Ochranný účinek extraktu Djulis (Chenopodium Formosanum) proti stárnutí kůže vyvolanému UV zářením a stárnutím prostřednictvím zmírnění oxidačního stresu a degradace kolagenu, část 1

Abstraktní: Stárnutí pleti je komplexní proces zahrnující fotostárnutí a glykační stres, které sdílejí některé základní dráhy a mají společné mediátory. Mohou způsobit poškození kůže a degradaci kolagenu vyvoláním oxidačního stresu a akumulací reaktivních forem kyslíku (ROS). Chenopodium formosanum (CF), také známý jako Djulis, je tradiční obilovina na Tchaj-wanu. Tato studie zkoumala ochranné mechanismy CF extraktu proti ultrafialovému (UV) záření a stresu vyvolanému pokročilými koncovými produkty glykace (AGE). Výsledky ukázaly, že extrakt CF měl silné antioxidační účinky a účinky pohlcující volné radikály. Mohl by snížit tvorbu intracelulárních ROS indukovanou UV zářením a iniciovat antioxidační obranný systém aktivací signální dráhy jaderného faktoru erytroidního 2-faktoru 2 (Nrf2)/hemooxygenázy-1 (HO-1) ve fibroblastech lidské kůže. Extrakt CF moduloval mitogenem aktivovanou proteinkinázu (MAPK) a signální dráhy transformovaného růstového faktoru-beta (TGF- ) ke zmírnění stárnutí pleti vyvolané oxidačním stresem. Navíc výsledky odhalily, že CF extrakty nejen podporovaly syntézu kolagenu, ale také zlepšovaly stárnutím vyvolanou degradaci kolagenu. CF extrakt zeslabil AGEs-indukovanou ROS produkci a upregulaci receptorů pro AGEs (RAGE). Celkové výsledky naznačují, že extrakt CF poskytuje účinnou strategii proti stárnutí tím, že zabraňuje poškození pokožky oxidativním stresem a ztrátou kolagenu se silnými antioxidačními, anti-fotoaging a antiglykačními aktivitami.

Glykosid cistanche může také zvýšit aktivitu SOD v srdeční a jaterní tkáni a významně snížit obsah lipofuscinu a MDA v každé tkáni, účinně zachycovat různé reaktivní kyslíkové radikály (OH-, H₂O₂ atd.) a chránit před způsobeným poškozením DNA. OH-radikály. Cystanche fenylethanoidové glykosidy mají silnou schopnost vychytávání volných radikálů, vyšší redukční schopnost než vitamín C, zlepšují aktivitu SOD v suspenzi spermií, snižují obsah MDA a mají určitý ochranný účinek na funkci membrány spermií. Polysacharidy Cistanche mohou zvýšit aktivitu SOD a GSH-Px v erytrocytech a plicních tkáních experimentálně senescentních myší způsobených D-galaktózou, stejně jako snížit obsah MDA a kolagenu v plicích a plazmě a zvýšit obsah elastinu. dobrý čisticí účinek na DPPH, prodlužuje dobu hypoxie u senescentních myší, zlepšuje aktivitu SOD v séru a oddaluje fyziologickou degeneraci plic u experimentálně senescentních myší Experimenty prokázaly, že Cistanche má dobrou antioxidační schopnost s buněčnou morfologickou degenerací a má potenciál být lékem k prevenci a léčbě nemocí stárnutí kůže. Zároveň má echinakosid v Cistanche významnou schopnost vychytávat volné radikály DPPH a má schopnost vychytávat reaktivní formy kyslíku a bránit volnými radikály indukované degradaci kolagenu a má také dobrý reparační účinek na poškození aniontů volnými radikály thyminu.

