních buněk v kostní dřeni. Buněčné a molekulární události, které jsou základem AML, zahrnují poškození DNA, klonální množení, zvýšenou buněčnou smrt a další genetickou nestabilitu, které jsou výsledkem oxidativního stresu vyvolaného ROS [4]. Fyziologie člověka je obdařena četnými mechanismy, které dokážou generovat antioxidanty k ochraně před oxidačním stresem, což vede k ochraně buněk před toxickými účinky a slouží k prevenci nemocí [5]. Buňky si však vyvíjejí endogenní mechanismy, které působí proti oxidativnímu stresu a zachovávají požadované ROS [6].
NAD(P)H: chinonoxidoreduktáza 1 (NQO1) je flavoenzym [7], který může katalyzovat dvou nebo čtyřelektronovou redukci a využívá této vlastnosti k detoxikaci chininů [8]. Může chránit buňky před oxidačním poškozením tím, že ponechá stranou redoxní cyklus a sníží produkci volných radikálů [8]. Kromě xenobiotické detoxikace se NQO1 podílí také na neutralizaci superoxidu, modulaci proteasomální degradace p53 [9], inhibici Bcl-2 [10] a zvýšené náchylnosti k poškození buněk [11].
Cisplatina je první protirakovinný lék na bázi platiny schválený Úřadem pro kontrolu potravin a léčiv (FDA) [12]. Cisplatina vyvolává apoptózu indukcí oxidačního stresu a nadměrnou expresí tumor supresorového genu p53 [12]. Několik nežádoucích účinků, včetně nefrotoxicity, hepatotoxicity, gastrotoxicity, ototoxicity, myelosuprese a neurotoxicity, je důsledkem oxidačního stresu vyvolaného cisplatinou [12]. Tyto vedlejší účinky výrazně snížily používání cisplatiny, přestože má vynikající protirakovinnou aktivitu. Je dobře známo, že cisplatina vyvolává oxidační stres a potlačuje gen NQO1 v ledvinách myší [13]. Proto se hledání a ověřování účinných přírodních zdrojů antioxidantů stává oblastí povědomí. Příjem antioxidantů rostlinného původu, jako jsou flavonoidy, karotenoidy a fenolové sloučeniny, může vést k ochraně před kardiovaskulárními chorobami, šedým zákalem a rakovinou [14].
R. vicarious (Polygonaceae) je v bengálštině znám jako "Takpalong/ Chukapalong/Amlabetom" [15]. Roste v pouštních a polopouštních oblastech Asie, Austrálie a severní Afriky [16]. Je to málo prozkoumaná ohrožená rostlina v Bangladéši. V Bangladéši lidé konzumují celou rostlinu jako zeleninu po vaření se solí, různým kořením a olejem. Někdy lidé používají pouze čerstvé listy v míchaném salátu jako alternativu k salátu. Syrový list je mírně kyselý, ale po uvaření silně nakysne. Navíc se do rybích pokrmů během vaření obvykle přimíchá malé množství listů, aby měly mírně kyselou chuť.
Tato rostlina se celosvětově používá jako zelenina a léčivá bylina [17]. Listy a semena se používají jako protijed na hadí a štíří jed [17]. V lidovém léčení se R. vicarious odedávna používá k léčbě jaterních onemocnění, špatného trávení, zácpy, hromadění, zvracení, plynatosti, srdečních potíží, bolestí, poruch sleziny, dyspepsie, bolestí zubů, bronchitidy, astmatu, svrabu, leukodermie a jako laxativní, žaludeční, předkrm, tonikum, diuretikum a analgetikum [18]. Tato rostlina obsahuje řadu biologicky důležitých sloučenin včetně flavonoidů, antrachinonů, karotenoidů, vitamínů, lipidů a organických kyselin, které jsou dobře známé jako antioxidační, antimikrobiální a protirakovinné látky [19]. Každá část této rostliny obsahuje kvercetin (flavonoidy) ve zvýšeném množství [15]. Tato rostlina obsahuje 0,25 mg vitamínu A, 1,33 mg vitamínu C, 2,37 mg vitamínu E [15], 3,38 mg flavonoidů a 5,66 mg polyfenolů [20] na 100 g sušiny.
Shahat a kolegové [21] prokázali antiangiogenní a antiproliferativní účinky methanolového (80%) extraktu z R. vicarious aerial part proti hepatocelulárnímu karcinomu na krysím modelu. Další studie prokázala in vitro antiangiogenní potenciál extraktu R. vicarious [22]. Metanolový extrakt z celého R. vicarious poskytuje ochranu proti hepatotoxicitě vyvolané tetrachlormethanem in vivo [23]. Protizánětlivý účinek u králíků byl zřejmý u methanolického extraktu z listů R. vicarious [24]. Nedávná studie [25] popsala in vivo nefroprotektivní účinek frakcionovaného ethanolického vikariózního extraktu R. proti toxicitě gentamicinu a dichromanu draselného.
