Ochranné účinky kyseliny alfa-lipoové proti 5-fluorouracilem indukované gastrointestinální mukositidě u potkanů, část 1

Abstraktní: Kyselina alfa-lipoová (ALA) je široce používána v multivitaminových přípravcích a produktech proti stárnutí. Účelem této studie bylo prozkoumat potenciální ochranné přínosy ALA na gastrointestinální mukozitidu vyvolanou 5-fluorouracilem (5-FU) u potkanů ​​Wistar albino. Tkáně ze žaludku, tenkého střeva a tlustého střeva byly vyříznuty a byla získána krevní séra k identifikaci biochemických indexů, jako jsou TNF-, IL-1, MDA, GPx, SOD, MMP-1, {{ 8}}, -8 a TIMP-1. Byla také provedena histopatologická studie. Výsledky odhalily zvýšené hladiny TNF-, IL-1, MDA, MMP-1, -2, -8 a TIMP-1 v tkáních i sérech se zvýšenou mukozitidou a tyto hodnoty dramaticky poklesly po léčbě ALA. Snížené aktivity SOD a GPx ve skupinách s mukozitidou byly obráceny ve skupinách léčených ALA. Poškození způsobené mukozitidou v žaludku a tenkém střevě u skupiny léčené ALA podle histopatologického hodnocení ustoupilo. V důsledku toho může zavedení suplementace ALA v terapii 5-FU působit jako ochranná intervence u pacientů s rakovinou s gastrointestinální mukozitidou. Ve světle těchto zjištění může být ALA, antioxidant pocházející z potravy s pleiotropními vlastnostmi, účinnou léčbou 5-gastrointestinální mukositidy vyvolané FU a předcházet oxidativnímu stresu, zánětu a poškození tkání u pacientů s rakovinou, kteří dostávají {{ 24}}Terapie FU.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Fenylethanoidové glykosidy Cistanche mají robustní vychytávací schopnost volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermatu, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a dokáže vychytávat reaktivní formy kyslíku, bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý opravný účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Cistanche Tubulosa

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

1. Úvod

Kyselina alfa-lipoová (ALA) je přítomna v široké škále potravin, včetně zeleniny (špenát, brokolice, rajčata) a masa (zejména vnitřností), stejně jako v několika doplňcích výživy [1,2]. ALA má četné antioxidační účinky, včetně aktivace endogenních antioxidačních mechanismů a chelace kovových iontů, jako je železo, zinek a měď [3,4]. Jako molekula organosíry může ALA vychytávat reaktivní formy kyslíku (ROS) a zvyšovat aktivitu tkáňových antioxidačních enzymů, jako je glutathionperoxidáza (GPx) a superoxiddismutáza (SOD) [5–7]. Bylo zjištěno, že díky svým antioxidačním vlastnostem ALA snižuje buněčnou smrt závislou na ALA u rakoviny plic [8], rakoviny prsu [9] a rakoviny tlustého střeva [10]. Dřívější výzkum navíc ukázal, že ALA má protizánětlivé vlastnosti [11–16]. ALA působí na snížení zánětu modulací exprese zánětlivých cytokinů, jako je tumor nekrotizující faktor-alfa (TNF- ) a interleukin-1 (IL-1) [17,18]. Farmakologické přínosy ALA byly prokázány v celé řadě oblastí souvisejících s lékařstvím, včetně kardiovaskulárních, neuroprotektivních, kognitivních a anti-aging modelů [19].

Rakovina je hlavní příčinou úmrtnosti v každé zemi a hlavní překážkou dlouhověkosti [20]. Vedlejší účinky chemoterapeutických léků jsou jedním z nejdůležitějších oslabujících faktorů v boji proti rakovině a mukositida je jednou z nejčastějších chorob, se kterými se u pacientů s rakovinou setkáváme [21]. Mukozitida je patologický zánětlivý stav charakterizovaný ulcerací a zánětem sliznice gastrointestinálního systému [22]. Mukositida zvyšuje užívání opioidních analgetik kvůli bolesti a urychluje přechod na celkovou parenterální výživu kvůli nutričním problémům [23]. Mukozitida a obtíže související s mukozitidou snižují kvalitu života pacienta, zatímco vývoj život ohrožujících stavů a ​​negativní reakce na terapii jsou důvodem k obavám kvůli špatné léčbě lézí [24].