Klikněte na Cistanche Herba pro antioxidaci

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】

Klíčová slova: Chenopodium formosanum; Djulis; ultrafialová radiace; konečné produkty pokročilé glykace; glykační stres; reaktivní formy kyslíku

1. Úvod

Stárnutí je definováno jako výsledek progresivního poklesu fyziologických funkcí buněk a tkání těla. Během stárnutí hromadění poškozených produktů postupně ovlivňuje organizaci a reparační kapacitu tkáně. Kůže jako ochranná bariéra pro tělo je často vystavena vnitřním a vnějším faktorům stárnutí [1]. Dominantním vnějším faktorem, který přispívá ke stárnutí kůže, je vystavení UV záření při slunečním záření, nazývané fotostárnutí [2]. Kromě environmentálních podnětů je akumulace AGE považována za vnitřní faktor chronologického stárnutí, který spouští proces stárnutí kůže prostřednictvím glykačního stresu [3].

Jak okolní ROS produkované UV zářením, tak endogenní ROS tvořené oxidačním metabolismem regulují buněčný oxidační stres a ničí na kolagen bohatou extracelulární matrici (ECM), což je nejen charakteristickým znakem stárnutí kožní pojivové tkáně, ale také hlavní příčinou poškození kůže [ 4]. Poškození kolagenových příčných vazeb oslabuje dermální strukturální integritu a zvyšuje tuhost a křehkost kolagenové sítě, čímž podporuje tvorbu vrásek, ztrátu elasticity a suchost kůže [5].

UVB paprsky jsou nejškodlivější vlnové pásmo slunečního záření dopadajícího na Zemi, což vede k oxidačnímu stresu stimulací tvorby ROS a podílí se na hyperpigmentaci, zánětu kůže, imunosupresi, fotostárnutí a karcinogenezi [6,7]. Je dobře známo, že Nrf2 působí jako hlavní regulátor buněčné antioxidační obrany proti poškození kůže způsobenému UV zářením. Buňky mohou eliminovat oxidační stres a předcházet poškození regulací signální dráhy Nrf2/Kelch-like ECH-associated protein 1 (Keap1) [8,9]. Po expozici UV záření nadměrná produkce ROS aktivuje MAPK a nukleární faktor-kappa B (NF-κB), který naopak indukuje upregulaci matricových metalopeptidáz (MMP), což vyvrcholí degradací kolagenu a elastinu. Aktivátorový protein 1 (AP-1) navíc inhibuje signalizaci TGF- a vede ke snížení syntézy prokolagenu [10,11].

AGE jsou heterogenní skupina molekul vytvořená jako výsledek glykace, spontánní neenzymatické reakce mezi redukujícími cukry a aminoskupinami proteinů [3]. Interakce mezi AGEs a ​​specifickým receptorem AGEs (RAGE) spouští generování ROS a mění genovou expresi u poruch souvisejících s AGEs, jako je diabetes a selhání ledvin [12,13]. AGE se při stárnutí hromadí v proteinech ECM a Nε -(1-karboxymethyl)-L-lysin (CML) produkovaný oxidativní modifikací je hlavním glykovaným proteinem u lidí [14,15]. Během přirozeného stárnutí jsou AGE exprimovány v epidermis a dermis a lze pozorovat významně zvýšenou akumulaci AGE v oblastech kůže vystavených slunci [16]. UV záření navíc zvyšuje ukládání AGE prostřednictvím glykace sítě elastických vláken [17].

Chenopodium formosanum (CF), také známý jako Djulis, je jedlá rostlina na Tchaj-wanu a obvykle se vaří s rýží nebo proso jako základní potravina. CF je považována za potravinu s vysokou nutriční hodnotou a za zdroj bioaktivních sloučenin pro lidské zdraví [18]. Kromě bohaté dietní vlákniny, škrobu, esenciálních aminokyselin s omezeným obsahem zrna a polyfenolů [19,20] obsahuje CF také třídu sloučenin s dlouhou historií lékařského použití, nazývaných fytoekdysteroidy [21–24]. Předchozí studie uváděly, že CF vykazovala několik biologických aktivit, včetně antiobezitních [21], antihypertenzních [22], antihyperglykemických [25,26], hepatoprotektivních [27–29], antikarcinogenních [23,24,30,31], a vlastnosti proti stárnutí [19,32]. Dodnes však nebyly odhaleny ani detailní ochranné účinky extraktu CF na pokožku, ani základní mechanismy proti vnitřnímu a vnějšímu stárnutí pokožky spojenému s oxidačním a glykačním stresem. Účelem této studie bylo objasnit antioxidační účinky extraktu CF a prozkoumat základní obranné mechanismy proti stárnutí extraktu CF proti degradaci kolagenu UV a AGE ve fibroblastech lidské kůže.