S ohledem na výše uvedené informace jsme se zaměřili na inspekci účinku extraktů R. vicarious (RVE) z hlediska zotavení z nefrotoxicity vyvolané cisplatinou prostřednictvím zachování exprese genu NQO1 na zvířecím modelu.
cistanche zdravotní přínosy: léčba onemocnění ledvin
Materiály a metody
Chemikálie a činidla
Cisplatina a 2, 2-difenyl-1-pikrylhydrazyl (DPPH) byly zakoupeny od SIGMA-ALDRICH (USA).
Sada pro kolorimetrický test kreatininu (ID produktu – 700 460) byla zakoupena od Cayman Chemical (USA). Dulbeccovo modifikované Eagleovo médium (DMEM), fetální bovinní sérum (FBS) a antibiotikum (10,000 U/ml penicilinu a 10,000 ug/ml streptomycinu) byly zakoupeny od Gibco (Gibco Laboratories, USA). ROS-Glo™ H2O2 Assay kit a GoTaq® qPCR Master Mix byly získány od Promega (USA). Souprava pro reverzní transkripci TIAN-Script M-MLV byla zakoupena od TIANGEN (Čína) a primery od IDT (Integrated DNA Technologies, Malajsie). Všechny ostatní chemikálie a činidla použitá v tomto experimentu byly analytické čistoty.
Odběr rostlinných vzorků a příprava extraktu
Čerstvé rostliny R. vicarious byly zakoupeny z místního trhu v Sonadighi, Rajshahi, Bangladéš. Vzorek rostliny byl identifikován a ověřen Dr. Ahmad Humayan Kabir, katedra botaniky, University of Rajshahi, Bangladéš. Exemplář pod voucherem č. 00095 byl uložen v herbáři katedry botaniky, University of Rajshahi. Nadzemní části závodu byly vyčištěny, vysušeny při 37 stupních, rozemlety na hrubý prášek pomocí elektronické sušičky a skladovány v uzavřené nádobě při 4 stupních. Jemný prášek (10 g) se rozpustí v methanolu (500 ml). Obsah byl sonikován (Soni-prep 150, Čína) při 20 kHz po dobu 10 minut. Filtrace extraktu byla provedena za použití filtračního papíru ze skleněných vláken (Macherey NAGEL, GmBH, Německo) s DURAN Filtering Apparatus (Německo). Nakonec byl filtrát zakoncentrován za použití lyofilizačního zařízení (VirTis Benchtop Pro, SP SCIENTIFIC, USA). Extrakt byl nakonec pojmenován RVE.
Test antioxidační aktivity in vitro
Antioxidační kapacita RVE in vitro byla stanovena na základě vychytávání DPPH, jak bylo popsáno dříve [26] s malou modifikací. Schopnost RVE pohlcovat radikály DPPH byla hodnocena na základě převodu fialové barvy DPPH na žlutou barvu. Reakční směs v každé mikrocentrifugační zkumavce (2 ml) sestávala z 950 μl methanolického roztoku DPPH radikálů (0,1 mM) a 50 μl RVE z pěti různých koncentrací (200, 500, 1000, 2000 a 4000 ug /ml methanolu), aby byly konečné koncentrace 10, 25, 50, 100 a 200 ug/ml. Další zkumavka obsahující 50 ul methanolu a 950 ul methanolického roztoku DPPH byla ponechána jako kontrola. Zkumavky byly ponechány 30 minut na tmavém místě. Absorbance směsí byla měřena při 517 nm pomocí GENESYS 10S UV-VIS spektrofotometru (Thermo SCIENTIFIC, USA). Nakonec bylo vypočteno procento aktivity pohlcující radikály (RSA) na základě odbarvení DPPH pomocí následujícího vzorce procento RSA=[(ADPPH − ARVE)/ADPPH] × 100, kde ADPPH je absorbance roztoku DPPH (kontrola) a ARVE je absorbance roztoku RVE. Koncentrace, při které RVE vedla k 50 procentům RSA, byla označena jako hodnota IC50 a byla vypočítána pomocí grafu, v němž bylo procento RSA umístěno proti různým použitým koncentracím RVE.
