Trojrozměrná architektura nefronů v normální a cystické ledvině
Mar 17, 2022
další informace:ali.ma@wecistanche.com
Thomas Blanc1,2,7Nicolas Goudin3,7, Mohamad Zaidan1,4,7, Meriem Garfa Traore3, Frank Bienaime1,5,Lisa Turinsky1, Serge Garbay1, Cle´ment Nguyen1, Martine Burtin1, Ge´rard Friedlander1,6, Fabiola Terzi1,8a Marco Pontoglio1,8
1Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale U1151, Centre National de la Recherche Scientifique UMR8253, Université deParis, Institut Necker Enfants Malades, Département « Croissance et Signalisation », Paříž, Francie;2Service de Chirurgie Viscérale etUrologie Pédiatrique, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paříž, Francie;3Struktura Fédérative de Recherche Necker, US24-UMS3633, Paříž, Francie; 4Service de Néphrologie-Transplantation, AP-HP, Hôpital Bicêtre, Le Kremlin-Bicêtre, Francie;5Service d'ExplorationsFonctionnelles, AP-HP, Hôpital Necker Enfants Malades, Paříž, Francie; a6Service d'Explorations Fonctionnelles, AP-HP, HôpitalEuropéen Georges Pompidou, Paříž, Francie
KLÍČOVÁ SLOVA: cystickáledvinachoroba;ledvina; nefron; nefronoftóza; čištění tkání
Překladové prohlášení
Clearingové metody poskytují jedinečný nástroj pro pochopení toho, jak morfologické změny vedou k patologickým následkům.Ledvinyjsou kritické orgány, které udržují tělesnou homeostázu prostřednictvím vody, metabolitů a elektrolytů, které zásadně závisí na komplexní 3-dimenzionální struktuřenefronyKdyž je tato strukturní organizace změněna, následuje renální patofyziologie. V této studii jsme vyvinuli výkonnou metodu založenou na optickém čištění, multifotonové mikroskopii a digitálním sledování pro studiumledvinana úrovni jednoho nefronu za fyziologických a patologických podmínek. Konkrétně poskytujeme první 3-rozměrnou rekonstrukci polycystickidney v měřítku jednohonefrony. Tuto metodu lze aplikovat na několik patologických kontextů, což nám umožňuje lépe porozumět složitému procesu deteriorace ledvin a následně vyvinout cílenější terapeutické strategie
Ledviny prostřednictvím svého komplexu udržují tělesnou homeostázu3-rozměrný(3D) struktura nefronu. Když se tato strukturní organizace změní, následuje renální patofyziologie. Chronickýledvinaonemocnění jsou charakterizována rozvojem renálních lézí. Je zajímavé, že patologové zaznamenali širokou heterogenitu v distribuci lézí během chronických onemocnění ledvin.1,2 Zda to odráží skutečnost, že specifické segmenty nefronů mohou být různě poškozeny, nebo alternativně, že některé nefrony mají různou náchylnost k poranění jako celku, není známo. K vyřešení tohoto problému je povinné rekonstruovat 3D (Trojrozměrný) tvarnefronyv patologických souvislostech.
Pokud je nám známo,nefronybyly plně rekonstruovány pouze pomocí sériových 2D řezů.3–5 Přestože standardní histologické řezy poskytují vysoké rozlišení, 3Drekonstrukce jsou pracné a obtížně se získávají. To je způsobeno především mechanickými deformacemi, což je nevyhnutelný efekt procesu krájení. Navíc 3D (rekonstrukce z 2D snímků neumožňuje přímé zobrazení 3D struktur v celoplošně namontovaných tkáních.
Multifotonová mikroskopie zlepšila naši schopnost detekovat morfologické změny v tlustých řezech. Významným omezením je však malá přístupná hloubka kvůli rozptylu světla. Minimalizací rozdílů v indexu lomu čistící činidla dramaticky zlepšila schopnost zobrazovat hloubky obrazu.6,7 Navzdory skutečnosti, že první čistící činidlo bylo představeno před stoletím,8 teprve nedávno bylo vyvinuto několik čistících protokolů, většinou pro mozek.9 –17Nedávné studie prokázaly jejich potenciál pro zobrazování dalších pevných orgánů, jako jsou játra, slinivka neboledvina.18–26
Polycystickéledvinanemoc, geneticky heterogenní porucha zahrnující mutace v několika ciliárních genech, je nejčastějším dědičným onemocněním ledvin.27,28 Polycystickáledvinaonemocnění je charakterizováno vývojem cyst, které vedou k úplné destrukci ledviny.28 Mikrodisekční studie naznačují, že cysty se mohou vyvinout buď jako „vytlačení“ segmentu nefronu, jako je tomu u autozomálně dominantně polycystického onemocnění ledvin; jako extatická expanze sběrných kanálků (CD), jako u autosomálně recesivních polycystickýchledvinachoroba; nebo výlučně v medulárních tubulech, jako u nefronofthisis (NPHP).27,29 Jak se však cysty vyvíjejí ve 3D (Trojrozměrný) a organizovat se mezi sebou a normálními sousedními tubuly dosud neznámými.
Zde jsme zkombinovali optické čištění s multifotonovou mikroskopií, abychom poskytli nové poznatky o tom, jaknefronyjsou formovány a organizovány ve fyziologických podmínkách a jak jsou modifikovány během onemocnění, jako je cystogeneze. Naše výsledky ukazují, že existují 3 typynefronya že cévy mohou ovlivnit prostorovou organizaci nefronů. Zajímavé je, že jsme pozorovali, že nefrony mají tendenci ležet ve specifických rovinách. Když jsme tuto techniku aplikovali na myši jck, neočekávaně jsme pozorovali, že cysty se vyvíjely pouze ve specifických nefronových segmentech s vřetenovitými cystami promíchanými s normálními tubuly.
Klikněte naCistanchevedlejší efektypro onemocnění ledvin
VÝSLEDEK
Experimentální nastavení
Studovat tvar celkunefronyve vztahu k jejich prostředí jsme přijali techniku založenou na optickém čištění a multifotonové mikroskopii (doplňkový obrázek S1A). Porovnáním různých protokolů optického čištění jsme určili, že proledvinabenzylalkohol/benzylbenzoát (BABB) byl nejvhodnější z hlediska účinnosti (doplňkový obrázek S1B a C a doplňková tabulka S1).
3D (Trojrozměrný) rekonstrukce a digitální trasování vyžadují vysoce kvalitní snímky s vysokým rozlišením a vysokým poměrem signálu k pozadí. Pozorovali jsme, že optický signál poskytovaný nativní fluorescencí nebyl jednotný na řezech ledvin. Zejména obrazy z dřeně byly špatně kontrastovány s nízkým poměrem signálu k pozadí (doplňkový obrázek S2). Abychom zlepšili poměr signálu k pozadí, obarvili jsme řezy kyselinou jodistou – Schiff (doplňkový obrázek S1D), protože jsme empiricky zaznamenali, že toto barvení způsobilo vysoký kontrast v tenkých řezech během 2-fotonfluorescence. Signál však nebyl stejnoměrný v hustém barvení kyselinou jodistou – Schiffledvinařezy (doplňkový obrázek S1E). Proto jsme řezy ledvin obarvili lektiny vázanými na fluorochrom: aglutinin z arašídů a aglutinin z pšeničných klíčků, které barví glomeruly a tubuly, a aglutinin Griffonia simple I folia, který označuje krevní cévy.30 Je pozoruhodné, že s kombinací selektinů se poměr signálu k pozadí se dramaticky zvýšil v celých řezech ledvin s významným zlepšením jak v rovině XY, tak v ose z (doplňkový obrázek S1E a doplňkový film S1).
