Prediktivní význam exprese proteinu 8 souvisejícího s myeloidem v ledvinách u pacientů s obezitou nebo onemocněním ledvin souvisejícím s diabetem 2.

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Takashige Kuwabara¹, Kiyoshi Mori1,^2*, Masato Kasahara^1,3, Hideki Yokoi¹, Hirotaka Imamaki¹,Akira Ishii¹, Kenichi Koga¹, Akira Sugawara⁴, Shinji Yasuno³, Kendži Uešima³, Takashi Morikawa⁵,Yoshio Konishi⁵, Masahito Imanishi⁵, Akira Nishiyama⁶, Kazuwa Nakao^1,2, Masashi Mukoyama¹

¹Katedra medicíny a klinické vědy, Kjótská univerzita Graduate School of Medicine, Kyoto, Japonsko,

²Medical Innovation Center, Kjótská univerzita pro postgraduální studium medicíny, Kyoto, Japonsko,

³Oddělení výzkumu EBM, Institut pro rozvoj klinické a translační vědy, Kjótská univerzitní nemocnice, Kyoto, Japonsko,

⁴Oddělení nefrologie, Nemocnice Červeného kříže v Osace, Osaka, Japonsko,

5 Division of Nefrology and Hypertension, Osaka City General Hospital, Osaka, Japan,

6 Ústav farmakologie, Kagawa University Medical School, Kagawa, Japonsko

Abstraktní

Pozadí a cíl: Uvedli jsme, že toll-like receptor 4 (TLR4) a jeden z jeho endogenních ligandů, myeloid-příbuzný protein 8 (MRP8 nebo S100A8), hrají důležitou roli v progresi diabetické nefropatie u myší. Cílem této studie bylo zhodnotit významnostledvinaExprese MRP8 u pacientů sobezita- nebo související s diabetem 2onemocnění ledvin. Metody: U diabetických, obézních nebo kontrolních subjektů byly hladiny exprese MRP8 mRNA a proteinu ve vzorcích renální biopsie stanoveny pomocí RT-PCR v reálném čase a imunohistochemie (n=28, resp. 65) a jejich asociace s výchozí hodnotou a byly analyzovány prognostické parametry. Účinky MRP8 na expresi prozánětlivých genů byly zkoumány pomocí makrofágů. Výsledek:ledvinyHladiny exprese genu a proteinu MRP8 byly zvýšené u obézních nebo diabetických skupin ve srovnání s kontrolní skupinou. U všech subjektů podle jednorozměrné lineární regresní analýzy korelovaly glomerulární MRP8-pozitivní počet buněk a tubulointersticiální MRP8-pozitivní oblast na počátku, v tomto pořadí, nejen s různými známými rizikovými faktory pro diabetickou nefropatii (jako je např. jako systolický krevní tlak, proteinurie a sérový kreatinin), ale také s rozsahem glomerulosklerózy a tubulointersticiální fibrózy. Nezávislé faktory predikující hladiny bílkovin v moči o rok později byly zkoumány multivariační analýzou a zahrnovaly glomerulární MRP8-pozitivní počet buněk (b=0.59, P,0.001), proteinurii (b=0,37, P=0,002) a systolický krevní tlak (b=0,21, P=0,04) na výchozí hodnotě, po úpravě o známé riziko faktory. Exprese proteinu MRP8 byla pozorována v CD68-pozitivních makrofázích a atrofických tubulech. V kultivovaných myších makrofázích proteinem MRP8 indukované exprese prozánětlivých cytokinů také spouštěly autoindukci MRP8 v závislosti na TLR4-.

Závěry: Glomerulární exprese MRP8 se zdá být spojena s progresí proteinurie u obézních pacientů nebo pacientů s diabetem typu 2, pravděpodobně indukcí zánětlivých změn v makrofázích prostřednictvím signalizace TLR4.

Účinky cistanche: léčba onemocnění ledvin

Úvod

Chronický zánět hraje důležitou roli v patogenezi diabetu respobezitaa její kardiovaskulární komplikace [1]. Předpokládá se účast vrozených imunitních receptorů a endogenních ligandů v procesu chronického zánětu. Myeloid-related protein 8 (MRP8, také známý jako S100A8 nebo calgranulin A) byl původně identifikován jako cytoplazmatický protein vázající vápník v neutrofilech a monocytech [2] a stal se široce uznáván jako silný endogenní ligand pro Toll-like receptor 4 (TLR4). ) u různých onemocnění včetně septického šoku, vaskulárních a autoimunitních poruch [3,4,5]. Nedávno jsme navrhli, že signalizace MRP8/TLR4 hraje důležitou roli v hyperlipidémií indukované progresi diabetické nefropatie [6]. Glomerulární makrofágy a buňky sběrných kanálků jsou hlavními zdroji MRP8 v myších modelech diabetické nefropatie[6] a renální fibrózy [7]. Plazmatické hladiny MRP8, který obvykle tvoří heterodimerní komplex s vazebným partnerem MRP14 v krevním řečišti, jsou u obézních subjektů zvýšené [8,9]. Nebyly však žádné zprávy zkoumající renální expresi MRP8 u pacientů s obezitou resptyp2 cukrovkaa jeho souvislost s renální prognózou.

Cílem této studie bylo stanovit hladiny exprese mRNA a proteinu MRP8 vledvinajaponských pacientů s diabetickou nefropatií (DN),obezita-související glomerulopatie (ORG), nefrotický syndrom s minimálními změnami (MCNS) nebo malá glomerulární abnormalita (MGA), které byly všechny diagnostikovány renální biopsií, a zhodnotit, zda exprese MRP8 v ledvinách může předpovídat renální výsledky.

Cistanche může zlepšit funkci ledvin

Materiály a metody

Etické prohlášení

Studie na lidech byla provedena v souladu se zásadami vyjádřenými v Helsinské deklaraci a byla schválena etickými výbory pro výzkum člověka na Kjótské univerzitě, postgraduální lékařské fakultě a Ósaka City General Hospital, v tomto pořadí. Všichni účastníci dali písemný informovaný souhlas. Protokol studie na zvířatech byl schválen Výborem pro výzkum zvířat Kjótské univerzity Graduate School of Medicine (číslo povolení: Med Kyo 13318). Všechny operace na zvířatech byly prováděny v narkóze pentobarbitalem sodným a bylo vynaloženo veškeré úsilí k minimalizaci utrpení.