Experimentální zvířata a experimentální design
Samci myší Swiss Albino ve věku 42 dní (30–32 g tělesné hmotnosti) byli aklimatizováni po dobu 1 týdne před zahájením experimentu v místnosti (teplota asi 25 ± 2 stupně a ~ 50 procent vlhkosti, cyklus tma/světlo 12 hodin). Pitná voda a jídlo byly poskytovány ad libitum.
Myši byly náhodně rozděleny do osmi skupin (n {{0}}). První (kontrolní) skupina byla ošetřena 0,2 ml 0,9% NaCl. Další čtyři skupiny byly léčeny cisplatinou v dávce 2,5 mg/kg po dobu 5 dnů v intervalu 24 hodin. Po podání cisplatiny byla jedna skupina (druhá skupina) ponechána bez jakékoli další léčby a zařazena jako stresovaná kontrolní skupina. Třetí, čtvrtá a pátá skupina byla dále léčena RVE v dávkách 25, 50 a 100 mg/kg po dobu 5 dnů. Další tři skupiny byly léčeny pouze RVE v dávkách 25, 50 a 100 mg/kg po dobu 5 dnů. Cisplatina a RVE byly rozpuštěny v destilované vodě. Všechny léčby byly podávány intraperitoneálně. Po 24 hodinách od posledního ošetření byla zvířata po cervikální dislokaci usmrcena [25]. Poté se pobřišnice otevřela nůžkami, krev byla odebrána po punkci srdce a ledviny byly odebrány pomocí kleští. Krev byla podrobena kontrole hladiny kreatininu v séru. Ledviny byly podrobeny hodnocení hladiny malondialdehydu a genové exprese.
Měření sérového kreatininu
Sérový kreatinin byl měřen pomocí sady Creatinin Colorimetric Assay Kit-700,460 (Cayman Chemical, USA) podle protokolu výrobce dodávaného se sadou.
Měření renální peroxidace lipidů
Malondialdehyd (MDA) je konečným produktem peroxidace lipidů v ledvinové tkáni a obvykle se měří jako indikátor produkce ROS. Hladina MDA však byla měřena v renální tkáni podle předchozí studie [27]. Nejprve byla renální tkáň homogenizována v pufru fosforečnanu sodného (0,1 M, pH 7,4). Reakční roztok obsahující 0,8 procenta kyseliny thiobarbiturové (1,5 ml), 8,1 procenta SDS (200 ul), 20 procent (pH 3,5) kyseliny octové (1,5 ml) a dH2O (600 ul) byl přidán do 100 μl homogenizované tkáně a směs byla poté inkubována při 95 stupních po dobu 1 hodiny. Po ochlazení byly směsi centrifugovány při 10,000 g po dobu 10 minut při 4 stupních a absorbance supernatantu byla měřena při 532 nm se standardním 1, 1, 3, 3- tetramethoxypropanem. Množství celkového proteinu bylo měřeno pomocí soupravy Bradford Protein Assay kit (BIO-RAD, USA) a jeho porovnáním se standardním hovězím sérovým albuminem (BSA). Intenzita lipidových peroxidů byla vyjádřena jako nanomoly (nM) MDA na miligram (mg) proteinu.
Polymerázová řetězová reakce v reálném čase (PCR v reálném čase)
PCR v reálném čase byla provedena tak, jak bylo popsáno dříve [28, 29]. Celková RNA z ledvinové tkáně byla izolována pomocí činidla TRIzol® (Invitrogen) podle protokolu dodaného výrobcem. Izolovaná RNA (1 ug) byla poté převedena na cDNA. Nejprve byly odebrány 2 ul náhodného hexameru (10 uM), 2 ul dNTP (10 mM), 1 ug RNA a HO bez nukleázy až do 15 ul a inkubovány po dobu 5 minut při 70 stupních. Směs byla okamžitě umístěna na led na 2 minuty. Poté byly do každé zkumavky přidány 4 μl pufru 1. vlákna (5x) a 1 μl M-MLV reverzní transkriptázy a inkubovány po dobu 10 minut a 50
min při 25 stupních a 42 stupních. Nakonec byl enzym M-MLV reverzní transkriptázy inaktivován inkubací směsi při 95 stupních po dobu 5 minut. Syntetizované produkty cDNA byly podrobeny PCR v reálném čase pro kvantifikaci exprese genů NQO1, p53 a Bcl-2 pomocí specifických primerů (tabulka 1). Každá reakce (10 μL) byla provedena v triplikátech obsahujících 5 μL GoTaq qPCR Master Mix (2x) (Promega, USA), 0,5 μL (10 mM) každého primeru, 3 μL vody bez nukleázy a 1 μl cDNA v 48-jamkových reakčních destičkách. Tepelné cyklování bylo prováděno pomocí stroje PCR v reálném čase (Eco™ Real-Time PCR System, Illumine®, USA) s následujícími podmínkami cyklování: 95 stupňů po dobu 10 minut, následovaných 40 cykly 95 stupňů po dobu 30 s, 50 stupňů po dobu 30 s a 72 stupňů po dobu 25 s. Specifičnost PCR reakcí byla potvrzena analýzou křivky tání při 95 stupních po dobu 15 s, 45 stupních po 15 s a 95 stupních po 15 s. Specifičnost PCR reakcí byla potvrzena analýzou křivky tání při 95 stupních po dobu 15 s, 45 stupních po 15 s a 95 stupních po 15 s. Relativní kvantifikace genové exprese byla provedena pomocí endogenního genu GAPDH jako kontroly na základě metody ACq.
