Pentraxinem{0}}zprostředkovaná aktivace komplementu u prasečího modelu ischemie/reperfuzního poškození ledvin

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Chiara Divella a kol

ABSTRAKTNÍ

Pentraxiny jsou rodinou evolučně konzervovaných molekul rozpoznávajících vzorce s klíčovou rolí ve vrozené imunitě a zánětu, jako je opsonizace patogenů během bakteriálních a virových infekcí. Zejména se ukázalo, že dlouhý pentraxin 3 (PTX3) reguluje několik aspektů zánětu cév a tkání během transplantace pevných orgánů.

Naše studie zkoumala roli PTX3 jako možného modulátoru aktivace komplementu u prasečího modelu renálního ischemického/reperfuzního (I/R) poškození. Prokázali jsme, že I/R poraněním indukovaná časná depozita PTX3 na peritubulární a glomerulární kapilární úrovni. Konfokální laserová skenovací mikroskopie odhalila depozita PTX3, která se lokalizovala společně s CD31 plus endoteliálními buňkami. Kromě toho byl PTX3 spojen s infiltrujícími makrofágy (CD163), dendritickými buňkami (SWC3a) a myofibroblasty (FSP1). Konkrétně jsme prokázali významnou PTX{10}}zprostředkovanou aktivaci klasických (C1q zprostředkovaných) a lektinových (MBL zprostředkovaných) drah komplementu. Je zajímavé, že depozita PTX3 se lokalizovala společně s aktivací terminálního komplexu komplementu (C5b-9) na endoteliálních buňkách, což ukazuje, že aktivace komplementu zprostředkovaná PTX3- se vyskytovala hlavně na renální vaskulární úrovni. Závěrem lze říci, že tato data naznačují, že PTX3 by mohl být potenciálním terapeutickým cílem pro prevenci I/R poškození vyvolaného komplementem.

Korespondence s:Giuseppe Castellano

klíčová slova:ischemické/reperfuzní poškození, systém komplementu, pentraxin 3,ledvina, klasická cesta

Cistanche tubulosa zabraňuje onemocnění ledvin, kliknutím sem získáte vzorek

ÚVOD

Ischemicko-reperfuzní (I/R) poškození představuje hlavní příčinu akutníchledvinazraněnípo transplantaci a vyznačuje se výraznou aktivací systému komplementu [1, 2]. V tomto scénáři hrají endoteliální buňky (EC) kritickou roli v maladaptivní reparaci po I/R, což vede k časné fibróze endoteliálním až mezenchymálním přechodem (EndMT) [3]. Během reperfuzní fáze komplement řídí imunologické a zánětlivé procesy a přispívá k různým imunitním a zánětlivým onemocněním [2–5]. Další základní složky humorální části vrozeného imunitního systému představují pentraxiny, o kterých se předpokládá, že hrají klíčovou roli ve vaskulární biologii [6].

Pentraxiny jsou rodinou multimerních rozpustných proteinů [6], které jsou na základě své struktury klasifikovány do krátkých a dlouhých rodin [7]. Tyto evolučně konzervované proteiny jsou efektory akutní fáze, které slouží jako senzory pro iniciaci zánětu a rychlý nárůst v plazmě během infekce [8]. Dlouhý pentraxin 3 (PTX3) je rozpustná molekula rozpoznávající vzory, která je klíčová pro vrozenou imunitní ochranu a může aktivovat systém komplementu [9–11].

Zejména PTX3 indukoval aktivaci klasické a lektinové dráhy vazbou s C1q, MBL, Ficolinem-2 a je schopen ovlivnit alternativní dráhu prostřednictvím CFH [10–12].

Na rozdíl od jiných pentraxinů produkovaných játry v krevním řečišti (tj. CRP) může být PTX3 uvolňován rezidentními buňkami v místě zánětu, například z mononukleárních fagocytů, dendritických buněk, fibroblastů a EC [9] působící parakrinním způsobem. [13]. PTX3 je také uložen v hotové formě v neutrofilech, lokalizován ve specifických granulích a secernován v reakci na rozpoznání mikrobiálních skupin [14]. V EC je exprese PTX3 snadno indukována TNF- a IL-1, čímž dochází k přechodu z klidového, protizánětlivého fenotypu do prokoagulačního a prozánětlivého stavu, čímž se silně reguluje mikrovaskulární funkce [7, 8 ]. Z tohoto důvodu byly úrovně PTX3 popsány jakochronickýledvinachorobazvýšení hladin proteinu PTX3 korelovalo s poklesem GFR a kardiovaskulárními komplikacemi, avšak stále je málo známo o úloze PTX3 v časných stádiích jako I/R-indukované akutníledvinazranění [15, 16].