Studijní předměty

Proteinuričtí pacienti sobezitanebo diabetes typu 2, kteří podstoupili renální biopsii, byli zařazeni do této studie. Pacienti s infekčním onemocněním, rakovinou, onemocněním jater nebo kolagenovým onemocněním byli vyloučeni. Proteinurie byla definována jako protein v moči vyšší než 0,5 g/g kreatininu nebo albumin v moči vyšší než 300 mg/g kreatininu v alespoň dvou po sobě jdoucích měřeních.Obezitabyl definován jako index tělesné hmotnosti (BMI) vyšší než 25.{1}} (kg/m²). Diabetes typu 2 byl diagnostikován v souladu s kritérii Světové zdravotnické organizace. Biochemická měření při přijetí k renální biopsii byla použita jako základní charakteristiky pro průřezovou analýzu. Odhadovaná rychlost glomerulární filtrace (eGFR) byla vypočtena pomocí zjednodušené predikční rovnice navržené Japonskou nefrologickou společností: eGFR (ml/min/1,73 m²)=1946 [věk (roky)]20.287 6 [sérový kreatinin (mg perdl)]21.094 60.739 (pro ženy), což je ověřená místní modifikace MDRD [ 10]. Sérové ​​koncentrace kreatininu byly měřeny pomocí enzymatické metody.

Pro imunohistochemii bylo analyzováno 65 japonských pacientů, kteří v letech 2000 až 2011 podstoupili renální biopsii na katedře medicíny a klinické vědy, Kyoto University Hospital. Biopticky ověřené diagnózy všech pacientů v tomto období jsou uvedeny v tabulce S1 v souboru S1. Subjekty zkoumané v této práci zahrnovaly DN (n=19), ORG (n=10) a neobézní, nediabetické kontrolní subjekty, které byly diagnostikovány jako MGA(n=19) nebo MCNS (n=17). Některé případy v těchto kategoriích byly vyloučeny, protože dostupné zbytkové vzorky obsahovaly méně než 10 glomerulů. Definice DN se skládala z (1) více než 5 let trvání po začátku diabetu, (2) existence mikro- nebo makroalbuminurie, (3) kompatibilních histopatologických změn s DN, jako je ztluštění bazální membrány glomerulů, mezangiální expanze, nodulární skleróza (Kimmelstiel-Wilsonovy uzly) a/nebo arteriolární hyalinóza a (4) vyloučení jiných příčin renálních poruch [11]. ORG byl definován morfologicky jako fokální segmentální glomeruloskleróza a/nebo glomerulomegalie u subjektů s oběmaobezitaa proteinurie, jejichž definice byly popsány výše [12,13].

Pro analýzu exprese mRNA byly vyloučeny vzorky nízké kvality, ve kterých byly hladiny 18S ribozomální RNA (rRNA) nižší než limit citlivosti detekce pomocí RT-PCR v reálném čase. Zařazení jedinci se skládali z 22 pacientů s diabetem 2. typu, kteří podstoupili renální biopsii v Osaka City General Hospital v letech 2000 až 2010, a 6 nediabetických kontrolních subjektů, kteří měli biopsií potvrzenou MGA.

Tabulky 1 a 2 shrnují základní klinické charakteristiky pacientů, kteří byli vyšetřeni imunohistochemickou analýzou nebo analýzou genové exprese. Pro světelnou mikroskopii byly vzorky tkáně zpracovány podle standardních postupů. Řezy byly obarveny hematoxylinem-eosinem, kyselinou jodistou-Schiff, kyselinou jodistou methenaminem stříbrem nebo Masson trichromem (obr. S1). Poměry počtu glomerulů s globální sklerózou mezi celkovými glomeruly a relativními oblastmi tubulointersticiální fibrózy byly nezávisle hodnoceny dvěma patology, kteří nevěděli o diagnóze a klinických datech.

Účinky cistanche: léčba onemocnění ledvin

Definice renálních výsledků

Následující dva prognostické ukazatele byly zkoumány lineární regresní a logistickou regresní analýzou: (1) rozsah proteinurie měřený jeden rok po biopsii a (2) renální příhoda definovaná jako roční zvýšení sérového kreatininu o 0,50 procenta od výchozího stavu nebo zahájení chronické dialýzy.

Imunohistochemie

Imunohistochemie MRP8 a CD68 byla provedena za použitíledvinařezy (tloušťka 4 mm) fixované 4% pufrovaným paraformaldehydem. Po získání antigenu pomocí citrátového pufru byly řezy ledvin inkubovány s 10% kozím sérem, následně s myšími anti-lidskými MRP8 (1:100; BMA biomedicals, Augst, Švýcarsko)[14] nebo myšími anti-lidskými CD68 protilátkami (1:50 DAKO, Ely, UK), resp. Primární protilátky byly vizualizovány sekundární protilátkou konjugovanou s křenovou peroxidázou a 3,3-diaminobenzidin tetrahydrochloridem (Dako USA, Carpinteria, CA). Jádra byla kontrastně obarvena hematoxylinem. MRP8-pozitivní buňky byly spočítány ve více než 10 glomerulech a MRP8-pozitivní oblast v tubulointersticiu byla měřena kvantitativně, aby se získal průměr pro každého subjektu pomocí softwaru MetaMorph 7.5 (Molecular Devices, Downingtown, PA, USA ). Kolokalizace CD68- a MRP8-pozitivních buněk byla hodnocena pomocí sériových řezů. V negativních kontrolách barvených bez první protilátky nebyl ani signál MRP8 ani CD68 (obr. S2). Předinkubací protilátky anti-MRP8 s 20 molárním přebytkem rekombinantního lidského proteinu MRP8 (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) při 4 uC přes noc bylo barvení výrazně sníženo, ne-li úplně, což dále podpořilo specifitu protilátky (obr. S3). .

Cistanche k léčbě ledvin

Hodnocení exprese mRNA

Zamrzlýledvinařezy byly rozděleny na glomerulové a neglomerulové tkáně pomocí laserové záchytné mikrodisekce (LM200; Olympus, Tokyo, Japonsko), jak bylo popsáno dříve [15]. Celková RNA byla extrahována mini kitem RNeasy (Qiagen, Tokyo, Japonsko). Úrovně exprese mRNA byly stanoveny pomocí TaqMan real-time PCR (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) [16,17]. Hladiny exprese všech genů byly normalizovány hladinami 18S rRNA (vnitřní kontrola). Viz tabulka S2 v souboru S1 pro sekvence primeru a sondy. Eukaryotická 18S rRNA byla detekována pomocí PreDeveloped TaqMan Assay Reagents (Applied Biosystems).

