Micelární formulace kvercetinu zabraňuje nefrotoxicitě cisplatiny

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Alfredo G. Casanova, Marta Prieto, Clara I. Colino a kol.

Antioxidační flavonoidkvercetinbylo prokázáno, že bránínefrotoxicitana zvířecích modelech a v klinické studii a je tak velmi slibným profylaktickým kandidátem ve vývoji.kvercetinrozpustnost je velmi nízká, což znemožňuje klinickou aplikaci. Cílem této práce bylo studovat u potkanů ​​biologickou dostupnost a nefroprotektivní účinnost micelární formulace Pluronic F127-zapouzdřenákvercetin(P-kvercetin), se zlepšenou rozpustností ve vodě. Intraperitoneální podání P-kvercetinvede ke zvýšené plazmatické koncentraci a biologické dostupnostikvercetinve srovnání s ekvimolárním podáváním přirozenékvercetin. Navíc P-kvercetinzachovává si celkové nefroprotektivní vlastnosti a dokonce mírně zlepšuje některé parametry renálních funkcí ve srovnání s přírodnímikvercetin. Konkrétně P-kvercetinsnížil přírůstek plazmatického kreatininu (z 3,4±{2}},5 na 1,2±0,3 mg/dl) a močoviny (z 490,9±43,8 na 184,1±) 50,1 mg/dl)a snížení clearance kreatininu (z {{20}},08±0,02 na 0,58±0,19 ml/min) vyvolané nefrotoxickým chemoterapeutikem cisplatinou, a zlepšil histologický důkaz tubulárního poškození. Tato nová formulace se zlepšenými kinetickými a biofarmaceutickými vlastnostmi umožní další zkoumáníkvercetinjako kandidátní nefroprotektivum v nižších dávkách a cestami podávání orientovanými na jeho klinické použití.

klíčová slova:cisplatina;nefrotoxicita; flavonoid;kvercetin; nefroprotekce; biologická dostupnost;ledvinamicely; rozpustnost; formulace

Prevencenefrotoxicita

Klikněte pro Cistanche para que sirve pro onemocnění ledvin

1. Úvod

Léknefrotoxicitaje vážným medicínským a ekonomickým problémem [1,2], přičemž 25 procent ze 100 nejpoužívanějších léků na jednotkách intenzivní péče je nefrotoxických [3], anefrotoxicitaje také důležitou příčinou poklesu kandidátů během procesu objevování léku 4]. Cisplatina je protinádorové činidlo na bázi platiny, které se často používá při léčbě různých solidních maligních novotvarů [5,6]. Téměř 30 procent pacientů vykazuje důkazynefrotoxicitaběhem prvních deseti dnů po podání cisplatiny, což představuje významné omezení jejího dávkování a terapeutické účinnosti [5-8]. Akutní cisplatinanefrotoxicitazpůsobuje tubulopatii odvozenou z 5-násobné akumulace v epiteliálních buňkách proximálního tubulu, s ohledem na jeho plazmatickou koncentraci [9-1l], a v menší míře v distálním tubulu [12,13 ].

Cisplatinová tubulopatie se vyznačuje elektrolytickými poruchami (hlavně hypomagnezémií a hypokalemií) aakutníledvinazranění(AKI). AKI je běžný syndrom charakterizovaný náhlým poklesem glomerulární filtrace (GFR), těžkou azotemií a často oligurií nebo anurií [7,14]. Kromě toho endoteliální dysfunkce, která zvyšuje renální vaskulární rezistenci a zhoršuje autoregulaci, také přispívá k AKI indukovanému cisplatinou[9]. AKI je obvykle reverzibilní stav, který má nicméně relevantní dopad na výsledky pacientů, včetně zvýšené nemocniční úmrtnosti (více než 50 procent případů mezi kriticky nemocnými), prodloužené hospitalizace, dodatečných nákladů na zdravotní péči a středních a dlouhodobé scénáře, zvýšené riziko rozvojechronické onemocnění ledvina celkové a kardiovaskulární morbimortality [7,14]. Na subcelulární a molekulární úrovni je tubulární cytotoxicita cisplatiny řízena mitochondriálním poškozením, které omezuje dýchání, vyvolává oxidační stres a indukuje apoptotickou a nekrotickou buněčnou smrt a zhoubnou zánětlivou odpověď [13,15,16]. Oxidační stres je uznáván jako centrální mechanismus cytotoxicity cisplatiny anefrotoxicita[12,13,15-17], vznikající zvýšenou produkcí reaktivních forem kyslíku a oslabenou endogenní antioxidační enzymovou bariérou [5,7,18].

