Kvantitativní hodnocení zánětlivých infiltrátů v biopsiích transplantovaných ledvin pomocí multiplexní amplifikace tyramidového signálu a hlubokého učení

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Meyke Hermsen¹Valery Volk²Jan Hinrich Bräsen²a kol

Abstraktní

Zpožděná funkce štěpu (DGF) je silným rizikovým faktorem pro rozvoj intersticiální fibrózy a tubulární atrofie (IFTA) při transplantacích ledvin. Kvantitativní hodnocení zánětlivých infiltrátů v biopsiích ledvin pacientů s DGF může odhalit prediktivní markery pro rozvoj IFTA. V této studii jsme zkombinovali multiplexní amplifikaci tyramidového signálu (mTSA) a konvoluční neuronové sítě (CNN) k posouzení zánětlivého mikroprostředí v biopsiích ledvin pacientů s DGF (n=22) odebraných 6 týdnů po transplantaci. Pacienti byli stratifikováni pro vývoj IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" one="" mtsa="" panel="" was="" developed="" for="" visualization="" of="" capillaries,="" t-="" and="" b-lymphocytes,="" and="" macrophages,="" and="" a="" second="" mtsa="" panel="" for="" t-helper="" cell="" and="" macrophage="" subsets.="" the="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged="" and="" custom-made="" python="" scripts="" enabled="" conversion="" to="" artificial="" brightfield="" whole-slide="" images="" (wsi).="" we="" used="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" with="" cytoplasmatic="" staining="" patterns="" in="" immunohistochemistry="" and="" developed="" two="" new="" cnns="" for="" the="" detection="" of="" macrophages="" and="" nuclear-stained="" lymphocytes.="" f1="" scores="" were="" 0.77="" (nuclear-stained="" lymphocytes),="" 0.81="" (cytoplasmatic-stained="" lymphocytes),="" and="" 0.82="" (macrophages)="" on="" a="" test="" set="" of="" artificial="" brightfield="" wsi.="" the="" cnns="" were="" used="" to="" detect="" inflammatory="" cells,="" after="" which="" we="" assessed="" the="" peritubular="" capillary="" extent,="" cell="" density,="" cell="" ratios,="" and="" cell="" distance="" in="" the="" two="" patient="" groups.="" in="" this="" cohort,="" the="" distance="" of="" macrophages="" to="" other="" immune="" cells="" and="" peritubular="" capillary="" extent="" did="" not="" vary="" significantly="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" between="" patient="" groups.="" cd163+="" cell="" density="" was="" higher="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (p="" <="" 0.05).="" cd3+cd8−/cd3+cd8+="" ratios="" were="" higher="" in="" patients="" with=""><10% ifta="" development="" (p="" <="" 0.05).="" we="" observed="" a="" high="" correlation="" between="" cd163+="" and="" cd4+gata3+="" cell="" density="" (r="0.74," p="" <="" 0.001).="" our="" study="" demonstrates="" that="" cnns="" can="" be="" used="" to="" leverage="" reliable,="" quantitative="" results="" from="" mtsa-="" stained,="" multi="" spectrally="" imaged="" slides="" of="" kidney="" transplant="">

Cistanche deserticola zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

Úvod

Zpožděná funkce štěpu (DGF) po transplantaci ledviny je multifaktoriální a souvisí především s charakteristikami dárce a dobou ischemie. DGF je obecně popisován jako potřeba dialýzy do 7 dnů po transplantaci a je silným rizikovým faktorem pro chronické poškození ledvinového štěpu [1–3]. Klasickou součástí chronického poškození ledvin je přítomnost intersticiální fibrózy a tubulární atrofie (IFTA). Ne všichni pacienti s DGF však progredují k rozvoji IFTA a komplexní vztah mezi DGF a IFTA je stále špatně pochopen. To je zaprvé způsobeno prodlevou mezi potenciálně kauzálními událostmi a funkčním poklesem a zadruhé kvůli variabilním a komplexním účinkům potenciálních induktorů, jako je odmítnutí a vedlejší účinky medikace [1, 4]. Obecná přítomnost zánětu a specifických makrofágů byla popsána v mnoha studiích jako prediktor ztráty štěpu [5–8]. Základní patologické procesy však nejsou plně pochopeny a vysoké úrovně zánětu vždy nevedou k dlouhodobé ztrátě štěpu. V důsledku environmentálních podnětů získávají makrofágy specializované funkce a polarizují se na různé fenotypy. Četné studie naznačují, že specifické podtypy makrofágů (alternativně aktivované makrofágy) se podílejí na remodelaci tkáně indukcí opravy tkáně nebo fibrózy. Je známo, že polarizace směrem k tkáňovému remodelačnímu (někdy pro-fibrotickému) fenotypu závisí na široké škále environmentálních stimulů, mimo jiné poskytovaných subtypy T-helper lymfocytů [9–11]. Hodnocení populací T-helper buněk ve štěpu v době DGF odhalilo převládající subtyp T-helper 1, ale korelace s výsledkem štěpu nebo progresí do IFTA nebyly dosud zkoumány [12]. Komplexní posouzení zánětlivého mikroprostředí specificky zaměřené na makrofágy a podskupiny pomocných T-buněk v pečlivě vybraných kohortách pacientů by mohlo poskytnout pohled na to, proč někteří, ale ne všichni pacienti s DGF postupují k rozvoji IFTA.

Komplexní vyšetření zánětlivých infiltrátů však brání několik (technických) omezení. Tradiční imunohistochemie (IHC) a imunofluorescenční techniky podporují vizualizaci pouze omezeného počtu buněčných markerů v jednom tkáňovém řezu. Sériové řezání malých, cenných tkáňových fragmentů, jako jsou biopsie ledvin, není žádoucí a interpretace vztahů mezi buňkami v různých řezech je obtížná. Navíc kvantitativní hodnocení zánětlivých infiltrátů vizuálním odhadem přináší značnou míru variability mezi pozorovateli [13]. Tradiční techniky zpracování obrazu, jako je prahování pixelů, předěl a segmentace založená na morfologii, spoléhají na předchozí znalost všech morfologických reprezentací buněk a intenzity zbarvení tkání v celém souboru dat [14–16]. Proto tyto metody často postrádají robustnost pro variace biologických a technických obrazů a špatně se přenášejí do nových nebo externích souborů dat. Vzestup digitální patologie urychlil vývoj alternativních metod pro hodnocení snímků na celém snímku (WSI) [17, 18]. Modely hlubokého učení, konkrétně konvoluční neuronové sítě (CNN), se ukázaly jako schopné segmentovat a detekovat relevantní biologické struktury na histopatologických preparátech [19–23]. Tyto techniky mají potenciál přejít od subjektivního vizuálního odhadu a tradičního zpracování obrazu k přesné, objektivní a reprodukovatelné detekci buněk.

