Potenciální terapeutický přínos nízké dávky Cistanche u chronického únavového syndromu

Chronický únavový syndrom(ME/CFS) je vysilující multisystémový systémchronický stav neznámé etiologie classifified jako imunitní dysfunkcesyndrom a neurologická porucha. Objev široce vyjádřeného přechodného jevuPotenciál receptoru Melastatin 3 (TRPM3) jako v podstatě cílený nociceptorový kanálurčitými opioidními receptory a jejich implikace ve vápníku (Ca2 plus) závislý Natural KillerImunitní funkce (NK) buněk zvýšily možnost, že by to mohl být TRPM3farmakologicky zaměřené na léčbu charakteristických symptomů ME/CFS. naltrexonhydrochlorid (NTX) působí jako antagonista mu (m)-opioidní receptor tedy negujejeho inhibiční funkce na TRPM3. Na základě výhodhlášené pacienty na jejichpříznaky, nízká dávka NTX (LDN, 3.0–Zdá se, že léčba 5.0 mg/den) nabízí určité potenciální výhodynaznačuje, že jeho účinek může být zaměřen na patomechanismus ME/CFS. Jak to nepotvrzuje žádná literaturaúčinnostLDN pro pacienty s ME/CFSin vitro, tato studie zkoumá potenciální terapeutický účinek LDN u pacientů s ME/CFS. TRPM3Aktivita iontového kanálu byla měřena po modulaci pregnenolon sulfátem (PregS) a žádná inNK buňky u 9 pacientů s ME/CFS, kteří užívali LDN, a 9 odpovídajících věku a pohlavízdravé kontroly pomocí techniky celobuněčné patch-clamp. Uvádíme, že pacienti ME/CFSužívání LDN ​​obnovilo TRPM3-jako iontové proudy v NK buňkách. Malé iontové proudy s atypické TRPM3-jako vnější nápravabyly měřeny po aplikaci PregS, a.sTRPM3-agonista v NK buňkách od pacientů užívajících LDN. Navíc PregS-evokovaný iontovýproudy přes TRPM3 byly významněmodulován žádným vstupem, antagonistou TRPM3-,v NK buňkách od pacientů s ME/CFS užívajících LDN. Tato data podporují hypotézu, žeLDN může mít potenciál jako léčba ME/CFS charakterizací základního onemocnění regulační mechanismy léčby LDN zahrnující TRPM3 a opioidní receptory v NKbuňky. A konečně, tato studie může sloužit k opětovnému použití léčiv na trhu a také k podpořeschválení prospektivních randomizovaných klinických studií o úloze a dávce NTX vléčení pacientů s ME/CFS.

klíčová slova:cistanche s nízkou dávkou, přechodný receptorový potenciál melastatin 3, kalcium, opioidní receptor, myalgencefalomyelitida/chronický únavový syndrom, přirozené zabíječské buňky, celobuněčná patch-clamp elektrofyziologie