Úloha PTX3 u zánětlivých onemocnění ledvin je bivalentní, protein může ze strany aktivovat klasické a lektinové dráhy podporující iniciální zánět a poranění [10–12]. Na druhé straně N-terminální doména aktivace komplementu modulovaného PTX3 zeslabila nábor leukocytů a inhibovala intersticiální fibrózu při akutním poškození ledvin, čímž podpořila opravu tkáně [17–20].

Komplement hraje klíčovou roli v patofyziologii akutních poranění vyvolaných I/Rledvinazranění[21, 22]. Na prasečím modelu poškození ledvin I/R jsme prokázali klíčovou roli aktivace systému komplementu při indukci EndMT a časné fibrózy se zapojením jak klasických, tak lektinových drah [23]. Kromě toho jsme prokázali, že terapeutická inhibice těchto cest komplementu rekombinantním C1-INH (rhC1INH) způsobila významné snížení ukládání komplementu se sníženým náborem infiltrujících zánětlivých buněk a tubulointersticiálním poškozením [23]. Tyto výsledky potvrdili také Delpech PO et al [24]; významná modulace v glomerulární a tubulární depozici C1q, MASP a C4d byla hodnocena po 30 minutách po reperfuzi, což ukazuje na ústřední roli C1-INH při působení proti klasickým a lektinovým drahám.

V této studii jsme zkoumali možné zapojení PTX3 do zprostředkování časné aktivace komplementu při poškození ledvin I/R, charakterizující různé buněčné zdroje PTX3.

VÝSLEDEK

PTX3 je exprimován endoteliálními buňkami a imunitními infiltrujícími buňkami v prasečím modelu I/R poranění

Nejprve jsme zkoumali přítomnost PTX3 na prasečím modelu teplého I/R-indukovaného poškození ledvin. Pozorovali jsme velmi omezené depozita PTX3 v normální tkáni (obrázek 1A). Poškození I/R způsobilo difuzní ukládání PTX3 již 15 minut po reperfuzi (obrázek 1B, 1C) v tubulointersticiální oblasti (obrázek 1E), v peritubulárních kapilárách (obrázek 1D; šipka) a na glomerulárních úrovních (obrázek 1D). Depozita PTX3 byla stále detekovatelná 1 hodinu po reperfuzi na úrovni peritubulárních kapilár (obrázek 1G). V naší předchozí práci [23] jsme ukázali, že hlavními rysy I/R poškození jsou apoptóza tubulárních epiteliálních buněk a nábor infiltrujících zánětlivých buněk, jako jsou monocyty, dendritické buňky a lymfocyty. Nicméně rutinním histologickým hodnocením (doplňkový obrázek 1) jsme prokázali, že 30 minut teplé ischemie následovaných 15 minutami reperfuzí indukovaného časného intersticiálního poškození tubulu, charakterizovaného větší kongescí kapilár a fokální cytoplazmatickou vakuolizací epitelu renálních tubulů, ve srovnání s bazálním stav.

Abychom dále charakterizovali buněčnou lokalizaci depozit PTX3 a vyhodnotili jeho potenciální účinek na modulaci zánětlivé odpovědi a poranění, provedli jsme analýzu dvojitým imunobarvením a konfokální mikroskopií. Exprese proteinu PTX3 byla detekována ve většině EC na peritubulárních (obrázek 2A) a glomerulárních (obrázek 2B) kapilárních hladinách, 15 minut po reperfuzi.

Je dobře známo, že poškození I/R je charakterizováno zvýšenou aktivací vrozených a adaptivních imunitních odpovědí, včetně přenosu zánětlivých buněk do nemocného orgánu, což dále zhoršuje poškození prostřednictvím imunitních buněk a systému komplementu [25]. V našem modelu prasat jsme také pozorovali, již 15 minut po reperfuzi, hustý zánětlivý infiltrát složený převážně z makrofágů a dendritických buněk v tubulo-intersticiální oblasti. Zjistili jsme, že obě tyto buňky prezentující antigen se vyznačovaly zvýšenou expresí PTX3 ve srovnání s T0, protože jsme pozorovali zvýšený počet CD163 plus /PTX3 plus (obrázek 2E, 2F, 2K) a SWC3a plus /PTX3 plus (Obrázek 2G, 2H, 2L) buňky na intersticiálních hladinách tubulů v T15.

