Spermidin zmírňuje nitroděložní hypoxií vyvolané poškození mitochondrií novorozence u potkanů ​​inhibicí oxidačního stresu a regulací mitochondriální kontroly kvality, část 1

Abstraktní

Pozadí: Intrauterinní hypoxie (IUH) zvyšuje riziko kardiovaskulárních onemocnění u potomků. Polyamin spermidin (SPD) je jako lapač reaktivních forem kyslíku (ROS) nezbytný pro přežití a růst embryí a plodů. Jsou však nutné další studie ochrany SPD a mechanismů poškození srdce u potomků vyvolaného IUH.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Fenylethanoidové glykosidy Cistanche mají robustní vychytávací schopnost volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermatu, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý reparační účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Cistanches Herba For Anti-aging

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Cíle: Tato studie měla za cíl prozkoumat preventivní účinky prenatální léčby SPD na poškození srdce vyvolané IUH u novorozených potomků potkanů ​​a jeho základní mechanismus související s mitochondriemi.

Metody: Krysí model IUH byl vytvořen expozicí 10 procentům O2 sedm dní před termínem. Mezitím po dobu sedmi dnů dostávaly březí krysy SPD (5 mg.kg-1.d-1; ip). Jednodenní potomci potkanů ​​byli usmrceni, aby se vyhodnotilo několik parametrů, včetně vývoje růstu, poškození srdce, proliferace kardiomyocytů, oxidačního stresu myokardu, buněčné apoptózy a mitochondriální funkce, a měli kontrolu mitochondriální kvality (MQC), včetně mitofágie, mitochondriální biogeneze a mitochondriální fúze/štěpení. V experimentech in vitro byly primární kardiomyocyty vystaveny hypoxii s nebo bez SPD po dobu 24 hodin.

Výsledek: IUH snížila tělesnou hmotnost, hmotnost srdce, srdeční expresi Ki67, aktivitu SOD a hladiny CAT a adenosin 5'-trifosfátu (ATP) a zvýšila expresi BAX/BCL2 a počet TUNEL-pozitivních jader. Kromě toho IUH také způsobila abnormalitu mitochondriální struktury, dysfunkci a sníženou mitofágii (snížený počet mitofagozomů), pokles mitochondriální biogeneze (snížená exprese SIRT-1, PGC-1, NRF-2 a TFAM) a vedlo k nerovnováze štěpení/fúze (zvýšené procento mitochondriálních fragmentů, zvýšená exprese DRP1 a snížená exprese MFN2) v myokardu. Léčba SPD překvapivě normalizovala změny v parametrech indukovaných IUH. Kromě toho SPD také zabránila akumulaci ROS vyvolané hypoxií, rozpadu potenciálu mitochondriální membrány a poklesu mitofágie v kardiomyocytech.

Závěr: Léčba SPD u matky způsobila poškození srdce vyvolané IUH u novorozených potkaních potomků zlepšením mitochondriální funkce myokardu prostřednictvím antioxidace a antiapoptózy a regulací MQC.