Buněčná kultura a léčba
Lidská epiteliální buněčná linie renálního proximálního tubulu, buňky HK{0}}, byly udržovány v DMEM doplněném 10 % FBS a antibiotiky (50 U/ml penicilinu a 50 ug/ml streptomycinu) v inkubátoru s 5 % CO2 a 95 % procento vlhkosti při 37 stupních.
Test měření H2O2
Hladina H2O2 v buňkách HK-2 byla odhadnuta pomocí soupravy ROS-Glo™ H2O2 Assay kit (Promega, USA) podle protokolu poskytnutého výrobcem soupravy. HK-2 buňky (1000 buněk) v 70 μl DMEM byly umístěny do jamek 96-jamkové mikrotitrační destičky. Po umožnění připojení buněk na povrch stěny bylo 10 μl DMEM z jamek mikrotitrační destičky nahrazeno 10 μl cisplatiny (25 μM v DMEM) a uchováváno v inkubátoru po dobu 12 hodin. Poté bylo přidáno 10 ul RVE, aby byly konečné koncentrace 125, 250 a 500 ug/ml v DMEM a inkubováno dalších 12 hodin. Poté bylo do každé jamky přidáno 20 μl roztoku substrátu H2O2 a 100 μl detekčního roztoku ROS-Glo™. Reakce byla inkubována při teplotě místnosti po dobu 20 minut. Nakonec byla změřena luminiscence pomocí GloMax Luminometer (Promega, USA).
GC-MS analýza
GC-MS analýza RVE (rozpuštěného v methanolu) byla provedena, jak je popsáno dříve [30] pomocí GCMS-QP2020 (SHIMADZU) zahrnujícího automatický vzorkovač (AOC{ {5}}s), autoinjektor (AOC-20i) a plynový chromatograf (GC-2010 Plus) propojený s hmotnostním spektrometrem vybaveným SH-Rxi{{1{{ 37}}}}Kapilární kolona Sil MS (30 m × 0,25 μm ID × 0,25 μm DF). Nosný plyn Helium bylo udržováno na konstantním průtoku 1,72 ml/min a vstřikovaný objem 5 μl byl podroben dělicímu poměru 10:1. Teplota vstřikovače byla udržována na 220 stupních, teplota iontového zdroje byla 280 stupňů, teplota pece byla naprogramována od 80 stupňů (udržení po dobu 2 minut), se zvýšením o 5 stupňů/min na 150 stupňů (doba zdržení 5,0 min), poté 5 stupňů/min na 280 stupňů, končící 8minutovou izotermou při 280 stupních. Hmotnostní spektra byla snímána při 1,5 kV se skenovacím intervalem 0,5 s a vzorek byl měřen v rozsahu 45–350 m/z. Zpoždění rozpouštědla bylo od 0 do 3 minut a celková doba běhu GC-MS byla 55 minut. Relativní koncentrace detekovaných sloučenin byla měřena porovnáním jejich průměrné plochy píku s celkovou plochou. Interpretace hmotnostního spektra v GC-MS byla provedena pomocí databází National Institute Standard and Technology (NIST) včetně NIST08, NIST08s a NIST14.
Statistická analýza
Statistické analýzy byly provedeny pomocí ANOVA po Dunnettově T3 testu pomocí softwaru IBM SPPS (verze 20). Data jsou vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (SD). Významné srovnání bylo zváženo na str<0.05. all="" of="" the="" graphs="" were="" prepared="" using="" microsoft="" excel="" (version="">
Výsledek
Test antioxidační aktivity in vitro
Ačkoli bylo dříve hlášeno, že RVE má antioxidační aktivitu, znovu jsme zkontrolovali antioxidační aktivitu našeho extraktu pomocí kapacity pohlcování volných radikálů DPPH. RVE neutralizoval DPPH v závislosti na dávce (obr. 1). RVE odhalila značnou antioxidační aktivitu in vitro a vypočtená hodnota IC50 RVE byla 37,39 ± 1,89 ug/ml.
