Léčba diabetické nefropatie: oxid uhelnatý

další informace:ali.ma@wecistanche.com

Část Ⅱ: Oxid uhelnatý zmírňuje stárnutí u diabetické nefropatie zlepšením autofagie

Guibin Meil; Chunjie Jiang; Xueer Cheng; & spol.

ABSTRAKTNÍ

Cíle: Senescence, charakterizovaná trvalou zástavou cyklu, hraje důležitou roli vdiabetická nefropatie(DN). Mechanismus stárnutí ledvin je však stále nejasný a léčba, která se na něj zaměřuje, musí být dále prozkoumána.

Materiály a metody: DN (diabetická nefropatie) myši byly indukovány pomocí HFD a STZ a 3 typy renálních buněk byly ošetřeny vysokou hladinou glukózy (HG), aby se vytvořil model in vitro. Markery související se stárnutím a autofagií byly detekovány pomocí qRT-PCR a Western blotu. Dále byly k objasnění mechanismu použity autofagické inhibitory a koimunoprecipitaceKysličník uhelnatý (CO). Kromě toho byl specifický vztah mezi autofagií a stárnutím zkoumán imunofluorescenční trojitou co-lokalizací a ELISA.

Výsledky: Odhalili jsme, že stárnutí nastalo in vivo a in vitro, což by mohlo být zvráceno CO (Kysličník uhelnatý). Mechanicky jsme prokázali, že CO (Kysličník uhelnatý) inhibovala dysfunkci autofagie u DN (diabetická nefropatie) myší částečně díky oddělení Beclin-1-Bcl-2 komplexu. Další výsledky ukázaly, že inhibitory autofagie blokovaly zlepšení CO (Kysličník uhelnatý) při stárnutí. Data navíc odhalila, že autofagie regulovala degradaci sekrečního fenotypu souvisejícího se stárnutím (SASP) včetně -1, Il-6, Tgf- a Vegf. Závěry: Tyto výsledky naznačují, že CO (Kysličník uhelnatý) chrání DN (diabetický nefropaty) myši po senescenci ledvin a ztrátě funkce zlepšením autofagie částečně zprostředkované disociujícím Beclin-1-Bcl-2 komplexem, který je pravděpodobně připisován degradaci SASP. Tyto poznatky přinášejí nové nápady pro prevenci a léčbu DN (diabetická nefropatie) a regulaci stárnutí.

Klikněte na Cistanche DHT pro funkci ledvin

PRO ČÁST KLIKNĚTE ZDE Ⅰ

4|DISKUSE

Hromadící se senescentní buňky jsou stále více považovány za maligní zombie buňky odolné vůči smrti, se schopností vyvolat tkáňovou dysfunkci a podněcovat nemoci související s věkem. Výzkumníci uvedli, že transplantace senescentních prekurzorových tukových buněk do 6-měsíčních myší způsobila na dávce závislý pokles tělesné funkce.2 Naopak odstranění senescentních buněk zlepšilo řadu onemocnění souvisejících s věkem, jako je T2D,30osteoartritida31, a Alzheimerova choroba.32Naše výsledky ukázaly výskyt stárnutí u DN (diabetická nefropatie) myši a 3 typy renálních buněk vystavených HG. Tyto výsledky a předchozí výzkum konzistentně naznačovaly přítomnost stárnutí u DN (diabetická nefropatie). Je zajímavé, že mezi 9 druhy tkání 27-měsíčních SD potkanů ​​byla renální senescence nejčasnější a nejzávažnější, což naznačuje, že ledviny byly náchylné k senescenci.33 Na základě těchto zjištění jsme spekulovali, že terapie zaměřené na senescenci buňky mohou chránit před DN (diabetická nefropatie). Nedávné omezené důkazy ukázaly, že CO (Kysličník uhelnatý) zmírnil stárnutí endoteliálních buněk vyvolané léky. Podobně jsme poskytli výsledky, že CO (Kysličník uhelnatý) významně down-reguloval velkou část senescentního fenotypu a podle toho obnovil renální funkce u DN (diabetická nefropatie) myši. Zatímco CO (Kysličník uhelnatý) bylo prokázáno, že uplatňují renoprotekci proti ischemické reperfuzi a myším s transplantací ledvin prostřednictvím protizánětlivých, antiapoptózových a dalších klasických cest4, naše studie navrhla nový mechanismus, který CO (Kysličník uhelnatý) uděluje zlepšení po renální senescenci DN (diabetická nefropatie) myši.