ÚVOD

myalgická encefalomyelitida/Chronický únavový syndrom(MĚ/CFS) je závažný multisystémový stav charakterizovanýpřetrvávající vysilující únava doprovázená řadouinvalidizující symptomy včetně pozátěžové nevolnosti, spánkudysfunkce, rozšířená bolest, stejně jako neurokognitivní,autonomní, kardiovaskulární, neuroendokrinní a imunitníprojevy (1, 2). Existuje různá závažnost ME/CFS(mírné až velmi těžké) (3), kde je to významnéa konzistentníimunitní dysfunkce a abnormality v přirozeném zabijákovi (NK)buněčné funkce byly hlášeny na základě závažnosti (4). Bezklinicky stanovený diagnostický test, diagnostika je komplexní anepřesný. Diagnóza v současnosti závisí na různých symptomechdefinice případů, známé jako kanadská kritéria konsensu(CCC, 2003) a International Case Criteria (2011), kterézabývat se klinickými charakteristikami ME/CFS (2, 5, 6). Theetiologie a specifickápatofyziologie stavu, kterýpostihuje 17 až 24 milionů lidí na celém světě (7), zůstávají neznámé.ME/CFS se potenciálně rozvíjí v důsledku poškození vNeselektivní kationt přechodného receptorového potenciálu (TRP).kanály způsobené buď genetickými nebo získanými faktory (8–13). Předchozí studie naznačovaly důležitost TRP melastatinu 3(TRPM3), široce exprimovaný vápník (Ca2 plus)-propustnýneselektivní kationtový kanál v patofyziologii ME/CFS(8–10). V poslední době nezávislé elektrofyziologické výzkumyprokázala ztrátu funkce iontového kanálu TRPM3 potéstimulace dvěma silnými TRPM3-agonisty, pregnenolonemsulfát (PregS) a nifedipin a inhibice selektivníma silný blokátor, deoxybezoin ononetin, v NK buňkách ztři různé kohorty pacientů s ME/CFS (11–13). TRPM3 byl již dříve identifikovánjako chemo- atermosenzitivní nociceptorový kanál v somatosenzorickémsystému a podílí se na detekci škodlivého tepla a zánětutepelná hyperalgezie a také přenos bolesti(14). Nedávná literatura naznačuje, že signální dráhyspojené s aktivací určitého spřaženého G-proteinureceptory (GPCR), nazývané opioidní receptory, mohou inhibovat TRPM3aktivita iontového kanálu přímou vazbou Gbgpodjednotkatrimerní G-proteiny do iontového kanálu (15–18). fyziologicky,opioidní receptory jsou aktivovány endogenními opioidními peptidymodulovat mechanismy bolesti a zánětucesty (19). Opioidní léky nebo opiáty produkují jak analgezii, tak inežádoucí vedlejší účinky připojením ke stejným GPCR (19). Důkazy ukazují, že opioidní receptory nejsou pouze exprimoványcentrálním nervovým systémem (CNS), ale jsou široce distribuoványna tkáních a orgánových systémech mimo CNS, jako je napřimunitní buňky (20). Aktivace leukocytárních opioidních receptorůvede k sekreci endogenních opioidních peptidů, kterénásledně aktivují neuronální opioidní receptory a zmírňujíbolest (21). Bylo také prokázáno, že opioidy působí imunosupresivněúčinky na vrozený a adaptivní imunitní systém (22). MĚ/Patologii CFS lze považovat za poruchu iontových kanálů respkanálopatie (8–13) a také imunitní dysfunkcesyndrom a neurologická porucha (23, 24). Je tedy životně důležitýprozkoumat regulační mechanismy, které jsou základemInterakce TRPM3-opioidního receptoru v NK buňkách z ME/CFSpacientům lépe porozumět patogenezi.Objev TRPM3 jako nociceptorového kanálupodstatně zacílena na určité opioidní receptory, stejně jako jejíimplikace v Ca2 plus-dependentní imunitní funkce NK buněknaznačuje, že iontový kanál TRPM3 může být farmakologickyzaměřené na léčbu ME/CFS. Naltrexon hydrochlorid (NTX) je akonkrétně dlouhotrvající opioidní antagonistazaměřené na mu-opioidreceptor (MOR) a v menší míře delta-opioidreceptory (dNEBO) (25, 26). Vazba NTX zapnutamNEBO negujeinhibiční funkce těchto opioidních receptorů na TRPM3 (15, 17, 18, 26). Již dříve jsme o tom informovaliin vitroléčbaNK buněk od pacientů s ME/CFS s NTX po dobu 24 hodin, obnovíaktivita iontového kanálu TRPM3 (13). Obnova iontu TRPM3aktivita kanálu zase obnovila odpovídající Ca2 plussignalizace asama o soběNK buňky' aktivační a efektorové funkce(13). NTX se běžně používá při léčbě opioidů azávislost na alkoholu v dávce 50-100 mg/den (25). Na vysokédávkování, předpokládá se, že NTX blokuje euforické pocity beta-endorfinůkteré jsou zapojeny do přirozených okruhů odměn aproto může udržet závislost (27). Nízká dávka (3.0–5.0 mg/den,zdá se, že nízké dávky NTX, LDN) mají opačný účinek,zvýšení účinku endorfinů ke snížení bolesti a posílenípotěšení (28). Tomu se věřímají význam u nemocíjako ME/CFS, kde je nedostatečnásekrece endogenníchopioidní peptidy ovlivňují imunitní odpověď nebo kontrolu bolesti (29, 30), nebo uvolnění prozánětlivýchcytokiny (25, 31). Nedávnýstudie uvedla, že LDN je bezpečná a účinná pro zmírnění ME/CFSsymptomy retrospektivním vyšetřením klinického pacientazáznamy 218 pacientů s ME/CFS, kterým byla podána LDN (27). I kdybynové důkazy naznačují, že LDN může zlepšit každodenní funkce akvalita života u pacientů s ME/CFS, dálein vitrovyšetřování jepotřebné k pochopení základních regulačních mechanismůzapojením TRPM3 a opioidních receptorů v NK buňkách na pomocpochopit patomechanismus ME/CFS a identifikovatterapeutické cíle.Tato studie zkoumala potenciální terapeutický účinekLDN u pacientů s ME/CFS obnovením iontového kanálu TRPM3funkce v NK buňkách pomocí celobuněčných technik patch-clamp.Naše výsledky ukazují, že pacienti s ME/CFS užívající LDN ​​majíobnovil TRPM3-jako iontové proudy v NK buňkách. ObnovaFunkce TRPM3 je nutná k podpoře Ca2 pluspřestavba signáluv NK buňkách asama o soběAktivace NK buněk a efektorové funkce.Toto je prvnístudie, aby se zjistila účinnostLDN pro ME/CFSpacientůin vitro, tedy potvrzujícíjeho potenciál pro použití jako aléčbu nemoci.