1. Pozadí

Epidemiologické studie a studie na zvířatech ukazují, že adv se nitroděložní prostředí je spojeno se zvýšeným rizikem kardiovaskulárních onemocnění v dospělosti (1). Prenatální hypoxie, nejčastější nepříznivé nitroděložní prostředí, může způsobit, že plod není schopen realizovat svůj geneticky determinovaný růstový potenciál, což se projevuje zpomalením růstu a poškozením orgánových funkcí na jaře(2). Chronická fetální hypoxie je často důsledkem těhotenství se zvýšenou vaskulární rezistencí placenty, jako je preklapsie, intergravidita ve vysoké nadmořské výšce nebo respirační onemocnění matky. Významněji je třetina z nich postižena syndromem obstrukční spánkové apnoe hypoventilace (OSAHS) v pozdním těhotenství a je také spojena s rozvojem syndromu gestační hypertenze. Nejkritičtější patofyziologickou změnou SAHS je chronická intermitentní hypoxie (3, 4). U několika zvířecích modelů vedla intrauterinní hypoxie (IUH) ke snížení srdeční účinnosti, diastolické a systolické dysfunkci, hypertrofickému růstu, snížené proliferaci kardiomyocytů a opožděnému zrání kardiomyocytů ve fetálním a neonatálním srdci, čímž se zvyšuje riziko srdečních poruch u dospělých potomků ( 5). Programovací efekt chronické hypoxie může vysvětlit především mechanismus v kritických fázích vývoje srdce, který vede ke zvýšení srdečního oxidačního stresu a zvýšení buněčné apoptózy u potomků (6-9). Koncept vývojového programování dává smysl, protože naše fyziologie je v raném věku mnohem tvárnější a plastičtější. Nitroděložní stav určuje a programuje pojmy fyziologie a metabolismu, které náš život. V souladu s tím fetální adaptivní odpověď na IUH vede k rozvoji kardiovaskulárních onemocnění dospělých (10). Mitochondrie jsou složité organely, které hrají klíčovou roli při generování buněčné energie a nesčetném množství sklepních signalizačních událostí. Strukturální a funkční integrita mitochondrií je kritická pro přežití kardiomyocytů, a když je narušena, narušení mit-hondriální homeostázy vede k rozvoji onemocnění karaku. V poslední době se několik studií zaměřilo na roli chronické prenatální hypoxie indukující mitochondriální dysfunkci při zprostředkování poškození srdce potomků. Bylo hlášeno, že mitochondriální funkce byla narušena a exprese několika mitochondriálních molových pravidel změnila perinatální srdce vystavené IUH (11). Kromě toho IUH vede ke snížené aktivitě mitochondriálního komplexu enz e ak dysfunkci srdce u dospělých potomků po ischemii myokardu (12). V souladu s tím se tato studie zaměřila na odhalení molekulární vazby mezi prenatální hypoxií, oxidačním stresem, mitochondriální dysfunkcí a poškozením srdce u nových potomků (13).

K rozvoji a dozrávání tohoto velkoobjemového mitochondriálního systému v myokardu dochází hlavně v perinatálním a postnatálním vývojovém stádiu, primárně kvůli metabolickému posunu srdce od používání glukózy nebo mastných kyselin pro tvorbu adenosin-5'-trifosfátu (ATP) po narození. (14). Nové důkazy naznačují, že mechanismy kontroly kvality mitochondrií (MQC) jsou kritickými determinanty pro zrání kardiomyocytů (15). Kontrola kvality mitochondrií, včetně mitochondriální biogeneze, mitofágie spolu s dynamikou, jemně vyladěná regulační síť, řídí kvantitu a kvalitu mitochondrií a zlepšuje mitochondriální funkci a přežití kardiomyocytů ve stresových podmínkách (16). Koaktivátor 1 receptorů aktivujících peroxisomové proliferátory (PPAR ) (PGC-1) ​​hraje klíčovou roli při řízení mitochondriální biogeneze a funkce v srdci (17). Srdce myší s koaktivátorem receptoru 1 / (-/-) aktivují proliferátory peroxisomů a vykazují známky defektu zrání a závažné abnormality v mitochondriální funkci a hustotě (18). Kromě toho delece mitofagie-mediátoru Parkin zabraňuje morfologickému a funkčnímu zrání mitochondrií v novorozeneckém stadiu (19). Mitochondrie jsou vysoce dynamické organely, které podstupují neustálé štěpení a fúze spojené s jejich funkcí. V pozdním embryonálním období vykazuje autoac-specifická genetická ablace mitochondriální fúze pro u MFN1 a MFN2 u myší závažnou mitochondriální dysfunkci po narození a rozvíjí se kardiomyopatie (20). Nedávná studie překvapivě odhalila, že chronická hypia narušila mitochondriální dynamiku v předním mozku fetálního gui a prase (21). V souladu s tím může MQC působit jako ohnisko ve vývoji poranění myokardu u novorozeneckého potomka s IUH. O účincích prenatální hypoxie na neonatální srdeční systém MQC a účinku dysfunkce MQC na zdraví srdce novorozence je však známo jen málo. Tato studie převzala tuto misi, aby prozkoumala mitochondriální mechanismus poškození myokardu vyvolaného IUH u nových potomků a dále prozkoumala preventivní strategie ke snížení poškození srdce IUH.