Tabulka 1. Základní klinické charakteristiky pacientů při renální biopsii, kteří byli analyzováni na expresi proteinu MRP8 imunohistochemicky.

MGA: malá glomerulární abnormalita, MCNS: nefrotický syndrom s minimálními změnami, ORG:obezita-příbuzná glomerulopatie, DN: diabetická nefropatie, BMI: index tělesné hmotnosti, BUN: dusík močoviny v krvi, CRP: C-reaktivní protein. Data jsou 6 SD. *Celkové rozdíly mezi skupinami MGA, MCNS, ORG a DN byly porovnány podle ANOVA.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t001

MRP8 léčba makrofágů

Makrofágy derivované z kostní dřeně byly generovány z myší divokého typu nebo TLR4 knockout (KO) myší [18] na genetickém pozadí C57BL/6J (Oriental BioService, Kyoto, Japonsko), jak bylo popsáno dříve [6]. Stručně, po lýze červených krvinek byly buňky kostní dřeně resuspendovány v médiu obsahujícím 20 procent fetálního telecího séra a 50 ng/ml rekombinantního lidského faktoru stimulujícího kolonie makrofágů (Peprotech, Rocky Hill, NJ, USA) a kultivovány při 37 uC v atmosféře 5 procent CO2. V den 7 byly makrofágy inkubovány s rekombinantním myším MRP8 (Abnova, Taipei, Taiwan) nebo vehikulem po dobu 4 hodin. Polymyxin B (25 mg/ml, NacalaiTesque, Kyoto, Japonsko) byl přidán do každé jamky, aby se minimalizovala kontaminace endotoxinem, jak bylo popsáno dříve [3,19]. Noendotoxin byl detekován v jakékoli koncentraci MRP8 testované dále inkubací s 25 mg/ml polymyxinu B pomocí ToxinSensorChromogenic LAL Endotoxin Assay Kit (GenScript, Piscataway, NJ, USA). Celková RNA z buněk byla extrahována pomocí RNeasy MiniKit a hladiny exprese mRNA interleukinu-1 beta (IL-1b), tumor nekrotizujícího faktoru alfa (TNFa) a MRP8 byly stanoveny pomocí TaqMan v reálném čase RT-PCR. Hladiny exprese všech genů byly normalizovány hladinami GAPDH hlodavců (interní kontrola, předem vyvinutá činidla testu TaqMan). Sekvence primeru a sondy pro PCR v reálném čase jsou uvedeny v tabulce S2 v souboru S1.

Statistická analýza

Data jsou vyjádřena jako průměr 6 SD nebo průměr 695 procent intervalu spolehlivosti (CI), pokud je to vhodné. Pro srovnání mezi čtyřmi skupinami byla použita jednosměrná nebo dvoucestná ANOVA s Bonferroniho post-hoc analýzou a kategorické proměnné byly porovnány pomocí x2 testu. Pro srovnání mezi dvěma skupinami byl podle potřeby použit studentův nepárový t-test. Spearmanovy korelační koeficienty byly odhadnuty pro určení asociací mezi dvěma proměnnými. Pro zkoumání účinků výchozích kovariát určujících rozsah glomerulární nebo tubulointersticiální exprese MRP8 nebo hladiny proteinu v moči jeden rok po biopsii byly provedeny jednorozměrné a vícerozměrné lineární regresní analýzy. Logistická regresní analýza byla použita k analýze vysvětlujících proměnných predikujících výskyt renálních příhod. Všechna data byla analyzována pomocí softwaru StatView 5.0 (SAS InstituteInc., Cary, NC, USA). Hodnoty P0.05 byly považovány za statisticky významné.

Účinky cistanche: léčba onemocnění ledvin

Výsledek

Porovnali jsme hladiny exprese proteinu MRP8 vledvinamezi DN, ORG a neobézními, nediabetickými kontrolními skupinami (MGA a CNS). Imunohistochemická analýza odhalila, že jak počet glomerulárních MRP8-pozitivních buněk (obr. 1A), tak tubulointersticiální MRP8-pozitivní plocha (obr. 1B) u DN byly významně větší než v jiných skupinách, včetně MGA, MCNS, a ORG (P<0.01). org="" subjects="" also="" showed="" a="" tendency="" of="" elevated="" mrp8expression="" compared="" to="" mga="" and="" mcns="" (fig.="" 1a,="" 1b).="" furthermore,="" glomerular="" mrp8="" mrna="" expression="" levels="" in="" dn="" subjects="" were="" significantly="" higher="" compared="" to="" non-dm="" control="" subjects="" (p,0.01,="" fig.="" 1c).="" in="" non-glomerulus="" tissues,="" mrp8mrna="" expression="" levels="" were="" much="" lower="" than="" those="" in="" glomeruli,="" both="" in="" non-dm="" and="" dm="" groups.="" abundant="" mrp8="" protein="" expression="" in="" the="" tubulointerstitium="" of="" dn="" cases="" was="" not="" clearly="" reflected="" into="" increased="" mrna="" expression,="" which="" may="" be="" partly="" caused="" by="" deposition="" of="" blood-derived="" proteins="" in="" the="" tubulointerstitium="" as="" discussed="" in="" the="" next="" section.="" as="" shown="" in="" representative="" photos="" (fig.="" 1d–g,="" see="" fig.="" s4="" in="" detail),="" renal="" biopsy="" samples="" from="" mga="" and="" mcns="" subjects="" showed="" few="" mrp8-positive="" cells="" in="" glomeruli="" (fig.="" 1d,="" 1e="" and="" fig.="" s4).="" in="" org="" subjects,="" somemrp8-positive="" cells="" appeared="" in="" glomeruli="" and="" tubulointerstitium(fig.="" 1f="" and="" fig.="" s4).="" in="" dn="" subjects,="" a="" marked="" increase="" of="" mrp8-expressing="" cells="" in="" glomeruli="" and="" significant="" expansion="" of="" mrp8-positive="" areas="" in="" the="" tubulointerstitium="" were="" observed="" in="" a="" focal="" manner="" (fig.="" 1g="" and="" fig.="" s4).="" of="" note,="" mrp8-positive="" cells="" were="" absent="" in="" nodular="" sclerosing="" lesions="" of="" diabetic="" glomeruli="" (fig.="" s4:dn="" case="" 2,="" 3)="" as="" described="" previously="" for="" sclerotic="" lesions="" in="" anca-associated="" glomerulonephritis="" [20].="" paired="" immunohistochemistry="" for="" cd68="" and="" mrp8="" in="" serial="" sections="" suggested="" thatmrp8="" signals="" were,="" at="" least="" in="" part,="" observed="" in="" macrophages="" expressing="" cd68="" (fig.="" 2),="" as="" we="" reported="" in="" a="" mouse="" model="" of="" diabetic="" nephropathy="" [6].="" besides,="" focally="" injured="" atrophic="" tubular="" epithelial="" cells="" also="" strongly="" expressed="" mrp8,="" which="" were="" surrounded="" by="" mrp8(+)-,="" cd68(+)-positive="" macrophages="" (fig.="" 2,="" fig="" s4:="" dn="" case="" 3-5).="" in="" the="" cases="" with="" nephrotic="" range="" proteinuria,="" mrp8="" staining="" was="" also="" observed="" along="" brush="" borders="" of="" proximal="" tubules="" both="" in="" mcns="" and="" dn="" cases="" (fig.="" s4).="" since="" the="" sample="" number="" of="" mrna="" expression="" was="" too="" small="" for="" multivariate="" analysis,="" the="" following="" analyses="" were="" performed="" using="" data="" from="" patients="" studied="" by="">