Kliknutím sem se dozvíte více informací o funkci proti únavě cistanche

MATERIÁLY A METODYNábor účastníků

Devět pacientů s ME/CFS a devět zdravých ve stejném věku a pohlavíkontroly (HC) byly získány pomocí Národního centra proPacient s neuroimunologií a vznikajícími nemocemi (NCNED).databáze mezi zářím 2019 a únorem 2021.Účastníci byli ve věku od 18 do 60 let. Všechny ME/CFSpacienti již dříve obdrželi potvrzenolékařská diagnózaa byly prověřeny pomocí komplexního online dotazníkuv souladu s Centrem pro kontrolu nemocí aDefinice případů prevence (CDC), CCC a ICC. Všech devět JÁ/Pacienti s CFS byli definovánize strany CCC. Všech devět pacientů s ME/CFSbyli rekrutováni NCNED, protože dříve zahájili LDNošetření (3.0–5.0 mg/den) po dobu alespoň 4 týdnů jako součást jejichplán péče po předepsání jejich praktickým lékařem.HC nehlásil žádný výskyt únavy a byl v dobrém zdravotním stavubez průkazu nemoci. Účastníci z toho byli vyloučenistudie, pokud byly těhotné nebo kojící, nebo hlášeny apředchozí anamnéza kouření, zneužívání alkoholu nebo chronického onemocnění(například autoimunitní onemocnění, kardiovaskulární onemocnění,diabetes, metabolický syndrom, onemocnění štítné žlázy, malignity,nespavost, chronická únava a primární psychické poruchy)nebo byli obézní (BMIVětší než nebo rovno30). Žádný z účastníků neuvedl užívání opioidůnebo jakékoli jiné léky proti bolesti v předchozích 3 měsících, stejně jakofarmakologické látky, které přímo nebo nepřímo ovlivňují TRPM3 nebo Ca2 plussignalizace. Účastníkům bylo poskytnutomožnost ukončit jakýkoli konfliktléky minimálně 14dnů před darováním krve se souhlasem svého lékaře.Všichni účastníci vyplnili online dotazníksociodemografické pozadí, anamnéza, léky ahistorie symptomů u pacientů s ME/CFS (stůl 1). Položka 36-krátkodobý zdravotní průzkum (SF-36) a Světová zdravotnická organizace(WHO) Disability Assessment Schedule (DAS) byl zvyklýurčit úroveň postižení a kvalitu života (Tabulka 2) (32, 33). Nakonec byli pacienti ME/CFS požádáni, aby sami uvedli závažnostpříznaky před a po užití LDN ​​(Tabulka 3). Tentovyšetřování bylo schváleno GriffithemUniverzitní člověkEtická komise pro výzkum (GU2019/1005) a Gold CoastEtická komise pro výzkum člověka ve fakultní nemocnici(HREC/2019/QGC/56469).

Mononukleární buňka periferní krveIzolace a izolace přirozených zabíječských buněk

Celkem bylo odebráno 85 ml plné krvezkumavky s kyselinou ethylendiamintetraoctovou (EDTA).přesvenepunkcekvalifikovanýmflebotoma od každého účastníka mezi 8:30 hodinoua 10:30 na sběrných místech včetně GriffithaUniverzita,Royal Brisbane a ženy's Hospital, Robina Hospital, SunshineCoast University Hospital, Calvary John James Hospital,