Exprese PTX3 může přispívat k EndMT u poranění I/R

V předchozích pozorováních jsme prokázali, že I/R poranění bylo odpovědné za EndMT [26, 27], charakterizované získáním mezenchymálního fenotypu pomocí EC se ztrátou specifických endoteliálních markerů a ziskem mezenchymálních markerů, jako jsou fibroblasty specifické protein 1 (FSP-1), neuronální kadherin (N-cadherin) a alfa-aktin hladkého svalstva (alfa-SMA). Zkoumali jsme tedy, zda exprese PTX3 pomocí EC může ovlivnit tento proces. Jak se očekávalo, když jsme zkoumali expresi alfa-SMA jako markery aktivovaného myofibroblastu, nenašli jsme žádnou společnou lokalizaci mezi alfa-SMA a PTX3 (obrázek 2C, 2D). Naopak jsme během sledovaného období pozorovali nárůst tubulointersticiálních FSP1 plus /PTX3 plus myofibroblastů (obrázek 2K–2M).

Depozita PTX3 jsou spojena s aktivací systému komplementu

Nakonec jsme zkoumali, zda vklady PTX3 byly spojeny s aktivací komplementu. Stejně jako u jiných složek rodiny pentraxinů může PTX3 regulovat aktivaci klasické dráhy komplementu [7]. Abychom definovali vztah mezi PTX3 a aktivací komplementu, provedli jsme dvojitou imunofluorescenci, abychom vyhodnotili expresi PTX3 a terminální Komplex komplementu, C5b-9, využívající protilátky namířené proti C9-neoepitopu. Pozorovali jsme významnou společnou lokalizaci depozit PTX3 a C5b-9 (obrázek 3A, 3B). Terminální komplex komplementu byl lokalizován na peritubulární úrovni i v peritubulárních kapilárách spolu s vrstvou endoteliálních buněk, jak jsme již dříve prokázali [23, 28]. Protože PTX3 může aktivovat komplementový systém klasickou a lektinovou cestou, hodnotili jsme ukládání C1q a MBL v renálním parenchymu. Je zajímavé, že depozita C1q (obrázek 3E, 3F) a MBL (obrázek 3C, 3D) byla nalezena hlavně na intersticiální a kapilární úrovni (obrázek 3C až 3F), jak bylo popsáno dříve [23], a kolokalizována s depozity PTX3.

C1-inhibitor interferuje s vazbou PTX3 na endoteliální buňky

V naší předchozí práci [23] jsme prokázali, že podávání C1-inhibitoru vedlo k významnému snížení ukládání komplementu, se sníženým náborem infiltrujících zánětlivých buněk a tubulointersticiálním poškozením. Proto jsme zkoumali hladinu exprese PTX3 u zvířat léčených rhC1-INH. Zjistili jsme, že infuze C1-inhibitoru snížila depozita PTX3 v peritubulárních kapilárách a intersticiální úrovni po 15 minutách po reperfuzi (obrázek 4A).

Kromě toho, abychom podpořili hypotézu, že snížení depozit PTX3 u zvířat léčených rhC1-INH bylo spojeno s inhibicí poškození endotelu, provedli jsme experimenty in vitro a vyhodnotili jsme vazbu rhC1-INH a PTX3 na kultivované EC za normálních podmínek nebo v přítomnosti buněčného stresu (obrázek 4B). Analýza FACS ukázala, že EC za normálních podmínek nevázala jak rhC1-INH, tak PTX3. V souladu s naší předchozí studií [26] jsme pozorovali zvýšenou buněčnou vazbu rhC1-INH na H2O2-stimulovanou EC ve srovnání s bazálními podmínkami. Navíc v nepřítomnosti rhC1-INH by PTX3 mohl vázat aktivovaný EC. Je zajímavé, že když H2O2-aktivovaný EC byl inkubován s PTX3 a rhC1-INH, pozorovali jsme, že C1INH byl schopen chránit EC po blokování vazby PTX3.

DISKUSE

V této studii jsme prokázali depozici PTX3 v časné fázi renálního I/R poškození a její možný příspěvek k rozvoji EndMT. Zajímavé je, že jsme zjistili, že aktivace komplementu zprostředkovaná PTX3-se vyskytuje hlavně na vaskulární úrovni, kde se nachází společně s C1q a MBL, rozpoznávacími molekulami klasických a lektinových drah kaskády komplementu.