Nejčastěji používaným chemoterapeutickým lékem u gastrointestinálních malignit je pyrimidinový analog 5-fluorouracil (5-FU). 5-FU uplatňuje své protirakovinné účinky inhibicí thymidylátsyntázy (TS) a integrací jejích metabolitů do RNA a DNA [25]. Tato látka však vyvolává gastrointestinální mukozitidu, což je závažný oslabující vedlejší účinek [26]. V rozvoji těchto nežádoucích účinků hraje hlavní roli zejména degradace oxidant-antioxidační rovnováhy, vzestup hladin prozánětlivých cytokinů a aktivita proteolytických enzymů. Ačkoli se ve snaze řešit tento problém používaly antioxidační a protizánětlivé léky, dosud nebyla identifikována zvláště robustní terapeutická metoda [27,28].

K dnešnímu dni několik studií uvádí použití 5-FU a ALA společně u různých druhů rakoviny; patří sem cervikální a kolorektální tumory [29,30]. Dále by byla výhodná pomocná medikace, která by mohla být začleněna do léčebných postupů, aby se zabránilo pacientům s rakovinou před nežádoucími účinky gastrointestinální mukositidy vyvolané 5-FU. Účelem této studie tedy bylo určit biologické účinky použití ALA u krys s modelem mukositidy vytvořeným 5-FU, navíc prozkoumat její možné použití jako kandidátního činidla v léčebných protokolech.

2. Materiály a metody

2.1. Zvířata

Zvířata byla převzata z jednotek pro experimenty na zvířatech Univerzity Blízkého východu. Krysy (Wistar albino, obě pohlaví) byly od začátku udržovány v cyklu tma/světlo 12:12 h při teplotě místnosti 22 ± 2 °C v zařízení s řízenou vlhkostí (50 ± 5 procent). Krmení bylo ad libitum bez jakéhokoli omezení jejich standardního krmiva pro krysy a pitné vody. Potkani byli umístěni v kleci z plexiskla (4 krysy na klec o rozměrech 60 × 40 × 40 cm). Protokol studie byl schválen Etickým výborem pro místní experimenty na zvířatech na Blízkém východě (schválení č. 2019/01 dne 17. ledna 2019 a 2020/11 dne 27. listopadu 2020) a etické pokyny uvedené v Helsinské deklaraci z roku 1964 a jejích pozdějších dodatcích byli sledováni.

Třicet dva krys Wistar Albino obou pohlaví o hmotnosti 200–250 g bylo rozděleno do čtyř skupin po osmi krysách (n=8): kontrolní, ALA, mukositida a mukozitida plus ALA skupiny. Kontrolní skupina dostávala pouze intraperitoneální (ip) fyziologický roztok (SF) jednou denně po dobu jednoho týdne. Skupina ALA dostávala pouze ALA v dávce 100 mg/kg ip jednou denně po dobu jednoho týdne ode dne 1 [31,32]. Skupina s mukozitidou byla léčena SF (ip) v den 1 a 400 mg/kg 5-FU ip od 2. dne do konce experimentu [33]. Skupina Mucositis plus ALA dostávala 100 mg/kg ip ALA v den 1 a 400 mg/kg ip 5-FU v den 2. Poté se pokračovalo v podávání 100 mg/kg/den ip ALA až do konce experimentu . Zvířata byla monitorována po dobu jednoho týdne, přičemž během této doby nebyla zaznamenána žádná úmrtnost. Zvířata ve všech skupinách byla na konci období výzkumu usmrcena podáním kombinace předávkování ketaminem/xylazinem. Laboratorní testy byly provedeny v diagnostické laboratoři a histopatologické laboratoři zvířecí nemocnice, Near East University.

2.2. Odběr vzorků krve a tkání

Vzorky krve byly odebrány a předloženy do laboratoře ve zkumavkách pro separaci séra. Vzorky séra byly separovány při 2000 x g po dobu 10 minut a udržovány při -80 ◦C až do další analýzy. K odstranění přebytečné krve byly odebrány tkáně žaludku, tenkého střeva a tlustého střeva a promyty roztokem fosfátového pufru (pH=7,4). Poté po dodání do laboratoře prošly homogenizační procedurou. Homogenizace tkáně byla provedena podle protokolu výrobce za použití pufru RIPA (položka č. 10010263, číslo šarže 0490889-1, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA) a sady mlýnků na tkáň Dounce (D8938, šarže 3110, Sigma -Aldrich, St. Louis, MO, USA) na ledě. Po homogenizaci byly vzorky centrifugovány při 1600 x g po dobu 10 minut při plus 4 °C. Ke kvantifikaci hladin proteinů ve vzorcích tkání byla použita Bradfordova technika stanovení proteinů a supernatanty byly poté zmraženy při -80 ◦C pro následné zkoumání.