2. Výsledky

2.1. HPLC-ESI-MS/MS a MRM kvantitativní analýza

Obsahová analýza cílových bioaktivních sloučenin v CF extraktu byla provedena metodami vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC)-Mass/MS a metodou monitorování více reakcí (MRM). Iontový chromatogram MRM a hmotnostní spektrum na pozitivním módu elektrosprejové ionizace (ESI) standardu 20-hydroxyecdysonu a rutinu byly uvedeny v doplňkových materiálech. Přechod od prekurzorového iontu při m/z 481 k produkci při m/z 371 pro 20-hydroxyekdyson (obrázek S1a) a přechod od prekurzorového iontu při m/z 611 k produkci při m/z 3 03 pro rutin (obrázek S1b). Obrázek S2 ukazuje celkový iontový chromatogram (TIC) a extrahovaný iontový chromatogram (EIC) 20-hydroxyecdysonu (m/z 481) a rutinu (m/z 611) v CF extraktu. Obsah rutinu a 20-hydroxyecdysonu v extraktu CF byl 14,5 ± 0,4 mg/g a 19,5 ± 0,6 mg/g, v daném pořadí.

2.2. Antioxidační aktivita a efekt vychytávání volných radikálů CF extraktu

2.2.1. Aktivita odstraňování volných radikálů DPPH

DPPH je běžně používané činidlo pro odhad celkové aktivity antioxidantů pohlcujících volné radikály detekcí schopnosti extraktů poskytovat vodíkové protony. Výsledek ukázal, že extrakt CF vykazoval silnou vychytávací aktivitu 40,2 procenta ± 3,3 procenta při 50 µg/ml a 89,1 procenta ± 2,6 procenta při 500 µg/ml, zatímco vychytávací aktivita kyseliny askorbové byla 96,6 procenta. ± 2,3 procenta při 10 ug/ml (obrázek la). Polovina maximální inhibiční koncentrace (IC50) extraktu CF na vychytávání volných radikálů DPPH byla 84,7 ± 13,0 ug/ml.

2.2.2. Snížení schopnosti

Redukční schopnost extraktu CF pozorovaná v této studii je znázorněna na obrázku 1b. Redukční kapacita extraktu CF byla 51,3 procenta ± 1.0 procenta při 100 µg/ml a 66,9 procenta ± 1,7 procenta při 1000 µg/ml. Redukční kapacita srovnávací kontrolní kyseliny askorbové (100 ug/ml) byla 79,7 procenta ± 1,2 procenta.

2.2.3. Aktivita vychytávání superoxidových aniontů (O2 −).

Aktivita vychytávání radikálů superoxidových aniontů byla 82,2 procenta ± 6,1 procenta pro 250 µg/ml BHA (srovnávací kontrola) a pohybovala se od 59,6 procenta ± 3,5 procenta do 73,1 procenta ± 2,6 procenta pro extrakt CF 100–1000 µg/ml CF (obr.).

2.2.4. Aktivita zachycování peroxidu vodíku (H2O2).

Aktivita vychytávání peroxidu vodíku se pohybovala od 10,3 procenta ± 1,1 procenta do 61,1 procenta ± 2,3 procenta pro 200–1500 µg/ml CF extraktu a byla 96,3 procenta ± 2,0 procenta pro BHA (250 µg/ml) ( Obrázek 1d). IC50 extraktu CF byla 956,5 ± 59,2 ug/ml pro aktivitu vychytávání peroxidu vodíku.