Cílem této studie je vyvinout metodu pro objektivní, kvantitativní hodnocení mnohočetných zánětlivých buněčných markerů, a obejít tak potřebu rozsáhlého sériového dělení sklíčka. Abychom toho dosáhli, kombinujeme multiplexní IHC, multispektrální zobrazování a modely hlubokého učení. Abychom demonstrovali použitelnost těchto technik, studujeme korelace zánětlivého mikroprostředí, kvantifikované modely hlubokého učení, s vývojem IFTA v biopsiích štěpu pro sledování pacientů s DGF.

cistanche extrakt pro léčbu onemocnění ledvin

Materiály a metody

Abychom vyhodnotili zánětlivé mikroprostředí v biopsiích ledvin pacientů s DGF, provedli jsme multiplexní IHC na kontrolních biopsiích odebraných 6 týdnů po transplantaci. Pacienti byli stratifikováni pro vývoj IFTA (<10% versus="" ≥10%)="" from="" 6="" weeks="" to="" 6="" months="" post-transplantation,="" based="" on="" a="" histopathological="" assessment="" by="" three="" kidney="" pathologists.="" multiplex="" ihc="" was="" performed="" using="" tyramide="" signal="" amplification="" (mtsa)="" panels.="" one="" mtsa="" panel="" was="" designed="" for="" the="" visualization="" of="" capillaries,="" macrophages,="" and="" t="" and="" b="" lymphocytes="" (panel="" i),="" and="" one="" mtsa="" panel="" for="" the="" visualization="" of="" polarized="" t-helper="" lymphocytes="" and="" macrophages="" (panel="" ii).="" second,="" the="" mtsa="" slides="" were="" multi="" spectrally="" imaged,="" and="" custom-made="" python="" scripts="" were="" used="" to="" convert="" the="" multispectral="" images="" to="" artificial="" brightfield="" ihc="" wsi.="" converting="" the="" slides="" to="" artificial="" ihc="" wsi="" allowed="" for="" the="" application="" of="" an="" existing="" cnn="" for="" the="" detection="" of="" lymphocytes="" in="" ihc="" [22].="" this="" existing="" cnn="" was="" designed="" for="" cytoplasmatic="" lymphocyte="" markers.="" hence,="" a="" second="" and="" third="" cnn="" was="" developed="" in="" this="" study="" for="" the="" quantification="" of="" macrophages="" and="" nuclear="" lymphocyte="" markers="" in="" ihc="" wsi.="" these="" three="" cnns="" were="" subsequently="" used="" to="" quantitatively="" assess="" the="" inflammatory="" infiltrates="" in="" the="" two="" patient="" groups="" and="" to="" study="" the="" correlations="" of="" the="" inflammatory="" microenvironment="" at="" 6="" weeks="" post-transplantation="" with="" the="" development="" of="" ifta="" 6="" months="" after="">

Vzorky tkání

Použili jsme kontrolní biopsie od příjemců transplantované ledviny na lékařské fakultě Hannover (Hannover, Německo), získané v rámci prospektivního programu dozorové biopsie. Kritéria pro zařazení byla: výskyt DGF (definovaný jako<500 ml="" urine="" production="" within="" the="" first="" 24="" h="" after="" transplantation="" and/or="" the="" need="" for="" dialysis="" within="" 7="" days="" post-transplantation),="" absence="" of="" rejection="" in="" any="" of="" the="" surveillance="" biopsies="" or="" biopsies="" for="" cause="" within="" the="" first="" year="" post-transplantation,="" and="" absence="" of="" ifta="" in="" the="" surveillance="" biopsy="" taken="" at="" 6="" weeks="" after="" transplantation="" (based="" on="" the="" pathology="" report="" and="" graded="" according="" to="" the="" banff="" lesion="" grading="" system="" [24]).="" all="" patients="" were="" treated="" with="" dialysis="" because="" of="" no,="" or="" insufficient="" graft="" function,="" variably="" manifested="" by="" (combinations="" of)="" anuria,="" oliguria,="" metabolic="" de-arrangement="" with="" acidosis,="" or="" hyperkalemia.="" none="" of="" the="" patients="" had="" hyperkalemia="" or="" hypervolemia="" alone.="" formalin-fixed,="" paraffin-embedded="" tissue="" (ffpe)="" from="" biopsies="" taken="" 6="" weeks="" and="" 6="" months="" post-transplantation="" was="" collected.="" six="" patients="" did="" not="" undergo="" a="" surveillance="" biopsy="" procedure="" 6="" months="" after="" transplantation.="" instead,="" the="" surveillance="" biopsy="" was="" taken="" at="" 3="" months="" post-transplantation="" was="" included="" (n="3)" or="" the="" nearest="" cases="" with="" sufficient="" cortical="" tissue="" (here="" defined="" as="" ≥4="" glomeruli)="" in="" both="" the="" 6="" weeks="" and="" the="" 6="" months="" biopsy="" were="" included="" in="" the="" study="" (n="24)." one="" case="" was="" excluded="" because="" of="" interstitial="" nephritis="" of="" unknown="" cause="" and="" one="" more="" case="" due="" to="" fixation="" artifacts.="" a="" final="" number="" of="" 22="" patients="" were="" included="" in="" this="" study="" (table="">

Hodnocení IFTA

Rozsah intersticiální fibrózy (ci) a tubulární atrofie (ct) (IFTA) po 6 týdnech a 6 měsících, vyjádřený pomocí Banffova systému klasifikace lézí [24], byl získán ze zprávy o patologii. Pro podrobnější posouzení vztahu mezi časnými zánětlivými infiltráty a vývojem IFTA byla všechna sklíčka obarvená PAS digitalizována pro opětovné vyšetření pomocí digitálního skeneru sklíček Pannoramic 25{9} Flash II (3DHistech, Maďarsko) s 20 × objektiv s rozlišením 0,24 μm/ pixel. PAS WSI obou časových bodů (6 týdnů a 6 měsíců) byly hodnoceny pro rozsah IFTA (procento plochy povrchu s 10procentními intervaly) třemi ledvinovými patology. Průměrné skóre IFTA patologů bylo použito jako konečné skóre pro výpočet změny IFTA mezi 6 týdny a 6 měsíci po transplantaci. Pacienti byli stratifikováni podle absolutního zvýšení skóre IFTA o 10 procent nebo více (n=13) a žádné nebo<10% increase="" of="" ifta="" (n="9)" (table="" 1).="" recipient="" characteristics,="" donor="" characteristics,="" and="" banff="" ci,="" ct,="" ti,="" i,="" and="" i-ifta="" lesion="" scores="" (obtained="" from="" the="" pathology="" report)="" are="" listed="" in="" table="" 1="" for="" both="" patient="" groups.="" significant="" differences="" between="" patient="" groups="" were="" assessed="" using="" the="" independent="" samples="" mann–whitney="" u="" test="" or="" fisher's="" exact="" test="" and="" are="" displayed="" in="" table="">

Kromě toho byla srovnávána skóre Banffových lézí mezi časovými body pomocí testu Wilcoxon sign ranks. To odhalilo významné rozdíly mezi 6týdenní a 6měsíční biopsií pro Banff kategorie ti (p=0,017), ci (p=0,004) a ct (p=0,011) .