Účinná profylaktická opatření pro cisplatinunefrotoxicitapředstavují nesplněnou klinickou potřebu zlepšit svůj farmako-toxikologický profil a maximalizovat jeho užitečnost. Stávající preventivní strategie, včetně intenzivní hydratace, prokázaly pouze omezenou ochranu [6,19]. Nové strategie založené na společném podávání nefroprotektiv jsou ve vývoji. Kandidátní nefroprotektiva zahrnují hořčíkové přípravky |6,9 a především různé antioxidanty [6,20,21]. Flavonoidy jsou skupinou nefroprotektivních polyfenolických produktů získaných ze zeleniny, ovoce, ořechů a vína se silnými antioxidačními vlastnostmi [22].kvercetinje charakteristický flavonoid, který má mnoho příznivých účinků [23,24], včetně vychytávání reaktivních forem kyslíku, potlačení aktivace krevních destiček, endoteliální ochrany, modulace zánětu, inhibice apoptózy, suprese nádoru a nefroprotekce. Spoluadministracekvercetinspolu s terapií cisplatinou na zvířecím modelu nádoru poskytuje nefroprotekci bez narušení protinádorového účinku |25,26]. Ve skutečnosti byla identifikována aktualizovaná metaanalýzakvercetinjako velmi slibného kandidáta neuroprotektoru pro další klinický vývoj [21]. Nedávná klinická studie konzistentně uvádí ochranný účinekkvercetinna kontrastem indukovanou nefropatii (CIN) [27].

Silné omezení potenciální aplikacekvercetin(obecně sdílený s flavonoidy) je jeho nízká rozpustnost ve vodě vyplývající z jeho chemické struktury a složek, které snižují jeho absorpci v tenkém střevě, a tím i jeho biologickou dostupnost a účinnost [23,24, 28]. Zajímavé je, že lipofobní glukózakvercetinkonjugáty (glukosidy) jsou podstatně biologicky dostupnější než lipofilní aglykony, protože lipofilní aglykony jsou méně rozpustné ve střevním lumen [24]. Ve skutečnosti,kvercetinglukosidy z cibule vykazují nejvyšší míru vstřebávání a zvyšují obsah tuku v potravěkvercetinvstřebávání aglykonu v tenkém střevě [29]. Velmi nízká rozpustnost ve voděkvercetinnejenže brání jeho klinickému použití praktickými cestami podávání (tj. orální, intravaskulární), ale také omezuje preklinický výzkum. Nicméně na zvířecích modelech lze pro účely prokázání koncepce použít alternativní cesty (tj. intraperitoneální) se suspenzemi léčiva [25,26].

kvercetinbyly vyvinuty formulace s novými nosnými materiály se zlepšenou rozpustností ve vodě, jejichž biomedicínské vlastnosti je třeba testovat. Pluronic poloxamery jsou třídou nosných materiálů, které hostí a zvyšují absorpci ve vodě nerozpustných sloučenin díky jejich schopnosti tvořit micely ve vodném prostředí [30]. Zde jsme předpokládali, že micelární formulacekvercetinzapouzdřený dříve popsaným Pluronic F127 [31, by si zachoval nefroprotektivní vlastnosti přirozenékvercetina zároveň nabízí zlepšené biofarmaceutické vlastnosti pro manipulaci, formulaci a podávání.

Zabránitnefrotoxicita:kvercetin

2. Výsledky

S novou micelární formulací byla provedena studie biologické dostupnosti a nefroprotekcekvercetinzapouzdřené s Pluronic F127[31 a naší tradiční přírodní formulacíkvercetin|25,26|(viz níže Materiály a metody). Zatímco tento byl suspenzí obsahující tensoaktivní látku, první byl solný roztok bez dalších přísad. Naše tradiční přírodní složeníkvercetinbyl vhodný pouze pro experimentální účely, vysrážel se, když byl ponechán v klidu, a bylo obtížnější s ním manipulovat a injektovat. Naproti tomu micelární formulace se chovala jako roztok a nevykazovala žádné potíže s používáním.