2.2.5. Aktivita vychytávání hydroxylových radikálů (· OH).

Aktivita vychytávání hydroxylových radikálů extraktu CF (100–1000 µg/mL) a srovnávacího kontrolního mannitolu (µg/ml) je znázorněna na obrázku 1e. Aktivita vychytávání hydroxylových radikálů 1000 ug/ml CF extraktu byla 63,3 procenta ± 3,5 procenta a aktivita mannitolu (2500 ug/ml) byla 69,7 procenta ± 2,2 procenta. Vychytávací účinek extraktu CF byl podobný účinku srovnávací kontroly a IC50 CF pro aktivitu vychytávání hydroxylových radikálů byla 240,7 ± 24,3 ug/ml.

2.2.6. Chelatační aktivita železných iontů (Fe2 plus).

Obrázek lf ukazuje chelatační aktivitu CF extraktu a srovnávací kontroly EDTA. Aktivita se pohybovala od 6,5 procenta ± 1,4 procenta do 67,6 procenta ± 2,5 procenta pro 100–1000 µg/ml CF extraktu a 97,5 procenta ± 2,0 procenta pro 100 uM EDTA. IC50 extraktu CF byla 625,5 ± 46,0 ug/ml pro chelataci kovu.

2.3. CF extrakt zmírnil UV-indukovanou cytotoxicitu v buňkách Hs68

Pro vyhodnocení cytotoxického účinku extraktu CF ve fibroblastech lidské kůže (buňky Hs68) byla životaschopnost buněk ošetřených extraktem CF hodnocena testem MTT. Jak je znázorněno na obrázku 2a, extrakt CF neindukoval cytotoxicitu u buněk Hs68 v rozmezí koncentrací 50–250 µg/ml; proto byly tyto koncentrace zvoleny pro následující experimenty.

Buňky Hs68 byly vystaveny UVB záření a byla stanovena životaschopnost buněk, aby se vyhodnotil ochranný účinek extraktu CF proti poškození světlem. Výsledky ukázaly, že UVB (20–100 mJ/cm2) zářením indukovaná cytotoxicita v buňkách Hs68 v závislosti na dávce (obrázek 2b). Nicméně buňky Hs68 byly vystaveny UVB (80 mJ/cm2) a následně ošetřeny CF extraktem (100, 150, 200 a 250 ug/ml) po dobu 24 hodin; CF extrakt významně zmírnil cytotoxicitu indukovanou UV zářením (obrázek 2c).

2.4. Extrakt CF Snížil intracelulární tvorbu ROS indukovanou UV zářením v buňkách Hs68

ROS může vyvolat protein související s fotostárnutím pokožky a přenos signálu tím, že způsobí intracelulární oxidační stres v lidské kůži. Fluorogenní barvivo měří množství oxidačních volných radikálů v buňkách. Po ozáření UVB (80 mJ/cm2) po dobu 2 hodin byla produkce ROS v buňkách Hs68 indukována 216-krát ve srovnání s neozářenou skupinou. Léčba 100–250 µg/ml extraktu CF však významně snížila tvorbu ROS. ROS byly downregulovány 1.{11}}krát ve srovnání s radiační skupinou extraktem CF při 250 µg/ml (obrázek 3).