Multiplexní TSA barvení

Provedli jsme multiplexní IHC s použitím mTSA k vizualizaci více buněčných markerů v 6týdenních biopsiích. Po inkubaci s primární a sekundární protilátkou byla tkáň ošetřena fluorescenčně značeným tyramidem. Křenová peroxidáza ze sekundární protilátky katalyzuje tvorbu aktivních tyramidových radikálů. Tyramidové radikály se kovalentně vážou na tyrosinové zbytky na antigenu. Tato trvalá vazba umožnila teplem indukované odstranění komplexu primární-sekundární protilátky při zachování fluorescenčního tyramidu [25]. To umožnilo následnou následnou inkubaci s dalšími protilátkami ze stejného druhu proti cílovým antigenům.

mTSA byla provedena na dvou po sobě jdoucích sklíčkách z 6týdenních kontrolních biopsií. Vyvinuli jsme dva panely mTSA pro hodnocení zánětlivého infiltrátu a rozsahu peritubulárních kapilár v našich skupinách pacientů. Panel I existoval pro protilátky anti-CD3, CD4, CD8, CD20, CD68 a CD34. Panel II byl použit ke zkoumání polarizace T-helper buněk a makrofágů pomocí anti-CD4, Tbet, GATA3, CD68 a CD163 protilátek. Specifikace protilátek, ředění a pořadí barvení jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1. Všechna sklíčka byla zbavena parafinů v xylenu, dehydratována v 95% ethanolu, promyta vodou z vodovodu a vařena pro získání epitopu v 10x zředěném trisborátu-EDTA (TBE 10x , 0658, VWR Life Sciences, US) pufr. Po ochlazení byla sklíčka promyta 3% roztokem peroxidázy vodíku pro blokování endogenní peroxidázy a promyta tris-pufrovaným fyziologickým pufrem s 0,05% Tween 20 (822184, Merck KGaA, Německo) (TBS-T). Blokování proteinů bylo provedeno pomocí TBS-T s 1 procentem hovězího sérového albuminu (BSA) (mTSA krok 1). Primární protilátky byly inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti nebo přes noc při čtyřech stupních Celsia (mTSA krok 2). Po promytí v TBS-T byla sklíčka inkubována s HRP-konjugovanou sekundární protilátkou (Poly-HRP-GAMs/Rb IgG, VWRKDPVO999HRP, Immunologic, Nizozemí) po dobu 30 minut při teplotě místnosti (mTSA krok 3). Dále byla provedena TSA pomocí fluoroforů Opal TSA z Opal 7-color Manual IHC Kit (NEL811001KT, Akoya Biosciences, USA) (mTSA krok 4) (fluorofory a jejich odpovídající protilátky jsou uvedeny v doplňkové tabulce 1). Komplex protilátka-TSA byl odstraněn cyklem varu v TBE pufru (mTSA krok 5). Kroky 1–5 mTSA byly opakovány, dokud nebyla sklíčka obarvena všemi protilátkami z příslušného panelu. Sklíčka byla pokryta fluoromount-G s DAPI (00-4959-52, Thermo Fisher, USA).

herba cistanche

Multiplexní ověřování TSA

Opakované cykly varu mohou ovlivnit afinitu cílového epitopu. Některé protilátky vykazují slabší vzor barvení po vícenásobném varu tkáně, jiné protilátky potřebují více cyklů varu k dosažení optimální intenzity barvení a jiné nejsou ovlivněny vůbec. Tento účinek jsme hodnotili u všech protilátek pomocí chromogenního IHC na FFPE kontrolní tkáni mandlí. Pro každou testovanou protilátku (n=9) bylo vyříznuto šest řezů (tloušťka 4 μm). Všechna sklíčka byla zbavena parafinů v xylenu, dehydratována v 95% ethanolu, promyta ve vodě z vodovodu a vařena pro získání epitopu v 10x zředěném TBE (cyklus varu jedna). Po ochlazení bylo jedno sklíčko na testovanou protilátku uloženo ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Zbývající sklíčka se znovu uvařila. Tento cyklus se opakoval pětkrát. Všechna sklíčka byla následně promyta 3% roztokem peroxidázy vodíku a následně opláchnuta v PBS. Primární protilátky (doplňková tabulka 1) byly inkubovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti. Po inkubaci byla sklíčka promyta v PBS. Sklíčka barvená protilátkami anti-CD68, Tibet a GATA3 vyžadovala další inkubaci s post-protilátkovým blokováním (PAB) po dobu 15 minut (blokování VWRKDPVB, Immunologic, Nizozemsko). Po inkubaci byla sklíčka promyta v PBS a inkubována s HRP-konjugovanou sekundární protilátkou (podle PAB VWRKDPVB110HRP, Immunologic, Nizozemí, pro ostatní viz sekundární protilátka doplňková tabulka 1). Vizualizace byla provedena pomocí 3,3'-diaminobenzidinu (DAB) (Bright-DAB, VWRKBS04, Immunologic, Nizozemí). Výsledky jsou vizualizovány na doplňkovém obrázku 1. Na základě těchto výsledků jsme určili optimální pořadí protilátek pro experimenty s mTSA, jak je uvedeno v doplňkové tabulce 1.

Pokud jsou epitopy zájmu ko-lokalizovány, depozita tyramidu mohou vzájemně interferovat. K testování této sterické inhibice jsme použili sklíčka s kontrolní tkání mandlí a obarvili je našimi panely mTSA. Exprese protilátky v mTSA byla porovnána s expresí na jednobarevných sklíčkách, která prošla stejným počtem cyklů varu. Nepozorovali jsme rozdíly ve vzorcích barvení mezi jednoduše a multiplexně barvenými sklíčky (příklady zahrnuté z panelu I, doplňkové obrázky 2 a 3). Všechny primární protilátky v mTSA byly použity ve stejném ředění, které bylo použito pro chromogenní IHC. Intenzita fluorescenčního signálu byla optimalizována úpravou ředění TSA roztoku.

Multiplexní TSA zobrazování

Multispektrální zobrazování bylo prováděno pomocí Vectra Polaris Imaging System (CLS143455, Akoya Biosciences, USA) s objektivem 20x, při rozlišení 0,49 μm na pixel a pomocí DAPI, FITC, CY3, Texas Red a Cy5 spektrální kostky. Systém Vectra umožňuje ruční výběr regionů pro multispektrální snímání, které jsou následně systémem rozděleny do dlaždic (obr. 1.1). Spektra autofluorescence a všech fluoroforů Opal TSA byla předem zaznamenána ve spektrální "knihovně" pomocí softwaru Inform Advanced Image Analysis Software 2.4.6. (Akoya Biosciences, USA). Spektrální knihovna umožnila rozložit multiplexní dlaždici na několik samostatných dlaždic představujících příspěvek každého fluoroforu ("rozmixování"). To vedlo k monochromovým, vícekanálovým dlaždicím, přičemž každý kanál odpovídal jednomu fluoroforu, a tedy protilátce (obr. 1.2).