3D vizualizace segmentu nefronů
Pro vizualizaci tvaru celkunefrony, sledovali jsme jejich cesty, počínaje močovým pólem glomerulu a končící na CD junkci (doplňkový film S2). Navzdory skutečnosti, že použité lektiny globálně vážou všechny nefronsegmenty, všimli jsme si, že při pečlivé kontrole se selektiny vyznačovaly specifickým vzorem ve způsobu, jakým barvily bazální nebo luminální membrány v různých nefronsegmentech. Jinými slovy, využili jsme stereotypního vzoru barvení lektinem k identifikaci různých segmentů nefronů. Tímto způsobem bychom mohli snadno identifikovat 6 entit: proximální tubulus (PT), tenkou končetinu (TL) henleloopu (HL), tlustou vzestupnou končetinu (TAL) HL, distální stočený tubulus (DCT), spojovací tubulus (CNT), a CD. Přechod mezi PT a TL byl charakterizován náhlou ztrátou typického signálu PT kartáčkového lemu a zmenšením šířky lumenu, která v TL téměř prakticky chyběla (obrázek 1a). Naopak přechod mezi TL a TAL byl charakterizován významným zvětšením vnějšího tubulárního průměru a relativně konstantní šířkou lumenu (obrázek 1b). U všech nefronů byl přechod TAL na DCT systematicky nalézán na vaskulárním pólu glomerulu. Tento přechod byl charakterizován náhlým zvětšením zevního tubulárního průměru, které bylo způsobeno především signifikantním zvětšením průměru lumenu (obr. 1c). Přechod mezi DCT a CNT byl charakterizován aredukcí jak v tubulárním průměru, tak v lumenu (obrázek 1d). Nakonec bylo spojení mezi CNT a kortikálním CD charakterizováno náhlým zvýšením jak tubulárního průměru, tak lumenu (obrázek 1e). Kvantifikace těchto morfologických přechodů byla statisticky významná (obrázek 1f) a její vhodnost byla ověřena barvením se specifickými tubulárními markery (doplňkové obrázky S3–S5 a doplňkový film S3–S5).
Tvar a velikost PT se liší podle jejich hloubky
Barvení tlledvinařezy nám umožnily vysledovat souřadnice prostorového vývoje celých segmentů PT. Zajímavé je, že jsme zjistili, že jejich tvar byl extrémně proměnlivý a určený polohou jejich glomerulů v kortexu. Globálně jsme identifikovali 3 vzory. První odpovídal tomu nejpovrchnějšímunefrony(SNs) (obrázek 2a; doplňkový film S6), který zabíral nejvzdálenější část kůry (nejvíce vnějších 30 procent blízko ledvinové kapsle). Jejich svinuté části tvořily kompaktní struktury s pouze 6 až 7 závity kolem vlastního glomerulu, které zabíraly velmi malé a těsně zaplněné prostory. Konvoluce těchto SN skončila dlouhou a rovnou pars recta, která sestoupila do dřeně. Na opačném konci tohoto spektra jsme pozorovali druhý vzor nefronů umístěných v nejhlubší části kůry (40 procent větší vnitřní hloubka), vedle dřeně (juxtamedulární nefrony [JN]) (obrázek 2a; doplňkový obrázek S6 a doplňkový film S6). Jejich PT byly charakterizovány počáteční krátkou smyčkou, která systematicky sestupovala směrem k papile a poté se U otočila, aby stoupala směrem k ledvinovému pouzdru. Na rozdíl od SN byly proximální stočené tubuly JN charakterizovány jako malé spirály, které se vyvinuly kolem jejich vlastního glomerulu a zabíraly velké, volně sbalené domény v juxtamedulární kůře. Svinutá část PT JN měla 10 až 15 svinutí, které tvořily velké domény. Konečně třetí vzor zahrnoval nefrony umístěné ve střední části kůry (střední nefrony [MN]) (obrázek 2a; doplňkový film S6). Je zajímavé, že tyto tubuly měly tvar a prostorovou orientaci, která představovala přechod mezi SN a JN. Ve skutečnosti obsahovaly 8 až 9 závitů s cívkami, které byly větší než SN, ale menší než JN. Kromě toho měly MN delší pars recta než JN. Je zajímavé, že globální srovnání tvarů PTs ukázalo, že SN a MN měly homogenní vzor, zatímco JN byly extrémně heterogenní (doplňkový obrázek S6). Kromě toho došlo k prostorové rekonstrukci několikanefrony odhalili, že PT se nikdy neprolínají (SupplementaryMovie S6), což naznačuje, že každý nefron zaujímá svůj vlastní individuální prostor v kůře.
Morfometrické analýzy potvrdily velké rozdíly ve velikosti a tvaru SN a JN, s přechodným aspektem pro MN. PT JN byl více než 2-krát delší než PT SN (obrázek 2b); přímost však byla větší u SN než u JN (obrázek 2c), což je v souladu s pozorováním, že tubuly JN byly mnohem klikatější (obrázek 2a; doplňkový obrázek S6).
Obrázek 1|Morfologická kritéria používaná k identifikaci segmentů nefronů. (a–e) Morfologie různých segmentů myší s nefronovou kontrolou.Nefronybyly vysledovány od močového pólu glomerulu ke sběrnému kanálku (proximální tubulus [PT]: tyrkysový; tenký člen[TL] Henleovy kličky: světle šedý; tlustý vzestupný člen [TAL] Henleovy kličky: tmavě šedý; distální stočený kanálek [DCT]: růžový; spojovací kanálek [CNT]: žlutý; kortikální sběrný kanálek [CCD]: oranžový). Šipky označují průměr různých segmentů nefronů. (pokračování)
Obrázek 1|(Pokračování) (f) Kvantifikace vnějšího tubulárního průměru různých segmentů nefronů. Data jsou vyjádřena jako průměr±SEM. Analýza rozptylu následovaná Tukey-Kramerovým testem: **P < 0.01, ***P < 0,001.