2.3. Měření biochemických indexů

Aktivity alanintransaminázy (ALT), aspartáttransaminázy (AST), alkalické fosfatázy (ALP), laktátdehydrogenázy (LDH), lipázy (LIP), amylázy (AMY), kreatininu, dusíku močoviny v krvi (BUN), celkového proteinu (TP) a hladiny albuminu byly měřeny jako biochemické indexy ve vzorcích séra pomocí automatického analyzátoru klinické chemie BS-240 VET (Mindray, Shenzhen, Čína).

2.4. Měření cytokinů v séru a tkáních

Koncentrace TNF- a IL-1 ve vzorcích séra a tkání byly měřeny pomocí komerčně dostupných testovacích souprav pro potkany specifické enzymové imunoanalýzy (ELISA) (ELR-TNF- a ELR-IL1 -, RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA) podle pokynů výrobce.

2.5. Měření matricových metaloproteináz (MMP) a tkáňových inhibitorů metaloproteináz-1 (TIMP-1) v séru a tkáních

MMP a TIMP-1, které se podílejí na různých biologických procesech, jako je rakovina a zánět, byly měřeny v tkáňových homogenátech i sérech pomocí pokynů výrobce a doporučení komerčně dostupných testů ELISA specifických pro potkany (MMP{ {2}} E-EL-R0617; Elabscience, Wuhan, Čína; MMP-2 ELR-MMP2; MMP-8 ELR-MMP8; TIMP-1 ELR-TIMP-1 RayBiotech Life Inc., Norcross, GA, USA). Sérové ​​koncentrace MMP a TIMP-1 byly vyjádřeny jako pg/ml, zatímco tkáňové hladiny byly vyjádřeny jako pg/mg proteinu.

2.6. Měření malondialdehydu (MDA), GPx a SOD v tkáních

Hladiny MDA v tkáních byly hodnoceny pomocí komerčně dostupných testovacích souprav pro stanovení stavu peroxidace lipidů (TBARS Assay Kit, položka č. 10009055, Cayman Chemicals, Ann Arbor, MI, USA). Princip měření je založen na reakci s kyselinou thiobarbiturovou (TBA) ve vroucí vodě po dobu 60 minut v kyselém prostředí a měření absorbance reakční směsi při 532 nm (Ohkawa et al., 1979). K měření absorbance byl použit VersaMax Tunable Microplate Reader (Molecular Devices, San Jose, CA, USA). Koncentrace MDA ve tkáních byly vyjádřeny jako nmol MDA/mg proteinu.

Ve tkáních byla aktivita GPx a SOD hodnocena pomocí testovacích souprav připravených k použití. (RANSEL RS505, RANSOD SD125, Randox Laboratories Ltd., Crumlin, Spojené království) pomocí automatizovaného analyzátoru klinické chemie BS-240 VET (Mindray, Shenzhen, Čína). Množství GPx a SOD ve vzorcích tkáně (žaludek, tenké střevo a tlusté střevo) bylo vyjádřeno jako U/mg proteinu.

2.7. Histopatologické hodnocení

Tkáně žaludku, tenkého střeva a tlustého střeva získané bezprostředně po experimentálním období byly fixovány v 10 procentech (v/v) neutrálním formalínu po dobu 24 hodin při teplotě místnosti. Po fixaci byly tkáně umístěny na zařízení pro sledování tkání, Leica TP1020 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Německo). Tkáně odebrané ze zařízení pro sledování tkání byly poté zality v parafínu. Z tkání byly vyříznuty řezy o tloušťce 5-µm pomocí mikrotomu Leica RM2255 (Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Německo) a bylo provedeno rutinní barvení hematoxylinem a eosinem (HE). Řezy byly histomorfologicky zkoumány světelným mikroskopem Leica DM500 spojeným s integrovaným digitálním zobrazovacím analytickým systémem Leica Microsystem Framework (Leica Application Suite verze 3.0 Series 38132019, Leica ICC50 HD, Leica Biosystems Nussloch GmbH, Nußloch, Německo).

2.8. Statistické analýzy

Pro statistickou analýzu byl použit software GraphPad Prism (verze 7.{2}}4, GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Data byla všechna vyjádřena jako průměr ± standardní odchylka (X ± SD). K porovnání datových skupin byl použit test analýzy rozptylu (ANOVA), po kterém následoval Tukeyův vícenásobný srovnávací test. Kromě toho byl k porovnání histomorfologických skóre mezi skupinami použit Kruskal-Wallisův test. Rozdíl p < 0,05 byl považován za statisticky významný.