Polyaminy (PA), včetně putrescinu (PU), spermidinu (SPD) a sperminu (SP), jsou přítomny téměř ve všech živých organismech a jsou nezbytné pro embryonální a fetální přežití, růst a vývoj (22-24) . Studie zjistily, že ovce vystavené IUH mohou zlepšit embryonální dysplazii doplněním exogenních polyaminů (25, 26). Rostoucí množství literatury navíc naznačuje roli polyaminů při vychytávání volných radikálů a ochraně DNA, proteinů a lipidů před škodlivým poškozením oxidativním stresem. Bylo také zjištěno, že suplementace polyaminu prodlužuje životnost v modelových organismech prostřednictvím antioxidačních, protizánětlivých a mitofágií indukujících pro-tries (27-29). Nedávné studie prokázaly, že suplementace SPD ve stravě je kardioprotektivní a prodlužuje délku života u myší i lidí tím, že stimuluje mitofágii a mitochondriální dýchání a zlepšuje srdeční funkci (30, 31). Ještě důležitější je, že jsme již dříve uvedli, že hypoxická expozice matek během pozdních fází vývoje plodu vedla k vybledlému seznamu a zvýšenému katabolismu polyaminů v karakové tkáni novorozených potkanů. SPD zabránila poškození srdce u mláďat potkanů ​​vystavených IUH inhibicí mitochondriální mentace (32).

2. Cíle

V této studii se předpokládá, že IUH indukuje deficity mitochondriální struktury a funkcí zvýšením oxidačního stresu a zničením mechanismu MQC v srdci novorozeného potomka a předpokládá se, že léčba SPD matky in utero sníží poškození myokardu snížením programu rozvoje mitochondrií. Tato studie může přispět k rozvoji preventivních nebo terapeutických strategií pro IUH potomky k prevenci kardiovaskulárních onemocnění dospělých.

3. Metody

3.1. Zvířata

Samci a samice potkanů ​​Wistar (ve věku 3 měsíců) byli zakoupeni od Department of Laboratory Animals na Harbin Medical University. Všechny postupy byly schváleny Etickým kontrolním výborem Harbin Medical University (Čína) a všechny experimenty byly provedeny podle pokynů National Institutes of Health. Krysy s poměrem samce k samici 2:1 byly náhodně umístěny do klece pro páření. Následující den byly provedeny vaginální stěry ke zjištění přítomnosti spermatu ve vaginálních zátkách nebo vaginálních stěrech, což bylo potvrzeno jako nultý den těhotenství. Březí krysy byly drženy v místnosti s kontrolovanou vlhkostí (60 procent) a kontrolovanou teplotou (21 stupňů) a cyklus světlo-tma byl 12:12 hodin.