2.1. Studie biologické dostupnosti

Jako metoda pro srovnávací biologickou dostupnost, evolucekvercetin(Q) plazmatická koncentrace byla studována po jediném intraperitoneálním bolusu přirozeného a P-kvercetin(PQ). Obrázek 1 ukazuje průměrkvercetinkřivky plazmatické hladiny získané po podání dávkykvercetinnebo P-kvercetin. Maximální koncentrace léčiva (Cmax) pozorované ve skupinách Q a PQ byly 1,14 ± 1,28 ug/ml a 8,90 ± 4,62 ug/ml, v daném pořadí, tj. 7.8-násobný přírůstek pro P-kvercetincož ukazuje, že micelární formulace zvýšila absorpci léčiva.

Obrázek 1. Vývoj plazmatické koncentrace kvercetinu po intraperitoneálním podání jednoho bolusu ekvimolárního P-kvercetinu a přirozeného kvercetinu.

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM) (n=5 na skupinu). *str<0.05;><0.01;><0.001 vs.qgroup.="">kvercetin(50mg/kg,ip.);PQ:100mg/kgi.pP-kvercetin(obsahující 50 mg/kgkvercetin).

Tabulka 1. Farmakokinetické parametry po intraperitoneálním podání P-kvercetinu a přírodního kvercetinu (n=5 na skupinu).

Otázka: kvercetin(50 mg/kg, ip; PQ: P-kvercetin(100 mg/kg,ip).AUCo24: plocha pod parciální křivkou; AUCo: plocha pod celkovou křivkou; MRT: střední doba zdržení; t1/2: poločas eliminace; X: sklon koncové fáze.

Tabulka 1 ukazuje farmakokinetické parametry nezávislé na modelukvercetinu potkanů ​​po podání jedné bolusové dávky přirozenékvercetinnebo P-kvercetin. Doba do Cmax byla zvýšena z 15 minut (pro přirozenékvercetin) až 1 h (pro P kvercetin). Toto zpoždění může být přičítáno postupnému uvolňováníkvercetinz micelární formulace. Celková expozice krys flavonoidu byla významně vyšší u P-kvercetin, jak ukazuje větší plocha pod křivkou (AUC), která se převádí do o 302,5 procenta vyšší biologické dostupnosti. Tyto výsledky naznačují, že vyšší rozpustnost micelární formulace zvyšuje její absorpci.

2.2. Studie účinnosti nefroprotekce 2.2.1. Fyziologický stav

Jak dokazuje vývoj tělesné hmotnosti (obrázek 2a), celkový zdravotní stav se po léčbě cisplatinou ve srovnání s kontrolními zvířaty zhoršil. Ani přírodníkvercetinani P-kvercetinvýznamně modifikoval účinek cisplatiny. Nicméně obojíkvercetinléčby téměř úplně zabránily nárůstuledvina/poměr tělesné hmotnosti vyvolaný cisplatinou (obrázek 2b), parametrem, o kterém je známo, že koreluje s velikostí opotřebenínefrotoxicita[32].

Obrázek 2. Vývoj celkového zdravotního stavu. (a) Procentuální změna tělesné hmotnosti v průběhu experimentu; (b) Poměr ledvin/tělesná hmotnost v den 9.

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (n=3-5 na skupinu). *str<><0.01;><0.001vs.controlgroup.><0.05;><0.01 vs.="" cp="" group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,="" i.p.)on="" day="">

CP plus Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3; CP plus PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3.

2.2.2. Renální funkce a hodnocení renální tkáně

Podle mezinárodních kritérií je AKI definována a diagnostikována podle zvýšení koncentrace kreatininu v plazmě (Crp)[33-35], náhradního markeru rychlosti glomerulární filtrace (GFR). Jiné parametry, jako je koncentrace močoviny v plazmě, jsou také často hodnoceny jako indikátory azotémie [36-38]. Zvýšení Crp a plazmatické urey jsou známkami snížené GFR a AKI. V naší studii byla renální funkce cisplatinou těžce postižena a tento účinek byl částečně zlepšenkvercetin. P-kvercetinvykázala o něco odvážnější aktivitu než přirozenoukvercetin, což naznačuje mírnější poškození a zlepšený profil zotavení (obrázek 3). Potkani ve skupině s cisplatinou (CP) podstoupili zjevnou AKI, protože u nich došlo k progresivnímu a signifikantnímu zvýšení plazmatických hladin kreatininu a močoviny ve srovnání s kontrolami (obrázek 3a, b). Tyto parametry se také zvýšily ve skupinách CP plus Q a CP plus PQ, ale ve výrazně nižší míře. Rozdíly mezi skupinami CP plus Q a CP plus PQ nebyly statisticky významné, nicméně krysy léčené P-kvercetinvykazovali mírně nižší hladiny kreatininu a močoviny než ti, kteří byli léčeni přírodnímkvercetin. Clearance kreatininu (ClCr) je standardní metoda pro měření GFR ]39,40]. V souladu s údaji o Cr cisplatina vyvolala hluboký pokles, který byl částečně zmírněnkvercetin(Obrázek 3c). V tomto případě byl však patrný rozdíl mezi P-kvercetinem a přírodním kvercetinem, přičemž první z nich byl výrazně účinnější při zlepšování a urychlení zotavení. Za zmínku stojí, že Clcr a Crpl se chovají nepřímo úměrně, což je patrné pouze v ustáleném stavu. Během AKI se však funkce ledvin neustále a rychle mění, což vede k mírnému rozpojení tohoto vztahu.