3. Výsledky

3.1. ALA pozitivně ovlivňuje biochemické indexy

Tabulka 1 ukazuje aktivitu enzymů v séru a koncentrace metabolitů. Ve srovnání s kontrolní skupinou měla skupina s mukozitidou podstatně vyšší hladiny albuminu, ALT, AST, ALP, LDH, amylázy, lipázy, BUN, kreatininu a TP (p < 0.05 –0.0001). Byl však významný rozdíl v hladinách albuminu, AST, ALT, ALP, LDH, BUN, kreatininu, amylázy, BUN a kreatininu mezi skupinou ALA plus Mucositis a skupinou Mucositis (p < 0,05–0,001). Hladiny ALP, ALT, AST, LDH a amylázy byly také podstatně odlišné mezi skupinami s mukozitidou a ALA (p < 0,05–0,0001). V souladu s tím bylo pozorováno, že hladiny jaterních enzymů, pankreatických enzymů a metabolitů se dramaticky snížily ve skupině s mukozitidou, když byla k léčbě přidána ALA.

3.2. ALA snižuje produkci prozánětlivých cytokinů

Hladiny prozánětlivých cytokinů TNF- a IL-1 ve vzorcích séra, žaludku, tenkého střeva a tlustého střeva lze vidět na obrázku 1. Hladiny TNF- a IL-1 v séru a všech tkáně zvířat ve skupině s mukozitidou byly významně vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou, ALA a mukozitidou plus ALA (p < 0.05–0.0{ {17}}{{20}}1). Hladiny TNF- a IL-1 v séru a ve všech tkáních se však významně snížily ve skupině s mukozitidou plus ALA ve srovnání se skupinou s mukozitidou (p < 0,05–0,0001). Mezi kontrolní skupinou a skupinou s mukozitidou plus ALA byl podstatný rozdíl v hladinách TNF- v tenkém a tlustém střevě. (p < 0,01). Byly také významné rozdíly v hladinách TNF- v tlustém a tenkém střevě mezi skupinami ALA a Mucositis plus ALA. (p < 0,01, p < 0,001, v tomto pořadí). Kromě toho existovaly statisticky významné rozdíly mezi kontrolní skupinou a skupinou s mukozitidou plus ALA, pokud jde o hladiny IL-1 v žaludku (p < 0,05). Zdá se tedy, že ALA významně potlačuje hladiny prozánětlivých cytokinů u mukozitidy.

3.3. Léčba ALA snižuje peroxidaci lipidů a zvyšuje aktivitu antioxidačních enzymů v tkáních

Hladiny MDA, aktivity GPx a SOD byly kvantifikovány za účelem posouzení peroxidačního a antioxidačního stavu na úrovni tkáně (obrázek 2). Hladiny MDA ve skupině s mukozitidou v žaludku, tenkém střevě a tlustém střevě byly významně vyšší než u kontrolní skupiny, skupiny ALA a skupiny Mucositis plus ALA (p < 0.05–0 0,0001). Kromě toho hladiny MDA v tlustém střevě u skupiny s mukozitidou plus ALA byly podstatně odlišné od hladin u kontrolní skupiny a skupiny ALA (p < 0,0001).

Potkani v kontrolní skupině a skupině ALA měli významně vyšší hladiny SOD ve všech tkáních než potkani ve skupině s mukozitidou (p < {{0}}.05–0.{{8} }}{{10}}01). Hladiny SOD ve vzorcích tlustého střeva byly významně odlišné ve skupinách ALA a Mucositis plus ALA (p < 0,01). Ve vzorcích žaludku byly hladiny SOD významně nižší ve skupinách ALA a Mucositis plus ALA (p < 0,05). Kromě toho byly hladiny SOD v tenkém střevě potkanů ​​ze skupiny s mukozitidou podstatně nižší než hladiny SOD ve skupině ALA (p < 0,05). Hladiny SOD v žaludku a tlustém střevě zvířat ve skupinách s mukozitidou a mukozitidou plus ALA však byly podstatně odlišné (p < 0,05–0,0001).

3.4. Léčba ALA zvyšuje hladiny tkáňových MMP a TIMP-1

Aktivity MMP{{0}}, MMP-2, MMP-8 a TIMP-1 (tabulka 2) v séru, žaludku, tenkém střevě a tlustém střevě byly významně vyšší ve skupině s mukozitidou ve srovnání s kontrolní skupinou a skupinou ALA (p < 0.05–0.0001). Zvýšení hladin MMP-1, MMP-2, MMP-8 a TIMP-1 v séru a žaludku, tenkém a tlustém střevě potkanů ​​Mucositis bylo významně potlačeno Mukozitida plus ALA potkani (p < 0,05–0,0001), ačkoli nebyl žádný významný rozdíl v sérových hladinách MMP-8 mezi skupinami Mucositis plus ALA a Mucositis.