Royal Melbourne Hospital, Austrálie. Rutinní úplná analýza krvebyla provedena do čtyř hodin od odběru červených krvinekpočet, počet bílých krvinek a počet granulocytů pro každý z nichúčastník na Gold Cost University Hospital nebo Royal MelbourneNemocnice, Austrálie.Vzorky byly poskytnuty do laboratoře a deidentifikacepoužívatunikátní kód nezávislým sběratelem krve. Periferní krevmononukleární buňky (PBMC) byly izolovány z 80 ml celkukrev centrifugací na médiu s hustotním gradientem (FicollPaque Premium; GE Healthcare, Uppsala, Švédsko) jako dřívepopsané (34, 35). PBMC byly obarveny trypanovou modří(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ke stanovení počtu buněk aživotaschopnost buněk. PBMC byly upraveny na afifikonečná koncentrace5x107 buněk/ml pro izolaci NK buněk.NK buňky byly izolovány imunomagnetickou selekcí za použití anEasySep Negative Human NK Cell Isolation Kit (Stem CellTechnologies, Vancouver, BC, Kanada). Purifikace NK buněk byla stanovena pomocíflflow cytometrie. NK buňky byly inkuboványpo dobu 20 minut při teplotě místnosti v přítomnosti CD56FITC ({{0}},25µg/5µl) a CD3 PE Cy7 (0,25µg/20µl) monoklonálníprotilátky (BD Bioscience, San Jose, CA, USA) jako dřívepopsané (10). 7-amino-aktinomycin (7-AAD) (2,5 µl/test) (BDBioscience, San Jose, CA, USA) byl použit ke stanovení buněkživotaschopnost. Buňky byly promyty a resuspendovány ve 200 ulml zbarvicí pufr (BD Bioscience, New Jersey, USA) a získanýv 10,000 událostí pomocí LSRFortessa X-20 (BD Biosciences,San Diego, CA, USA). Pomocí dopředného a bočního rozptylupopulace lymfocytů byla gatována při získávání vzorku.Poté byla identifikována populace NK buněkjako CD3− CD56Plusbuňky.

Záznam elektrofyziologie celých buněk

Elektrofyziologické záznamy byly prováděny s borosilikátemskleněné kapilární elektrody o vnějším průměru 1,5 mm a anvnitřní průměr 0.86 mm (Harvard Apparatus, Holliston, MA,USA). Odpor pipety při plněnís roztokem pipety byl 8-12 MW. Pipety byly namontovány na CV203BU head-stage(Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) připojené 3-cestouhrubý manipulátor a mikromanipulátor (Narishige, Tokio,Japonsko). Elektrické signály byly zesílenya zaznamenány pomocí anZesilovač Axopatch 200Ba software PClamp 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA). Data byla filtrovánapři 5 kHz avzorkované digitálně při 10 kHzpřesanalog Digidata 1440Adigitální převodník (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Theprotokol napěťové rampy byl krokem od udržovacího potenciálu plus 10mV až−90 mV, po které následuje 0,1 s náběh na plus 110 mV, přednávrat k plus 10 mV (opakuje se každých 10 s). Spojení kapalinypotenciál mezi pipetou a roztoky lázně (−10 mV).opraveno. Složka unikajícího proudu nebyla odečtenazaznamenané proudy. Elektroda byla naplněnas intracelulárnímroztok pipety obsahující 30 mM CsCl, 2 mM MgCl2110 mMKyselina L-asparagová, 1 mM EGTA, 10 mM HEPES, 4 mM ATP,0,1 mM GTP, pH upravené na 7,2 pomocí CsOH a osmolalita

290 mOsm/l s D-mannitolem. Roztok pipety byl zfiltrován pomocí 0.22mm membránový filtr(Sigma-Aldrich, St. Louise, MO,USA), rozděleny na alikvoty a skladovány v−20 stupňů. Roztok do koupeleobsažené: 130 mM NaCl, 10 mM CsCl, 1 mM MgCl21,5 mMCaCl22H2O, 10 mM HEPES, pH upraveno na 7,4 pomocí NaOH aosmolalita 300 mOsm/L s D-glukózou. Všechna činidla bylazakoupeno od Sigma-Aldrich, kromě ATP a GTP, kterébyly zakoupeny od Sapphire Bioscience. Iontový TRPM3proudy na NK buňkách byly stimulovány přidáním 100mM PregS(Tocris Bioscience, Bristol, UK) do roztoku lázně, zatímcoPregS-indukované TRPM3 proudy byly blokovány přidáním 10mM ononetin (Tocris Bioscience, Bristol, Velká Británie). Pro každého účastníka,Bylo pořízeno 10 různých nahrávek. Proto N znamená početúčastníci v každé skupině (pacienti ME/CFS nebo HC) a n, kpočet čtení nebo velikost vzorku. Všechna měření bylaprováděné při pokojové teplotě. Autoři odstranilimožnost zapojení chloridového proudu do TRPM3hodnocení pomocí kyseliny L-asparagové v intracelulární pipetěřešení. Vyloučeny byly také články, které mají nestabilní proudyz analýzy.Statistická analýzaByly identifikovány populace lymfocytůod kolegupomocí cytometrievpřed a po stranách bodové grafy. Čistota CD3- CD56Plusbyly stanoveny lymfocyty. Cytometrická data byla exportována zFacsDiva v8.1 a analyzovány pomocí SPSS v24 (IBM Corp, Version24, Armonk, NY, USA) a GraphPad Prism v7 (GraphPadSoftware Inc., verze 7, La Jolla, CA, USA). Elektrofyziologickédata byla analyzována pomocí softwaru pCLAMP 10.7 (MolecularDevices, Sunnyvale, CA, USA). Origin 2018 (OriginLabCorporation, Northampton, MA, USA) a GraphPad Prismv7 (GraphPad Software Inc., verze 7, La Jolla, CA, USA).používá se pro statistickou analýzu a prezentaci dat. Vizuální aK určení normality byly použity výpočetní metodynezávislá data.