3.2. Model intrauterinní hypoxie

Od 15. do 21. dne březosti byly krysy ve skupině s hypoxií (n=10) umístěny do uzavřené plexisklové komory, kde byl injikován vzduch a dusík a sledovány analyzátorem kyslíku (Pro OX12{{13 }}; BioSpherix, New York, USA) a inhaloval s obsahem kyslíku 10 procent po dobu čtyř hodin denně. Vzorky arteriální krve byly odebrány z pravé stehenní tepny, byly měřeny hodnoty krevního plynu a pH, aby se udržoval parciální tlak arteriálního kyslíku 50 - 55 mmHg, saturace krve kyslíkem byla udržována na 80 - 85 procentech a specifické postupy byly provedeny, jak bylo popsáno dříve (32). Experimentální samice potkanů ​​byly náhodně rozděleny do čtyř skupin: kontrolní skupina (kontrola), skupina s intrauterinní hypoxií (Hpx), skupina s intrauterinní hypoxií plus spermidin (Hpx-Spd) a skupina pro intrauterinní hypoxii plus spermidin plus inhibitor (Hpx-Spd-DFMO ). Šest krys na skupinu bylo intraperitoneálně injikováno 15. - 21 den březosti. Krysám byl podáván 0,9% fyziologický roztok (1 ml/kg/den) v kontrolní a Hpx skupině, SPD (5 mg/kg/d) ve skupině Hpx-Spd a SPD (5 mg/kg/den) a difuorometie -L-ornitin (DFMO, inhibitor klíčového enzymu syntézy polyaminů ODC) (5 mg/kg/d) ve skupině Hpx-Spd-DFMO, resp. Po porodu byli 1-denní novorozenci usmrceni a jejich srdce byla extrahována pro následné experimentální studie.

3.3. Histologická analýza

Tkáň levé komory krys byla nařezána na tloušťku < 1 cm, fixována 4% paraformaldehydem, dehydratována alkoholem a uložena do parafínu. Zapuštěný parafín byl nařezán na plátky o tloušťce 5 mm, poté vysušen při konstantní teplotě v sušárně 60 stupňů, zbaven vosku xylenem a následovalo barvení hematoxylin-eosinem (HE). Tkáňové řezy byly pozorovány pro hodnocení změn v srdeční morfologii a strukturách optickým mikroskopem (Eclipse E200; Nikon, Tokio, Japonsko).

3.4. Imunofluorescenční analýza

Imunofluorescenční barvení Ki67 bylo provedeno tak, jak bylo popsáno dříve (33). Stručně, levá ventrikulární tkáň krys byla fixována ve 4% formalínu, zalitém v parafinu; nejprve bylo dokončeno odparafinování, hydratace a oprava antigenu. Tyto tkáně byly blokovány 0,5% hovězím sérovým albuminem po dobu 2 hodin a poté inkubovány s Ki67 králičí monoklonální protilátkou (1:100, AF1738, Beyotime, Čína) při 4 stupních přes noc. Po promytí PBS byla tkáň inkubována s Alexa fluorem značeným kozím anti-králičím IgG (1:500, A 0468, Beyotime, Čína) a kontrastně obarvena DAPI na jádra. Obrázky byly prohlíženy a skenovány pod laserovou konfokální mikroskopií (OLYMPUS, FV1000, Japonsko). Software byl použit k analýze kolokalizace sloučených obrázků.

3.5. Kvantifikace fibrózy

Srdeční fibróza byla hodnocena Massonovým trichromem. Jak je popsáno výše, řezy srdeční tkáně z novorozených krys byly zbaveny vosku a hydratovány standardními metodami a poté obarveny Massonovým trichromem podle protokolů. Pro každé srdce byly použity dva nesousedící průřezy. Procento fibrotické oblasti v celkové oblasti myokardu levé komory bylo analyzováno pomocí softwaru ImageJ, vl.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.6. TdT-zprostředkované dUTP Nick End Labeling a apoptotická měření buněk

Ke stanovení počtu apoptotických buněk v srdcích jednodenních neonatálních potkanů ​​byl použit test dUTP zprostředkovaného značení dUTP nick end labeling (TUNEL). Srdeční tkáně byly ošetřeny podle dříve popsaného postupu s použitím soupravy Cell Death Detection Kit (Roche, Německo) podle pokynů výrobce. Tři sklíčka z každého bloku byla hodnocena na procento apoptotických buněk. Náhodně byla zkoumána čtyři pole diapozitivů s 200násobným zvětšením. Celkem bylo v každém poli spočítáno 100 buněk.