Tabulka 2. Základní klinické charakteristiky pacientů při renální biopsii, kteří byli analyzováni na expresi MRP8 mRNA pomocí RT-PCR v reálném čase.

Asociace meziledvinaSignály MRP8 a výchozí klinické parametry v době renální biopsie byly analyzovány v průřezu (tabulka 3). Jednorozměrnou analýzou byla exprese glomerulárního a/nebo tubulointersticiálního proteinu MRP8 významně korelována s věkem, systolickým a diastolickým krevním tlakem, proteinem v moči, sérovými hladinami kreatininu, BUN a HDL cholesterolu, eGFR a rozsahem globální glomerulosklerózy a tubulointersticiální fibrózy. Tyto parametry byly dále zkoumány multivariační analýzou po vyloučení diastolického krevního tlaku, eGFR a BUN kvůli kolinearitě. Procento tubulointersticiální fibrózy bylo nezávisle korelováno s glomerulárními signály MRP8 (b=0,62, upravená P=0.02) a signály tubulointersticiální MRP8 (b=0,85, upravená P 0,001), resp. Navíc tubulointersticiální signály MRP8 byly také nezávisle korelovány s výchozí proteinurií (b=0,20, upraveno P=0,01). Analýzy rozptýleného grafu mezi signály MRP8 v glomerulech nebo tubulointersticiu a klinickými parametry naznačovaly, že skupina MCNS měla odlišný distribuční vzorec od ostatních skupin, zejména pokud jde o hladinu bílkovin v moči a sérového LDL cholesterolu (obr. S5A–D, S6A–D). Vyloučení skupiny MCNS zlepšilo korelaci mezi signály MRP8 a hladinami proteinu v moči nebo sérového LDL-cholesterolu (obr. S5E–F, S6E–F). Proto jsme provedli subanalýzu s vyloučením pacientů s MCNS a zjistili jsme, že močový protein byl nezávislým faktorem korelujícím s glomerulárními MRP8 signály multivariační analýzou (tabulka 4; b=0.36, upravené P=0.03 ).

Dále jsme provedli lineární regresní nebo logistickou regresní analýzu, abychom identifikovali vysvětlující faktory predikující renální výsledky, kterými byl rozsah proteinurie o rok později a renální příhoda během jednoho roku. Protože mezi glomerulárními a tubulointersticiálními signály MRP8 existovala dobrá souvislost (obr. S7; R=0.67,P,0.001), byly tyto parametry alternativně zařazeny do dalších analýz . Hodnotili jsme souvislost mezi výchozími parametry a proteinem v moči 1 rok po renální biopsii pomocí vícenásobné regresní analýzy. Jak ukazuje tabulka 5, glomerulární MRP8 signál (b=0,59, upravená P,0,001) byl prediktivním faktorem pro rozsah proteinurie o rok později, stejně jako výchozí systolický krevní tlak (b {{13} },21, upravená P=0,04) a výchozí proteinurie (b=0,37, upravená P=0,002). Tyto parametry byly nezávislé na dalších známých rizikových faktorech diabetické nefropatie včetně renální dysfunkce (sérový kreatinin) a rozsahu globální sklerózy a tubulointersticiální fibrózy [11,21–24]. Na druhou stranu tubulointersticiální signál MRP8 (b=0 0,34, upravené P=0 0,09) nebyl nezávislým prediktivním faktorem pro hladiny bílkovin v moči o rok později. Renální příhody se objevily u 7 pacientů (6 u DN a 1 u ORG) do jednoho roku po renální biopsii. Podle jednorozměrné analýzy byly významnými prediktivními faktory pro výskyt renálních příhod nejen rozsah glomerulosklerózy a tubulointersticiální fibrózy a glomerulární a tubulointersticiální signály MRP8, ale také krevní tlak, renální dysfunkce a hladiny bílkovin v moči. Při multivariační analýze se však jejich kovariáty navzájem vyrušily (tabulka S3 v souboru S1), pravděpodobně kvůli vysokým korelacím mezi těmito parametry.

Nakonec jsme zkoumali účinnost MRP8 jako endogenního ligandu pro TLR4 pomocí kultivovaných makrofágů. U makrofágů pocházejících z kostní dřeně z myší divokého typu indukoval protein MRP8 upregulaci prozánětlivých cytokinových genů, jako je IL-1b a TNFa, a také spustil autoindukci MRP8, a to způsobem závislým na dávce mezi 1{{ 15}}-1000 ng/ml. Tyto účinky MRP8 byly potlačeny přibližně ze dvou třetin v makrofázích získaných z TLR4 KO myší (P,0,01) (obr. 3).