Poškození I/R spouští výraznou zánětlivou odpověď charakterizovanou aktivací komplementu, volnými kyslíkovými radikály a prozánětlivou produkcí cytokinů, což vede k aktivaci vaskulárního endotelu a periferních leukocytů [29, 30]. Během I/R poranění vede aktivace komplementu k ukládání komponent komplementu na povrchovou membránu poškozeného a dysfunkčního EC se současnou tvorbou anafylatoxinů a amplifikací zánětlivého procesu [31]. Během zánětu se PTX3 rychle zvyšuje a mohl by hrát ústřední roli v modulaci endoteliální odpovědi. PTX3 byl skutečně indikován jako potenciální biomarker vaskulární endoteliální dysfunkce u několika onemocnění, včetně chronickýchledvinaonemocnění, preeklampsie a několik vaskulárních onemocnění [7, 16, 17, 32]. Prokázali jsme také, že PTX3 se podílí na dalších vaskulárních komplikacích, jako je selhání arteriovenózní píštěle u hemodialyzovaných pacientů [33]. Tato pozorování naznačují, že PTX3 by mohl být mostem mezi zánětlivou odpovědí a endoteliální dysfunkcí [34]. V souladu s těmito studiemi jsme pozorovali depozita PTX3 na endoteliální úrovni již po 15 minutách po reperfuzi (obrázek 2A, 2B). Naše výsledky také ukázaly, že v časné fázi I/R poranění se PTX3 kolokalizoval s myofibroblastovým markerem, FSP-1 (obrázek 2I, 2J), ale ne s alfa-SMA, markerem exprimovaným aktivovaným myofibroblastem (obrázek 2C, 2D). Celkově vzato by tato data mohla naznačovat, že endoteliální dysfunkce a proces EndMT [35], pozorované u zvířat s I/R [26], se poprvé objevily u EC exprimujících PTX3.

Spojení mezi PTX3 a zánětlivými buňkami je široce uznáváno. V tomto článku jsme se konkrétně zaměřili na inherentní účinky PTX3 na intersticiální infiltraci leukocytů, které jsou hlavním zdrojem PTX3 [36]. Konkrétně jsme zjistili, že makrofágy a dendritické buňky po 15 minutách po reperfuzi exprimují vyšší hladiny PTX3 (obrázek 2E až 2H). Tyto údaje jsou v souladu s narůstajícím množstvím důkazů naznačujících relevantní roli vrozené imunity při zprostředkování časného poškození při I/R poranění [23]. Včasná aktivace komplementu v renální tkáni po poranění I/R vede ke generaci několika zánětlivých mediátorů, které zvyšují nábor imunitních buněk [21, 23, 37, 38]. Nedávné studie identifikovaly PTX3 jako jednu z hlavních složek sítě, která řídí zánětlivou odpověď spouštěnou I/R poraněním [39]. V různých experimentálních modelech I/R poškození může PTX3 vykonávat dvojí opačné role na specifické tkáně [40, 41]. Časná produkce PTX3 je spojena s poškozením ledvin, protože indukuje časnou expresi endoteliálních adhezních molekul a chemokinů, které urychlují lokální maladaptivní zánětlivou odpověď.

Naopak prodloužená lokální produkce PTX3 zabraňuje nadměrnému orgánovému zánětu a dysfunkci [41].

PTX3 je komplementový kaskádový modulátor [9, 42]; to je v souladu s pleiotropními vlastnostmi PTX3, což ukazuje na dvojí roli PTX3 jako modulátoru nebo zesilovače přirozené imunitní odpovědi [39]. Zpočátku PTX3 aktivuje komplement vazbou C1q a MBL [43]; časný zvýšený zánět je však třeba omezit na cílovou oblast. Proto by PTX3, náborem faktoru H nebo inhibicí angiogeneze, mohl také snížit zánětlivou odpověď a aktivaci komplementu a zachovat renální parenchym před zánětlivým poškozením [43]. Ačkoli je aktivace komplementu v I/R u hlodavců lokalizována hlavně na tubulární úrovni [44], během reperfuzní fáze je endotel primárním cílem různých prozánětlivých látek, včetně mediátorů komplementu [2]. Již dříve jsme prokázali, že na prasečím modelu poranění I/R stejně jako u pacientů s DGF dochází k aktivaci komplementového systému v časné fázi, na peritubulárních kapilárách, v intersticiu a na glomerulárním endotelu [23]. Naše data ukázala jasnou společnou lokalizaci depozit C5b-9 na PTX3 plus EC po 15 minutách po reperfuzi (obrázek 3A, 3B). Renální endotel se tedy zdá být převládajícím místem aktivace komplementu zprostředkované PTX3- v časné fázi I/R poranění v preklinických i klinických podmínkách.