3.7. Měření aktivity antioxidačních enzymů

Aktivita superoxiddismutázy (SOD) a katalázy (CAT) byla měřena pomocí komerčních souprav (SOD: A001-3- 1 a CAT: A007-1-1; Jiancheng Bio. Institute, Nanjing, Čína) pomocí spektrofotometru (Perkin- Elmer, Norwalk, CT, Spojené státy americké). Podle pokynů výrobce byla operace dokončena a koncentrace proteinu byla měřena metodou bicinchoninové kyseliny (Pierce, Rockford, Spojené státy americké) s bovinním sérovým albuminem (BSA) jako standardem (34).

3.8. Měření obsahu adenosin-5'-trifosfátu

Obsah ATP v srdeční tkáni byl měřen pomocí testovací soupravy ATP (S0026B, Beyotime, Bio. Institute, Čína). Podle pokynů výrobce byl přidán lyzát v poměru podle hmotnosti tkáně, homogenizován skleněným homogenizátorem a poté odstředěn při 4 stupních 12 000 g. Byl odebrán supernatant a obsah ATP v každém vzorku byl detekován pomocí luminometru (NanoDrop, Nanodrop2000, Thermo, USA) soupravy BCA (P0012s, Beyotime, Bio. Institute, Čína). Ke stanovení koncentrace proteinu a následné přeměně koncentrace ATP na nmol/g proteinu byla použita metoda bicinchoninové kyseliny.

3.9. Transmisní elektronová mikroskopie

Srdeční apikální tkáň byla rozřezána na malé kousky přibližně 1 mm x 1 mm x 1 mm a poté fixována v glutaraldehyd fosfátovém pufru při 4 stupních. Po rutinní dehydrataci, namáčení, zalití a barvení byly vyrobeny ultratenké řezy o 50 - 70 nm. Ultrastruktura srdeční tkáně byla pozorována pod transmisním elektronovým mikroskopem (TEM) a fotografována (H600 Hitachi, Tokio, Japonsko). Jednotlivé mitochondrie a myofilamenta byly mapovány pod podmínkou 10000násobného zvětšení pomocí softwaru Image J verze 1.80 (National Institutes of Health) a jejich plochy byly měřeny z každého srdce (35). Mezitím byly identifikovány mitochondriální fragmenty < 1 µm3, které nebyly rozděleny (obvykle kulaté), a bylo spočítáno průměrné procento mitochondriálních fragmentů v zorném poli pomocí indexu mitochondriální fragmentace (MFI).

3.10. Mitochondriální izolace

Mitochondrie byly izolovány při 4 stupních za použití diferenciální centrifugace s Mitochondria Isolation Kit (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Čína). Stručně řečeno, čerstvá srdeční tkáň byla nařezána na kousky tkáně a odstředěna s 10 objemy předem vychlazeného PBS, supernatant byl odstraněn, sraženina byla štěpena trypsinem po dobu 20 minut, přidaný izolační pufr A byl odstředěn, supernatant byl přenesen do jiného zkumavka, znovu odstředěna a vysráženou frakcí byly izolované mitochondrie. Finální srdeční mitochondriální peleta byla resuspendována v homogenizačním pufru, uložena na ledu a použita pro experimenty funkce mitochondriálního dýchání během 4 hodin.

3.11. Měření spotřeby mitochondriálního kyslíku

Spotřeba mitochondriálního kyslíku byla měřena kyslíkovou elektrodou Clarkova typu (Hansatech Instruments, Norfolk, UK) v mitochondriálním dýchacím pufru. Pyruvát (5 mM) a malát (5 mM) byly použity jako substrát pro mitochondrie obsahující komplex I v konečné koncentraci 500 ug proteinu/ml. Spotřeba kyslíku stimulovaná ADP (respirace ve stavu 3) byla měřena v přítomnosti 200 uM ADP a spotřeba kyslíku nezávislá na ADP (respirace ve stavu 4) byla monitorována. Poměr kontroly dýchání (RCR, stav 3 dělený stavem 4) odráží spotřebu kyslíku fosforylací (spojováním). Postupy pokračovaly, jak bylo popsáno dříve (36).