Obrázek 1. Imunohistochemické a mRNA analýzy pro MRP8 inledvinabioptické vzorky. Kvantifikace glomerulárního MRP{{0}}pozitivního počtu buněk (A) a tubulointersticiální MRP8-pozitivní oblasti (B). mRNA exprese MRP8 v glomerulárních a neglomerulárních frakcích (C). Otevřené sloupce: neobézní, nediabetické kontroly, které jsou MGA nebo MCNS, uzavřené sloupce: ORG nebo DN (A–C). Reprezentativní obrázky skupin MGA, MCNS, ORG a DN (D–G). MGA: malá glomerulární abnormalita, MCNS: nefrotický syndrom s minimálními změnami, ORG: glomerulopatie související s obezitou, DN: diabetická nefropatie. *P,0,01.doi:10,1371/journal.pone.0088942.g001

Diskuse

Tato studie prokázala, že MRP8 je hojně exprimován v glomerulech a tubulointersticiu pacientů s DNA ve srovnání s ORG a neobézní, nediabetickou kontrolou (MGA a MCNS). Kromě toho u subjektů ORG měly úrovně exprese MRP8 tendenci být vyšší než u subjektů s MGA nebo MCNS. V základním průřezovém šetření zahrnujícím všechny subjekty, pomocí jednorozměrné lineární regresní analýzy, glomerulární MRP8-pozitivní počet buněk a tubulointersticiální MRP8-pozitivní oblast, v tomto pořadí, korelovaly nejen s různými známými rizikovými faktory pro diabetická nefropatie (jako je systolický krevní tlak, proteinurie a sérový kreatinin), ale také s rozsahem glomerulosklerózy a tubulointersticiální fibrózy. Multivariační analýzou byla tubulointersticiální MRP8-pozitivní oblast významně korelována s proteinurií a tubulointersticiální fibrózou. Počet glomerulárních MRP8-pozitivních buněk významně koreloval s tubulointersticiální fibrózou v primární analýze a s proteinurií v subanalýze s vyloučením skupiny MCNS. Imunohistochemie ukázala, že MRP8 byl exprimován, alespoň částečně, CD68(plus)-exprimujícími makrofágy a atrofickými tubuly. Tato zjištění zvyšují možnost, želedvinaSignály MRP8 v glomerulech nebo tubulointersticiu mohou sloužit jako nové markery diabetické nefropatie.

Obrázek 2. Lokalizace exprese proteinu CD68 a MRP8 v sériových řezech případů diabetické nefropatie. Exprese CD68(A, B) a exprese MRP8 (C, D) v párových renálních vzorcích (A a C, nebo B a D). Šipky označují kolokalizaci signálů CD68 a MRP8.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g002

V prognostické studii multivariační analýza odhalila, že hladiny proteinů v moči rok po biopsii ledvin byly nezávisle spojeny s glomerulárním počtem MRP8-pozitivních buněk, proteinem v moči a systolickým krevním tlakem na počátku. Je třeba poznamenat, že glomerulární exprese MRP8 vykazovala nejsilnější korelaci s proteinem v moči o rok později (b= 0.87), dokonce silnější než výchozí protein v moči (b= 0.78), podle jednorozměrné analýzy. Je to částečně proto, že glomerulární exprese MRP8 není výrazně zvýšena u „benigních“ forem proteinurie, jako jsou ty pozorované u pacientů s MCNS, jejichž hladiny proteinurie jsou extrémně vysoké při diagnóze renální biopsií, ale obvykle se upraví do jednoho roku po zahájení imunosupresivní terapie. Tato zjištění naznačují, že glomerulární exprese MRP8 může mít jedinečnou prediktivní povahu jako marker onemocnění, který nemůže být nahrazen výchozí proteinurií nebo rutinní patologickou analýzou hodnotící globální glomerulosklerózu a tubulointersticiální fibrózu. Kromě toho spekulujeme, že glomerulární exprese MRP8 není jednoduchým markerem nebo pozorovatelem, ale aktivním hráčem v glomerulárním poškození, jak je diskutováno níže.

Koeficient determinace (R2) vypočítaný s vysvětlujícími parametry zahrnutými do vícenásobné regresní analýzy byl 0,52*, respektive 0,74#. y, roky; BP, krevní tlak; gCr, g kreatininu; T-chol, celkový cholesterol; HDL-Chol, HDL cholesterol; LDL-chol, LDL cholesterol; GS, glomeruloskleróza; TI, tubulointerstitial.doi:10.1371/journal.pone.0088942.t003

Tabulka 4. Subanalýza vztahu mezi základními klinickými parametry a signály MRP8 po vyloučení skupiny MCNS.

Tabulka 5. Vícenásobná regresní analýza pro identifikaci faktorů predikujících hladiny bílkovin v moči 1 rok po renální biopsii

Obrázek 3. Účinky MRP8 na makrofágy derivované z kostní dřeně. Makrofágy odvozené z kostní dřeně (BMDM) byly stimulovány rekombinantním myším MRP8 po dobu 4 hodin. Chybové úsečky ukazují 95% CI a statistické analýzy byly provedeny s logaritmicky transformovanými hodnotami. Dvoucestná ANOVA odhalila významné účinky genotypů, koncentrací MRP8 a jejich interakcí na expresi všech 3 genů (P,0.001 pro všechna srovnání). n=4. WT, divoký typ; KO, knockout; IL-1b, interleukin 1 beta; TNFa, tumor nekrotizující faktor-alfa. *P,0,01 mezi různými koncentracemi, #P,0,01 mezi genotypy.doi:10.1371/journal.pone.0088942.g003

V dalším pokusu o longitudinální studii se logistickou regresní analýzou nepodařilo zjistit žádné nezávislé prediktory pro výskyt renální příhody během jednoho roku. Spekulujeme, že je to částečně proto, že tubulointersticiální exprese MRP8 a tubulointersticiální fibróza byly dva silné prediktory renální příhody v univariační analýze, ale jejich významy byly navzájem zrušeny v multivariační analýze. Tyto dva parametry vykazovaly silnou korelaci (R=0.68, P,0.001) (obr. S8), což naznačuje, že tyto dva parametry mohou být ekvivalentní predikci renálních příhod. Intersticiální exprese MRP8 skutečně vykazovala zcela podobný vzor jako intersticiální fibróza hodnocená Massonovým trichromem. Množství intersticiálního MRP8 do značné míry závisí na pozitivních signálech v atrofických tubulech spíše než na signálech v makrofázích, jejichž rys se liší od vlastností glomerulárního MRP8 v tečkovité distribuci. Navíc malá velikost vzorku, krátká doba pozorování a malý počet subjektů, u kterých se vyvinuly renální příhody, mohly snížit detekční schopnost. Vzhledem k tomu, že exprese MRP8 v tubulárních epiteliálních buňkách hraje kauzální roli v progresi tubulointersticiálního zánětu u myšího modelu renální fibrózy[7], bude zapotřebí další analýza k objasnění role tubulointersticiálního MRP8 u DN.