Konverze na IHC s umělým jasným polem

Na základě uložených souřadnic byly dlaždice sešity tak, aby vytvořily vícekanálové WSI pomocí vlastního python skriptu (obr. 1.3). Kanály představující signál DAPI (IDAPI) a kanály představující jednu z protilátek (IIHC) byly převedeny na umělý hematoxylin a DAB barvení, v daném pořadí (obr. 1.4 a 1.5). Na základě známého chromatického hematoxylinu a DAB Cx, Cy souřadnic po transformaci hue-saturation-density (HSD) byly vektory barvení získány v předchozích studiích [26, 27]. Tyto vektory barvení byly použity k výpočtu hodnot červená-zelená-modrá pro IHC umělého světlého pole (obr. 1.5), jako:

s CR, st absorpce světla barviva st v červené části spektra. Hodnoty pro B a G byly vypočteny podobným způsobem.

Analýza obrazu

Oblasti zájmu (ROI)

Oblasti zájmu (ROI) byly anotovány pro každý případ v kohortě pomocí softwaru platformy pro automatizovanou analýzu diapozitivů (ASAP; verze 1.9, dostupný jako software s otevřeným zdrojovým kódem na GitHubu). Tyto oblasti zájmu se skládají z kortikálního tubulointersticia, tedy vylučují pouzdro, glomeruly a tepny. Vzhledem k tomu, že zánět v renálních subkapsulárních oblastech je v transplantační patologii považován za nespecifický, biopsie v této studii byly primárně analyzovány s vyloučením subkapsulární oblasti (definované jako 400 µm pod pouzdrem). Sekundárně jsme opakovali analýzy včetně subkapsulární oblasti. Vizuální příklady oblastí zájmu jsou uvedeny na doplňkovém obrázku 4.

Detekce lymfocytů CNN I

Umělé IHC obrazy ve světlém poli představující barvení CD3, CD4, CD8 a CD20 byly analyzovány pomocí existující CNN s architekturou U-Net [22, 28]. Tato síť byla speciálně navržena pro detekci cytoplazmatických lymfocytárních markerů v IHC. Výkon CNN lze vyjádřit přesností, zapamatovatelností a skóre F1-, kde:

CNN dosáhla přesnosti {{0}},76, stažení 0,79 a F1-skóre 0,78 na testovací sadě který byl použit v původním článku, obsahujícím tradiční IHC WSI. Detekce jednotlivých pozitivních buněk vyžaduje prahování výstupu CNN, po kterém následuje postprocessing. Protože barvení CD3 v panelu mTSA bylo silnější ve srovnání s CD4, CD8 a CD20, byl použit nižší práh detekce objektu pro poslední tři (0,4) a původní práh detekce objektu pro CD3 (0,7). K posouzení výkonu CNN na umělých IHC WSI s jasným polem v této studii byly v této studii použity čtyři umělé pole IHC WSI (CD8 a CD20 od dvou pacientů) jako testovací soubor. Tečkové anotace (n=1115) byly vygenerovány pomocí softwaru ASAP. Po použití sítě byla vypočtena přesnost, zapamatovatelnost a skóre F{19}}, aby bylo možné posoudit výkon CNN. Detekce byly považovány za pravdivě pozitivní, pokud byly nalezeny do 4 µm (průměrný průměr lymfocytů) od základní pravdivé anotace. Když byly nalezeny dvě detekce v rozmezí 4 µm, pouze detekce, která byla nejblíže anotaci, byla považována za skutečně pozitivní. Následně byla detekce lymfocytů CNN I použita pro analýzu všech umělých jasných IHC WSI reprezentujících cytoplazmatické lymfocytární markery (CD3, CD4, CD8 a CD20).

Detekce lymfocytů CNN II

Analýza umělého světlého pole IHC WSI s nukleárními barvícími vzory (jak jsou prezentovány T-bet a GATA3) kanály reprezentujícími DAPI a CD4 byly vybrány pro spojení do jednoho WSI (4). Barvicí vektory získané v předchozích studiích byly použity k umělému zbarvení signálu DAPI modře (hematoxylin) a signálu CD4 hnědé (DAB), což vedlo k umělému světlému poli IHC WSI (5).

požadované školení, ověření a testování nové CNN. Za tímto účelem bylo vyříznuto devět sklíček z kontrolní tkáně ledvin, mandlí a slepého střeva FFPE. Tato sklíčka byla IHC obarvena anti-Tibet (klon 4B1{{1{16}}}}, 14-5825-82, Thermo Fisher Scientific, USA) a anti-GATA3 (klon L50-823, CM -405B, Biocare Medical, Nizozemsko) protilátky. Diapozitivy byly digitalizovány pomocí digitálního skeneru diapozitivů Pannoramic 25{18}} Flash II v rozlišení 0,12 μm/pixel. Dva pozorovatelé vytvořili 5726 bodových anotací v různých oblastech pomocí softwaru ASAP. Anotace z pěti snímků byly použity pro trénování architektury U-Net CNN pomocí polí 256 × 256 pixelů s velikostí pixelů 0,49 μm/ pixel. Dvě WSI byly použity pro validaci CNN a pro stanovení prahu detekce objektu (0,4). Výkon CNN na tradičním IHC WSI byl hodnocen na zadržené testovací sadě dvou IHC WSI. Výkon CNN na umělém světlém poli IHC WSI byl hodnocen na sekundární testovací sadě obsahující čtyři umělé světlé pole IHC WSI (Tibet a GATA3 od dvou pacientů) s 1082 bodovými anotacemi. Přesnost, zapamatovatelnost a F1-skóre byly vypočteny pro posouzení výkonu v obou testovacích sadách. Detekce byly považovány za pravdivě pozitivní, pokud byly nalezeny do 4 µm od základní pravdivé anotace. Když byly nalezeny dvě detekce v rozmezí 4 µm, pouze detekce, která byla nejblíže anotaci, byla považována za skutečně pozitivní. Následně byla detekce lymfocytů CNN II použita pro analýzu všech umělých světlých polí IHC WSI reprezentujících jaderné (lymfocytární) markery (Tibet a GATA3).