Obrázek 2 |Trojrozměrný(3D) rekonstrukce proximálního tubulu odhaluje 3 různé tvary a organizace. (a) Reprezentativní 3Drekonstrukční snímky proximálních tubulů přes celou kůru ledvin, rozdělené do 3 úrovní (bílé čáry) podle tvaru proximálních tubulů (PTs): povrchní (modrá), střední (zelená) a juxtamedulární (červená) kůra, což odpovídá vnějším 30 procentům, středním 30 procentům a vnitřním 40 procentům kůry. Všimněte si různých tvarů těchto 3 typůnefronya zejména délku a tortuozitu juxtamedulárních tubulů. Tyč {{0}} mm. (b,c) Kvantifikace (b) délky a (c) přímosti 3 typů proximálních tubulů. (d) Kvantifikace objemu glomerulů z každé oblasti kůry. Data jsou vyjádřena jako průměr SEM. Analýza rozptylu následovaná Tukey-Kramerovým testem: juxtamedulární PT versus povrchová PT: ###P < 0.001;="" juxtamedulární="" pt="" versus="" střední="" pt:="" ***p="">< 0,001;="" povrchní="" pt="" versus="" střední="" pt:="" $$$p=""><>
Obrázek 3 |Trojrozměrný(3D) rekonstrukce nefronů odhaluje 3 různé typy nefronů. (a) Reprezentativní 3D snímky celého nefronu (levé panely) od glomerulů po sběrný kanálek v povrchové kůře (modrá), střední kůře (zelená) a juxtamedulární oblasti (červená) u kontrolních myší. Segmentace nefronů (pravé panely) pro 3 různé typy nefronů. Pruh=150 mm. (b) Kvantifikace vnitřní vzdálenosti mezi 2 rameny Henleovy kličky pro 3 typy nefronů. (c) Kvantifikace délky nefronu pro (pokračování)
Obrázek 3|(pokračování) 3 druhynefrony. (d) Kvantifikace délky různých segmentů nefronu podle typu nefronu. Data jsou vyjádřena jako průměr±SEM. Analýza rozptylu následovaná Tukey-Kramerovým testem: juxtamedulární nefron (JN) versus povrchový nefron (SN): ###P < 0.001;="" jn="" versus="" střední="" nefron="" (mn):="" *p="">< 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001.="" cnt,="" spojovací="" trubice;="" dct,="" distálně="" stočený="" tubulus;="" pt,="" proximální="" tubulus;="" tal,="" tlustý="" vzestupný="" člen="" henleovy="" kličky;="" tl,="" tenké="" rameno="" henleovy="">
Glomerulární velikost se mění s hloubkou
Poté jsme analyzovali hloubku a průměr glomerulů náhodně vybraných z každé ze 3 zón. Morfometrická analýza odhalila, že glomeruly byly umístěny v průměru 783 a 355 mm od ledvinového pouzdra u JN a SN. Jak bylo uvedeno dříve, pozorovali jsme, že velikost glomerulů se lišila podle jejich hloubky. Konkrétně glomerulární objem JN byl 3krát větší než objem SN a MN (obrázek 2d).
3D rekonstrukce nefronu
Poté jsme sledovali prostorový vývoj celkunefronyz PT na CNT. Globální pohled na jejich 3D (Trojrozměrný) rekonstrukce potvrdila, že tvar nefronu se mezi SN, MN a JN lišil (obrázek 3a; doplňkový film S7). Tento rozdíl byl způsoben především strukturou PT. Kromě toho jsme pozorovali, že HL má jinou 3D prostorovou organizaci. Konkrétně TL a TAL byly vzdálenější v JNs než v SN a MN (obrázek 3b). Morfometrické analýzy odhalily, že JN byly globálně 2-krát delší než SN (obrázek 3c). Zvýšená délka byla proporcionálně distribuována ve všech segmentech, kromě TAL a DCT, které měly tendenci mít podobnou absolutní délku u všech typů nefronů (obrázek 3d). To naznačuje, že prodlužování nefronu je překvapivě homogenně vzorovaný proces.
Obloukové cévy ovlivňují juxtamedulární konvoluci PT
Chcete-li získat komplexnější pohled naledvinastruktury, využili jsme barvení Griffonia simplicifoliaagglutinin, což nám umožnilo vysledovat obloukovité cévy a jejich větve do kortikálních radiálních cév (obrázek 4a; doplňkový film S8). Zajímavé je, že doprovodné 3D (Trojrozměrný) rekonstrukce nefronů a cév ukázala, že obloukovité cévy mají tendenci být v překvapivě paralelní prostorové organizaci s blízkými tubuly. Zejména jsme pozorovali, že cesta, kterou sledují specifické JN (omezené JN), má tendenci sledovat cestu blízkého plavidla (obrázek 4b; doplňkový film S9). Je pozoruhodné, že toto zkreslení (pozorované pouze v podmnožině JNnefrony) odpovídal za velkou heterogenitu tvarů PT (doplňkový obrázek S6). Morfometrické analýzy odhalily, že „omezené“ PT byly výrazně delší a klikatější (snížená přímost) než „neomezené“ (obrázek 4c a d). Stojí za zmínku, že svinuté části SN i MN byly umístěny nad obloukovitými cévami a nebyly omezeny.
Cistanche-chronické onemocnění ledvin
Tubuly mají tendenci ležet v rovinách
Zajímavé je, že kontrola 3D (Trojrozměrný) tvarynefronynaznačil, že mají tendenci ležet v rovinách (obrázek 5a; doplňkový filmS10). Pro kvantifikaci tohoto parametru a posouzení možného statistického vychýlení této konformace jsme měřili obecnou tendenci tubulů ohýbat se z roviny definované jejich smyčkami. Naše měření ukázala, že ve srovnání se simulovaným modelem náhodné chůze generovaným se stejnou sadou po sobě jdoucích naměřených úhlů a délky mezi po sobě jdoucími body (obrázek 5b), tubuly měly tendenci se vyvíjet s menší odchylkou od roviny (obrázek 5c). To naznačovalo, že trubice omezovaly jejich cestu podél roviny. Pozorované rozdíly byly vysoce statisticky významné (P <>
3D rekonstrukce nefronu odhaluje specifický vzorec pro vývoj cyst
Abychom zjistili, zda náš protokol umožňuje sledování nefronů v dezorganizovaných patologických tkáních, charakterizovali jsme tvary a prostorovou distribuci cyst u myší jack, což je široce používaný model NPHP a cystického onemocnění.31–33 3D snímky ukázaly, že navzdory vzhled prominentních cyst, obecný 3D (Trojrozměrný) průběh nefronů se významně nelišil od kontrolních myší (Suplementary Movie S11). Podobně morfometrické analýzy potvrdily, že globální délkanefronyglomerulární objem a délka každého segmentu nefronu byly srovnatelné s těmi u kontrolních myší (doplňkový obrázek S7). Je třeba poznamenat, že kvůli vývoji cyst jsme nebyli schopni odlišit TL od TAL v HL. U všech nefronů se vyvinuly fusiformní cysty (SupplementaryMovies S11 a S12). Jedním z nejpozoruhodnějších rysů bylo pozorování, že fusiformní cystické dilatace se vyskytovaly na několika místech podél stejného segmentu nefronu (doplňkové filmy S12 a S13). Je zajímavé, že jsme pozorovali, že cysty se nikdy nevyvinuly u PT a HL sestupných končetin (obrázek 6a; doplňkový film S12). Na rozdíl od toho byly detekovány převážně v HL ascendentních končetinách, DCT, CNT a v horní části CD v návaznosti na CNT (obrázek 6a; doplňkový film S12). Zejména jsme pozorovali, že DCT, stejně jako segmenty CNT, měly zvláštně zvýšenou pravděpodobnost vzniku cyst v jejich distálnějších částech (obrázek 6b). Kvantitativní morfometrické analýzy 3D rekonstrukčních snímků odhalily, že celkový objem cysty na nefron byl zvláště vysoký v CNT (obrázek 7a). Kromě toho jsme pozorovali, že zvětšení cyst v HL a DCT bylo větší u JN než u SNs a MN (obrázek 7a; doplňkový film S12). Navíc výskyt cyst byl u JN významně vyšší než u jiných typůnefrony(Obrázek 7b). Také jsme pozorovali, že průměrná glomerulární mezivzdálenost (vypočtená na nejbližších 5 glomerulech) měla tendenci být zvláště zvýšená u incystických myší, zejména v povrchnějším kortexu (doplňkový obrázek S8).