S výjimkou široce uznávaných drah p53/p21 a p16 bylo popsáno, že stárnutí je autofagií regulováno pozitivně. Tyto výsledky a předchozí výzkum konzistentně naznačovaly přítomnost stárnutí u DN (diabetická nefropatie) V souladu s tím bylo zjištěno snížení autofagie v ledvinách se stárnutím.5 Navíc existovala negativní korelace mezi Atg5 a renálním stárnutím DN (diabetická nefropatie) myši, což naznačuje potenciál anti-senescence autofagie u DN (diabetická nefropatie). Naše výsledky ukázaly, že dysfunkce autofagie a autofagického toku in vivo a vitro byly pozitivně spojeny s akumulovanými senescentními buňkami. Zajímavé je, že CO (Kysličník uhelnatý) byl považován za účinný aktivátor autofagie. V naší studii CO (Kysličník uhelnatý) aktivoval autofagii, ale snížil autofagozomy. Další údaje ukázaly, že CO (Kysličník uhelnatý) zlepšila lysozomální funkci a autofagický tok transfekcí RFP-GFP-LC3. Kromě toho inhibitory autofagie a siAtg7 omezily zlepšení stárnutí pomocí CO (Kysličník uhelnatý) in vitro, což podporuje CO (Kysličník uhelnatý) zpomalil stárnutí prostřednictvím autofagie.

Nejen to, disociace Beclin-1-Bcl-2 komplexu CO (Kysličník uhelnatý) byl pozorován v DN (diabetická nefropatie) myši. Pokud je nám známo, Beclin-1 funguje jako iniciátor autofagie, když je odpojen od Bcl-2. Narušení komplexu může být potenciálním cílem pro autofagii aktivovanou CO (Kysličník uhelnatýKromě toho vyřazení vazebných míst Beclin{0}} a Bcl{1}} nejen aktivovalo autofagii, ale zlepšilo stárnutí a délku života myší,21 což naznačuje komplex koordinovaně regulované autofagie a stárnutí. Naše experimenty ukázaly, že toto komplexní disociační činidlo ABT737 dále zvýšilo aktivaci autofagie a zlepšení stárnutí pomocí CO (Kysličník uhelnatý) in vitro. V souladu s našimi výsledky narušení interakce Beclin-1-Bcl-2 komplexu pozitivně ovlivňuje řadu onemocnění, včetně ochrany proti srdečním poraněním u myší s diabetickou kardiomyopatií3 stupně a uplatnění renoprotekce u myší vystavených ischemii-reperfuzi.37 Tato pozorování ukázala, že CO (Kysličník uhelnatý) může aktivovat autofagii disociací Beclin-1-Bcl-2 komplexu, aby se zmírnilo stárnutí a poškození ledvin.

OBRÁZEK ​​5 Aktivovaná autofagie může degradovat SASP v DN (diabetická nefropatie) myši.

A, Imunohistochemické obrazy a kvantifikace exprese p65 a jaderné translokace (n=3). Měřítko: 50 μm. B, Western blot analýza GATA4 (n=3).

C, Reprezentativní imunofluorescenční obrazy společné lokalizace mTOR, LC3 puncta a LAMP2 v ledvině. Měřítko: 25 μm.

DG, Reprezentativní imunofluorescenční snímky ukázaly trojitou společnou lokalizaci IL-1, IL-6, TGF- a VEGF s LC3 a LAMP2 (červené šipky) a bílé šipky označovaly umístění s LC3. Měřítko: 25 μm.

H, Celková hladina proteinu VEGF (buněčný lyzát a supernatant) v HPC ošetřených různými formulacemi (HG, ABT737: 1 mmol/L, rapamycin: 10 nmol/L a CORM-2).