Obrázek 3. Vývoj renálních parametrů.

(a) Plazmatická koncentrace kreatininu; (b) Plazmatická koncentrace močoviny; (c) Clearance kreatininu; (d) Proteinurie; a (e)KIM-1 vylučování moči.

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr±SEM(n=3-5 na skupinu). *str<><><0.001 vs=""><0.05;><0.01vs.cp group.cp:cisplatin(6.5="" mg/kg,i.p.)on="" day="">

CP plus Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3; CP plus PQ: P-kvercetin(100 mg/kg, ip.) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3. KIM-1:ledvinazraněnímolekula1.

Proteinurie se také často měří v souvislosti s renální patologií. V závislosti na základním modelu poškození může mít proteinurie glomerulární původ (tj. zvýšená permeabilita glomerulární filtrační bariéry) nebo jako v případě cisplatinynefrotoxicita[13], může vzniknout z defektní tubulární reabsorpce v důsledku tubulárního poranění. Nesignifikantní zvýšení proteinurie bylo detekováno ve skupinách CP a CP-Q (ačkoli méně výrazné ve skupině CP-Q) 7. den, které se vrátilo k normálu do 9. dne. Podobně vylučování biomarkeru tubulárního poškození močí (tj.ledvinazraněnímolekula 1; KIM-1)[41,42]byla výrazně zvýšena cisplatinou a toto zvýšení bylo utlumeno oběma formamikvercetin, i když P-kvercetinbyla opět o něco efektivnější.

Histologická studie renální tkáně byla v souladu s biochemickými nálezy. Vzorky od potkanů ​​léčených cisplatinou odhalily masivní tubulární nekrózu v horním pruhu vnější dřeně, doprovázenou určitým kortikálním postižením akvercetinsnížené kortikální poranění (obrázky 4 a 5). U krys, které dostaly pouze nefrotoxickou látku, se rozvinula tubulární dilatace a obstrukce (považovaná za nahromaděný hyalinní materiál) a tubulární nekróza s deepitelizací a odlupováním buněk. Obakvercetinléčby podobně snížily kortikální poškození vyvolané cisplatinou, ale neměly žádný účinek na poškození dřeně (obrázky 4 a 5).

Obrázek 4. Reprezentativní snímky renálních vzorků obarvených hematoxylinem a eosinem.

Černé šipky: tubulární nekróza a odlupování buněk; modré šipky: tubulární dilatace; zelené šipky: intratubulární depozita hyalinního materiálu. CP:cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3;

CP plus Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3; CP plus PQ: P-kvercetin(100 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3.

Obrázek 5. Kvantifikace poškození ledvin.

Hodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± SEM (n =5 snímků × 3 krysy na skupinu). * str<><0.001 vs.=""><0.05 vs.cp="">

CP: cisplatina (6,5 mg/kg, ip.) v den 3; CP plus Q:kvercetin(50 mg/kg, ip po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3; CP plus PQ: P-kvercetin(100 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3.AU: libovolné jednotky.

3. Diskuse

Naše výsledky ukazují, že micelární formulacekvercetins Pluronic F127 (P-kvercetin), nesoucí vylepšené biofarmaceutické vlastnosti, zvýšil biologickou dostupnost tohoto antioxidačního flavonoidu a zachoval (nebo dokonce mírně zlepšil) jeho celkové nefroprotektivní vlastnosti ve srovnání s přírodnímikvercetin.