Měření sérového kreatininu
Hladina sérového kreatininu u myší byla významně (p < {0}},05)="" zvýšena="" po="" podání="" cisplatiny="" (tabulka="" 2).="" léčba="" pomocí="" rve="" pozoruhodně="" (p="">< 0,05)="" zlepšila="" hladinu="" kreatininu="" v="" závislosti="" na="" dávce="" (tabulka="">
Měření renální peroxidace lipidů
Ve srovnání s kontrolou cisplatina značně (p < {{0}}="" 0,05)="" zvýšila="" obsah="" mda="" v="" renální="" tkáni="" myší="" (tabulka="" 3).="" naproti="" tomu="" léčba="" rve="" značně="" (p="">< 0,05)="" obnovila="" mda="" téměř="" do="" normálu="" způsobem="" závislým="" na="" dávce="" (tabulka="">
PCR v reálném čase
Cisplatina významně (p < {{0}}.05)="" snížila="" expresi="" mrna="" nqo1="" o="" 0.15-násobně="" a="" zvýšila="" p53="" a="" bcl-2="" mrna="" výraz="" 24="" a="" 4.{9}}násobek="" (obr.="" 2).="" rve="" značně="" (p="">< 0.05)="" zmírnil="" expresi="" mrna="" nqo1,="" p53="" a="" bcl-2="" způsobem="" závislým="" na="" dávce="" (obr.="" 2).="" ve="" srovnání="" s="" jedinou="" skupinou="" léčenou="" cisplatinou="" byla="" exprese="" mrna="" nqo1="" zvýšena="" o="" 3,57,="" 6,36="" a="" 9.28-krát="" 25,="" 50="" a="" 100="" mg/kg="" rve="" (obr.="" 2a).="" exprese="" mrna="" p53="" byla="" opět="" snížena="" o="" 0,63,="" 0,46="" a="" 0.21-krát="" při="" 25,="" 50="" a="" 100="" mg/kg="" rve="" (obr.="" 2b).="" exprese="" bcl-2="" mrna="" byla="" také="" snížena="" o="" 0,71,="" 0,40="" a="" 0,{47}}krát="" při="" 25,="" 50="" a="" 100="" mg/kg="" rve="" (obr.="" 2c).="" nebyly="" však="" zjištěny="" žádné="" významné="" (p=""> 0,05) změny v hladině exprese genů NQO1, p53 a Bcl-2 v důsledku léčby RVE (obr. 3).
H2O2měření
V testu měření H2O2 H2O2úroveň byla považována za úměrnou luminiscenci. Podání cisplatiny významně (p < {{0}}.05)="" zvýšilo="" hladinu="" h2o2="" 2.2-krát="" (obr.="" 4).="" léčba="" pomocí="" rve="" značně="" snížila="" (p="">< 0.05)="" hladinu="" h2o2="" o="" 0,25,="" 0,38="" a="" 0.{16}}krát="" odpovídajícím="" způsobem="" při="" 125,="" 250="" a="" 500="">
GC-MS analýza
Celkem 10 sloučenin (tabulka 4 a obr. 5) včetně "Isoborneol, pentamethyldisilanylether (seskviterpenalkohol)", "Thymin (pyrimidinová nukleobáze)", "4H-Py-ran-4-one, 2,{{ 8}}dihydro-3,5-dihydroxy-6-methyl- (saponin)“, „Hexadekanová kyselina, methylester (methylester mastné kyseliny)“, „9,12- Kyselina oktadekadienová, methylester (methylester mastné kyseliny), "9-Kyselina oktadecenová (Z)-, methylester (methylester mastné kyseliny)", "Methylstearát (methylester mastné kyseliny)", "Diisooktylftalát" (ester)", "13-dokosenamid, (Z)-(alkaloid)" a "Skvalen (triterpen)" byly detekovány v RVE.
výhody cistanche tubolosa: snížení krevních lipidů
Diskuse
Přírodní a syntetické antioxidanty byly komplexně studovány a bylo zjištěno, že jsou funkční buď pro prevenci nebo zmírnění toxicity ve fyziologii zvířat [31]. Antioxidační doplňky jsou složkou vyvinutou buď chemickou syntézou nebo extrakcí z přírodních potravin, ale nejsou svým složením totožné s antioxidanty dostupnými v potravinách [5]. Názory na to, zda syntetické antioxidanty poskytují podobné zdravotní přínosy jako přírodní antioxidanty, se proto v průběhu času rozdělují [32]. Přichází potřeba omezit používání syntetických antioxidačních doplňků a hledat alternativní, levné, obnovitelné, přírodní a možná i bezpečnější zdroje účinných přírodních antioxidantů.