I, exprese proteinu VEGF v supernatantu HPC ošetřeného odlišně. J, poměr uvolňování VEGF proteinu HPC (supernatant/celkový lyzát) (n=6). *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

A co víc, specifický vztah mezi autofagií a stárnutím vyžaduje další objasnění. Autofagie je proces čištění, který dodává uzavřené složky do lysozomu k degradaci. Výzkumníci prokázali, že autofagie snižuje sekreci Il-1, hlavní složky SASP, prostřednictvím degradační dráhy. Překvapivě byla v ledvinách pozorována společná lokalizace IL-1, LC3 puncta a LAMP2, což naznačuje degradaci IL-1 CO (Kysličník uhelnatý) léčba v DN (diabetická nefropatie) myši. Kromě toho se intracelulární I{{0}}, TGF- a VEGF, v daném pořadí, lokalizovaly společně s LC3 puncta a LAMP2, což ukazuje na průnik mezi autofagií a degradací SASP. Důsledně bylo prokázáno, že lékem aktivovaná autofagie snižuje sekreci IL-6 v chondrocytech,3", zatímco potlačení autofagie delecí Atg7 způsobilo zvýšený export IL-16.IL-6 a IL-8 v adipocytech a buňkách rakoviny prsu.0 Bylo však hlášeno, že IL-1 není přímým substrátem pro autofagickou eliminaci v makrofázích,1 což naznačuje, že SASP byl částečně degradován autofagií.

Pozoruhodně jsme pozorovali, že SASP se nachází společně s autofagozomy v ledvinách DN (diabetická nefropatie) myši (obrázek 5D-G, bílá šipka), což naznačuje, že SASP může být pohlcen autofagozomy, ale uniknout lysozomům. To je potenciálně přičítáno sekreční autofagii v tom, že autofagozomy nejsou dodávány do lysozomů, ale místo toho fúzují přímo s plazmatickou membránou, což vede k uvolnění cytosolických složek (SASP) do extracelulárního prostoru. Společná lokalizace SASP a autolysozomů se však výrazně zvýšila u normálních a CO (Kysličník uhelnatý)-intervenované myši (obrázek 5D-G, červená šipka). Možným vysvětlením tohoto jevu je, že jak autofagií zprostředkovaná sekrece, tak degradace se účastní transportu SASP.3 Ačkoli regulace divergence mezi vylučováním versus degradací intracelulárního obsahu musí být plně pochopena, zjistili jsme, že CO (Kysličník uhelnatý)a autofagičtí agonisté blokovali export VEGF v HPC ošetřeném HG, což naznačuje, že aktivovaná autofagie přispěla k degradaci SASP. Navíc bylo hlášeno, že zhoršená lysozomální funkce způsobuje uvolňování autolyzozomálních materiálů v mikrogliální buňce.4 (Kysličník uhelnatý)-indukovaná aktivace autofagie a obnovení lysozomální funkce může vést k větší degradaci SASP než k sekreci.

Mnoho důkazů prokázalo, že secernovaný SASP hrál negativní roli u některých onemocnění. Například bylo hlášeno, že SASP usnadňuje retinální vaskulární poškození přenosem stárnutí u myší s retinopatií,4 indukuje stárnutí a poškozuje nesenescentující žlučové buňky.46 Není však známo, zda SASP je odpovědný za DN (diabetická nefropatie) progrese. Výsledky Omics ukázaly, že zánětlivé cytokiny byly up-regulovány v časné a zejména v pozdní DN (diabetická nefropatie7. Důsledně jsme zjistili, že mnoho SASP bylo vyvinuto v DN (diabetická nefropatie) myši, mezi nimiž byl IL-1 zvýšen nejvýrazněji ve srovnání s normálními myšmi a VEGF byl lokalizován společně s autolysozomy nejzjevněji v normálních a CO (Kysličník uhelnatý)-zasahovaly myši. A léčba anti-IL-lgG oslabených poškození ledvin včetně fibrózy u db/db myší.48 Delece VEGF-B chránila proti DN (diabetická nefropatie) snížením akumulace lipidů v ledvinách, zatímco nadměrná exprese VEGF-A u dospělých myší zhoršila renální dysfunkci a změnu struktury.50 Výše ​​uvedené údaje o regulaci SASP dále naznačovaly klíčovou roli SASP v DN (diabetická nefropatie). Naše studie také ukázala, že podávání CO (Kysličník uhelnatý) inhiboval expresi a sekreci SASP, následně zlepšil renální fibrózu a strukturální změny. Z toho jsme odvodili, že blokovací věk SASP zprostředkované stárnutí prostřednictvím degradační dráhy autofagie může být jedním z mechanismů, kterými CO (Kysličník uhelnatý) chrání HFD plus STZ indukované DN (diabetická nefropatie).