Interakce pentraxinů s C1q a její role v aktivaci klasické komplementové dráhy jsou dobře popsány [45–47]. V kontextu vrozených imunitních odpovědí může PTX3 vázat různé složky komplementu a modulovat aktivaci komplementu [43, 48]. PTX3 aktivuje komplement vazbou C1q [49]. Naše výsledky na zvířecím modelu jasně ukázaly, že PTX3 může zprostředkovat aktivaci klasické dráhy interakcí s C1q (obrázek 3E, 3F). Navíc PTX3 také moduluje lektinovou dráhu komplementu, jak je znázorněno na obrázku 3C, 3D. MBL váže PTX3 prostřednictvím své domény podobné kolagenu [45] a komplexy MBL/PTX3 rekrutují C1q a vyvolávají ukládání C3 a C4 na povrchy cílových buněk.

Celkově tyto výsledky naznačují ústřední roli PTX3 při zprostředkováníledvinapoškození při poranění I/R, což by mohlo mít důležité důsledky pro terapie zaměřené na komplement při poškození ledvin I/R.

V naší předchozí studii [26] jsme zkoumali zapojení komplementu do zprostředkování aktivace EC pomocí rekombinantní formy C1-INH, silného inhibitoru proteáz klasické a lektinové cesty komplementu (C1r, C1s, a MASP2). Na stejném zvířecím modelu jsme ukázali (obrázek 4A), že terapeutická inhibice obou drah pomocí rhC1INH snížila depozita PTX3 v peritubulárních kapilárách a intersticiální úrovni po 15 minutách po reperfuzi. Tato data potvrzená in vitro výsledky na EC (obrázek 4B) nás vedla k hypotéze, že rhC1INH může chránit poškozenou EC po blokování vazby PTX3. V literatuře existují důkazy o vazbě C1-INH na endoteliální adhezní molekuly, exprimované na aktivovaném endotelu, nazývané selektiny, zejména P a E-selektiny [50, 51]. Tato vazba na EC může interferovat s interakcí endotel-leukocyty během zánětu a představuje další důležitý protizánětlivý mechanismus [50, 51]. Proto jsme předpokládali, že rh-C1INH může vázat aktivovaný EC a zprostředkovávat lokální regulaci aktivace komplementu a zánětlivého procesu. V našich předchozích studiích jsme prokázali zapojení komplementu do I/R poranění a dalších imunitně zprostředkovaných renálních onemocnění [38, 52–54]. Mechanismy aktivace komplementu v tomto zvířecím modelu by mohly mít důležité důsledky pro interpretaci dat očekávaných v lidském prostředí. Pro úspěšný vývoj terapeutických intervencí zaměřených na aktivaci komplementu [36, 54] je nezbytné stanovit platnost údajů o prasatech ve vztahu k tomu, co se vyskytuje za klinických okolností. Vzhledem k tomu, že tento výzkum je omezen na observační studie, jsou zapotřebí další experimenty k vymezení vzájemně propojených mechanismů mezi PTX3 a Komplementem, které by mohly upozornit na nové terapeutické strategie. Z výsledků výše naše data podporují hypotézu, že PTX3 by mohl regulovat více aspektů I/R poškození zprostředkovaného komplementem, čímž představuje potenciální terapeutický cíl.

MATERIÁLY A METODY

Model poranění ledvin I/R prasete

Zvířecí model poškození ledvin I/R byl vyvinut, jak bylo popsáno dříve [23]. Po schválení etickou komisí Ministerstva zdravotnictví prošla 4-měsíční samice velkých bílých prasat (n=8, n=4 ve skupině, 20 kg) experimentální otevřený chirurgický výkon v celkové anestezii. Zvířata hladověla 24 hodin před indukcí anestezie. Elektrokardiogram, srdeční frekvence, saturace hemoglobinu kyslíkem, složení dýchacích plynů, dechová frekvence, dechový objem, tlak v dýchacích cestách, systolický arteriální krevní tlak a centrální žilní tlak byly nepřetržitě monitorovány a automaticky zaznamenávány (Ohmeda Modulus CD; DatexOhmeda, Helsinki, Finsko) . Levá renální tepna a žíla byly izolovány a cévní smyčka byla umístěna kolem renální tepny pomocí pravoúhlé svorky. Před ischemií (T0) byla provedena renální biopsie. Poté byla vyvolána ischemická fáze (30 min) tahem za smyčku cévy. Poté bylo provedeno několik biopsií 15, 30 a 60 minut po reperfuzi; zvířata byla usmrcena 24 hodin po chirurgickém zákroku. Část každého bioptického vzorku byla okamžitě rychle zmražena v médiu s optimální teplotou řezání (Tissuetek, Pittsburgh, PA) a uložena v kapalném dusíku. Další část byla fixována v pufrovaném formalínu (4 procenta) po dobu 12 hodin a zalita v parafínu za použití standardních postupů.