kvercetinbyl postulován jako slibný kandidát na ochranu před poškozením ledvin způsobeným řadou léků a toxinů, včetně cisplatiny [25,26], methotrexátu [43,44], ciprofloxacinu [45], NaF [46], HgCl [47l a kadmia [48]. Přestože tyto studie prokázaly preklinickou účinnost,kvercetinnebyl testován v podobných klinických scénářích kvůli překážkám ve formulaci a nízké biologické dostupnosti, s výjimkou klinické studie, ve kterékvercetinposkytly určitou ochranu před CIN [27]. Obě omezení jsou důsledkem velmi špatné rozpustnosti ve vodě (pouze 0,01 mg/ml, při 25 stupních [49])kvercetina jeho nízké stability (která je ovlivněna teplotou, pH, hydroxylací, enzymatickou aktivitou a kovovými ionty)[28,29,50]. Orálně podávanékvercetinčelí rozsáhlé degradaci během průchodu žaludkem kvůli velmi nízkému pH žaludku (tj. 1,5)[50]. V tenkém střevě, chemicky chráněno vyšším pH(7,5), zbkvercetinse vstřebává jen minimálně. Proto, aby se zvýšila jeho biologická dostupnost a biologická účinnost, byly vyvinuty nové formulace kvercetinu s cílem zlepšit jeho rozpustnost ve vodě a také chránit jeho aktivní části před degradací, včetně lipozomů, nanočástic, nanoemulzí a micel [28].

Naše micelární složení s Pluronic F127 se zvyšujekvercetindesetinásobná rozpustnost a ve studiích in vitro prokázala lepší rozpouštěcí chování v simulovaných žaludečních a střevních tekutinách, protože dosahuje významného zmenšení velikosti částic a homogennější disperzekvercetinv polymerní matrici I31. Tato formulace poskytuje výrazně zvýšené množstvíkvercetindo krevního řečiště, což vede k 3-násobku biologické dostupnosti, která se kupodivu promítá pouze do mírně vyššího nefroprotektivního účinku. Ve shodě jsme nepozorovali další nefroprotektivní účinek, když jsme použili vyšší dávku (tj. 100 mg/kg) přírodníkvercetinv předchozích experimentech (naše nepublikovaná pozorování)[25,26]. V těchto studiích byla naše interpretace taková, že pravděpodobně vyšší dávky ipkvercetin(i.e., >50 mg/kg) se nepromítlo do zvýšené biologické dostupnosti v důsledku snížené rozpustnosti, což nevedlo k žádné významně zvýšené čisté absorpci. To se shodovalo se žlutými usazeninami nevstřebanéhokvercetinnalezen v peritoneální dutině při obětování. Kromě toho naše současné výsledky ukazují, že i vyšší plazmatické koncentrace kvercetinu (jako ty, které byly získány s P-kvercetinem) vedou pouze k mírně vyššímu účinku. Protožekvercetindistribuce byla vysvětlena ve zjednodušené formě pomocí dvoukompartmentového modelu prvního řádu [51], přístup k cílovým buňkám z hlavního kompartmentu (tj. krevního řečiště) se nezdá být omezením. Důvod, proč je maximálního nefroprotektivního účinku téměř dosaženo s nižšími plazmatickými koncentracemi, které poskytuje přirozený kvercetin, zůstává nejasný.

To má praktické důsledky pro další vývojkvercetinjako profylaktický nefroprotektor. Za prvé, tyto výsledky otevírají možnost studovat, zda režimy s nižším dávkováním budou podobně účinné, jako je značný přebytek biologické dostupnosti P-kvercetinmůže být obětován bez ztráty terapeutického účinku, ale maximalizuje bezpečnostní profil. Zadruhé, nyní je otevřena příležitost pro orální podávání, které však musí být testováno pro novou formulaci. Absorpce z peritoneální dutiny se vyhne bariérám, se kterými se setkáváme při orální cestě. Předpokládá se, že vyšší rozpustnost ve střevním lumen může vést ke zvýšení a nastaveníkvercetinbiologická dostupnost v rámci terapeutického okna. Za třetí, intravenózní cesta by nyní mohla být realistickou alternativou s minimalizovanou toxicitou, která by zabránila absorpčním bariérám. Dosud experimentální injekční formulacekvercetinpoužil jako rozpouštědlo dimethylsulfoxid (DMSO) [51].