Obrázek 4|Cévy určují tvar nefronu. (A)Trojrozměrnýrekonstrukce architektury cév od obloukovitých cév po kortikální radiální cévy. Tyč ¼ 200 mm. (b) Reprezentativní obrazy "neomezených" (horní panel) a "omezených" (spodní panel) juxtamedulárních proximálních tubulů. Tyč ¼ 100 mm. (c, d) Kvantifikace (c) délky a (d) přímosti "neomezených" a "omezených" juxtamedulárních proximálních tubulů. Data jsou vyjádřena jako průměr±SEM. Mann-Whitney test: "omezený" versus "neomezený":*P < 0.05,="" ***p=""><>
3D (Trojrozměrný) rekonstrukce četných cyst odhalila, že byly extrémně variabilní ve tvaru a objemu (obrázek 6c; doplňkové filmy S11 a S13). V HL ascendentální končetině měly cysty vřetenovitý tvar s malým průměrem. V DCT měly cysty spíše kulovitý a větší tvar a byly rozptýleny mezi nedilatovanými tubuly. Je zajímavé, že přechod mezi DCT a CNT byl systematicky charakterizován normální nedilatovanou strukturou. Naproti tomu u CNT jsme systematicky pozorovali souvislou dilatovanou cystickou strukturu přímo v kontaktu s CD. Zajímavé je, že u CD se tato struktura postupně zmenšila na normální velikost tubulu. Více distálně nebyly v přilehlé oblasti CD detekovány žádné další cysty. Dalším konzistentním znakem byla zvláštní prostorová organizace cyst ve vzestupné končetině HL. Ve skutečnosti, ačkoli cysty byly hlubší a blíže kličce u SN, byly povrchnější a blíže k DCT u JN (obrázek 6c). Cysty opět zaujímaly střední polohu u MN (obrázek 6c).
Obrázek 5|Nefronové tubuly mají tendenci se vyvíjet jako plochá struktura. (a) Typická dráha proximálního tubulu nefronu. Tato dráha ilustruje její tendenci ležet v rovině. Rovinnost vývoje dráhy může být lépe vidět, když je správně otočena a zarovnána s úhlem pohledu pozorovatele (viz pravostranné znázornění stejného trubicového segmentu, který je na levé straně znázorněn pod jiným úhlem) . (b) Schematické znázornění trubkové dráhy složené ze 4 segmentů (mezi 5 body definujícími danou trubkovou dráhu zobrazenou jako příklad). Stupeň, do kterého dráhy mají tendenci vycházet „mimo svou rovinu“, může být znázorněn úhlem, který je zde označen jako „beta“. (pokračování)
Obrázek 5|(Pokračování) Tento úhel se měří mezi segmentem p3-p4 vzhledem k rovině (definované bezprostředně předcházejícími body p3, p2 a p1) a ve schématu je reprezentován tmavě šedým obdélníkem. Výpočet beta úhlů byl poté rekurzivně vypočítán společně se sadou bodů v trubkové dráze. Abychom vyhodnotili rozsah vychýlení těchto beta úhlů, simulovali jsme náhodnou chůzi (Monte Carlosimulation [MCs]) pomocí stejné sady po sobě jdoucích úhlů alfa každé trubicové dráhy (měřeno mezi všemi po sobě jdoucími segmenty). Tato náhodná chůze vygenerovala cestu s identickou sadou alfa úhlů a náhodných beta úhlů. (c) Houslové grafy globální distribuce úhlů beta a výsledek MCs v proximálním tubulu (PT), tenkém rameni (TL) Henleovy kličky, tlustém vzestupném rameni (TAL) Henleovy kličky, distálním stočeném tubulu (DCT) ) a spojovacího tubulu (CNT). MCs, P <>
DISKUSE
Tradiční histologické metody jsou omezené ve schopnosti odhalit patologické změny, které ovlivňují celkový tvarnefrony. Zde představujeme účinný přístup založený na čištění tkání, který má potenciál řešit zásadní otázkyledvinaarchitektura s nebývalými prostorovými detaily za normálních i patologických podmínek. Naše výsledky potvrdily existenci 3 typů nefronů, které se liší svou polohou, tvarem a velikostí v souladu s jejich funkčními specifičnostmi. Navíc jsme ukázali, že nefronstend leží v rovinách a přizpůsobuje se prostorové organizaci plavidla. Je zajímavé, že když jsme tuto techniku aplikovali na model cystického onemocnění ledvin, pozorovali jsme, že cysty se vyvíjejí ve všech nefronech, ale pouze ve specifických segmentech. Je zajímavé, že jsme ukázali, že tvar cysty se liší podle nefronsegmentu a že podél stejného nefronu se cysty vkládají do normálních nedilatovaných tubulů. Celkově tyto výsledky poskytují první 3D (Trojrozměrný) charakteristika prostorového uspořádánínefronya cév a je důležité, aby poskytovaly základ pro pochopení patologického procesu, jako je ascystogeneze.
Optické čištění ledvin je náročné kvůli vysokým úrovním autofluorescence a hustoty buněk. Porovnáním různých zúčtovacích protokolů jsme v BABB identifikovali výkonnou techniku pro implementaci vizualizace a rekonstrukce struktur umístěných v nejhlubší částiledvina, tedy dřeň. Navíc je BABB rychlý a škálovatelný a jakmile se vyčistí, vzorky mohou být uloženy měsíce před pořízením snímku. Další hlavní výhodou této techniky je její nízká cena. Čistidla mohou způsobit zmenšení nebo zvětšení struktur.9–17 Protože jsou však tyto změny velikosti ledvin izotropní, neočekává se, že by relativní měření byla ovlivněna nebo zkreslena jejich interpretace. Jedním z nejdůležitějších omezení je anotace struktur, která je velmi časově náročná. Nicméně stále roste počet technik založených na hlubokém učení, které by toto omezení měly rychle překonat.
V souladu s výsledky získanými klasickými technikami naše studie ukázala, že nefrony se liší svým tvarem a délkou podle své polohy. Zejména jsme pozorovali, že JN mají rozvinutější spletité PT a větší glomeruly a jsou 2krát delší než SN. Zvětšená délka je výsledkem harmonického procesu, protože prodlužování ovlivňuje proporcionálně všechny segmenty nefronů. Wealso pozoroval, že JN mají větší HL. Celkově tato data jasně ukazují, že mikroanatomie SN a JN je významně odlišná a že MN vykazují střední rysy. Je zajímavé, že to ukázaly fyziologické studienefronyjsou také funkčně odlišné.2 Morfogenetické jevy, které jsou základem těchto rozdílů, nejsou dosud známy. Je tedy lákavé spekulovat, že konkrétní struktura JNs může odpovídat za specifičnost jejich funkcí.