Souhrnně tato zjištění naznačují, že CO (Kysličník uhelnatý) zmírnil renální senescenci DN (diabetická nefropatie) prostřednictvím zlepšení autofagie zprostředkované disociací Beclin-1-Bcl-2 komplexu, což bylo částečně přičítáno degradaci SASP. Naše studie vrhá nové světlo na prevenci a léčbu DN (diabetická nefropatie) a regulaci renálního stárnutí. Očekává se, že specifické účinky stárnutí na DN (diabetická nefropatie) si zaslouží další zkoumání. Na druhou stranu léky proti senescenci se mohou stát průlomem v léčbě DN (diabetická nefropatie) a další nemoci související s věkem.

OBRÁZEK ​​6 CO aktivoval autofagii částečně disociací Beclin-1-Bcl-2 komplexu.

A, Co (Kysličník uhelnatý)-imunoprecipitace Beclin-1 a Bcl-2 a kvantifikace poměru Beclin-1 k Bcl-2 v ledvinách (n=3).

B, Western blot analýza série autofagických proteinů (LAPM2, p62 a LC3) v HBZY-1 ošetřených odlišně (HG, CORM-2 a Beclin-1-Bcl2 komplex disociační činidlo ABT737) ( n=5).

C, Kvantifikace exprese p53, p21 a p16 (n=5 nebo 6).

D, Snímky SA- -gal barvení 3 druhů renálních buněk léčených odlišně a statistické výsledky (n=3). Měřítko: 50 μm. *P < 0,05,="" **p="">< 0,01,="" ***p=""><>

REFERENCE

1. Alicia RZ, Rooney MT, Tuttle KR.Diabetické onemocnění ledvin: výzvy, pokrok a možnosti. Clin J Am Soc Nephrol. 2017;12(12):2032-2045.

2. Konsorcium CKDP, Matsushita K, Vandervelde, et al. Asociace odhadované rychlosti glomerulární filtrace a albuminurie s mortalitou ze všech příčin a kardiovaskulární mortalitou v obecných populačních kohortách: společná metaanalýza.Lancet.2010;375(9731):{{ 6}}. 3. Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, et al. Clearance p16Ink4a-pozitivních senescentních buněk oddaluje poruchy spojené se stárnutím. Příroda. 2011;479(7372):232-236.

4. Kitada K, Nakano D, Ohsaki H, et al. Hyperglykémie způsobuje buněčné stárnutí prostřednictvím SGLT2- a p21-závislé dráhy v proximálních tubulech v časném stadiu diabetické nefropatie. J Diabetes Complicat.2014;28(5):604-611.

5. Tsai YC, Kuo PL, Kuo MC, a kol. Interakce miR-378i-Skp2 reguluje stárnutí buněk u diabetické nefropatie. J Clin Med. 2018;7(12):468.

6. Baker DJ, Childs BG, Durik M a kol. Přirozeně se vyskytující p16(Ink4a)-pozitivní buňky zkracují zdravý život. Příroda. 2016;530(7589):184-189.

7. Al-Douahji M, Brugarolas J, Brown PA, Stehman-Breen CO (Kysličník uhelnatý), Alpers CE, Shankland SJ. Inhibitor cyklinkinázy p21WAF1/CIP1 je nutný pro glomerulární hypertrofii u experimentální diabetické nefropatie. Kidney Int. 1999;56(5):1691-1699.