2.5. Extrakt CF spustil antioxidační obranný systém aktivací signální dráhy Nrf2/HO-1 v buňkách Hs68

2.5.1. Účinky CF extraktu na UV-indukovanou expresi Nrf2/HO-1

Za normálních podmínek Keap1 tvoří komplex s Nrf2 a podporuje ubikvitinaci a degradaci Nrf2. Signální dráha Nrf2 je však zahájena, když jsou buňky stimulovány environmentálním oxidačním stresem. V této studii byly buňky Hs68 ošetřeny extraktem CF, aby byly pozorovány jeho účinky na signální dráhu Nrf2 po UV záření. Jak je znázorněno na obrázku 4, UVB (40 mJ/cm2) záření indukovalo expresi Nrf2 a snížilo expresi Keap1, zatímco extrakt CF (250 µg/ml) významně indukoval expresi Nrf2 2.{15}}krát ve srovnání se skupinou ozařovanou . Po UV záření a ošetření CF extraktem v množství 250 µg/ml se proteinová exprese HO-1 zvýšila 2.5-krát. Výsledky ukázaly, že extrakt CF by mohl iniciovat antioxidační obranný mechanismus prostřednictvím signální dráhy Nrf2/HO-1 a chránit buňky před oxidačním stresem v biologickém systému.

2.5.2. Účinky CF extraktu na UV-indukovanou jadernou translokaci Nrf2

UV záření podporuje aktivaci Nrf2 a translokaci do jádra buněk. V této studii byl proveden test imunofluorescenčního barvení Nrf2 ve fibroblastech lidské kůže za účelem stanovení úrovně aktivace Nrf2. Translokace Nrf2 z cytoplazmy do jádra se zvýšila po UVB záření, zatímco translokace byla také zesílena po ošetření extraktem CF (obrázek 5). Výsledky testu imunofluorescenčního barvení byly v souladu s expresí Nrf2 na obrázku 4.

2.6. CF extraktem modulovaná buněčná signální dráha spojená s fotostárnutím kůže v buňkách Hs68

2.6.1. Účinky CF extraktu na UV-indukovanou expresi MMP-1, -3, -9 a TIMP-1

UV záření indukuje fosforylaci MAPK, která spouští downstream signální transdukci k aktivaci transkripčního faktoru AP{{0}} a ke zvýšení exprese MMP. Když je pokožka vystavena oxidativnímu stresu, dochází k upregulaci MMP, což pak vyvolává degradaci kolagenu a tvorbu vrásek. Jak ukazuje obrázek 6, UVB záření významně zvýšilo expresi MMP -1, -3 a -9 (2.2-násobek, 1.3-násobek a 1.5-násobek ve srovnání s kontrolní skupinou), zatímco extrakt CF zeslabil expresi MMP. Ošetření CF extraktem v dávce 250 µg/ml významně potlačilo hladiny UVB indukované exprese MMP-1, MMP-3 a MMP-9 1.1-krát, 0 .9-násobek a 1.{21}}násobek ve srovnání s kontrolní skupinou.

Tkáňové inhibitory metaloproteináz (TIMP) jsou inhibitory MMP exprimovaných v kožní pojivové tkáni. Exprese TIMP-1 byla snížena po UVB záření a zesílena extraktem CF (100–250 µg/ml) (obrázek 6). Tyto výsledky ukázaly, že ošetření extraktem CF zabránilo zvýšení hladin MMP-1, -3 a -9 vyvolané UV zářením a snížení TIMP-1; proto může extrakt CF snižovat rozklad extracelulární matrice kůže vyvolaný UV zářením a udržovat strukturální integritu v dermis.

2.6.2. Účinky CF extraktu na UV-indukovanou expresi AP-1 a MAPK

UVB záření upregulovalo expresi pc-Jun a c-Fos (24- a 1{6}}násobně ve srovnání s kontrolní skupinou), zatímco byly downregulovány extraktem CF (100–250 µg/ ml). Ošetření extraktem CF významně snížilo expresi pc-Jun a c-Fos při 250 ug/ml (obrázek 7a). Obrázek 7b ukázal, že expozice UVB zvýšila expresi fosforylace p38 a ERK na 2.1- a 15-násobek ve srovnání s celkovými hladinami proteinu v buňkách Hs68. Léčba extraktem CF (100–250 µg/ml) však významně inhibovala nadměrnou expresi MAPK indukovanou UVB. Fosforylace p38 a ERK byla potlačena na bazální úrovně koncentrací CF extraktu 250 ug/ml. Kromě toho by extrakt CF mohl inhibovat nadměrnou expresi AP-1 vyvolanou UV zářením a chránit pokožku před fotostárnutím.