V souladu s naší předchozí studií [6] byla mRNA MRP8 upregulována převážně v glomerulární frakci lidských subjektů s DN ve srovnání s kontrolními subjekty s MGA. Na druhou stranu exprese proteinu MRP8 byla pozorována nejen v glomerulu, ale také v tubulointersticiu. V tomto ohledu je třeba poznamenat, že existovaly dva odlišné vzorce barvení MRP8 v tubulointersticiu DN. Jedním z nich bylo intenzivní a fokální barvení v silně atrofických tubulech. Druhým bylo mírné zbarvení distribuované podél kartáčkového okraje proximálních tubulů, které bylo také nalezeno v ORG a MCNS. Tyto signály pravděpodobně představují protein MRP8 získaný z krve a reabsorbovaný proximálními tubuly, což by nemělo být doprovázeno zvýšenou expresí mRNA MRP8. Pokud jde o proteiny jiné než MRP8, my a další jsme nedávno uváděli podobné jevy detekce imunoreaktivních proteinů v proximálních tubulech způsobených reabsorpcí, ale nikoli renální syntézou [25,26]. Na druhou stranu, protože v testu absorpce protilátek zůstalo malé barvení MRP8, zejména v glomerulárních exsudativních lézích a silně zjizvených, fibrotických lézích kolem atrofických tubulů, nelze přítomnost nespecifických signálů zcela negovat (obr. S3).

Glomerulární signály MRP8 vykazovaly hlavně přerušované vzory u subjektů s DN (obr. 1, obr. S4). Protože oba CD68 a MRP8 byly detekovány myšími monoklonálními protilátkami, lokalizace těchto molekul byla hodnocena sériovými řezy, nikoli dvojitým imunobarvením. Vzorce barvení MRP8 byly kompatibilní s těmi u jiných zánětlivých renálních poruch včetně IgAnefritidy [27], membranoproliferativní glomerulonefritidy [14] a glomerulonefritidy související s ANCA [20], u kterých byly makrofágy navrženy jako hlavní zdroj MRP8, jak jsme uvedli v model hlodavce [6]. Neutrofily by navíc mohly být považovány za další zdroj MRP8 ovlivňující cévní komplikace [28]. V současné době zkoumáme molekulární mechanismus, proč je MRP8 převážně upregulován v buňkách myeloidní linie infiltrujících glomeruly. Studie in vitro odhalila, že MRP8 indukoval expresi zánětlivých cytokinů a také potencoval expresi samotného MRP8 v makrofázích v závislosti na TLR4-. Navíc MRP8-pozitivní buňky chyběly v nodulárních sklerotizujících lézích, což naznačuje, že glomerulární MRP8 může odrážet probíhající glomerulární poškození [20]. Důležité je, že rozsáhlá studie na lidech uvádí, že exprese genu MRP8 v krevních mononukleárních buňkách pacientů s diabetem 1. typu je významně zvýšená u subjektů s diabetickými komplikacemi včetně nefropatie [29].

Protože inhibice systému renin-angiotenzin (RAS) je důležitým determinantem renálních výsledků, zkoumali jsme účinky RASblockade naledvinavýraz MRP8. Nezjistili jsme žádný významný rozdíl v expresi mRNA MRP8 v ledvinách mezi pacienty s DN léčenými s blokádou RAS nebo bez ní (obr. S9), pravděpodobně proto, že případy léčené blokádou RAS měly tendenci mít závažnější hypertenzi a proteinurii než případy bez blokády RAS

U obézních lidí a myší může zvýšený plazmatický komplex MRP8/14 odrážet určitý stupeňobezitaa pocházejí z adipocytů i leukocytů [8,9]. Naše případy ORG měly mírné barvení MRP8 v proximálních tubulech, což naznačuje zvýšené plazmatické hladiny MRP8. Naproti tomu mezi tubulointersticiální expresí MRP8 a indexem tělesné hmotnosti nebyla žádná významná korelace (obr. S6G). Proto místní exprese MRP8 vledvinamůže sloužit spíše jako marker renálního poškození než proobezita[8,9].

Cistanche pro zlepšení dysfunkce ledvin

Naše studie má několik omezení. Počet vzorků každé studované skupiny byl malý. Neidentické subjekty byly zařazeny do mRNA a imunohistochemických analýz. Vzhledem k tomu, že jsme analyzovali pouze pacienty, kteří podstoupili renální biopsii, složení zde zkoumaných pacientů nemusí odrážet složení pacientů s diabetem 2. typu nebo obecně chronických pacientů.ledvinanemocných subjektů. Ačkoli věk nebyl v našich datech zachován jako nezávislý faktor spojený se signály MRP8 (tabulka 3), je známo, že stárnutí souvisí s chronickým zánětem [30]. Vliv věku nelze zcela opomenout. Ačkoli většina signálů MRP8 byla ztracena v testu absorpce protilátky, zůstaly některé pozitivní signály, které mohou být způsobeny nespecifickou vazbou první protilátky. Jak bylo diskutováno výše, vyšetření renální exprese MRP8 pomocí renální biopsie nám pomáhá porozumět patofyziologii a prognóze chronických onemocnění ledvin, zejména spojených sobezitaa diabetes, ale má nevýhodu pro rutinní a opakované použití v ambulancích

Souhrnně, tato studie naznačuje, že exprese MRP8 vledvinaodráží aktuální patologický stav a také předpovídá renální výsledky u pacientů sobezitanebocukrovka typu 2. Další výzkumy studující hladiny MRP8 v moči u obézních nebo diabetických pacientů ve velkém měřítku mohou být oprávněná