Mikroskopická studie

Vzorky ledvin zalité v parafínu z renálních biopsií byly použity pro konvenční histologické barvení (H&E, kyselina jodistá-Schiff). Snímky byly získány zařízením Aperio ScanScope CS2 (Aperio Technologies, Vista, CA, USA). Tubulo-intersticiální a glomerulární léze byly hodnoceny pomocí kvalitativní analýzy dvěma pozorovateli (CD, MR), kteří si nebyli vědomi původu

Protilátky

Primární protilátky použité v této studii rozpoznávaly následující antigeny: PTX3 (MNB4: přímo proti PTX3 N-terminální doméně, Exira Life Sciences In., Larsen, Švýcarsko); CD163 (monocyty/makrofágy, US Biological, Swampscott, MA); SWC3a (dendritické buňky, [55] 74-22-15A, BD Biosciences); FSP1 (fibroblastový specifický protein 1, Abcam, Cambridge, UK); alfa-aktin hladkého svalstva (Santa Cruz Biotechnology Inc.; Santa Cruz, CA, USA); C1q (R9/2, AbDSerotec; Kidlington, Spojené království); MBL (3E7: přímo proti doméně rozpoznávání sacharidů MBL, biotechnologie Hycult, Uden, Nizozemsko) a neoantigen C9 (aE11, biotechnologie Hycult). Křížová reaktivita byla ověřena preinkubací specifických protilátek před jejich použitím s lidskými peptidy použitými k jejich získání. Předinkubace zrušila specifické barvení na prasečí tkáni.

Tkáňová imunofluorescence a konfokální laserová skenovací mikroskopie

Charakterizace a lokalizace signálu PTX3 byly zkoumány na zmrazené tkáni obsažené v médiu OCT (Tissue-Tek). Sklíčka byla inkubována s 5% králičím sérem po dobu 1 hodiny při 37 °C. Sklíčka byla poté inkubována po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti se specifickými protilátkami. Po třech promytích v PBS byla pak sklíčka inkubována s vhodnými sekundárními protilátkami (Alexa Flour 488 a 555, Molecular Probes, Eugene, OR). Všechny řezy byly kontrastně obarveny TO-PRO-3 (Molecular Probes). Negativní kontroly byly připraveny s irelevantními protilátkami. Řezy byly analyzovány pomocí konfokálního laserového skenovacího mikroskopu Leica TCS SP2 (Leica, Wetzlar, Německo). Počet infiltrujících buněk byl měřen v alespoň 10 vysoce výkonných (x630) polích/řez dvěma nezávislými pozorovateli zaslepenými vzhledem k počátku sklíček. Konečné počty byly průměrem dvou měření. V žádném případě nebyla variabilita mezi pozorovateli vyšší než 20 procent.

Buněčná kultura a analýza průtokovou cytometrií

Endoteliální buňky lidské pupečníkové žíly (HUVEC, EC) byly zakoupeny od American Type Culture Collection (ATCC-LGC Standards, Sesto San Giovanni, Itálie). EC byl pěstován v jejich doporučeném médiu, EndoGro (Merck Millipore, Darmstadt, Německo). EC bylo naneseno v hustotě 1{{10}},000 buněk/cm2 a bylo stimulováno působením H2O2 (3 procenta, 1 hodina). Poté byly bazální a stimulované EC promyty dvakrát PBS a byly odstraněny PBS-EDTA 2 mM a trypsinem 0,001×. Poté byly buňky resuspendovány v PBS a byly inkubovány s PTX3 (rekombinantní lidský PTX3, Sigma-Aldrich, Merck, Německo) (1 ug/ml) nebo/a s rhC1-INH (Ruconest®, Pharming) (2,5 ug /ml) po dobu 60 min. Po trojnásobném promytí PBS IX byly buňky resuspendovány v pufru průtokové cytometrie (FACS) (fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, pH 7,2, 0,2 procenta hovězího sérového albuminu a 0,02 procenta azidu sodného) a inkubovány s blokujícím činidlem FCR (Miltenyi Biotec). 10 min při pokojové teplotě. Po zablokování byly EC inkubovány s králičím anti-lidským C1-INH (poskytl Prof. M. Daha, University of Leiden, ředění 1//100) nebo/a s potkaním anti-PTX3 (MNB4, Exira Life Sciences In., ředění 1/20) při teplotě místnosti po dobu 30 minut a promyty pufrem FACS. Poté byly buňky inkubovány s kozím anti-králičím IgG PE (Molecular Probes, ředění 1/100) nebo/s anti-krysím IgG FITC (Molecular Probes, 1/100 ředění) při teplotě místnosti po dobu 30 minut a třikrát promyty. Buňky byly analyzovány pomocí FC500 (Beckman Coulter, Brea, CA, USA) a softwaru Kaluza. Oblast pozitivity byla stanovena pomocí izotypově shodné mAb a bylo získáno celkem 104 událostí pro každý vzorek. Byly provedeny tři nezávislé experimenty.