Konkrétně grafy histogramu aByly použity Shapiro-Wilkův test normality, šikmost a špičatostk určení distribuce dat a normality. V závislostina normalitu bylo provedeno statistické srovnání pomocínezávislý neparametrický Mann-Whitney U test, popřnezávislý parametrický t-test. Byl použit Fishersův exaktní testurčit citlivost NK buněk na ononetin. Význambylo nastavenou p<0.05 and="" the="" data="" are="" presented="" as="" mean="" ±="" sem="" unless="">jinak uvedeno.VÝSLEDEKCharakteristika účastníka aKrevní parametryBylo zahrnuto 18 věkově a pohlavně shodných účastníkůtoto vyšetřování. Demografické údaje pro pacienty jsoushrnuto vstůl 1. Nebylo tam žádné významnérozdíl vvěk nebo pohlaví mezi pacienty s ME/CFS a HC. SF-36 aKe zjištění zdraví účastníků byly použity průzkumy WHODASsouvisející kvalita života (Tabulka 2) (36, 37). 

Jak se dalo očekávat, došlo k významnémurozdíl mezi skóre SF-36 a WHODASME/CFS pacienti a HC. Navíc plný krevní obrazparametry byly měřeny u každého zdravého účastníka aME/CFS pacienti (Tabulka 2). Zatímco jsme hlásili významný rozdíl eozinofilů mezi zdravými účastníky a ME/U pacientů s CFS byly všechny výsledky v rámci specifikovaných hodnotodkazrozsahy poskytované Univerzitní nemocnicí Gold CoastPatologické oddělení, laboratoř akreditovaná NATA. Žádné významné rozdíly byly hlášeny v jiných parametrech. Konečně ME/CFSpacienti hlásili zlepšení poruchy myšlení,koncentrace a kognitivní přetížení i jiné imunpříznaky poruch (bolest v krku, zvětšená nebo citlivá lymfauzliny a náchylnost k nachlazení/chřipce) po ošetření sLDN (Tabulka 3), jak bylo popsáno dříve (27, 38). 

Natural Killer Cell Purity

NK buňkačistota (CD3- /CD56Plus) byl 92,42 procent ± 1,849 pro HC a82,20 procent ± 9,409 pro pacienty s ME/CFS užívající LDN, jak bylo stanovenopodleflflow cytometrie (Obrázek 1A). Nebylo tam žádné významné rozdíl v čistotě NK buněk u pacientů s ME/CFS užívajících LDNve srovnání s HC (Obrázek 1B).

Aktivita iontového kanálu TRPM3 poStimulace pregnenolonem v NK buňkáchOd pacientů ME/CFS užívajících LDNVe srovnání s NK buňkami z HC

Aktivita iontového kanálu TRPM3 byla zaznamenána v izolovaném lidském NKbuňky od pacientů s ME/CFS užívajících LDN (3.0–5.0 mg/den) ave srovnání s izolovanými lidskými NK buňkami z věkově a pohlaví odpovídajícíchHC, za použití celobuněčné techniky patch-clamp.Funkce endogenního iontového kanálu TRPM3 byla rychlá areverzibilně aktivovaný aplikací 100mSpolečnost M PregS, spolneuronální steroid. Stimulace s měřením povoleným PregSmalého vně usměrňujícího proudu pod napěťovou svorkoupodmínky a pozorování typického tvaru proudového napětí TRPM3vztah (I–V) (Obrázek 2). my tedy,naměřili malý iontový proud s typickým3-TRPMvnější nápravav NK buňkách izolovaných z HC popřidání PregS (Obrázky 2A, B). Zajímavé je, že PregSaplikace v NK buňkách od pacientů s ME/CFS užívajících LDNnapodoboval PregS-indukovaný nárůst NK buněk z HC(Obrázky 2C, D). Stimulace PregS tedy vyvolala zvýšenínavenek napravenýchamplitudy proudu v NK buňkách zME/CFS pacienti užívající LDN ​​na stejnou úroveň jako NK buňkyHC (Obrázek 2E). Navíc proudy vyvolané PregS představují atypickýI–V z TRPM3 (Obrázek 2D). Údaje naznačují, že ME/Pacienti s CFS užívající LDN ​​již nemají poruchuAktivita kanálu TRPM3, jak bylo hlášeno dříve (11–13), aproto může mít LDN potenciální terapeutický přínospropatologie.