3.12. Analýza Western Blot

Vzorek srdečních tkání byl odebrán a uložen při -80 stupni. Zmrazené srdeční tkáně levé komory byly homogenizovány v ledově chladném RIPA lyzačním pufru (Beyotime Inc., Shanghai, Čína P0013B). Koncentrace proteinu byly kvantifikovány za použití soupravy pro stanovení proteinu BCA (Beyotime Inc., Shanghai, China P0006C). Vzorky obsahující celkový protein byly odděleny 10% (w/v) SDS-PAGE a přeneseny na PVDF membránu (Millipore, Bedford, MA, Spojené státy americké). Byly použity následující protilátky: Protilátky pro GAPDH (1:2000,10494-1-AP), MFN2 (1:1000,12186-1- AP), SIRT-1 (1:1000,{{16 }}AP), NRF-2 (1:600,16396-1-AP), TFAM (1:1000,19998-1-AP) a BAX (1,1000,509599-2-Ig) byly zakoupeny od Proteintech (WuHan, Čína), BCL2 (1: 2000, sc-7382) a DRP1 (1:1000, sc-271583) byly zakoupeny od Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX) a PGC -1 (1:1000, ab106814, Abcam, Cambridge, MA, Spojené království). Sekundární protilátka (kozí anti-králičí IgG značená křenovou peroxidázou) byla od Beyotime Corporation (Shanghai, Čína). Intenzity proteinových pásů byly kvantifikovány pomocí chemiluminiscenčního gelového zobrazovacího systému Fluor Chem (Protein Simple, USA). Optická hustota proteinových pásů byla analyzována pomocí softwaru Image J verze 1.52 (NIH, Bethesda, MD).

3.13. Model hypoxických kardiomyocytů

Kardiomyocyty neonatálních potkanů ​​(NRMC) byly izolovány a kultivovány standardními metodami, jak bylo popsáno dříve (32). Stručně řečeno, srdce třídenních novorozených krys byla extrahována, rozemleta, kultivována a poté štěpena v 0,25 procenta trypsinu a 0,02 procenta EDTA (Beyotime Biotechnology, Shanghai, China). Po odstředění byly precipitáty přeneseny do DMEM doplněného 10 procenty fetálního telecího séra (Biolot, Rusko) a inkubovány ve vlhkém vzduchu obsahujícím 5 procent 2. Tři dny po naočkování byly buňky umístěny do skleněné hypoxické komory (Biospherix OxyCycler C42 , Redfield, NY) a naplní se dusíkem po dobu 8 minut, aby se vypustil zbytkový kyslík. Tyto kardiomyocyty byly náhodně rozděleny do následujících skupin: (1) Kontrolní skupina (kontrola), buňky kultivované za normálních inkubačních podmínek; (2) skupina s hypoxií (Hpx), buňky umístěné v hypoxické komoře na 24 hodin a poté normálně kultivované po dobu 24 hodin; (3) skupina Hpx-Spd, buňky umístěné v hypoxické komoře a inkubované s 10 umol/l SPD po dobu 24 hodin; (4) Skupina Hpx-SpdDFMO, buňky umístěny do hypoxické komory a inkubovány s 10 umol/l SPD plus 2 mmol/l DFMO po dobu 24 hodin.

3.14. Měření druhů reaktivního kyslíku

Generování ROS bylo měřeno testem barvení dihydroethidiem (DHE) (kat. č. S0063, Beyotime, Čína). Stručně, primární kardiomyocyty byly inkubovány s 5 umol/l DHE při 37 stupních po dobu 30 minut, promyty PBS a poté přesunuty pod mikroskop, aby byly pozorovány změny intenzity fluorescence. Snímky byly pořízeny fluorescenčním mikroskopem Olympus FluoView FV1000 (Olympus Optical Co., Ltd., Takachiho, Japonsko) při excitační vlnové délce 535 nm a maximální emisní vlnová délka byla 610 nm, n > 20 buněk na skupinu.