Zajímavé je, že poprvé poskytuje 3D (Trojrozměrný) rekonstrukcenefronya jejich okolních cév jsme objevili prostorové omezení mezi obloukovitými cévami a podskupinou nefronů. Je tedy možné si myslet, že cévy mohou určovat způsob, jakým se nefrony prodlužují během vývoje.34,35 Inspekce 3D tvarů nefronů v kombinaci s výpočetními simulacemi také odhalila, že nefrony se nikdy neprolínají a že každý nefron má tendenci ležet v rovině. Funkční význam tohoto pozorování zbývá objasnit.
Vývoj cysty během polycystickýchledvinanemoc je stále zajímavý proces. NPHP, patologický stav charakterizovaný rozvojem cyst, je nejběžnějším genetickým onemocněním způsobujícím konečné stádium renálního onemocnění u dětí a dospívajících. Dosud bylo identifikováno dvacet genů NPHP.36Mezi nimi kóduje NEK8 člena rodiny kináz spojených s nikdy inmitózou A, která hraje roli ve funkci řasinek a progresi buněčného cyklu.37 Nek8 byl původně charakterizován jako gen mutovaný u myší jck.32 Zejména se ukázalo, že amutace ve stejné proteinové doméně vede u lidí k NPHP9.38 2 Studie D naznačují, že vývoj cyst se u různých forem polycystického onemocnění ledvin dramaticky liší.27,29 Zejména u NPHP se zdá, že cysty jsou odvozeny výhradně z CD a DCT.31 I když jsou tyto imunohistochemické studie informativní, nemohou argumentovat proti možnosti, že ztráta specifických tubulárních markerů39 uměle odpovídá za toto pozorování. Tedy naše 3D (Trojrozměrný) studie poskytuje první jasný důkaz, že vývoj cyst je proces, který může zahrnovat pouze specifické nefronsegmenty. Je zajímavé, že ačkoli je NIMA (Never In mitosisgene A) – Related Kináza 8 (NEK8) exprimována v cytoplazmě všech segmentů nefronů, její exprese v řasinkách je omezena na DCT a CD. Protože pouze tyto segmenty jsou náchylné k rozvoji cyst,31 můžeme předpokládat, že narušení ciliární funkce NEK8 je klíčovou událostí pro tvorbu cyst. Je zajímavé, že jsme také pozorovali, že fusiformní cysty jsou v kontinuitě s normálními nedilatovanými tubuly. Skutečnost, že recesivní zárodečná mutace vede k patologickému fenotypu pouze v podskupině buněk, naznačuje, že druhá příhoda může vyvolat vývoj cyst v těchto buňkách, jak se předpokládá u autozomálně dominantních polycystických buněk.ledvinanemoc.40,41
Obrázek 6 |Trojrozměrný(3D) rekonstrukce nefronu odhaluje, že cysty se vyvíjejí pouze ve specifických segmentech nefronu. (a) Reprezentativní 3D snímky s vykreslením objemu cysty celého nefronu (levé panely) od glomerulů po sběrný kanálek v povrchové kůře (modrá), střední kůře (zelená) a juxtamedulární oblasti (červená) u myší jack. Nefronová segmentace (pravé panely) pro 3 různé typynefrony. Pruh=150 mm. (b) Pravděpodobnost vzniku cyst v různých segmentech nefronů u myší jack. (pokračování)
Obrázek 6|(Pokračování) Horizontální osa je normalizovaná délka nefronů odpovídající 50 binům (proximální tubulus [PT], tyrkysový; Henleloop [HL], bílý; distální stočený tubulus [DCT], růžový; spojovací tubulus [CNT], žlutý). (c) Reprezentativní snímky rekonstrukce 3D cyst s vykreslením objemu cysty vzestupné končetiny HL (levé panely), DCT (střední panely) a CNT a kortikálních sběrných kanálků (CCD) (pravé panely) v povrchové (horní panely), střední (střední) panely) a juxtamedulární (spodní panely) nefrony u jack myší. Pruh= 50 mm.
Obrázek 7|Charakterizace distribuce a objemu cysty v celém nefronu. (a) Kvantifikace celkového objemu cysty (součet cyst na nefron) pro každý segment nefronu (Henleova smyčka [HL], bílá; distální stočený tubulus [DCT], růžový; spojovací tubulus [CNT], žlutý) a (b) délka tubulu obsazeného cystami pro každý typ nefronu (povrchní: modrý; střední: zelený; juxtamedulární: červený) u jackmiček. Data jsou vyjádřena jako průměr±SEM. Analýza rozptylu následovaná Tukey-Kramerovým testem: juxtamedulární nefron [JN] versus povrchový nefron [SN]: #P < 0.05;="" jn="" versus="" střední="" nefron="" [mn]:="" *p="">< 0,05,="" **p=""><>
Také jsme pozorovali, že zvětšení cyst je více převládající u JN než u SN, alespoň s ohledem na cysty, které se nacházejí mezi PT a CNT. Důsledně bylo hlášeno, že v souvislosti s glomerulosklerózou se glomerulární léze nacházejí častěji u JN než u inSN.1,21,42 Zda přepracování v důsledku zvýšené rychlosti glomerulární filtrace jednoho nefronu a transportních/enzymatických aktivit odpovídá za zvýšenou náchylnost JN zhoršovat se je zajímavá hypotéza, která si zaslouží další zkoumání.
V souhrnu popisujeme novou techniku k obrazuledvinyve 3D (Trojrozměrný) s dostatečnou molekulární specifitou a rozlišením pro přímý záznam prostorové a kvantitativní distribuce specificky označených vnitřních struktur (nefronycévy a cysty). Vzhledem k pohodlí, rychlosti a schopnosti přímé kvantifikace očekáváme, že se tato technika stane mocným nástrojem pro pochopení patofyziologie ledvin.
METODY
Zvířata
Všechny postupy na zvířatech byly schváleny „Službami veterinární policie de Paris“ a etickou komisí Université Paris Descartes. Dvouměsíční FVB/N myši (n=20) byly použity k nastavení experimentálních podmínek proledvinaStudie byla poté provedena na 2-týdenních samcích jack myší (n=4) a kontrolních sourozencích (n=3).
Příprava ledvinových tkání
Před usmrcením byly myši perfundovány intrakardiální katetrizací 25 ml heparinizovaného fyziologického roztoku (1000 IU/l) a následně 75 ml 4% paraformaldehydu ve fosfátem pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS). Experimenty byly prováděny pod xylazinem (Rompun 2 procenta, Bayer, Leverkusen, Německo, 6 mg/g tělesné hmotnosti) a ketaminem (Clorketam 1000, Vetoquinol SA, Lure, Francie, 120 mg/g tělesné hmotnosti) anestezií.
Pro clearingové studie,ledvinybyly fixovány ve 4% paraformaldehydu po dobu 4 hodin a zalité do 4% agarózy a 1{4}}mm silné řezy obklopující renální hilum byly nařezány a skladovány v PBS při 4stupeň. Řezy ledvin byly nejprve obarveny a poté vyčištěny.