Modulace PregS-evokovaných proudůS ononetinem v NK buňkách z ME/CFSPacienti užívající LDN ​​ve srovnání s NKBuňky z HC

PregS-indukovaný Ca2 plus- příliva iontové proudy přes TRPM3iontové kanály mohou být účinně inhibovány přírodní sloučeninou,deoxybezoin ononetin (39). Proto pro potvrzeníže TRPM3aktivita se podílí na PregS-evokovaných iontových proudech v NK buňkách, mydále použitý 10mMononetin pro modulaci iontového kanálu TRPM3činnost (Obrázek 3). Jak bylo uvedeno dříve (11–13), iontovéproudy vyvolané aplikací PregS byly účinnéinhibována současnou aplikací žádné v izolovanéNK buňky z HC (Obrázky 3A–C). Navíc,I–V zproudy citlivé na ononetin byly navenek usměrněnya typicképro TRPM3 (Obrázek 3B). Zajímavé je, že vyvolaly iontové proudyaplikací PregS byly také účinně inhiboványsoučasná aplikace 10mM ononetin v izolované NKbuňky od pacientů s ME/CFS užívajících LDN (Figurky 3D–G). Iontový proud3-závislý na TRPM byl již dřívehlášeno, že je rezistentní na ononetin v izolovaných NK buňkách zME/CFS pacienti (11–13). Nicméně NK buňky z ME/CFSpacienti užívající LDN ​​jsou citliví na ononetin ve stejném rozmezíjako NK buňky z HC (Obrázek 3G). Navíc,I–V ononetinucitlivé proudy byly navenek usměrněnya typické pro TRPM3

(Obrázek 3E). Konečně,Obrázek 3Hhlásí aktuální TRPM3amplitudy po stimulaci PregS a modulaci ononetinuv rámci HC a ME/CFS s LDN skupinami a pouzebyly zahrnuty záznamy citlivé na ononetin. Významný pokles amplitudy proudu TRPM3 byl hlášen pomodulace ononetinem u obou pacientů užívajících ME/CFSskupiny LDN (p=0.0336) a HC (p=0.0205). Tento graf potvrzujeIontový kanál TRPM3 funguje podobně v ME/CFSpacientů užívajících LDN ve srovnání s HC jako stejný proudjsou hlášeny rozsahy amplitud (Obrázek 3H). Dohromady tytovýsledky potvrzujíže ME/CFS pacienti užívající LDN ​​nemají anzhoršená aktivita iontového kanálu TRPM3, o které se uvádí, že jecharakteristika onemocnění (11–13). Na závěr léčbas LDN umožňuje obnovit funkci iontového kanálu TRPM3 v ME/pacientů s CFS a má proto potenciální terapeutický účinek.

DISKUSE

V této studii jsme použili celobuněčnou náplastovou svorkutechnika pro měření endogenního iontového kanálu TRPM3funkce v NK buňkách od pacientů s ME/CFS užívajících LDN. Myhlásit za prvníčas, který mají pacienti s ME/CFS užívající LDNobnovil TRPM3-jako iontové proudy v NK buňkách. Opravdu,aplikace PregS umožnila měření malých iontůproudy s typickým TRPM3-jako vnější usměrněnív NKbuňky od pacientů užívajících LDN. Navíc PregS-evokovaný iontovýproudy přes TRPM3 byly významněmodulovánononetin v NK buňkách od pacientů s ME/CFS užívajících LDN jakopodobně popsáno v HC. Tyto výsledky odrážejínaše předchozí zjištěníhlášení obnovení funkce iontového kanálu TRPM3v NK buňkách od pacientů s ME/CFS poin vitroléčba sNTX (13). Tyto výsledky jsou také v souladu s našimi předchozímivyšetřování naznačující, že ME/CFS lze považovat za akanálopatie vyvolaná ztrátou funkce TRPM3 acharakterizovaný poklesem PregS-indukovaných iontových proudůstejně jako rezistenci na ononetin v NK buňkách z ME/CFSpacienti (8–13). Může za to ztráta funkce TRPM3pro zhoršené Ca2 plussignalizace a Ca2 plus- zprostředkované buněčné funkce,včetně imunitních funkcí NK buněk (11–13). Naše současná nová studie je první in vitrostudie potvrzující účinnosta terapeutický přínosLDN pro pacienty s ME/CFScharakterizací základních regulačních mechanismů LDNléčba zahrnující TRPM3 a interakci opioidního receptoruv NK buňkách. LDN bylo dříve uváděno jako prospěšnéproléčba různých onemocnění, jako je roztroušená skleróza,Crohn'onemocnění, fibromyalgie, rakovina, zánětlivéstřevonemoc a ME/CFS (40–44). Konkrétněji, vpředběžná studie provedená Polo et al. na bezpečnost aúčinnost léčby LDN, 73,9 procenta pacientů s ME/CFShlášena pozitivní odpověď na léčbu (27). Většina pacientůzaznamenali zlepšenou bdělost/bdělost a zlepšenou fyzickou kondicia kognitivní výkon. Někteří pacienti také udávali menší bolesta horečka, což dokazuje, že LDN může vykazovat určitý potenciálzmírňuje široké spektrum symptomů ME/CFS (27). Podobně,Bolton a spol. popsali tři kazuistiky sestavené ME/CFSpacientů užívajících LDN a hlásili rozsah odpovědí,od změny života ke snížení pouze některých příznaků (38).