2.6.3. Účinky CF extraktu na UV-inhibovanou expresi TGF- a Smad3

TGF- hraje ústřední roli v syntéze extracelulární matrix a řídí homeostázu kolagenu v lidské dermis. Zvýšené ROS ve fibroblastech zhoršuje signalizaci TGF snížením exprese TGF a Smad3, což vede ke ztrátě kolagenu a destrukci dermální tkáně u stárnoucí kůže. Podobně v naší studii UVB záření downregulovalo expresi TGF- a Smad3, aby inhibovalo syntézu kolagenu. Ve srovnání s kontrolní skupinou byla exprese TGF- a Smad3 nižší ve skupině ozařované UVB; nicméně CF extrakt (100–250 µg/ml) významně obnovil expresi proteinu (obrázek 8).

2.7. CF extrakt zeslabený AGEs-indukovaná produkce ROS a exprese RAGE v buňkách Hs68

Pro zkoumání účinku extraktu CF na glykační stres byly buňky Hs68 ošetřeny CML. Po ošetření buněk CML (100 ug/ml) po dobu 6 hodin bylo množství generovaného ROS 192-krát vyšší než v neléčené skupině. Léčba extraktem CF (100–250 µg/ml) však významně snížila produkci ROS. ROS byla snížena 130-krát ve srovnání se skupinou léčenou CML extraktem CF při 250 µg/ml (obrázek 9). Kromě toho CML (100 µg/ml) významně zvýšila expresi RAGE na 2.2-krát ve srovnání s kontrolní skupinou, ale byla zmírněna ošetřením extraktem CF (obrázek 10), což ukazuje, že extrakt CF snížil indukci hlavně způsobené CML.

2.8. Extrakt CF podpořil syntézu kolagenu a zlepšil stárnutím indukovanou degradaci kolagenu v buňkách Hs68

2.8.1. Účinky extraktu CF na syntézu kolagenu

Buňky Hs68 byly ošetřeny extraktem CF (50–250 µg/ml) po dobu 24 hodin a exprese prokolagenu typu I byla měřena pomocí western blotu. Po ošetření extraktem CF byla exprese prokolagenu typu I významně zvýšena (1,{5}}krát ve srovnání s kontrolní skupinou) (obrázek 11a). Celkový obsah kolagenu v kontrolní skupině byl 14,93 ± 1,27 ug/ml, který se zvýšil na 39.00 ± 2,39 ug/ml po ošetření 250 ug/ml CF extraktu (obrázek 11b). Výsledky exprese prokolagenu typu I a celkového obsahu kolagenu ukázaly, že extrakt CF podporuje syntézu a produkci kolagenu.

2.8.2. Účinky extraktu CF na degradaci kolagenu indukovanou UV zářením a AGEs

Buňky Hs68 vystavené UVB (40 mJ/cm2) záření nebo ošetřené CML (100 ug/ml) byly ošetřeny CF extraktem po dobu 24 hodin. Jak je znázorněno na obrázku 12a, celkový obsah kolagenu byl významně snížen po UVB záření a ošetření CF extraktem obnovilo kolagen a významně zvýšilo tvorbu kolagenu při 250 ug/ml. Podobné výsledky byly ukázány u produkce kolagenu ošetřeného CML a řadou CF extraktů. Extrakt CF zmírnil snížení celkového kolagenu ošetřené CML (obrázek 12b).

Test imunofluorescenčního barvení byl použit ke stanovení hladiny kolagenu ve fibroblastových buňkách (obrázek 12c). Jak UVB záření, tak ošetření CML snížilo obsah kolagenu, zatímco CF extrakty zlepšily degradaci kolagenu. Výsledky testu imunofluorescenčního barvení CF extraktu na kolagenu byly v souladu s obsahem kolagenu na obrázcích 11b a 12a,b.

【Další informace:george.deng@wecistanche.com / WhatApp:{0}}】