Detekce makrofágů CNN

Na rozdíl od detekce lymfocytů není identifikace jednotlivých makrofágů jednoznačná. Zejména v seskupených scénách lze očekávat značnou míru variability pozorovatelů. Proto bylo použito mnohem větší množství případů a lidských anotací k trénování vyhrazené, třetí CNN pro detekci CD68 plus a CD163 plus makrofágů. Byla odebrána sklíčka barvená IHC (n=111) z nativní tkáně a tkáně transplantované ledviny. IHC barvení bylo provedeno pomocí anti-CD68 (klon PG-M1, GA61361-2, Dako Omnis, Dánsko nebo klon KP1, M0876, Dako, Dánsko) nebo anti-CD163 (klon MRQ -26 nebo 10D6, NCL-L-CD163, Leica Biosystems, UK) protilátka. Diapozitivy IHC byly digitalizovány pomocí panoramatického 250 digitálního skeneru diapozitivů Flash II nebo skeneru diapozitivů Aperio AT2 (Leica Biosystems, Wetzlar, Německo) v rozlišení 0,24 nebo 0 0,25 μm/pixel, resp. Čtyři pozorovatelé vytvořili 37 709 bodových anotací napříč více ROI ve WSI pomocí protokolu pro anotaci makrofágů, který byl dohodnut po počátečních pilotních experimentech. Anotace ze 101 snímků byly použity pro trénování architektury YoloV2 CNN [29]. Yolo je speciálně vhodný pro úlohy zaměřené na detekční úlohy. Síť sestávající ze sedmi konvolučních vrstev byla trénována na polích 256×256 pixelů extrahovaných v rozlišení 0,98 μm/pixel s ohraničujícími rámečky 21 μm (na základě průměrné velikosti makrofágů). Deset WSI bylo použito pro validaci CNN a pro stanovení prahu detekce objektu (0,45) a parametrů nemaximálního potlačení (0,05). Výkon CNN na tradičním IHC WSI byl hodnocen na zadržené testovací sadě deseti IHC WSI. Výkon CNN na umělém světlém poli IHC WSI byl hodnocen na sekundární testovací sadě obsahující čtyři umělé světlé pole IHC WSI (CD68 a CD163 od dvou pacientů) s 1033 body anotace. Skóre přesnosti, zapamatování a F1 byly vypočteny pro posouzení výkonu v obou testovacích sadách. Detekce byly považovány za skutečně pozitivní, pokud byly nalezeny do 21 um (průměrný průměr makrofágů) od základní pravdivé anotace. Když bylo nalezeno více detekcí v rozsahu 21 µm, pouze detekce, která byla nejblíže anotaci, byla považována za skutečně pozitivní. Následně byla makrofágová detekce CNN použita pro analýzu všech umělých IHC WSI ve světlém poli reprezentujících makrofágové markery (CD68 a CD163).

cistanche tubolosa testosteron

Dvojitá pozitivita

Pozitivita buněk pro dva markery (dvojitá pozitivita) byla hodnocena stanovením počtu pixelů mezi detekcemi buněk v různých kanálech. Pokud byla vzdálenost mezi dvěma detekcemi lymfocytů<4 µm,="" the="" cell="" was="" considered="" double-positive.="" for="" macrophages,="" this="" was="" set="" to=""><21µm. this="" was="" used="" to="" assess="" cd3+cd4+,="" cd3+cd8+,="" cd4+tbet+,="" cd4+gata3+,="" and="" cd68+cd163+="">

Počty buněk byly vypočteny uvnitř oblastí zájmu a hustoty buněk byly založeny na počtu buněk a ploše anotované oblasti zájmu.

Prostorové vztahy

Automatizovaná detekce buněk ve WSI umožňuje zkoumání prostorových vztahů mezi buňkami. Průměrná nejkratší vzdálenost byla stanovena (v oblastech kromě subkapsulární oblasti) pro buňky CD68 plus a buňky CD3 plus, CD3 plus CD8 plus a CD20 plus ve WSI panelu I pro obě skupiny pacientů a mezi buňkami CD163 plus a CD4 plus , CD4 plus Tbet plus a CD4 plus GATA3 plus ve WSI pro obě skupiny pacientů.

Peritubulární kapilární rozsah

Aby bylo možné posoudit rozsah peritubulární kapiláry, byly na Fidži analyzovány nesmíšené WSI reprezentující kanál CD34 (ImageJ verze 2.0.0, USA, makra a pluginy: "Open and Duplicate", "ASAP" ROI Reader") [30]. Pozitivní pixely byly určeny pomocí automatického prahování a následně vyjádřeny jako procento celkového počtu pixelů uvnitř ROI.

Statistická analýza

V 6týdenních biopsiích byly vypočteny hustoty následujících buněčných populací: T-lymfocyty (CD3 plus), cytotoxické T-lymfocyty (CD3 plus CD8 plus), B-lymfocyty (CD20 plus), makrofágy (CD68 plus, panely I a II), polarizované makrofágy (CD68 plus CD163 plus, CD163 plus), lymfocyty T-helper 1 (CD4 plus Tbet plus) a T-helper lymfocyty (CD4 plus GATA3 plus). Byly vypočteny Spearmanovy korelační koeficienty, aby se zjistilo, zda existuje korelace mezi hustotou lymfocytů T-helper 1 a T-helper 2 (CD4 plus Tbet plus, CD4 plus GATA3 plus) a hustotou polarizovaných makrofágů (buď CD68 plus CD163 plus nebo CD163 plus). Signál CD68 (fluorofor 540 nm) jsme pozorovali v umělých CD4 (fluorofor 520 nm) IHC panelu I. Proto dále uvádíme buněčné hustoty pro buňky CD3 plus CD8−. Abychom vyhodnotili rozdíly mezi skupinami pacientů s různými výsledky IFTA, uvádíme hodnoty mediánu, minimální a maximální hustoty buněk na skupinu. Významné rozdíly v hustotě buněk a rozsahu peritubulárních kapilár (definované jako CD34-pozitivní procento pixelů) mezi skupinami byly hodnoceny pomocí Mann–Whitneyho U testu pro nezávislé vzorky. Zda pacienti s různými výsledky IFTA vykazují významně odlišné poměry buněk CD3 plus CD8-/CD3 plus CD8 plus, bylo hodnoceno pomocí t-testu pro nezávislé vzorky. Rozdíly mezi skupinami pacientů v prostorových vztazích buněk CD68 plus a CD163 plus s jinými imunitními buňkami byly hodnoceny na významnost pomocí Mann–Whitneyho U testu pro nezávislé vzorky.

Výsledek

Detekce IHC pozitivních buněk na bázi CNN

Aby bylo možné aplikovat existující CNN, které byly původně vyvinuty pro mikroskopii ve světlém poli, byly fluorescenční snímky mTSA transformovány na snímky s umělým jasným polem. Příklady oblastí obarvených mTSA s jejich odpovídajícími obrazy IHC s umělým jasným polem jsou zahrnuty na obr. 2. Příklad umělého IHC WSI ve světlém poli je ukázán na doplňkovém obr. 4. WSI s více rozlišením lze otevřít a prohlížet při prohlížení digitálních diapozitivů software jako ASAP a Aperio ImageScope [v12.4.3.5008]. Jak je znázorněno na obr. 2, umělé světlé pole IHC WSI bylo vhodné pro automatizovanou analýzu pomocí CNN, které byly původně vyvinuty pro tradiční IHC WSI.