Na základě výhodhlášené pacienty o jejich příznacích,Léčba LDN může být použita jako potenciální léčba a můžezaměřit se na patomechanismus ME/CFS.Patogeneze ME/CFS je neznámá, ale abnormální iontkanály a konkrétnějimají narušenou funkci TRPM3nedávno se objevil jako charakteristický rys nemoci (8–13). Již dříve jsme hlásili ztrátu funkce TRPM3 pomodulace pomocí silných TRPM3-agonistů a antagonistů u NKbuňky ze tří různých kohort pacientů s ME/CFS (11–13). TRPM3 byl popsán jako centrální aktér Ca2 plus- závislých signálních drah, jak v excitabilních, tak v neexcitabilníchbuňky, kde Ca2 plussignály řídí různé buňkyprocesy (45). Papanikolaou et alTRPM3 jako andůležitou součástí'Ca2 plussada nástrojů' který podporuje provozování obchoduCa2 plusvstup a udržitelnost Ca2 plussignalizace vGlie bílé hmoty CNS (46). Podobně se ukázalo, že TRPM3 vedeke zvýšení Ca2 plus přílivv beta buňkách slinivky břišní, což má za následeknásledné uvolnění inzulínu (47). Každý typ buňky představuje unikátsignalizační fenotyp schopný dodávat přísně regulovanéčasoprostorový Ca2 plussignály pro modulaci jeho konkrétní funkce(48). V důsledku toho jakékoli jemné dysregulace Ca2 plussignály mohouvelmi ovlivňují buněčné funkce a mají za následek onemocnění (48, 49). NK buňky také vyžadují Ca2 pluspro efektivnístimulace afunkce včetně cytotoxicity NK buněk (50–53). KompromitovanýCytotoxická funkce NK buněk je dobře zdokumentovaná a konzistentnífunkce ME/CFS (54). Proto může dojít ke ztrátě funkce TRPM3přispívají k symptomatologii ME/CFS ovlivněnímCa2 plussignalizace a Ca2 plus-zprostředkované buněčné funkce, včetně NKimunitní funkce buněk.Dobře charakterizovaná funkce TRPM3 v literatuře je jehoroli při detekci škodlivého tepla (akutní bolesti) i zánětlivéhohyperalgezie (akutní a chronická bolest) (14). Jsou syntetizovány endogenní opioidyin vivomodulovatfyziologické analgetické reakce při zánětechaneuropatická bolest. Endogenní a exogenní opioidy se vážou naOR, nacházející se na periferii, u presynaptických a postsynaptickýchmísta v dorzálním rohu míšním a v mozkovém kmeni,thalamus a kůra v tom, co tvoří vzestupnou bolestpřevodovka (55). Nedávné studie to uvedlyopioidní receptory jsou také exprimovány imunitními buňkamiopioidní analgezie zprostředkovaná imunitními buňkami produkcí endogenníchopioidní peptidy, které zahrnují Gai/o–Gbg–fosfolipáza C(PLC)–inositol 1,4,5-trisfosfátový receptor (IP3R)– intracelulárníCa2 pluscesta. Uvolněné opioidní peptidy se následně aktivujíperiferní neuronální opioidní receptory a zmírňují bolest (21). Bylo také prokázáno, že opioidy přímo modulují funkcelymfocyty a další buňky zapojené do obrany hostitele aimunita s imunosupresivními účinky (56, 57). Konkrétnějiaktivace OR opioidními alkaloidy apeptidy, jako je morfin a endogenní peptidy,včetně beta-endorfinu a dynorfinových peptidů, což vede k asnížený počet makrofágů, snížený leukocytproliferace a migrace do zánětlivýchwebů, kleslfagocytotická aktivita makrofágů, snížená chemotaxe aprodukce superoxidu neutrofily a makrofágy,zrychlená apoptóza makrofágů, oslabená mikrobiochrana a snížená adheze leukocytů a endotelubuňky (58). Další negativní vlivy byly popsány také vvztah k mastocytům, dendritickým buňkám a NK buňkám s asnížená cytotoxicita NK buněk a produkce cytokinů (22, 56, 59, 60). Imunitní buňky, glie a neurony proto tvoříintegrovaná síť, která koordinuje imunitní reakce amoduluje excitabilitu cest bolesti (61). Cílení naopioidní receptory na imunitních buňkách mohou vést ke změnám vimunitní reakce na podporu rozlišení inflflstřelivo jakostejně jako modulace bolesti u pacientů s ME/CFS.Zajímavé je, že molekuly, které se vážou a aktivují opioidreceptory výrazněsnížit bolest závislou na TRPM3-. vreakce na akutní aktivaci agonisty, opioidními receptorypár do Gi/o proteiny, které disociují na Gai/o a Gbgpodjednotky k interakci s intracelulárními efektory (62). TRPM3aktivita je silně inhibována aktivací µOR přespřímá interakce s Gbgjako TRPM3-závislý Ca2 plusvstupy jsou silně a reverzibilně inhibovány, když buňmembrána jeflflpropláchnutý čištěným Gbg(15–18). NTX je dlouhotrvajícíspecificky opioidního antagonistybrzdícímOR, tedynegující inhibiční funkci tohoto opioidního receptoru naTRPM3 (22, 26). V naší předchozí studii jsme to uvedliin vitroošetření NTX obnovuje iontový kanál TRPM3aktivita v NK buňkách izolovaných z ME/CFS (13). Podobně vv současné studii ano, NK buňky izolované od pacientů užívajících LDNnevykazují žádnou zhoršenou aktivitu iontového kanálu TRPM3. LDNZdá se, že léčba u pacientů s ME/CFS obnovuje iont TRPM3funkce kanálu v NK buňkách, což vede k Ca2 plussignálypřestavba, aby přispěla k obnovení integritya stabilita specifické pro NK buňkysignalizační systémy (10–13). Je zajímavé, že bylo hlášeno, že antagonistický účinekNTX zapnutomOR také narušuje negativní zpětnou vazbu regulace nadNEBO, čímž se zvýšídfunkce NEBO.