Pro imunohistochemické studie na tenkých řezech byly ledviny přes noc fixovány ve 4% paraformaldehydu a byly řezány 4-mm řezy zalité v parafínu.
Barvení
Kyselina jodistá – Schiffovo barvení. 1.{1}mmledvinařezy byly inkubovány v čisté nebo 1:100 PBS zředěné kyselině jodisté-Schiff po dobu 5 minut při pokojové teplotě před vyčištěním.
Imunohistochemie na tenkých parafínových řezech. Čtyřmikrometrické řezy ledvin zalitých v parafínu byly zahřáté pro získání antigenu a inkubovány přes noc při 44 stupněs lektiny spojenými s flfluorochromem ke sledování tubulů (rhodamin aglutinin z arašídů [RL-1072-5] a rhodamin aglutinin z pšeničných klíčků [RL-1022-5], Vector Laboratories, Burlingame, CA, zředěný v poměru 1:200) a segment- specifická primární protilátka k zobrazení odlišných tubulárních segmentů (biotinylovaný lektin Lotus tetragonolobus [B-1325], Vector Laboratories, naředěný v poměru 1:100; myší anti-Calbindin D28K[D-4], Santa Cruz, Heidelberg, Německo, zředěno 1:200; kozí anti-AQP2 [C-17], Santa Cruz, zředěno 1:200). Následující den byly řezy inkubovány se sekundární protilátkou po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě (konjugát Alexa Fluor 488 [S32354], Invitrogen; anti-kozí Alexa Fluor 488 [A-11055], Invitrogen; anti-myší AlexaFluor 488 [A-21202], Invitrogen, Carlsbad, CA; vše zředěné v poměru 1:500) před obarvením 40,6-diamidino-2-fenylindolem. Všechny snímky byly pořízeny mikroskopem Nikon Eclipse E800 (Champignysur Marne, Francie) a připraveny pomocí softwaru Fiji (verze 1.50). Barvení lektinem na silných řezech. Tloušťka 1{37}}mmledvinasekce byly inkubovány ve 44 stupněpo dobu 1 měsíce v lektinech vázaných na Texas Red nebo flfluorescein isothiokyanate: aglutinin z arašídů (RL-1072-5) a aglutinin z pšeničných klíčků (RL-1022-5), zředěné v poměru 1:100 v 0,1 procenta PBS azidu a 0,1 procenta Triton-X. Řezy byly poté každý den promývány po dobu 2 týdnů PBS před čištěním.
Cistanche-funkce ledvin
Optické čištění
Pro vymazání měřítka 1.{1}mmledvinařezy byly inkubovány ve ScaleA2 (4M močovina, 0,1 procenta Triton X-100, 10 procento glycerolu) nebo ScaleB4 (8 Murea, 0,1 procenta Triton X-100 ) na 2 týdny, až 1 rok, ve 4stupeň.
Pro vyčištění BABB byly 1,{1}}mm řezy ledvin dehydratovány postupným propláchnutím ethanolem při pokojové teplotě. Vzorky byly poté inkubovány v BABB (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO) v poměru 1:2 po dobu alespoň 2 dnů při 4 stupních.
Získávání obrazu pomocí dvoufotonové mikroskopie
Tkáně byly zobrazeny vodným gelem na inverzním multifotonmikroskopu (LaVision BioTec) vybaveném Mai Tai HP Titanium-Sapphire Laser (Spectra-Physics, Santa Clara, CA) (doplňkový obrázek S1A). Vlnová délka excitace byla 815 nm při 8 procentech výkonu. Použili jsme 20XVodní imerzní objektiv (XLUMPLFL20XW,Olympus [Tokio, Japonsko]; numerická apertura, 0,95; pracovní vzdálenost, 2,0 mm). Pro akvizici fluorescence jsme použili neskenovaný detektor na 80 procent s pásmovým filtrem 593/40 nm.
První krok sestával z akvizice 2D mozaikového obrazu ve středním zásobníku z pomocí suboptimálních parametrů akvizice (400 mm x 400 mm a 1011 x 1011 pixelů, s 10procentním překrytím a průměrem čáry na 2), aby se vedl výběr nejdůležitějších centrálních polí (doplňkový obrázek S9A ). Jakmile byla definována zájmová pole XY mřížky a z, byly parametry upraveny pro získání vysoce kvalitních snímků. Takový přístup redukoval oblast zájmu na 5X12 polí na zásobník z. Poté jsme získali 850z svazků/optických řezů (velikost kroku 1- mm) obklopujících ledvinový hilum ve střední částiledvinasekce.
Sešívání, zpracování a sledování obrázků Každý stoh byl uspořádán podle metody vyvinuté Preibischetem al.,43 která umožňuje sešívat velkou sbírku obrázků pomocí pluginu "Grid/Collection stitching" softwaru Fidži (HTTP://Fiji. sc/Fiji). Protože jsme pozorovali důležitý posun mezi 2 sousedními obrázky po sešití, napsali jsme vlastní program pro párování v Pythonu. Tento program kompenzuje posun obrazu, což nám umožňuje správně zarovnat obrazy (doplňkový obrázek S9B). Snímky opravené sešitím byly analyzovány pomocí Imaris verze 8.4.2 (Bitplane, Zurich, Švýcarsko). Tubuly a cévy sledovaly ruční režim balíčku filament tracer Imaris a spojily se s Imaris Xtension, který jsme vyvinuli s MATLABem (https://www.dropbox.com/s/sm9u5em3orjrpmc/Standalone{11}}Připojit se_ Filament_Tool.zip?dl=0) (doplňkový obrázek S9C). Glomeruliand cysty byly 3D rekonstruovány pomocí manuálního režimu povrchového balíčku Imaris. 3D (Trojrozměrný) prostorová organizace glomerulů byla zobrazena pomocí manuálního režimu balíčku spotů Imaris.
Morfometrie
Délka tubulárního segmentu, délka nefronu a přímost byly stanoveny pomocí sady indikátorů filamentů od Imaris. Podle softwaru Imaris byla přímost kvantifikována jako poměr mezi vzdáleností mezi 2 body a délkou dráhy segmentu nefronu. Třicet jedna PT a 12 celýchnefronybyly rekonstruovány a měřeny u 3 myší divokého typu, zatímco 37 PT a 17 celých nefronů bylo rekonstruováno a měřeno u 4 myší jack. Cyst a glomerulární objemy byly stanoveny pomocí "povrchového balíčku" od Imaris. 31 a 34 glomerulů bylo naměřeno u myší divokého typu a myší jacka. Celkem bylo naměřeno 74 cyst.
Úhly "mimo rovinu" trubicových závitů (označené jako "beta") byly měřeny mezi rovinou (definovanou 3 po sobě jdoucími body) a směrem s dalším po sobě jdoucím čtvrtým bodem v prostoru (obrázek 5b). Pro vyhodnocení statistické významnosti pozorovaného zkreslení jsme simulovali distribuci beta úhlů s náhodnou rotací beta úhlů (simulace Monte Carlo) ve strukturách, které byly složeny ze stejných segmentů se stejnou sadou alfa úhlů.