Podpůrné informace

Obrázek S1 Reprezentativní fotografie ukazující řezy renální biopsie pacienta s DN obarveného (A) kyselinou jodistou Schiff, (B) kyselinou jodistou methenaminem stříbrem nebo (C) Masson trichromem. Poměr počtu glomerulů s globální sklerózou (šipky) mezi celkovými glomeruly a relativní plochou tubulointersticiální fibrózy byl u tohoto pacienta 33 procent a 65 procent. (TIFF)

Obrázek S2 Imunohistochemie pro proteiny MRP8 a CD68 u pacientů s DN. Fotografie v pravém sloupci ukazují negativní kontrolní experimenty bez 1. protilátky. (TIF)

Obrázek S3 Absorpční test protilátek pro barvení MRP8. PBS: fyziologický roztok pufrovaný fosfátem, rhMRP8: rekombinantní lidská MRP8. (TIF)

Obrázek S4 Reprezentativní fotografie exprese MRP8 ve skupinách MGA, MCNS, ORG a DN. (TIF)

Obrázek S5 Korelace mezi počtem glomerulárních MRP8-pozitivních buněk a klinickými parametry. Byly použity logaritmicky transformované hodnoty signálů MRP8. Korelace byly analyzovány pomocí všech 4 skupin (A–D, G) nebo 3 skupin kromě skupiny MCNS (E, F). Prázdné kruhy: malá glomerulární abnormalita (MGA), uzavřené kruhy: nefrotický syndrom s minimálními změnami (MCNS), prázdné trojúhelníky:obezita-příbuzná glomerulopatie (ORG), uzavřené trojúhelníky: diabetická nefropatie (DN).(TIF)

Obrázek S6 Korelace mezi tubulointersticiální MRP8-pozitivní oblastí a klinickými parametry. Byly použity logaritmicky transformované hodnoty signálů MRP8. Tyto korelace byly analyzovány pomocí všech 4 skupin (A–D, G) nebo 3 skupin kromě skupiny MCNS (E, F).(TIF)

Obrázek S7 Korelace mezi glomerulární a tubulointersticiální expresí MRP8. Byly použity logaritmicky transformované hodnoty signálů MRP8. (TIF)

Obrázek S8 Korelace mezi tubulointersticiální MRP8-pozitivní oblastí a tubulointersticiální fibrózou. Byly použity logaritmicky transformované hodnoty signálů MRP8. (TIF)

Obrázek S9 Renální mRNA exprese MRP8 u pacientů s DN s blokádou renin-angiotenzin nebo bez ní. NS: nevýznamné. n=15 (Ano), 6 (Ne). Mezi 22 případy DN nebyly informace o medikaci dostupné u jednoho pacienta.(TIF)

Soubor S1 Podpůrné tabulky.

Tabulka S1, Patologické diagnózy všech případů, které podstoupily renální biopsii na Oddělení medicíny a klinické vědy, Kyoto University Hospital v letech 2000 až 2011. Tabulka S2, Sekvence primeru a sondy pro TaqMan v reálném čase RT-PCR. Tabulka S3, Logistická regresní analýza pro výskyt renální příhody během jednoho roku. (DOC) Poděkování Děkujeme S. Tanakovi za statistické rady, Y. Ogawovi, N. Igarashimu a C. Kimurovi za technickou pomoc a A. Yamamotovi a SOginovi za pomoc sekretářce. Příspěvky autora Experimenty vymysleli a navrhli: TK KM MK HY MI AN KNMM. Provedl experimenty: TK HI AI KK TM YK MI AN. Analyzovaná data: TK KM MK HY AS SY KU KN MM. Přispěné reagencie/materiály/analytické nástroje: TK KM. Příspěvek napsal: TK KMMM.

Účinky cistanche: léčba onemocnění ledvin

Reference

1. Donath MY, Shoelson SE (2011) Diabetes 2. typu jako zánětlivé onemocnění. Nat Rev Immunol 11: 98–107.

2. Odink K, Cerletti N, Bruggen J, Clerc RG, Tarcsay L a kol. (1987) Dva proteiny vázající vápník v infiltrujících makrofázích revmatoidní artritidy. Nature 330: 80–82.

3. Vogl T, Tenbrock K, Ludwig S, Leukert N, Ehrhardt C, et al. (2007) Mrp8 a Mrp14 jsou endogenní aktivátory Toll-like receptoru 4, které podporují letální, endotoxinem indukovaný šok. Nat Med 13: 1042–1049.

4. Croce K, Gao H, Wang Y, Mooroka T, Sakuma M a kol. (2009) Myeloidrelated protein-8/14 je kritický pro biologickou odpověď na vaskulární poranění. Circulation 120: 427–436.

5. Loser K, Vogl T, Voskort M, Lueken A, Kupas V, et al. (2010) Toll-like receptor 4 ligandy Mrp8 a Mrp14 jsou klíčové ve vývoji autoreaktivních CD8 plus T buněk. Nat Med 16: 713–717.

6. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2012) Exacerbace diabetické nefropatie hyperlipidemií je zprostředkována Toll-like receptorem 4 u myší. Diabetologia 55: 2256–2266.

7. Fujiu K, Manabe I, Nagai R (2011) Epitelové buňky renálního sběrného kanálku regulují zánět při tubulointersticiálním poškození u myší. J Clin Invest 121: 3425–3441.

8. Sekimoto R, Kishida K, Nakatsuji H, Nakagawa T, Funahashi T, et al. (2012) Vysoké hladiny komplexu S100A8/A9 (kalprotektin) v oběhu u samců Japonců s abdominální adipozitou a dysregulovanou expresí S100A8 a S100A9 v tukových tkáních obézních myší. Biochem Biophys Res Commun 419: 782-789.

9. Mortensen OH, Nielsen AR, Erikstrup C, Plomgaard P, Fischer CP a kol. (2009) Kalprotektin – nový markerobezita. PLoS One 4: e7419.

10. Matsuo S, Imai E, Horio M, Yasuda Y, Tomita K a kol. (2009) Revidované rovnice pro odhadovanou GFR ze sérového kreatininu v Japonsku. jsem JledvinyDis53: 982–992.

11. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML a kol. (2005) Diabetická nefropatie: diagnostika, prevence a léčba. Diabetes Care 28:164–176.

12. Kambham N, Markowitz GS, Valeri AM, Lin J, D'Agati VD (2001)Obezitasouvisející glomerulopatie: vznikající epidemie.ledvinyInt 59: 1498–1509.