Statistická analýza

Data jsou prezentována jako průměr ± směrodatná odchylka (SD) a jsou porovnána pomocí analýzy rozptylu nebo párového Studentova t-testu, podle potřeby. Rozdíly byly považovány za statisticky významné, když byly hodnoty p menší než 0.05. Data byla analyzována pomocí softwarového balíku Statview (verze 5.0) (SAS Inc. Co., Cary, NC, USA). Grafy byly zobrazeny pomocí GraphPad Prism Software 5.

Zkratky

I/R: ischemie/reperfuze; EC: endoteliální buňky; PTX3: pentraxin 3; FSP-1: fibroblast-specifický protein 1; N-cadherin: neuronální kadherin; alfa-SMA: alfa-aktin hladkého svalstva.

AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY

CD koordinoval studii, podílel se na imunoznačení a konfokální mikroskopii renálních řezů a vypracoval rukopis. AS a RF se podílely na návrhu studie, přispěly k analýze dat, prováděly in vitro experimenty a kriticky revidovaly rukopis. MR a GSN provedly histopatologickou obrazovou analýzu. LL, FS, AMC provedli zvířecí model ischemicko-reperfuzního poškození a pomohli revidovat rukopis. GL, PD a MB provedli všechny chirurgické postupy na prasečím modelu a pomohli revidovat rukopis. MRD, P.vdP., C.vK., a FS rukopis revidovali.

PP, ER, GG, GS a LG rukopis kriticky revidovaly. GC poskytla nové analytické nástroje, navrhla a dohlížela na výzkum. CD, AS a RF k této studii přispěly stejnou měrou. Všichni autoři přispěli k článku a schválili předloženou verzi.

PODĚKOVÁNÍ

Děkujeme Claudii Curci z Renální, dialyzační a transplantační jednotky Kliniky urgentního příjmu a orgánových transplantací,

University of Bari za vynikající technickou pomoc.

STŘET ZÁJMŮ

Autoři prohlašují, že nejsou ve střetu zájmů.

FINANCOVÁNÍ

Tuto studii podpořila Univerzita v Bari „Aldo Moro“, italské ministerstvo zdravotnictví (GR 2016- 02362239 „Přístup založený na transkriptomice pro identifikaci prediktivních faktorů a terapeutických cílů pro opožděnou funkci štěpu vledvinapříjemci transplantací“, Bando di Ricerca Finalizzata 2016, CD získalo stipendium na tento projekt) a Fondo Sociale Europeo, Azione I.2 „Attrazione e Mobilità Internazionale dei Ricercatori“- AIM-1810057-aktivita 2 udělená AS

REFERENCE

1. Bonventre JV, Yang L. Buněčná patofyziologie ischemické akutníledvinazranění. J Clin Invest. 2011; 121:4210–21.

2. Jang HR, Rabb H. Vrozená imunitní odpověď u ischemické akutníledvinazranění. Clin Immunol. 2009; 130:41–50.

3. Ricklin D, Hajishengallis G, Yang K, Lambris JD. Doplněk: klíčový systém pro imunitní dozor a homeostázu. Nat Immunol. 2010; 11:785–97.

4. Thurman JM, Holers VM. Ústřední role alternativní cesty komplementu u lidských onemocnění. J Immunol. 2006; 176:1305–10. PMID: 16424154

5. Franzin R, Stasi A, Fiorentino M, Stallone G, Cantaluppi V, Gesualdo L, Castellano G. Zánětlivý a komplementární systém: Spojení mezi akutnímiledvinyZranění a chronické poškození štěpu. Front Immunol.