Pro výpočet pravděpodobnosti vzniku cystické léze spolu se segmenty nefronů jsme každý nefron reprezentovali sadou bodů v prostoru. Každý bod byl označen s ohledem na přítomnost cysty versus normální struktura a typ segmentu. Pravděpodobnost pro každou standardizovanou délku (nastavenou na 50 přihrádek) byla vypočtena jako poměr mezi počtem bodů s cystickou anotací a celkovým počtem bodů v přihrádce.
Pro výpočet průměrné glomerulární mezivzdálenosti jsme u každého glomerulu uvažovali průměrnou glomerulární interdistancii vypočítanou na nejbližších 5 glomerulech.
Analýzy dat a statistiky
Data jsou vyjádřena jako průměr ± SEM. Rozdíly mezi experimentálními skupinami byly vyhodnoceny pomocí analýzy rozptylu následované, pokud je signifikantní (P < {{0}}.05),="" tukey-kramerovým="" testem.="" když="" byly="" porovnány="" pouze="" 2="" skupiny,="" byl="" použit="" mann-whitney="" test.="" statistické="" analýzy="" byly="" provedeny="" pomocí="" softwaru="" graph="" prism="" (sandiego,="" ca,="" verze="">
ZVEŘEJNĚNÍ
Všichni autoři deklarovali žádné konkurenční zájmy.
PODĚKOVÁNÍ
Děkujeme Laboratoire Experimentation Animale et Transgenese (LEAT), Histology and Imaging Platforms of Structure Federative deRecherche Necker za technickou pomoc. Děkujeme Pierru Isnardovi, Marie-Claire Gublerové a Nicolasi Kuperwasserovi za kritické přečtení rukopisu. Tato práce byla podpořena Institut National de laSanté et de la Recherche Médicale, Université Paris Descartes, Assistance Publique – Hôpitaux de Paris, Agence Nationale de laRecherche, Whoami Laboratoire d'Excellence Who am I, RochePharma Research and Early Development (Basilej, Švýcarsko) a Institut Roche de Recherche et de Médecine Translationnelle (Paříž, Francie).
AUTORSKÉ PŘÍSPĚVKY
TB, NG a MZ navrhly a provedly experimenty a analyzovaly data. FB, LT, MGT a SG také provedly několik experimentů a analyzovaly data. MB a CN provedly myší experimenty. Na napsání rukopisu se také podílely TB a MZ. GF rukopis revidovala. FT a MP poskytli koncepční rámec a navrhli studii, dohlíželi na projekt a napsali práci.
Cistanche-Trojrozměrná architektura ledviny nefronů
DOPLŇKOVÝ MATERIÁL
Doplňkový soubor (PDF)
Obrázek S1. Experimentální nastavení, postup získávání a zpracování obrazu.
Obrázek S2. Limity autofluorescenčního signálu v XY az rozlišení.
Obrázek S3. Dvourozměrný obraz přechodu mezi PT a TL na 4-mm zalitém parafínuledvinasekce.
Obrázek S4. Dvourozměrný obraz přechodu mezi TAL a DCT na 4-mm řezech ledvin zalitých v parafínu.
Obrázek S5. Dvourozměrný obraz přechodu mezi DCT a CNT na 4-mm řezech ledvin zalitých v parafínu.
Obrázek S6. Trojrozměrná rekonstrukce odhaluje 3 různé tvary proximálních tubulů.
Obrázek S7.Trojrozměrnýrekonstrukce ukazuje, že délka a segmentacenefronynejsou ovlivněny cystami.
Obrázek S8. Hustota glomerulů v kontrole a cystickáledviny.
Obrázek S9. Postup získávání a následné zpracování obrazu. Tabulka S1. Porovnání metod čištění. Doplňkový soubor (filmy)
Film S1. Barvení lektinem výrazně zlepšuje rozlišení a poměr signálu k pozadí.
Film S2. Trasování dráhy tubulu.
Film S3. Trojrozměrná rekonstrukce vyčištěné ledviny ukazující spojení mezi proximálním tubulem a tenkým limbem Henleovy kličky.
Film S4. Trojrozměrná rekonstrukce vyčištěné ledviny ukazující spojení mezi tlustou vzestupnou končetinou Henleloop a distálním stočeným tubulem.
Film S5.Trojrozměrnýrekonstrukce vyklizenéholedvinazobrazující spojení mezi distálním stočeným tubulem a spojovacím tubulem.
Film S6. Tvar a velikost proximálních tubulů se liší podle jejich hloubky.
Film S7. Trojrozměrná rekonstrukce nefronu u kontrolních myší.
Film S8. Sledování cesty cévy z obloukovité cévy do akortikální radiační cévy.
Film S9. Obloukové cévy modelují tvar juxtamedulárních proximálních tubulů.
Film S10.Nefronymají tendenci ležet v letadle.
Film S11. Trojrozměrná rekonstrukce nefronu ukazuje specifický vzorec pro vývoj cyst.
Film S12.Trojrozměrnýsegmentace nefronů ukazuje, že cysty se vyvíjejí ve specifických segmentech nefronů.
Film S13. Prostorové uspořádání a vzájemná provázanostnefronya cévy v polycysticeledvina.
REFERENCE
1. Bohatá AR. Dosud nepopsaná zranitelnost juxtamedulárních glomerulů při lipoidní nefróze. Bull Johns Hopkins Hosp. 1957;100:173–186.
2. Bankir L, Bouby N, Trinh-Trang-Tan MM. Heterogenita nefronanatomie. Kidney Int Suppl. 1987;20:S25–S39.
3. Christensen EI, Grann B, Kristoffersen IB, et al.Trojrozměrnýrekonstrukce krysího nefronu. Am J Physiol Physiol. 2014;306:F664–F671.
4. Zhai XY, Birn H, Jensen KB a kol. Digitální trojrozměrná rekonstrukce a ultrastruktura proximálního tubulu myši. J Am Soc Nephrol.2003;14:611–619.
5. Zhai XY, Thomsen JS, Birn H, a kol. Trojrozměrná rekonstrukce myšího nefronu. J Am Soc Nephrol. 2006;17:77–88.
6. Puelles VG, Moeller MJ, Bertram JF. Nyní vidíme jasně: optické čištění aledvinamorfometrie. Curr Opin Nephrol Hypertens.2017;26:179–186.
7. Seo J, Choe M, Kim SY. Techniky čištění a značení biologických tkání ve velkém měřítku. Mol Cells. 2016;39:439–446.
8. Spalteholz W. Über das Durchsichtigmachen von menschlichen undtierischen Präparaten und seine theoretischen Bedingungen, nebst Anhang:Über Knochenfärbung. Lipsko, Německo: S. Hierzel; 1914.
9. Hama H, Kurokawa H, Kawano H, et al. Měřítko: chemický přístup pro fluorescenční zobrazování a rekonstrukci průhledného myšího mozku. Nat Neurosci. 2011;14:1481–1488.
10. Ertürk A, Becker K, Jährling N, et al.Trojrozměrnýzobrazování orgánů očištěných rozpouštědlem pomocí 3DISCO. Nat Protoc. 2012;7:1983–1995.