8. Wolf G, Schanze A, Stahl RAK, Shankland SJ, Amann K. Myši p27(Kip1) s knockoutem jsou chráněny před diabetickou nefropatií: důkaz pro insuficienci haplotypu p27(Kip1). Kidney Int. 2005;68(4):1583-1589.

9. BharathLP, Agrawal M, McCambridge G, a kol. Metformin zvyšuje autofagii a normalizuje mitochondriální funkci, aby zmírnil zánět spojený se stárnutím.Cell Metab.2020;32(1):44-55.e6. 10. Ma Y, Qi M, An Y, a kol. Autofagie řídí vlastnosti mezenchymálních kmenových buněk a stárnutí během stárnutí kostí. Stárnoucí buňka. 2018;17(1):e12709.

11. Garcia-Prat L, Martinez-Vicente M, Perdiguero E, et al. Autofagie udržuje stopku tím, že brání stárnutí. Příroda. 2016;529(7584):37-42.

12. Hartleben B, Gödel M, Meyer-Schwesinger C, et al. Autofagie ovlivňuje vnímavost glomerulárních onemocnění a udržuje homeostázu podocytů u stárnoucích myší. J Clin Invest.2010;120(4):1084-1096.

13. Tagawa A, Yasuda M, Kume S, et al. Porucha autofagie podocytů zhoršuje proteinurii u diabetické nefropatie. Diabetes. 2016;65(3):755-767.

14. Motterlini R, Otterbein LE. Terapeutický potenciál oxidu uhelnatého. Nat Rev Drug Discov.2010;9(9):728-743.

15. Abe T, Yazawa K, Fujino M, et al. Vysokotlaký oxid uhelnatý chrání štěpy ledvin potkanů ​​před apoptózou a zánětem.Lab Invest.2017;97(4):468-477.

16. Kim DS, Song L, Wang J a kol. Oxid uhelnatý inhibuje apoptózu ostrůvků indukcí autofagie. Antioxidační redoxní signál. 2018;28(14):1309-1322.

17. Lee S, Lee SJ, Coronata AA, et al. Oxid uhelnatý poskytuje ochranu při sepsi posílením autofagie a fagocytózy závislé na beclin 1-.Antioxid Redox Signal.2014;20(3):432-442.

18. WS J, Li Y, Yang P, Huang Y, Lu S, Xu F. Románová rolekysličník uhelnatýve zlepšení neurologického výsledku po zástavě srdce u starých potkanů: zapojení indukce mitochondriální autofagie.JAm Heart AssoC.2019;8(9):e011851.

19. Zheng M, Chen Y, ParkJ a kol. CO (Kysličník uhelnatý) zlepšuje stárnutí endotelu indukované 5-fluorouracilem prostřednictvím aktivace SIRT1. Arch Biochem Biophys.2019;677:108185.

20. Jiang C, Zhang S, Li D, et al. Zhoršený tok feritinu ofágy vyvolaný dietou s vysokým obsahem tuků zprostředkovává jaterní inzulínovou rezistenci prostřednictvím stresu endoplazmatického retikula. Food Chem Toxicol.2020;140:111329.

21. Fernandez AF, Sebti S, Wei Y, et al. Narušení regulačního komplexu beclin 1-BCL2 autofagie podporuje dlouhověkost u myší. Příroda. 2018;558(7708):136-140.

22. Liu M, Liang K, Zhen J, et al. Deficit Sirt6 zhoršuje poškození podocytů a proteinurii prostřednictvím cílení signalizace Notch. Nat Commun.2017;8(1):413.

23. Sturmlechner I, Durik M, Sieben CJ, Baker DJ, van Deursen JM. Senescence buněk při stárnutí a onemocnění ledvin. Nat Rev Nephrol. 2017;13(2):77-89.

24. Bird TG, Müller M, Boulter L, et al. Inhibice TGF obnovuje regenerační odpověď při akutním poškození jater potlačením parakrinní stárnutí. Sci Transl Med.2018;10(454):eaan1230.

25. Stolz A,Ernst A,DikicI. Rozpoznávání nákladu a obchodování v selektivní autofagii. Nat Cell Biol.2014;16(6):495-501.

Poznámka:výše uvedené není úplný seznam referencí