Tři CNN byly použity pro kvantitativní hodnocení zánětlivých buněk v 6týdenních mTSA barvených transplantačních biopsiích: pro detekci lymfocytů cytoplazmatickým (CNN I) a jaderným (CNN II) IHC barvením a pro detekci makrofágů. Tabulka 2 ukazuje výkon CNN (přesnost, vyvolání a F1-skóre) pro sady výdrže jak IHC WSI obarvených DAB, tak IHC WSI s umělým jasným polem. Výkon CNN byl obvykle stejně dobrý nebo lepší než základní úroveň CNN popsaná dříve (s F1-skóre 0,78), u které bylo prokázáno, že má výkon srovnatelný se zkušenými manuálními pozorovateli [22] . Zatímco detekce lymfocytů CNN II vykazovala poněkud snížený výkon na virtuálních snímcích ve světlém poli ve srovnání se skutečnými snímky DAB (na kterých byla CNN trénována), u CNN byl pozorován opak pro detekci makrofágů.

Příklad úspěšného automatického hodnocení dvojí pozitivity je na obr. 3.

Korelace různých typů buněk

Nejsilnější korelace byla pozorována mezi CD4 plus GATA3 plus hustotou buněk a CD163 plus hustotou buněk (Spearmanův koeficient 0,75, p < 0.001)="" v="" 6týdenní="" biopsie="" (doplňkový="" obr.="" 5a).="" tato="" korelace="" byla="" slabší="" mezi="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" hustota="" buněk="" a="" cd163="" plus="" hustota="" buněk="" (spearmanův="" koeficient="" 0.61,="" p="">< 0.01)="" (doplňkový="" obr.="" 5b)="" .="" při="" omezení="" buněčné="" populace="" na="" dvojitě="" pozitivní="" makrofágy="" (cd68="" plus="" cd163="" plus)="" byl="" spearmanův="" korelační="" koeficient="" 0,65="" (p="">< 0,01)="" s="" buňkami="" cd4="" plus="" gata3="" plus="" a="" 0,66="" (p="">< 0,01)="" s="" cd4="" plus="" tbet="" plus="" buňky="" (doplňkový="" obrázek="" 5c,="" d).="" zahrnutí="" subkapsulární="" oblasti="" do="" analýz="" nezměnilo="">

Srovnání zánětlivých infiltrátů mezipacienti progredující do IFTA versus non-IFTA

Pacienti s progresí do IFTA za 6 měsíců vykazovali významně vyšší hustotu CD163 plus buněk v biopsiích odebraných 6 týdnů po transplantaci (medián 505 buněk/mm2) oproti pacientům, kteří neprogredovali do IFTA (medián 370 buněk/mm2; p=0 0,043) (tabulka 3). Zahrnutí subkapsulární oblasti vedlo k mírnému snížení tohoto efektu (p=0,051). V obou panelech byly použity CD68 a CD4. Sklíčka barvená panelem mTSA I vykazovala více pozitivity CD68 než sklíčka obarvená panelem mTSA II. Hustota buněk CD4 je vyšší v mTSA panelu II ve srovnání s mTSA panelu I (tabulka 3).

Rozsah peritubulárních kapilár byl podobný v 6týdenních biopsiích pacientů s DGF s různými výsledky IFTA (tabulka 3), a to jak při vyloučení (p=0,74), tak při zahrnutí (p=0,90) subkapsulární oblasti z/v analýze.

Stanovení poměru CD3 plus CD8−/CD3 plus CD8 plus buněk ukázalo významně vyšší poměr u pacientů s<10% ifta="" development="" 6="" months="" post-transplantation="" (ratio="" of="" 17.5)="" than="" in="" patients="" with="" ≥10%="" ifta="" development="" (ratio="" of="" 9.80;="" p="0.043)" (table="">

Průměrná nejkratší vzdálenost od buněk CD68 plus k buňkám CD3 plus, CD3 plus CD8 plus a CD20 plus (panel I) a od buněk CD163 plus k buňkám CD4 plus, CD4 plus Tbet plus a CD4 plus GATA3 plus buňkám (panel II) byla se mezi skupinami pacientů významně neliší. Výsledky jsou znázorněny na obr. 4.

extrakt z cistanche: zlepšuje funkci ledvin a fyzickou sílu

Diskuse

V této studii jsme vyvinuli metodu pro přesnou a objektivní kvantifikaci infiltrátů zánětlivých buněk v biopsiích štěpu pacientů po transplantaci ledviny s DGF, která obchází rozsáhlé sériové řezání materiálu biopsie ledviny. Pro tento účel jsme zkombinovali multiplexní IHC, zesílení tyramidového signálu, multispektrální zobrazování a kvantifikaci pomocí CNN. Byli jsme první, kdo převedl dlaždicová multispektrální data na jeden jediný umělý chromogenní obraz na buněčný marker, což usnadnilo analýzu WSI a aplikaci CNN navržených pro IHC ve světlém poli. Navrhli jsme dva nové CNN pro detekci jaderně obarvených lymfocytů a makrofágů a prokázali zobecnitelnost CNN vyvinutých na tradičním IHC WSI na umělé světlé pole IHC WSI. Použitelnost naší metody byla prokázána použitím kvantitativních výsledků získaných CNN ke studiu korelací zánětlivého mikroprostředí v 6týdenních biopsiích pacientů s DGF s rozvojem IFTA 6 měsíců po transplantaci.

Použili jsme komerčně dostupnou soupravu pro ruční barvení pro multiplexní IHC k vizualizaci imunitních buněk a peritubulárních kapilár v biopsiích z dozoru získaných 6 týdnů po transplantaci. Postup multiplexního barvení sestával z několika kroků promývání, inkubace a varu tkáně a zahrnuje několik roztoků činidel. Rozsáhlá validace metod a kontroly kvality jsou proto velmi důležité a doporučuje se použití specifických protilátek, které poskytují konzistentní intenzitu barvení. Navzdory provedeným validačním krokům byly v CD4 kanálech sklíček z mTSA panelů I a II vidět vzory barvení podobné makrofágům. Cykly barvení CD4 a CD68 nebyly prováděny po sobě, takže tento jev nemohl být způsoben neúplným stripováním protilátky CD68 (doplňková tabulka 1). Ačkoli byly popsány vzácné výskyty duální pozitivity makrofágů s CD4 [31], věrohodnější vysvětlení spočívá v blízkosti emisních spekter fluoroforů, která byla použita pro vizualizaci CD4 (520 nm) a CD68 (540 nm), obě pokrytá filtrační kostkou FITC fluorescenčního mikroskopu. To může způsobit "vypouštění" silného signálu CD68 do kanálu CD4. Velká část tohoto signálu byla vyloučena z analýzy v panelu I, protože pouze CD4 plus buňky, které byly dvojitě pozitivní na CD3, byly použity pro obecnou analýzu T-pomocných buněk. Rozhodli jsme se však nepřímo hodnotit také obecné T-pomocné buňky pomocí CD3 plus CD8− jako náhrady. V panelu II byl CD4 použit výhradně v kombinaci s Tibetem a GATA3, což omezuje riziko použití falešně pozitivních detekcí.