11. Kuwajima T, Sitko AA, Bhansali P, et al. ClearT: čistící metoda bez detergentů a rozpouštědel pro neuronální a neneuronální tkáň. Vývoj. 2013;140:1364–1368.
12. Ke MT, Imai T. Optické čištění fixovaných vzorků mozku pomocí SeeDB. CurrProtoc Neurosci. 2014;66:2.22.1–2.22.19.
13. Chung K, Deisseroth K. CLARITY pro mapování nervového systému. NatMethods. 2013;10:508–513.
14. Tomer R, Ye L, Hsueh B, Deisseroth K. Advanced CLARITY pro rychlé zobrazování intaktních tkání s vysokým rozlišením. Nat Protoc. 2014;9:1682–1697.
15. Yang B, Treweek JB, Kulkarni RP, et al. Jednobuněčná fenotypizace v průhledné intaktní tkáni prostřednictvím celotělového pročištění. Buňka. 2014;158:945–958.
16. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, a kol. Zobrazování celého mozku s jednobuněčným rozlišením pomocí chemických koktejlů a výpočetní analýzy. Cell.2014;157:726–739.
17. Alanentalo T, Asayesh A, Morrison H, et al. Tomografické molekulární zobrazování a 3D kvantifikace v orgánech dospělých myší. Nat Methods.2007;4:31–33.
18. Parra SG, Chia TH, Zinter JP a kol. Multifotonová mikroskopie vyčištěných myších orgánů. J Biomed Opt. 2010;15:036017.
19. Renier N, Wu Z, Simon DJ a kol. iDISCO: jednoduchá, rychlá metoda k imunoznačení velkých vzorků tkáně pro objemové zobrazování. Buňka. 2014;159:896–910.
20. Lee H, Park JH, Seo I, a kol. Vylepšená aplikace technologie čištění elektroforetické tkáně, CLARITY, na neporušené pevné orgány včetně mozku, slinivky břišní, jater,ledvina, plíce a střevo. BMC Dev Biol. 2014;14:1–7.
21. Iversen BM, Amann K, Kvam FI, et al. Zvýšený glomerulární kapilární tlak a velikost zprostředkovávají glomerulosklerózu v juxtamedulární kůře SHR. Am J Physiol Physiol. 1998;274:F365–F373.
22. Angelotti ML, Antonelli G, Conte C, Romagnani P. Zobrazení ledvin: od světla k mikroskopii s vysokým rozlišením. Transplantace Nephrol Dial. 2021;36:19–28.
23. Puelles VG, van der Wolde JW, Schulze KE, et al. Validace trojrozměrné metody pro počítání a stanovení velikosti podocytů v celých glomerulech. J Am Soc Nephrol. 2016;27:3093–3104.
24. Pannabecker TL, Dantzler WH, Layton HE, Layton AT. Roletrojrozměrnýarchitektura v moči koncentrační mechanismus therat ledvinové vnitřní dřeně. Am J Physiol Physiol. 2008;295:F1271–F1285.
25. Saritas T, Puelles VG, Su XT a kol. Optické čištění v ledvině odhaluje přestavbu tubulů zprostředkovanou draslíkem. Cell Rep. 2018;25:2668–2675.e3.
26. Schuh CD, Polesel M, Platonova E, et al. Kombinované strukturální a funkční zobrazení ledvin odhaluje velké axiální rozdíly v endocytóze proximálního tubulu. J Am Soc Nephrol. 2018;29:2696–2712.
27. Braun DA, Hildebrandt F. Ciliopatie. Cold Spring Harb Perspect Biol.2017;9:a028191.
28. Bergmann C, Guay-Woodford LM, Harris PC a kol. Polycystickéledvinachoroba. Nat Rev Dis Prim. 2018;4:50.
29. Wilson PD. Polycystické onemocnění ledvin. N Engl J Med. 2004;350:151–164.
30. Laitinen L, Virtanen I, Saxén L. Změny ve vzorci glykosylace během embryonálního vývoje myší ledvin, jak byly odhaleny s lektinovými konjugáty. J Histochem Cytochem. 1987;35:55–65.
31. Smith LA, Bukanov NO, Husson H, et al. Vývoj polycystickoidní choroby u juvenilních myší s cystickou ledvinou: pohledy na patogenezi, ciliární abnormality a společné rysy s lidským onemocněním. J AmSoc Nephrol. 2006;17:2821–2831.
32. Liu S, Lu W, Obara T, a kol. Defekt v nové kináze z rodiny Nek způsobuje cystické onemocnění ledvin u myší a u zebřiček. Vývoj.2002;129:5839–5846.
33. Franke M, Baeßler B, Bechtel J, et al. Magnetické rezonanční T2 mapování a difúzně vážené zobrazování pro časnou detekci cystogeneze a odezvy na terapii na myším modelu polycystického onemocnění ledvin.ledvinyInt. 2017;92:1544–1554.
34. Barry DM, McMillan EA, Kunar B a kol. Molekulární determinanty vaskulární specializace nefronu vledvina. Nat Commun. 2019;10:5705.
35. Perretta-Tejedor N, Jafree DJ, Long DA. Endoteliálně-epiteliální komunikace u polycystickýchledvinaonemocnění: role signalizace vaskulárního endoteliálního růstového faktoru. Cell Signál. 2020;72:109624.
36. Srivastava S, Molinari E, Raman S, Sayer JA. Mnoho genů-jedna onemocnění?Genetika nefronofthisis (NPHP) a NPHP-souvisejících poruch.Front Pediatr. 2017;5:287.
37. Fry AM, O'Regan L, Sabir SR, Bayliss R. Regulace buněčného cyklu proteinkinázou rodiny NEK. J Cell Sci. 2012;125:4423–4433.
38. Otto EA, Trapp ML, Schultheiss UT, et al. Mutace NEK8 ovlivňují ciliární a centrosomální lokalizaci a mohou způsobit nefronoftízu. J Am SocNephrol. 2008;19:587–592.
39. Wilson PD. Apiko-bazální polarita v epitelu polycystického onemocnění ledvin.Biochim Biophys Acta. 2011;1812:1239–1248.
40. Happé H, Leonhard WN, van der Wal A, et al. Toxické tubulární poškození ledvin u myší s delecí Pkd1-urychluje cystogenezi doprovázenou dysregulovanou polaritou planárních buněk a kanonickými signálními cestami Wnt. Hum Mol Genet. 2009;18:2532–2542.
41. Piontek K, Menezes LF, Garcia-Gonzalez MA, et al. Kritický vývojový přepínač definuje kinetiku tvorby ledvinových cyst po ztrátě Pkd1. Nat Med. 2007;13:1490–1495.
42. Ikoma M, Yoshioka T, Ichikawa I, Fogo A. Mechanismus jedinečné citlivosti hlubokých kortikálních glomerulů zráníledvinyk těžké fokální glomerulární skleróze. Pediatr Res. 1990;28:270–276.
43. Preibisch S, Saalfeld S, Tomančák P. Globálně optimální šití dlaždicových 3D (Trojrozměrný) pořizování mikroskopických snímků. Bioinformatika. 2009;25:1463–1465.