Jedním z nejdůležitějších mechanismů je dráha jaderného faktoru erytroidního-2 faktoru souvisejícího-2 (Nrf2), který obecně chrání buňky před oxidačním stresem vyvolaným exogenními nebo endogenními stresory [27]. Účinné antioxidanty indukují expresi Nrf2, který se dále přesouvá do jádra a váže se na prvek antioxidační odezvy (ARE), který vyvolává expresi detoxikačního a antioxidačního genu NQO1 fáze II [33, 34]. NQ01 je široce a rozdílně exprimován tkáňově specifickým způsobem. NQO1 je cytosolický antioxidant flavoprotein, který katalyzuje 2-elektronovou redukci chinonů na hydrochinony, což má za následek detoxikaci elektrofilů a předvídání redoxního cyklování [35]. Podle předchozí studie [36] -lapachon aktivuje NQO1, což dále zvyšuje intracelulární hladinu NAD plus a chrání ledvinu před akutním poškozením vyvolaným cisplatinou.
Je známo, že cisplatina indukuje poškození glomerulární filtrační membrány prostřednictvím oxidačního stresu, zánětu a apoptózy, což dohromady vede ke snížení rychlosti glomerulární filtrace a ztrátě normální permeability membrány [37]. Hladina kreatininu v séru byla proto zvýšena. Sérový kreatinin je jedním z potenciálních markerů renální funkce. Léčba cisplatinou zvýšila obsah MDA v ledvinové tkáni, což je sekundární produkt peroxidace lipidů, a tato zpráva je stejná jako v předchozích studiích [27, 35, 37, 38]. Léčba pomocí RVE významně snížila obsah MDA v tkáni ledvin. Současně byla také snížena hladina kreatininu, což ukazuje na zlepšující účinek RVE.
Kromě toho byla exprese NQO1 významně snížena a exprese p53 a Bcl{2}} byla významně zvýšena po expozici cisplatině. Pokud jde o expresi NQO1 a p53 in vivo, náš výsledek je v souladu s předchozí studií [13]. Nedávná studie [39] ukázala, že cisplatina významně snížila expresi Bcl-2 v ledvinách myší, ale překvapivě jsme zjistili zvýšenou expresi. Tento rozdíl může být výsledkem rozdílu v dávce [40], protože Mohamed a kolegové [39] používali 8 mg/kg po dobu 12 dnů, zatímco my jsme používali 2,5 mg/kg pouze 5 dnů. Jiná studie [41] uvedla, že cisplatina může zvýšit expresi Bcl-2 v dávce, kdy není cytotoxická. Opět platí, že zvýšená exprese Bcl{18}} senzibilizuje buňky vůči oxidativnímu stresu [40].
Exprese p53 je však za normálních fyziologických podmínek nízká, ale očekává se, že po léčbě cisplatinou bude up-regulována, protože toto chemoterapeutické činidlo na bázi platiny aktivuje apoptotickou dráhu závislou na p53. Jakmile jsme myši léčili cisplatinou, p53 byl významně zvýšen v ledvinách myší ve srovnání s kontrolou. Další protoonkogen Bcl-2 také koreluje s úrovní exprese NQO1. Napodobováním exprese p53 jsme také zjistili, že hladiny Bcl- 2 byly zvýšeny při léčbě cisplatinou, ale po léčbě RVE byly významně znovu pokryty. To je možné, v reakci na oxidační stres se gen p53 aktivuje a vede k zastavení buněčného cyklu, senescenci nebo apoptóze [6]. Při detoxifikaci je nadměrná exprese NQO1 často považována za korelovanou s apoptózou v rakovinných buňkách [10], ačkoli základní mechanismus apoptózy a nadměrné exprese NQO1 je stále kontroverzní. Navíc u hepatocelulárního karcinomu nadměrná exprese NQO1 snižuje expresi Bcl-2 [10]. Proto-onkogen Bcl- 2 má také p53 jako korelaci s expresí NQO1. p53 je sekvenčně specifický transkripční faktor, který je aktivován četnými typy buněčného stresu [42], zatímco nadměrná exprese Bcl-2 působila jako mitochondriální stabilizátor pórů k usnadnění uvolňování cytochromu-c při oxidativním stresu [12]. V našem případě jsme zkontrolovali obě genové odpovědi při léčbě cisplatinou v normální tkáni ledvin a zjistili jsme jejich zvýšenou expresi. Léčba RVE vrátila expresi p53 a Bcl-2 téměř k normálu způsobem závislým na dávce. Tento typ zrušení exprese Bcl-2 byl také ukázán pomocí scavengeru ROS Trolox [43]. Kromě toho byla hladina H2O2 také výrazně zvýšena v buňkách HK-2 v důsledku léčby cisplatinou in vitro. Po léčbě RVE se hladina H2O2 významně vrátila k normálu. To je možná důsledkem efektu léčby RVE, která zvýšila expresi NQO1 [44], která působí ochranu proti oxidativnímu stresu [6].