2020; 11:734.PMID:32457738

6. Deban L, Jaillon S, Garlanda C, Bottazzi B, Mantovani A. Pentraxiny ve vrozené imunitě: lekce z PTX3. Cell Tissue Res. 2011; 343:237–49.PMID:20683616

7. Cieślik P, Hrycek A. Dlouhý pentraxin 3 (PTX3) ve světle jeho struktury, mechanismu účinku a klinických důsledků. Autoimunita. 2012; 45:119–28.PMID:21988562

8. Kuneš P, Holubcová Z, Koláčková M, Krejsek J. Pentraxin 3(PTX 3): endogenní modulátor zánětlivé odpovědi. Mediátory Inflamm. 2012; 2012:920517.PMID:22577258

9. Garlanda C, Bottazzi B, Bastone A, Mantovani A. Pentraxiny na křižovatce mezi vrozenou imunitou, zánětem, ukládáním matrix a ženskou plodností. Annu Rev Immunol. 2005; 23:337–66,115756PMID:15771574

10. Bottazzi B, Garlanda C, Cotena A, Moalli F, Jaillon S, Deban L, Mantovani A. Dlouhý pentraxin PTX3 jako prototypický receptor pro rozpoznávání humorálních vzorů: souhra s buněčnou vrozenou imunitou. Immunol Rev. 2009; 227:9–18.PMID:19120471

11. Ma YJ, Doni A, Hummelshøj T, Honoré C, Bastone A, Mantovani A, Thielens NM, Garred P. Synergie mezi fikolinem-2 a pentraxinem 3 posiluje vrozené imunitní rozpoznávání a ukládání komplementu. J Biol Chem. 2009; 284:28263–75.PMID:19632990

12. Netti GS, Lucarelli G, Spadaccino F, Castellano G, Gigante M, Divella C, Rocchetti MT, Rascio F, Mancini V, Stallone G, Carrieri G, Gesualdo L, Battaglia M, Ranieri E. PTX3 moduluje imunoflogózu v nádoru mikroprostředí a je prognostickým faktorem pro pacienty se světlobuněčným renálním karcinomem. Stárnutí (Albany NY). 2020; 12:7585–602.PMID:32345771

13. Souza DG, Amaral FA, Fagundes CT, Coelho FM, Arantes RM, Sousa LP, Matzuk MM, Garlanda C, Mantovani A, Dias AA, Teixeira MM. Dlouhý pentraxin PTX3 je rozhodující pro zánět tkáně po

střevní ischemie a reperfuze u myší. Am J Pathol. 2009; 174:1309–18.PMID:19286566

14. Jaillon S, Peri G, Delneste Y, Frémaux I, Doni A, Moalli F, Garlanda C, Romani L, Gascan H, Bellocchio S, Bozza S, Cassatella MA, Jeannin P, Mantovani A. Humorální receptor rozpoznávání vzorů PTX3 je uložen v neutrofilních granulích a lokalizuje se v extracelulárních pastích. J Exp Med. 2007; 204:793–804.PMID:17389238

15. Tong M, Carrero JJ, Qureshi AR, Anderstam B, Heimbürger O, Bárány P, Axelsson J, Alvestrand A, Stenvinkel P, Lindholm B, Suliman ME. Plazmatický pentraxin 3 u pacientů s chronicledvinaonemocnění: asociace s renální funkcí, proteinovou energií, chřadnutím, kardiovaskulárním onemocněním a mortalitou. Clin J Am Soc Nephrol. 2007; 2:889–97.PMID:17702732

16. Witasp A, Rydén M, Carrero JJ, Qureshi AR, Nordfors L, Näslund E, Hammarqvist F, Arefin S, Kublickiene K, Stenvinkel P. Zvýšené hladiny v oběhu a tkáňová exprese pentraxinu 3 u uremie: odraz endoteliální dysfunkce. PLoS One. 2013; 8: e63493.PMID:23658833

17. Presta M, Camozzi M, Salvatori G, Rusnati M. Role rozpustného receptoru pro rozpoznávání vzorů PTX3 ve vaskulární biologii. J Cell Mol Med. 2007; 11:723–38.PMID:17760835

18. Bottazzi B, Inforzato A, Messa M, Barbagallo M, Magrini E, Garlanda C, Mantovani A. Pentraxiny PTX3 a SAP ve vrozené imunitě, regulaci zánětu a remodelaci tkání. J Hepatol. 2016; 64:1416–27.

19. Xiao Y, Yang N, Zhang Q, Wang Y, Yang S, Liu Z. Pentraxin 3 inhibuje intersticiální fibrózu vyvolanou akutním poškozením ledvin prostřednictvím suprese dráhy IL-6/Stat3. Zánět. 2014; 37:1895–901.PMID:24854162

20. Inforzato A, Reading PC, Barbati E, Bottazzi B, Garlanda C, Mantovani A. „Sladká“ stránka dlouhého pentraxinu: jak glykosylace ovlivňuje funkce PTX3 ve vrozené imunitě a zánětu. Front Immunol. 2013; 3:407. PMID: 23316195