Nižší pozitivita CD68 byla pozorována v panelu II ve srovnání s panelem I. Předpokládáme, že jde o výsledek sterické inhibice depozitem tyramidu patřící k CD163 („deštník efekt“) [32]. Pozorovali jsme signifikantně více CD163-pozitivních buněk ve studované kohortě než ve tkáni mandlí, která byla použita ke kontrole sterické inhibice, což možná vysvětluje, proč tento efekt nebyl objeven během validace.

Multiplexní IHC bylo v několika onkologických studiích kombinováno s multispektrálním zobrazením pro vyšetření mikroprostředí nádoru a v poslední době také pro analýzu rejekce aloštěpu ledviny [33–35]. Pro extrakci příspěvku všech markerů na sklíčkách mTSA jsou řezy zobrazeny systémem Vectra nebo podobným fluorescenčním mikroskopem s multispektrálním nastavením. Po zaznamenání přehledového snímku s nízkým zvětšením systém Vectra rozdělí tkáň na dlaždice a automaticky dlaždice multispektrálně skenuje. Výsledkem jsou obrazové dlaždice s více přispívajícími spektry. Protože spektra jednotlivých fluoroforů jsou známa z předem zaznamenané spektrální „knihovny“, je možné rozložit dlaždice multiplexu na několik jednotlivých dlaždic představujících příspěvek každého fluoroforu (“rozmíchání”). Ve většině studií jsou nesmíchané obrázky následně analyzovány komerčním softwarem. V mnoha případech tyto programy nepodporují analýzu WSI, mají potíže s analýzou shluků buněk a často nejsou odolné vůči artefaktům a variacím barvení. Převedení nemíchaných dlaždic na umělé světlé pole IHC WSI nám umožnilo použít existující CNN speciálně navrženou pro detekci lymfocytů v IHC [22] (označovaná jako detekce lymfocytů CNN I). Tato síť dokáže detekovat jednotlivé a shluky lymfocytů s vysokou přesností a zároveň je odolná vůči barvení pozadí (obr. 2, CD3). Kromě toho jsme vycvičili dvě nové CNN pro detekci buněk s jaderným barvením (Tibet, GATA3) (detekce lymfocytů CNN II) a pro detekci makrofágů. Makrofágy je notoricky obtížné detekovat kvůli jejich rozptýlenému vzoru barvení. Detekce makrofágů CNN byla proto trénována pomocí anotací čtyř různých odborníků. Před vytvořením anotací bylo naplánováno několik schůzek, kde byla projednána a posouzena kritéria pro anotování makrofágů. To vedlo k síti, která dokáže detekovat makrofágy reprodukovatelným způsobem, přičemž je robustní pro nespecifické barvení (tabulka 2, obr. 2 a doplňkový obr. 6). Pokud je nám známo, jedná se o první algoritmus pro detekci makrofágů ve skenovaných histopatologických řezech. Výkon všech tří sítí jsme testovali na testovací sadě složené z tradičních IHC WSI (podobné těm, které se používají při tréninku) a na sekundární testovací sadě, která sestávala z umělého světlého pole IHC WSI, generovaného z multispektrálně zaznamenaných snímků. Všechny CNN vykazují velmi dobrý výkon na primárních testovacích sadách a podobné F1-skóre na sekundárních testovacích sadách. Výkonnostní metriky detekce lymfocytů CNN I byly vypočteny na normální tkáni, artefaktech a buněčných shlucích. Umělý IHC ve světlém poli druhé testovací sady neobsahoval žádné tkáňové artefakty a méně buněčných shluků. To může vysvětlit celkově lepší výkon této sítě na druhé testovací sadě. Detekce makrofágů CNN byla trénována a testována na anotacích čtyř různých anotátorů. Zatímco byla zvláště diskutována anotační kritéria, přesto byly pozorovány odchylky ve stylu anotace. Citlivost CNN je tedy pravděpodobně někde uprostřed extrémů stylu anotace. Anotace pro druhý testovací soubor byly generovány jedním anotátorem, zdánlivě odpovídající citlivosti CNN.

Použití popsaných CNN nám umožnilo vyšetřovat zánětlivý infiltrát s nebývalou přesností v unikátní sérii pečlivě vybraných časných sledovacích biopsií pacientů po transplantaci s DGF.

Bohužel mnoho vzorků muselo být z analýzy vyloučeno, většinou kvůli nedostatku zbytkové tkáně po diagnostickém zpracování. I přes omezenou velikost souboru dat jsme našli signifikantně vyšší CD163 plus buněčné hustoty v biopsiích pacientů s DGF, u kterých došlo k rozvoji IFTA, což je v souladu s potenciálně profibrotickou úlohou těchto buněk [11]. Zatímco pozorovaný trend byl v souladu s publikovanými údaji, nemohli jsme potvrdit škodlivý účinek časné přítomnosti CD68 plus makrofágů, které byly dříve hlášeny u jiných skupin pacientů po transplantaci ledviny [7, 36, 37]. Našli jsme pozitivní korelaci mezi hustotami CD4 plus GATA3 plus buněk a CD163 plus buněk, což by mohlo potvrdit příspěvek T-helper 2 lymfocytů k profibrotickému mikroprostředí. Zatímco v této studii nebyly objeveny žádné nové prediktivní biomarkery pro vývoj IFTA u pacientů s DGF, úspěšně jsme vyvinuli metody pro přesné, reprodukovatelné a škálovatelné hodnocení zánětlivého infiltrátu v řídké tkáni, jako jsou transplantační biopsie. Tyto metody jsou cenné pro budoucí kvantitativní studie zánětu v histopatologické tkáni.

Chcete-li zmírnit únavu nadledvin pomocí cistanche, klikněte sem a získejte další podrobnosti

Dostupnost dat

Žádosti o spolupráci zahrnující použití dat prezentovaných v této studii lze adresovat příslušnému autorovi (jeroen.vanderlaak@radboudumc.nl) nebo FF (Feuerhake. Friedrich@mh-hannover.de).

Poděkování

Děkujeme Marku Gorrisovi a Kiekovi Verrijpovi za jejich rady ohledně barvení a zobrazování mTSA, Merijnu van Erpovi za vývoj přizpůsobených funkcí ImageJ a Sophie van den Broek, Milly van de Warenburg a Martijnu Ottenovi za vytvoření základní pravdy pro síť detekce makrofágů. Dále děkujeme Irině Scheffnerové za její pomoc se sběrem klinických dat.

Autorské příspěvkyMH, VV, JS, WG, FF, BS, LBH a JAWML

navrhl studii. Materiál pro pacienty a klinická data byla shromážděna a poskytnuta JS, WG a FF. FF koordinoval úsilí vynaložené na MHH. JHB, EJS a JK skórovali na snímku PAS na procento IFTA. MH provedlo barvení mTSA, validaci panelů I a II a zobrazení a rozmíchání panelu I. VV zobrazovaný a nesmíchaný panel II. DJG vyvinul metody pro převod dlaždic mTSA na umělé světlé pole WSI. MH provedl převody. ZS-C vyvinul CNN pro detekci lymfocytů a napsal skripty pro kvantifikaci lymfocytů. JL vyvinul CNN pro detekci makrofágů a napsal skripty pro kvantifikaci makrofágů. MH provedla kvantifikaci buněk a kapilár. NSS vypočítal vzdálenosti buněk. MH, BS, LBH a JAWML analyzovaly data. MH udělal čísla a vypracoval dokument. Konečná verze rukopisu byla revidována a schválena všemi autory.