GC-MS chromatogram potvrdil existenci deseti sloučenin v RVE. Mezi nimi "4H-Pyran- 4-one, 2, 3-dihydro-3, 5-dihydroxy-6-methyl-", "Hexadecanová kyselina" a " Skvalen“ jsou dobře známé antioxidanty [45–47]. Tyto tři sloučeniny dohromady pravděpodobně projevovaly synergický nefroprotektivní účinek. Předchozí studie také informovaly o indukci exprese NQO1 vitamínem A [48], vitamínem C [49], vitamínem E [50], flavonoidy [51] a polyfenoly [50]. Proto tato zpráva navrhuje objasnit, zda tento konkrétní extrakt obsahuje něco mezi vitamínem A, vitamínem C, vitamínem E, flavonoidy a polyfenoly nebo ne.
Závěr
Celkové zjištění naznačuje, že RVE je fyziologicky účinná při ochraně ledvin před poškozením vyvolaným cisplatinou. Proto je zásadní objasnit přesné sloučeniny odpovědné za zmírnění nefrotoxicity vyvolané cisplatinou, které se mohou stát prospěšnými pro aplikaci u lidí.
Poděkování
Autoři jsou vděční Bangladéšské radě pro vědecký a průmyslový výzkum (BCSIR), pobočce Rajshahi za poskytnutí laboratorní podpory pro kvantifikaci RNA.
Příspěvky autorů
MMH prováděla návrh experimentu, experimentování, analýzu a přípravu dat, psaní a editaci rukopisů, revize a návrhy rukopisů; MST & MME provedli experimenty a analýzu dat; AME & MAR se podíleli na dohledu a zdrojích; AH byl zodpovědný za konceptualizaci, dohled, zdroje a editaci rukopisu. Všichni autoři
zkontroloval rukopis. Autoři přečetli a schválili konečný rukopis.
Financování
Současnou práci financoval výzkumný tým Univerzity Taif Supporting Project číslo (TURSP - 2020/75), Univerzita Taif, Taif, Saúdská Arábie.
Dostupnost dat a materiálů.
Všechny relevantní údaje jsou k dispozici a mohou být na vyžádání poskytnuty příslušnému autorovi.
Prohlášení
Etický souhlas a souhlas s účastí
Etika pro provedení tohoto experimentu byla schválena Institutional Animal, Medical Ethics, Biosafety and Biosecurity Committee (IAMEBBC), Institute of Biological Sciences (IBSc), University of Rajshahi, a byla poskytnuta pod číslem zprávy 31/{{1} }IAMEBBC/IBSc. Všechny metody byly prováděny v souladu s pokyny a předpisy poskytnutými výše uvedenou etickou komisí. Tato studie byla provedena v souladu s pokyny ARRIVE (Animal Research: Reporting of In Vivo Experiments). "Souhlas s účastí" se na tuto studii nevztahuje.
Podrobnosti o autorovi
1 Laboratoř molekulární biologie a proteinů, Katedra genetického inženýrství a biotechnologie, Fakulta věd o životě a Zemi, Univerzita v Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladéš. 2 Laboratoř molekulární patologie, Institut biologických věd, Univerzita Rajshahi, Rajshahi 6205, Bangladéš. 3Katedra biotechnologie, College of Science, Univerzita Taif, PO Box 11099, Taif 21944, Saúdská Arábie. 4Katedra genetiky, Zemědělská fakulta, Alexandrijská univerzita, Alexandria 21545, Egypt.
Reference
1. Bagchi K, Puri S. Volné radikály a antioxidanty ve zdraví a nemoci: přehled. East Mediterr Health J. 1998;4:350–60.
2. Koh EM, Lee EK, Song CH, Song J, Chung HY, Chae CH a kol. Ferulát, aktivní složka pšeničných klíčků, zlepšuje nerovnováhu PTK/PTP vyvolanou oxidativním stresem a inaktivaci PP2A. Toxicol Res. 2018;34(4):333–41.