Je známo, že cisplatina se hromadí v proximálních a distálních tubulech a poškozuje je a vyvolává apoptózu a nekrózu epiteliálních buněk tubulů v závislosti na koncentraci [16]. Nejvíce je postižen proximální segment S3, i když jsou také S1 a S2 stále více poškozovány vyššími dávkami. V souladu s jeho známými antiapoptickými vlastnostmi na buňkách tubulů [52,53],kvercetinsnížená kortikální tubulární deepitelizace. Shodný účinek pozorovaný u obou formulací posiluje myšlenku, žekvercetindistribuční kinetika kledvinyjsou v naší studii nasyceny. Navíc v rámciledviny, kvercetinvykazuje odlišné chování podél nefronu. Ve skutečnosti,kvercetinneměl žádný vliv na zevní dřeň, kde se nachází segment S3 proximálních tubulů.kvercetinZdá se, že se hromadí v S1, S2 nebo distálních tubulech, které se nacházejí blízko kortexu. Protože není známo jak (tj. které transportéry nebo difúzní cesty) a odkud (tj. luminální nebo bazolaterální strana)kvercetinpřistupuje k tubulárním buňkám, je nutný další výzkum k vysvětlení těchto rozdílných efektů.

Mírné uchování kortikální tkáně může vysvětlit účinek pouze částečněkvercetinna funkci ledvin (tj. GFR). Další ochrana může vzniknout z vaskulárních účinkůkvercetin. Endoteliální funkce se podílí na regulaci renálního průtoku krve (RBF) a GFR modulací aferentního a eferentního kontraktilního tonu arteriol [54-57]. Cisplatina indukuje endoteliální dysfunkci a předpokládá se, že to podstatně přispívá k poklesu GFR spolu s renální aferentní vazokonstrikcí indukovanou tubuloglomerulárními zpětnovazebními mechanismy (aktivovanými tubulárním poškozením) a zánětlivými cytokiny [13,58]. Zvrat endoteliální dysfunkce je skutečně široce uznávaným účinkemkvercetin(a flavonoidů obecně)[59-61l, což může vysvětlit pročkvercetinzlepšuje RBF (a tedy GFR), jak bylo uvedeno dříve [25]. Navíc tyto endoteliálně-vaskulární účinky mohou také pomoci vysvětlit mírně vyšší účinnost P-kvercetinna zlepšení funkce ledvin a obnovení funkce ledvin. Pravděpodobně není nerozumné spekulovat o tom, že vyšší biologická dostupnost by mohla mít odvážnější účinek na endoteliální lavor v přímém kontaktu s krví.

Některé z účinků pozorovaných po podáníkvercetinmohou být vyvíjeny jeho metabolity.kvercetinje metabolizován ve střevní sliznici a játrech glukuronidačními, sulfatačními a metylačními reakcemi [62], přičemž nejhojnějšími metabolity jsou glukuronidové metabolity v krevním řečišti [63]. konkrétněkvercetinBylo prokázáno, že -3-bO-glukuronid (Q3GA), hlavní plazmatický metabolit, má protizánětlivé a vaskulární účinky, a to jak přímo, tak po metabolizaci zpět na aglykonovou formu [64]. K pochopení specifických metabolitů odpovědných za neuroprotekci a jejich odlišnou produkci a transformaci z různých míst podání na jejich konečné cíle je nutný další výzkum.

Závěrem, tato počáteční studie ukazuje terapeutický potenciál P-kvercetinjako vylepšená formulace se zlepšenými biofarmaceutickými a farmakokinetickými vlastnostmi, užitečná pro další vývoj a perspektivní klinické použití v profylaxinefrotoxicita.

Výhody kvercetinu na nefrotoxicitu

4. Materiály a metody

Všechny chemikálie a činidla byly zakoupeny od společnosti Merck (Darmstadt, Německo), pokud není uvedeno jinak.

4.1. Příprava micelární formulace (P-kvercetin) a přirozenékvercetinFormulace

kvercetinhydrát (minimální čistota 95 procent) byl získán od Acros Organics (Madrid, Španělsko) a blokový kopolymer ethylenoxid-propylenoxid Pluronic F127 (průměrná molekulová hmotnost 12,6 kDa, hydrofilně-lipofilní rovnováha 22) poskytl BASF (Ludwigshafen am Rhein, Německo). Pro micelární formulaci byla k výrobě použita technika srážení superkritickým antirozpouštědlemkvercetin/částice Pluronic F127 (P-kvercetin), jak bylo popsáno dříve [31]. Výsledný Pluronic-kvercetinformulace měla relativní složení 50 procent /50 procent w/w Pluronic F127/kvercetin. Pro přirozenékvercetinformulace,kvercetinbyl suspendován v 0,16% Tween 20 ve fyziologickém roztoku, jak bylo popsáno dříve [25,26].