FinancováníTato práce byla podpořena iniciativou ERACoSysMed (projekt SysMIFTA) jako součást rámcového programu Evropské unie Horizont 2020 nabízeného společností ZonMw (grant č. 9003035004), se spolufinancováním německým ministerstvem výzkumu a vzdělávání (BMBF), grant č. . FKZ031L-0085A (SysMIFTA), FKZ01ZX1710A (MicMode-I2T) a FKZ01ZX1608A (SYSIMIT). JAWML obdržela konzultační poplatky od Philips (Nizozemsko) a granty od

ContextVision, Philips (Nizozemsko) a Sectra (Švédsko), mimo předloženou práci. JK získal finanční podporu od Dutch Kidney Foundation (projekt DEEPGRAFT, Grant č. 17OKG23).

Dodržování etických norem

Střet zájmůAutoři neuvádějí žádné konkurenční zájmy.

Etický souhlas a souhlas s účastíSběr a analýza dat byly prováděny s informovaným souhlasem pacienta a se souhlasem etické komise (č. 2765) Hannover Medical School.

Poznámka vydavateleSpringer Nature zůstává neutrální, pokud jde o jurisdikční nároky v publikovaných mapách a institucionálních přidruženích.

Otevřený přístupTento článek je licencován podle Creative Commons Attribution 4.{1}} Mezinárodní licence, která umožňuje použití, sdílení, adaptaci, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu nebo formátu, pokud uvedete příslušné jméno původního autora (autorů) ) a zdroj, uveďte odkaz na licenci Creative Commons a uveďte, zda byly provedeny změny. Obrázky nebo jiný materiál třetích stran v tomto článku jsou zahrnuty v licenci Creative Commons k článku, pokud není uvedeno jinak v kreditní hranici k materiálu. Pokud materiál není zahrnut v licenci Creative Commons článku a vaše zamýšlené použití není povoleno zákonnými předpisy nebo překračuje povolené použití, budete muset získat povolení přímo od držitele autorských práv.

Reference

1. Siedlecki A, Irish W, Brennanová DC. Zpožděná funkce štěpu při transplantaci ledviny. Am J Transplant. 2011;11:2279–96.

2. Khalkhali HR, Ghafari A, Hajizadeh E, Kazemnejad A. Rizikové faktory dlouhodobé ztráty štěpu u příjemců renálního transplantátu s chronickou dysfunkcí aloštěpu. Exp Clin Transplant. 2010;8:277–82.

3. Yarlagadda SG, Coca SG, Formica RN, Poggio ED, Parikh ČR. Asociace mezi opožděnou funkcí štěpu a aloštěpem a přežitím pacienta: systematický přehled a metaanalýza. Transplantace nefrolového číselníku. 2009;24:1039–47.

4. Schröppel B, Legendre C. Opožděná funkce ledvinového štěpu: od mechanismu k translaci. Kidney Int. 2014;86:251–8.

5. Mengel M, Reeve J, Bunnag S, Einecke G, Jhangri GS, Sis B a kol. Hodnocení celkového zánětu je lepší než současné Banffovo skóre zánětu v predikci výsledku a stupně molekulární poruchy v renálních aloštěpech. Am J Transplant. 2009;9:1859–67.

6. Cosio FG, Grande JP, Wadei H, Larson TS, Griffin MD, Stegall

MUDr. Předpovídání následného poklesu funkce aloštěpu ledviny z časných kontrolních biopsií. Am J Transplant. 2005;5:2464–72.

7. Toki D, Zhang W, Hor KLM, Liuwantara D, Alexander SI, Yi Z a kol. Role makrofágů ve vývoji fibrózy lidského renálního aloštěpu v prvním roce po transplantaci. Am J Transplant. 2014;14:2126–36.

8. Ikezumi Y, Suzuki T, Yamada T, Hasegawa H, Kaneko U, Hara M a kol. Alternativně aktivované makrofágy v patogenezi chronického poškození ledvinového aloštěpu. Pediatr Nephrol. 2015;30:1007– 17.

9. Biswas SK, Mantovani A. Plasticita makrofágů a interakce s podskupinami lymfocytů: rakovina jako paradigma. Nat Immunol. 2010;11:889–96.

10. Anders HJ, Ryu M. Renální mikroprostředí a makrofágové fenotypy určují progresi nebo ústup renálního zánětu a fibrózy. Kidney Int. 2011;80:915–25.

11. Ordikhani F, Pothula V, Sanchez-Tarjuelo R, Jordan S, Ochando J. Makrofágy při transplantaci orgánů. Frontiers Immunol. 2020;11:582939.

12. Loverre A, Divella C, Castellano G, Tataranni T, Zaza G, Rossini M, et al. Podskupiny T-helper 1, 2 a 17 buněk u pacientů po transplantaci ledvin s opožděnou funkcí štěpu. Transpl Int. 2011;24:233–42.

13. Klauschen F, Müller KR, Binder A, Bockmayr M, Hägele M, Seegerer P, et al. Bodování lymfocytů infiltrujících nádor: od vizuálního odhadu po strojové učení. Seminář Cancer Biol. 2018;52:151–7.

14. Lauren J, Häyry P, Paavonen T. Metoda založená na obrazové analýze pro kvantifikaci parametrů indexu chronického poškození aloštěpu. AMPS. 2006;114:440–8.

15. Malpica N, Solórzano CO, de, Vaquero JJ, Santos A, Vallcorba I, García-Sagredo JM, et al. Aplikace předělových algoritmů na segmentaci seskupených jader. Cytometrie. 1997;28:289–97.

16. Lai YK, Kalafuna PL. Efektivní kruhové prahování. IEEE Trans Med Imaging. 2014;23:992–1001.

17. Litjens G, Kooi T, Ehteshami Bejnordi B, Setio AAA, Ciompi F, Ghafoorian M, et al. Průzkum o hlubokém učení v analýze lékařského obrazu. Med Image Anal. 2017;42:60–88.

18. Madabhushi A, Lee G. Analýza obrazu a strojové učení v digitální patologii: výzvy a příležitosti. Med Image Anal. 2016;33:170–5.

19. Ehteshami Bejnordi B, Veta M, Diest PJ, van, Ginneken B, van, Karssemeijer N, Litjens G, et al. Diagnostické hodnocení algoritmů hlubokého učení pro detekci metastáz v lymfatických uzlinách u žen s rakovinou prsu. JAMA. 2017;318:2199–210.

20. Hermsen M, Bel T, de, Boer M, den, Steenbergen EJ, Kers J, Florquin S, et al. Histopatologické hodnocení ledvinové tkáně založené na hloubkovém učení. J Am Soc Nephrol. 2019;30:1968–79.