3.15. Stanovení potenciálu mitochondriální membrány

Barvivo tetramethylrhodamin ethyl ester (TMRE) je kladně nabité a může být selektivně lokalizováno v mitochondriích. Je široce používán pro stanovení mitochondriálního membránového potenciálu (∆Ψm). Stručně řečeno, k seskupeným ošetřeným kardiomyocytům byl přidán pracovní roztok barvení TMRE v koncentraci 200 umol/l, důkladně promíchán a umístěn do buněčného inkubátoru při 37 stupních po dobu 20 minut. Supernatant byl odsát a buňky byly promyty PBS a přeneseny do inverzního mikroskopu, aby se pozorovala změna intenzity fluorescence. Excitační vlnová délka byla 549 nm a emisní světlo bylo 579 nm. Intenzita červené fluorescence indikovala změnu ∆Ψm, n > 20 buněk na skupinu.

3.16. Experiment mitochondriální a lysozomální lokalizace

Podle instrukcí Mito-Tracker Green (NO.C1048, Beyotime, Čína) a Lyso-Tracker Red (NO.C1046, Beyotime, Čína) použily mitochondriální a lysozomální kolokalizační analýzu. NRCM byly naneseny pomocí 200 nM MitoTracker Green FM a 50 nM LysoTracker Red v HBSS po dobu 30 minut před experimenty, buňky byly promyty PBS a poté byly snímky buněk získány pomocí fluorescenčního mikroskopu Olympus FluoView FV1000. Laserová čára 488 nm byla použita k excitaci fluorescence MitoTracker Green, měřeno mezi 505 a 515 nm. Pro LysoTracker Red byla použita laserová čára 577 nm s měřením 590 nm. Překrytí intenzity červeného a zeleného pixelu bylo stanoveno pomocí kvantifikačního softwaru na mikroskopu Nikon Eclipse, n > 20 buněk na skupinu.

3.17. Statistická analýza

Všechna data z experimentálních skupin byla porovnána pomocí jednosměrné ANOVA následované Bonferroniho post hoc testem se softwarem GraphPad Prism verze 8 (GraphPad Software Inc., La, Jolla.CA) a softwarem SPSS verze 17.1 (SPSS, Chicago, IL, United státy). Data byla vyjádřena jako průměr ± SEM a hladina významnosti byla nastavena na P < 0,05.

4. Výsledky

4.1. Charakteristiky potomstva a srdce

Byla změřena tělesná hmotnost (BW) a hmotnost srdce (HW) a byl vypočten poměr HW/BW (HW/BW) (obrázek 1). Výsledky ukázaly, že u novorozených potkanů ​​se snížila BW a HW a jejich HW/BW se zvýšila v důsledku intrauterinní hypoxie. Ve srovnání se skupinou IUH se BW a HW novorozených potkanů ​​ve skupině SPD zvýšily (P < 0.05) a HW/BW se snížily (P < 0. 05); Ve srovnání se skupinou SPD se jak BW, tak HW skupiny léčené DFMO snížila (P < 0,05) a HW/BW se významně zvýšila (P < 0,05).

4.2. Účinky SPD na morfologickou strukturu myokardu, buněčnou proliferaci a fibrózu u novorozených potomků vystavených