4.2. Zvířata a bioetika

Všechny postupy byly schváleny Bioetickým výborem Univerzity v Sala-mance a regionální vládou Kastilie a Leónu, Ministerstvem zemědělství a živočišné výroby (kód: 0000037, 27. července 2015). Se zvířaty bylo zacházeno v souladu s pokyny směrnice Rady Evropského společenství 2010/63/EU a podle aktuální španělské legislativy pro použití a péči o pokusná zvířata (RD53/2013, 1. února 2013). Samci potkanů ​​Wis-tar (200-250 g) byli chováni v kontrolovaných podmínkách prostředí v zařízení Animal House University of Salamanca s volným přístupem k vodě a standardní potravě.

4.3. Studie biologické dostupnosti

Potkani byli rozděleni do dvou experimentálních skupin: O (n{0}}), ve kterých zvířata dostala jednu dávkukvercetin(50 mg/kg); a PQ(n=5), kdy zvířata dostala jednu ip ekvimolární dávku P-kvercetin(100 mg/kg (tj. obsahující 50 mg/kgkvercetin). Následně byly odebrány vzorky krve do zkumavek potažených kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA) z malého řezu na špičce ocasu v následujících časech:0.25,0.5,1,2,8, 12 a 24 hodin. Plazma byla získána centrifugací a 10 μl 10 mM kyseliny askorbové (aby se zabránilokvercetindegradace） byla přidána do 100 μl plazmy a zmražena na -80 stupeň až do její analýzy.kvercetinkoncentrace byly stanoveny metodou vysokoúčinné kapalinové chromatografie (HPLC) s reverzní fází s UV detekcí. Byla použita kolona Prosper o velikosti částic 3 um C18, s mobilní fází složenou z 28 procent acetonitrilu a 72 procent vodného roztoku 0,2% kyseliny ortofosforečné při průtoku 1 ml/min. Detekční vlnová délka byla 371 nm. Před nástřikem do chromatografického zařízení byly vzorky podrobeny procesu glukuronidace pro kvantifikaci celkového množstvíkvercetin. Za tímto účelem bylo 100}0 jednotek -glukuronidázy z Helix pomatia v 0,1 M acetátovém pufru (pH 5) přidáno do 100 μl plazmy a tato směs byla inkubována při 37 stupních po dobu 1 hodiny. . Poté byl proveden extrakční proces se 100 ul směsi 0,5 M 80~20 acetonitril/octová (třikrát). Jakmile byl supernatant odpařen v proudu dusíku, suchý zbytek byl znovu rozpuštěn v mobilní fázi o objemu 40 ul a 20 ul bylo injikováno do systému HPLC.

4.4. Studie nefroprotekce

Potkani byli rozděleni do následujících experimentálních skupin (obrázek 6): Kontrolní (n{1}}) zvířata dostávala vehikulum (NaCl0,9 procenta) intraperitoneálně (ip) po dobu 9 dnů; Zvířata CP(n=5) obdržela jednu nefrotoxickou dávku cisplatiny (6,5 mg/kg,ip) v den 3 experimentu; zvířata CP plus Q(n{9}}) dostávala denní dávkukvercetin(50 mg/kg,ip) po dobu 9 dnů a jedna dávka cisplatiny (6,5 mg/kg,ip) v den 3; a CP plus PQ (n=5)zvířata dostávala denní dávku P-kvercetin(100 mg/kg, ip (tj. obsahující 50 mg/kgkvercetin)) po dobu 9 dnů a dávka cisplatiny (6,5 mg/kg, ip) 3. den.

Obrázek 6. Schéma modelu nefrotoxicity.

CP: cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3; CP plus Q:kvercetin(50 mg/kg, ip) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3; CP plus PQ:P-kvercetin(100 mg/kg, ip.) po dobu 9 dnů a cisplatina (6,5 mg/kg, ip) v den 3.

Vzorky krve （150 μl） byly odebrány ve dnech 0, 3, 5, 7 a 9 v heparinizovaných kapilárách z malého řezu na špičce ocasu. Plazma byla oddělena centrifugací (11,{7}} otáček za minutu po dobu 3 minut) a udržována při -80C. Ve dnech 7 a 9 byla 24 hodinová moč shromažďována v metabolických klecích, vyčištěna centrifugací (2000 x g po dobu 9 minut) a skladována při -80 stupni. Na konci experimentu (den 9) byly krysy anestetizovány a jejichledvinybyly vypreparovány, zváženy a fixovány v 3,7% paraformaldehydu pro histologické studie.