VylepšenídNEBOaktivita podporuje cytotoxicitu NK buněk v reakci na beta-endorfiny in vitrona splenocytech krys, což naznačuje potenciálpoužití NTX při léčbě imunitní nedostatečnosti (63). Mechanismus, který je základem LDN's účinnostína únavu,Crohn'onemocnění, fibromyalgiea tedy roztroušená skleróza,zahrnuje intermitentní blokádu opioidních receptorů následovanouCa2 plus závislá produkcea upregulace endogenníchopioidy. Ludwig a kol. uvedl, že sérum [Met5 ]-enkefalinhladiny byly nižší u lidí s roztroušenou sklerózou ve srovnání su pacientů s roztroušenou sklerózou a LDN obnovily jejich hladiny.Podobně u experimentálních myší s autoimunitní encefalomyelitidou[Se setkal5 Hladiny ]-enkefalinu byly před objevením sníženyklinického onemocnění a byly obnoveny léčbou LDN(28). Proto se zdá, že léčba LDN vede kzesílení analgetických účinků a může být relevantní přiME/CFS, kde je nedostatečnáovlivňuje sekreci opioidních peptidůimunitní odpověď nebo kontrola bolesti (29, 30), nebo uvolnění prozánětlivýchcytokiny (25, 31). Opravdu, snížené beta-endorfinykoncentrace byla hlášena v ME/CFSpacienti trpící dysregulací termoregulacereakce a generalizovaná těžká nebo dlouhotrvající bolest (64). Na závěr, tato studie pro prvníčas hodnocen a identifikovánvliv LDN na funkci iontového kanálu TRPM3 vNK buňky u pacientů s ME/CFS. Tato nová studie uvádízákladní obnovení TRPM3-kanálu opioidního receptoruinterakce v NK buňkách od pacientů s ME/CFS užívajících LDN.Navíc široká distribuce iontových kanálů TRPM3 vtělo naznačuje, že k tomu může přispět jejich narušená funkcepříznaky a symptomy ME/CFS, a tedy léčbaLDN může mít terapeutickou roli. Nakonec k tomu slouží tato studiepodporovat plánování a schvalování potenciálních randomizovanýchklinické studie o úloze a dávce NTX v léčbě ME/pacientů s CFS.