13. Praga M, Morales E (2006)Obezitaproteinurie a progrese selhání ledvin. Curr Opin Nephrol Hypertens 15: 481–486.

14. Kawasaki Y, Hosoya M, Takahashi A, Isome M, Tanji M a kol. (2005) Exprese myeloidního proteinu 8 na makrofázích je užitečným prognostickým markerem renální dysfunkce u dětí s MPGN typu 1. Am JledvinyDis 45: 510–518.

15. Nishiyama A, Konishi Y, Ohashi N, Morikawa T, Urushihara M, et al. (2011) Angiotenzinogen v moči odráží aktivitu intrarenálního renin-angiotensinového systému u pacientů s IgA nefropatií. Transplantace Nephrol Dial 26: 170–177.

16. Ogawa Y, Mukoyama M, Yokoi H, Kasahara M, Mori K, et al. (2012) Natriuretický peptidový receptor guanylyl cyklázy-A chrání podocyty před aldosteronem indukovaným glomerulárním poškozením. J Am Soc Nephrol 23: 1198–1209.

17. Yokoi H, Mukoyama M, Mori K, Kasahara M, Suganami T, et al. (2008) Nadměrná exprese růstového faktoru pojivové tkáně v podocytech zhoršuje diabetickou nefropatii u myší.ledvinyInt 73: 446–455.

18. Hoshino K, Takeuchi O, Kawai T, Sanjo H, Ogawa T, et al. (1999) Špičkové: Myši s deficitem Toll-like receptor 4 (TLR4) jsou hyporesponzivní na lipopolysacharid: důkaz pro TLR4 jako produkt genu Lps. J Immunol162: 3749-3752.

19. Suganami T, Tanimoto-Koyama K, Nishida J, Itoh M, Yuan X a kol. (2007) Role Toll-like receptor 4/NF-kappaB dráhy v nasycených mastných kyselin indukovaných zánětlivých změnách v interakci mezi adipocyty a makrofágy. Arterioscler Thromb Vasc Biol 27: 84–91.

20. Pepper RJ, Hamour S, Chavele KM, Todd SK, Rasmussen N, et al. (2013) Exprese leukocytů a séra S100A8/S100A9 odráží aktivitu onemocnění u vaskulitidy a glomerulonefritidy spojené s ANCA.ledvinyInt 83: 1150–1158.

21. Ravid M, Brosh D, Ravid-Safran D, Levy Z, Rachmani R (1998) Hlavní rizikové faktory pro nefropatii u diabetes mellitus 2. typu jsou hladiny cholesterolu v plazmě, střední krevní tlak a hyperglykémie. Arch Intern Med 158: 998–1004.

22. Adler AI, Stratton IM, Neil HA, Yudkin JS, Matthews DR a kol. (2000) Asociace systolického krevního tlaku s makrovaskulárními a mikrovaskulárními komplikacemi diabetu 2. typu (UKPDS 36): prospektivní observační studie. BMJ 321: 412–419.

23. Ruggenenti P, Remuzzi G (1998) Nefropatie typu -2 diabetes mellitus. J Assoc Nephrol 9: 2157–2169.

24. Taft JL, Nolan CJ, Yeung SP, Hewitson TD, Martin FI (1994) Klinické a histologické korelace poklesu renálních funkcí u diabetických pacientů s proteinurií. Diabetes 43: 1046–1051.

25. Matsusaka T, Niimura F, Shimizu A, Pastan I, Saito A, et al. (2012) Liverangiotensinogen je primárním zdrojem renálního angiotenzinu II. J Am Soc Nephrol23: 1181–1189.

26. Kuwabara T, Mori K, Mukoyama M, Kasahara M, Yokoi H, et al. (2009) Hladiny lipokalinu spojeného s neutrofilní želatinázou v moči odrážejí poškození glomerulů, proximálních tubulů a distálních nefronů.ledvinyInt 75: 285–294.

27. Kawasaki Y, Suyama K, Go H, Imamura T, Ushijima Y, et al. (2009) Akumulace makrofágů exprimujících myeloidní protein 8 spojená s progresí sklerotických změn u dětí s IgA nefropatií. Tohoku J Exp Med 218: 49–55.

28. Nagareddy PR, Murphy AJ, Stirzaker RA, Hu Y, Yu S, et al. (2013) Hyperglykémie podporuje myelopoézu a zhoršuje řešení aterosklerózy. Cell Metab 17: 695–708.

29. Jin Y, Sharma A, Carey C, Hopkins D, Wang X a kol. (2013) Exprese zánětlivých genů je upregulována v periferní krvi pacientů s diabetem 1. typu. Péče o diabetes.

30. Longo VD, Finch CE (2003) Evoluční medicína: od trpasličích modelových systémů ke zdravým stoletým lidem? Science 299: 1342–1346.

Citace: Kuwabara T, Mori K, Kasahara M, Yokoi H, Imamaki H, et al. (2014) Prediktivní významledvinyExprese proteinu 8 souvisejícího s myeloidem u pacientů sObezita- nebo s diabetem 2. typu související onemocnění ledvin. PLoS ONE 9(2): e88942. doi:10.1371/journal.pone.0088942

Editor: Utpal Sen, University of Louisville, Spojené státy americké

Přijato 11. září 2013; Přijato 14. ledna 2014; Publikováno 18. února 2014

Copyright: 2014 Kuwabara et al. Toto je článek s otevřeným přístupem distribuovaný za podmínek licence Creative Commons Attribution License, která umožňuje neomezené použití, distribuci a reprodukci na jakémkoli médiu za předpokladu, že je uveden původní autor a zdroj.

Financování: Tato práce byla částečně podpořena grantem na výzkum diabetické nefropatie a nefrosklerózy od Ministerstva zdravotnictví, práce a sociálních věcí Japonska (KM), výzkumnými granty japonského ministerstva školství, kultury, sportu, vědy , and Technology (pro TK, KM a MM), od Japan Foundation for Applied Enzymology (pro TK) a od Smoking Research Foundation (pro MM). Investoři neměli žádnou roli v návrhu studie, sběru dat a analýze, rozhodování o publikaci nebo přípravě rukopisu.

Konkurenční zájmy: Autoři prohlásili, že neexistují žádné konkurenční zájmy.

* E-mail: keyem@kuhp.kyoto-u.ac.jp