Kreatinin v plazmě a moči byl měřen pomocí komerční soupravy založené na Jaffeově metodě [65] (QuantiChrom Creatinin Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Plazmatická močovina byla stanovena pomocí komerční soupravy založené na Jungově metodě [66] (Quan-tiChrom Urea Assay Kit, BioAssay Systems, Hayward, CA, USA). Clearance kreatininu (Clcr) byla vypočtena pomocí vzorce: Clcr=Crur × UF/ Crp); kde Crur odpovídá koncentraci kreatininu v moči, UF je průtok moči a Crp je plazmatická koncentrace kreatininu. Proteinurie byla měřena Bradfordovým testem [67]. KIM-1 byl kvantifikován pomocí krysyledvinyzraněnímolekula 1(KIM-1)ELISA Kit (Cusabio, Houston. TX, USA). podle pokynů výrobce.

Pro histologické studie byly renální vzorky zality v parafínu a 5 um tkáňové řezy byly obarveny hematoxylinem a eosinem. Fotografie byly pořízeny pod mikroskopem Olympus BX51 připojeným k barevnému digitálnímu fotoaparátu Olympus DP70 (Olympus, Madrid, Španělsko). Kvantifikace poškození byla provedena slepým způsobem, jak bylo popsáno dříve [68]. Stručně řečeno, bylo pořízeno pět náhodných fotografií kortikální oblasti a pět fotografií vnější medulární oblasti (tj. oblastí poškozených cisplatinou), které tyto oblasti rovnoměrně mapovaly. Každý obrázek byl rozdělen do 10 identických částí (pomocí softwaru Microsoft Office PowerPoint 2016), z nichž každé bylo přiřazeno skóre 0 (žádné poškození), 1 (přítomnost poškození na méně než 1/3 plochy), 2 (přítomnost poškození mezi 1/3-2/3 oblasti) nebo 3 (přítomnost poškození na více než 2/3 oblasti). Poškození bylo hodnoceno s ohledem na přítomnost tubulární nekrózy a odlupování buněk, tubulární dilataci, vakuolizaci, přítomnost hyalinních usazenin a ztrátu kartáčového lemu.

4.5. Statistická analýza

Data jsou prezentována jako průměr ± standardní chyba průměru (SEM). Odlehlé hodnoty byly identifikovány pomocí Grubbsova testu|69]. Normální distribuce dat byla hodnocena pomocí Shapiro-Wilkova testu. Ve studii biologické dostupnosti bylo srovnání mezi dvěma skupinami provedeno pomocí Studentova t-testu nebo Mann-Whitneyho U testu. Farmakokinetická studie byla provedena pomocí modelově nezávislé analýzy průměrných plazmatických hladinkvercetin. Odhadované parametry pro hodnocení relativní biologické dostupnostikvercetinbyly plocha pod parciální křivkou plazmatických hladin (AUC)24, plocha pod celkovou křivkou plazmatických hladin (AUC)0~, sklon terminální fáze, poločas eliminace (ti/2) a střední doba zdržení (MRT). Odhad farmakokinetických parametrů byl proveden kombinací lichoběžníkové metody pro odhad plochy pod parciální křivkou a nelineární regrese terminální fáze křivky plazmatické hladiny. Pro studii nefroprotekce byla pro srovnání mezi skupinami provedena analýza rozptylu (ANOVA) se Scheffeho testy nebo Kruskal-Wallis testem. Statistická analýza byla provedena pomocí softwaru IBM SPSS Statistics 20.0 (International Business Machines, Armonk, NY, USA). K vytvoření kresby a ilustrací byly použity Microsoft Office Excel a PowerPoint 2016 (Microsoft, Redmond, WA, USA).

Reference

1. Awdishu, L.; Mehta, RLThe6R's of Drug-InducedNefrotoxicita. BMCNephrol.2017,18,124. [CrossRefl[PubMed]

2. Perazella, MADrug Use andNefrotoxicitana jednotce intenzivní péče.ledvinyMezinár.2012,81,1172-1178. [CrossRef] [PubMed]

3. Taber, SS; Mueller, renální dysfunkce spojená s BADrug. Crit.Care Clin.2006,22,357-374, vi. [CrossRef] Huang, JX; Blaskovich, MA; Cooper, MACell-a Biomarker-založené testy pro predikciNefrotoxicita.

Poznámka:výše uvedené není úplný seznam referencí