Výsledky barvení srdeční HE ukázaly, že srdce jednodenních potomků vystavených IUH vykazovala otok a volně uspořádaná myokardiální vlákna. IUH srdce ošetřená SPD si však udržela přijatelnou strukturu myokardiální tkáně (obrázek 2A). Dále jsme hodnotili počet binukleárních kardiomyocytů s řezem tkáně obarveným HE; počet binukleárních kardiomyocytů byl větší ve skupině IUH než v kontrolní skupině (P < 0.05). Ve srovnání se skupinou IUH se podíl binukleárních kardiomyocytů ve skupině léčené SPD významně snížil (P < 0.05); DFMO zeslabil účinek SPD (P < 0.05) (obrázek 2C). Dále jsme pomocí imunofluorescenční metody detekovali expresi Ki67 (marker buněčné proliferace) v myokardu potkana. Čím vyšší je exprese Ki67, tím silnější je růžová fluorescence sloučením červené a modré (obrázek 2E). Výsledky ukázaly, že ve srovnání s kontrolní skupinou se exprese Ki67 ve skupině IUH významně snížila (P < 0.05), exprese Ki67 významně vzrostla po podání SPD (P < { {28}},05) a účinek SPD byl zrušen DFMO (P < 0,05) (obrázek 2F). Tyto výsledky naznačují, že SPD může inhibovat předčasné stažení kardiomyocytů z buněčného cyklu indukovaného IUH a podporovat proliferaci kardiomyocytů u nových potomků vystavených IUH. Poté jsme použili Massonovo barvení k detekci změn v obsahu kolagenu v myokardu a hodnotili jsme fibrózu myokardu měřením plochy kolagenu (obrázek 2 BandD). Zjistili jsme, že depozice kolagenu v myokardu v srdcích novorozených potkanů ​​vystavených IUH se zvýšila (P < 0,05), jejíž hladina byla vyšší ve srovnání s kontrolní skupinou. Oblast fibrózy myokardu po léčbě SPD se naopak významně snížila (P < 0,05). Ve srovnání se skupinou léčenou SPD se však oblast fibrózy významně zvýšila ve skupině HpxSpd-DFMO (P < 0,05).

4.3. Účinky spermidinu na mitochondriální strukturu myokardu, respirační funkci a obsah adenosin-5'-trifosfátu u novorozených potomků vystavených intrauterinní hypoxii

Změny ultrastrukturální struktury srdeční tkáně a mitochondriální charakteristiky byly analyzovány pomocí TEM (obrázek 3A). Ke kvantifikaci procenta obsahu mitochondrií (mitochondriální oblast v celé buněčné oblasti) a mitochondriální oblasti (obrázky 3B a C) byl použit software Image J. Výsledky ukázaly, že v kontrolní skupině byla myokardiální myofilamenta uspořádaná, struktura sarkomer jasná, mitochondrie kompaktní, matrix hustší a mitochondriální kristy uspořádané. Nicméně mitochondrie nabobtnaly a u některých kardiomyocytů ze skupiny IUH byla pozorována uvolněná matrice a snížená hustota. Ve srovnání s kontrolní skupinou byl jak podíl mitochondrií v kardiomyocytech, tak plocha mitochondrií snížena (P < 0.05). Avšak v srdcích potkanů ​​při léčbě SPD byla myokardiální myofilamenta čistá, struktura sarkomer byla jasná, mitochondriální matrix byla kompaktní a mitochondriální otok se snížil. Ve srovnání se skupinou IUH se zvýšil podíl mitochondrií v kardiomyocytech (P < 0.05) a zvětšila se plocha mitochondrií (P < 0,05). DFMO inhiboval tyto účinky vyvolané SPD (P < 0,05).

Použili jsme pyruvát/malát jako substrát pro hodnocení mitochondriální respirační funkce, včetně dechových frekvencí 3 a 4 a RCR (obrázek 3D - F). Všimli jsme si, že ve srovnání s kontrolní skupinou byla dechová frekvence ve stavech 3 a 4 a RCR ve skupině IUH všechny významně nižší (P < 0.{{10}}5). Zajímavé je, že RCR států 3 a 4 se po léčbě SPD zotavilo (P < 0.05). Na rozdíl od toho byly tyto účinky SPD významně inhibovány ve skupině léčené DFMO (P < 0 0,05). Podobně ve srovnání s kontrolní skupinou se obsah ATP v myokardu ve skupině IUH významně snížil (P < 0,05). Ve srovnání se skupinou IUH se obsah ATP výrazně zvýšil ve skupině léčené SPD (P < 0,05) a DFMO zeslabil účinky SPD (P < 0,05) (obrázek 3G). Tato zjištění naznačují, že SPD může chránit mitochondriální strukturu a poškození funkce myokardu a zabránit poklesu hladin ATP u novorozených potomků potkanů ​​vystavených IUH.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】