3. Hassan AI, Ibrahim RY. Některé genetické profily v játrech myší s nádorem Ehrlich ascites ve stresu z ozařování. J Radiat Res Appl Sci. 2014;7(2):188–97.
4. Zhou FL, Zhang WG, Wei YC, Meng S, Bai GG, Wang BY a kol. Účast oxidačního stresu při relapsu akutní myeloidní leukémie. J Biol Chem. 2010;285(20):15010–5.
5. Pham-Huy LA, He H, Pham-Huy C. Volné radikály, antioxidanty v nemoci a zdraví. Int J Biomed Sci. 2008;4:89–96.
6. Srijiwangsa P, Na-Bangchang K. Role NAD (P) H-chinon oxidoreduktázy 1 (NQO1) na progresi rakoviny a chemorezistenci. J Clin Exp Oncol. 2017;6:1–6.
7. Siegel D, Yan C, Ross D. NAD (P) H: chinonoxidoreduktáza 1 (NQO1) v citlivosti a rezistenci na protinádorové chinony. Biochem Pharmacol. 2012;83(8):1033–40.
8. Dinková-Kostova AT, Talalay P. NAD (P) H: chinonový akceptor oxidoreduktáza 1 (NQO1), multifunkční antioxidační enzym a výjimečně všestranná cytoprotekce. Arch Biochem Biophys. 2010;501(1):116–23.
9. Cullen JJ, Hinkhouse MM, Grady M, Gaut AW, Liu J, Zhang YP a kol. Dikumarolová inhibice NADPH: chinonoxidoreduktáza indukuje inhibici růstu rakoviny pankreatu mechanismem zprostředkovaným superoxidem. Cancer Res. 2003;63(17):5513–20.
10. Zhang X, Han K, Yuan DH, Meng CY. Nadměrná exprese NAD (P) H: chinonoxidoreduktáza 1 inhibuje proliferaci buněk hepatocelulárního karcinomu a indukovanou apoptózu aktivací AMPK/PGC-1 dráhy. DNA Cell Biol. 2017;36(4):256–63.
11. Zeekpudsa P, Kukongviriyapan V, Senggunprai L, Sripa B, Prawan A. Potlačení NAD (P) H-chinon oxidoreduktázy 1 zvýšilo citlivost buněk cholangiokarcinomu k chemoterapeutickým činidlům. J Exp Clin Cancer Res. 2014;33(1):1–13.
12. Dasari S, Tchounwou PB. Cisplatina v terapii rakoviny: molekulární mechanismy účinku. Eur J Pharmacol. 2014;740:364–78.
13. Zhu X, Jiang X, Li A, Zhao Z, Li S. S-Allylmerkaptocystein zeslabuje nefrotoxicitu vyvolanou cisplatinou prostřednictvím potlačení apoptózy, oxidačního stresu a zánětu. Živiny. 2017;9(2):166.
14. Matkowski A. Rostlinná kultura in vitro pro produkci antioxidantů – přehled. Biotechnol Adv. 2008;26(6):548–60.
15. El-Bakry AA, Mostafa HAM, Alam EA. Antioxidační aktivita Rumex vicarious L. ve vegetativní fázi růstu. Asian J Pharm Clin Res. 2012;5:111–7.
16. Rechinger KH. Rumex (Polygonaceae) v Austrálii: přehodnocení. Nuytsia. 1984;5:75–122.
17. Shahat AA, Alsaid MS, Alyahya MA, Higgins M, Dinkova-Kostova AT. NAD (P) H: Aktivita induktoru chinonoxidoreduktázy 1 některých saúdskoarabských léčivých rostlin. Planta Med. 2013;79(06):459–64.
18. El-Hawary SA, Sokkar NM, Ali ZY, Yehia MM. Profil bioaktivních sloučenin Rumex vicarious L. J Food Sci. 2011;76(8): C1195–202.
19. Barbosa-Filho JM, Alencar AA, Nunes XP, Tomaz AC, Sena-Filho JG, Athayde-Filho PF, et al. Zdroje alfa-, beta-, gama-, delta- a epsilon-karotenů: přehled z 20. století. Rev Bras. 2008;18(1):135–54.
20. Laouini SE, Ouahrani MR. Fytochemický screening, in vitro antioxidační a antibakteriální aktivita extraktu Rumex vicarious L.. Science Study Res: Chem Chem Engi Biotech Food Ind. 2017;18:367–76.