Poškození podocytů interakcí mezi Tlr8 a jeho endogenním ligandem MiR-21 v ucpané a jeho kolaterální ledvině

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

cistanche erektilní dysfunkce související s ledvinami

Zatímco chronické onemocnění ledvin převládá u dospělých, obstrukční nefropatie (ON) byla hlášena u mladých i starých pacientů. U ON byly široce zkoumány tubulointersticiální léze (TIL), ale glomerulární léze (GL) byly do značné míry opomíjeny. Zde ukazujeme nový mechanismus, který je základem vývoje GL v ON u mladých a starých myší. TIL se vyvíjejí dříve než GL v důsledku infiltrace zánětlivých buněk v tubulointersticiu, ale GL se vyvíjejí po aktivaci Toll-like receptoru 8 (Tlr8), i když nepřítomnost zánětlivých buněk infiltrujících glomerulus. Proteiny TLR8 a interleukin 1 beta (IL1b) se kolokalizují s redukujícími markery funkce podocytů (PFM), což ukazuje na aktivaci signalizace TLR8 v poškozených podocytech. Kromě toho, glomerulární a sérové ​​hladiny miR-21, endogenního ligandu pro Tlr8, byly vyšší u myšího modelu ON než u kontrolní kontroly. Glomerulární exprese Tlr8 pozitivně koreluje s miR-21 a downstream cytokiny Il1b a Il6 a negativně koreluje s PFM (Nphs1 a Synpo). Ukazujeme také kolokalizaci proteinů TLR8 a IL1b s redukcí PFM v obstrukcích avedlejšíledvinymladých a starých myší. Kromě toho výsledky studie in vitro odhalily vyšší expresi Tlr8 a jeho downstream cytokinů v glomerulech z obstrukceledvinypo léčbě miR- 21 mimikem než u kontroly. Závěrem lze říci, že nadměrná exprese Tlr8 může sloužit jako pravděpodobný mechanismus, který je základem vývoje GL u ON prostřednictvím poškození podocytů.

Klíčová slova: chronické onemocnění ledvin,obstrukční nefropatie, podocyt, TLR8, obstrukční a kolaterální ledvina

ÚVOD

Chronické onemocnění ledvin (CKD), hlavní problém veřejného zdraví, převládá u 8 až 13 procent celkové populace (1). Je častý u starších lidí v důsledku stárnutí společnosti. Obstrukční nefropatie (ON) je velmi zajímavá pro klinické lékaře, protože byla hlášena u pacientů z různých věkových skupin. ON je léčitelná a reverzibilní, na rozdíl od jiných CKD (2, 3). U dětí se vyskytuje u jednoho z 1500 mladých jedinců a její prevalence je ve vyspělých zemích 1 až 5 procent (4, 5). U dospělých se prevalence ON pohybuje od 5 z 1000 do 5 z 10000 jedinců. Kromě toho je prevalence chronické unilaterální ON přibližně 0,5 procenta, zatímco prevalence akutní unilaterální a chronické bilaterální ON je přibližně 0,1 procenta [4–7].

ON může vést k akutnímu poškození ledvin nebo CKD, které zahrnuje progresivní snížení renálních funkcí a změny renálních struktur trvající déle než 3 měsíce [8, 9]. Unilaterální ureterální obstrukce (UUO) je široce používaná strategie pro studium chronické ON. ON v ledvině UUO je charakterizována hypertrofií, hydronefrózou, náborem zánětlivých buněk v intersticiální oblasti, odumřením tubulárních buněk z hypoxie a ukládáním kolagenu v tubulointersticiu s následným rozvojem tubulointersticiální fibrózy (TF) (10).

Sondová výživa je důležitým znakem konečného onemocnění ledvin a hlavní determinantou progresivního poškození ledvin (11). TF byla rozsáhle zkoumána na ON modelech, ale údaje týkající se glomerulárního poškození, zejména abnormalit hemato-močové bariéry (BUB), jsou vzácné (8, 9, 12). Dále studie zkoumaly tubulointersticiální léze (TIL) v kolaterální ledvině u unilaterální ON, ale glomerulární léze (GL) byly do značné míry opomíjeny [12]. Několik zpráv odhalilo zapojení peritubulárních kapilár do progrese TIL u experimentální ON (13, 14). Glomerulus a glomerulární kapilára však drénují do tubulárních segmentů nefronu a peritubulárních kapilár. Proto se domníváme, že glomerulonefritida může také ovlivnit tubulointersticium. Naše předchozí studie zdůraznily příspěvek poškození glomerulárních vnitřních buněk, zejména podocytů, ke GL a následnému rozvoji TIL u myšího modelu s autoimunitním onemocněním v důsledku nadměrné exprese různých Toll-like receptorů (TLR) (15–18).

Glomerulární kapilární endotel a podocyty jsou důležitými vrátky zahrnujícími BUB. Mezi těmito dvěma epitely jsou podocyty nepřetržitě vystaveny nebezpečným signálům, včetně ligandů TLR, jako jsou molekulární vzory spojené s nebezpečím (DAMP) nebo molekulární vzory spojené s patogeny (PAMP), a to díky jejich jedinečné lokalizaci v glomerulech (15). Proto se předpokládá, že interakce mezi TLR v podocytech a jejich endogenními ligandy přispívá k poškození podocytů v neinfekčních podmínkách. V této studii jsme se zaměřili na vývoj GL v obstrukčních i kolaterálních ledvinách mladých a starých myší, protože ON se často vyskytuje u mladých i starších lidí. Objasnili jsme, že GL byla vyvinuta v ON v důsledku poškození podocytů prostřednictvím nadměrné exprese Tlr8 v podocytech z obstrukčních i kolaterálních ledvin mladých a starých myší.

MATERIÁLY A METODY

Etické prohlášení a experimentální ustájení zvířat Všechny experimenty s laboratorními zvířaty byly schváleny Institutional Animal Care and Use Committee Fakulty veterinárního lékařství Univerzity Hokkaido (číslo schválení 16- 0124). Autoři se řídili schválenou příručkou pro péči a používání laboratorních zvířat Univerzity Hokkaido, Fakulty veterinárního lékařství (schválenou Asociací pro hodnocení a akreditaci Laboratory Animal Care International). Šest týdnů staré myši C57BL/6N byly zakoupeny od Japan SLC Inc. (Hamamatsu, Japonsko) a udržovány ve specifických podmínkách bez patogenů v prostředí 1:1 světlo-tma. Experimentálním zvířatům byla poskytnuta ad libitní potrava a pitná voda.

Experimentální design Použili jsme mladé (9 týdnů) i staré (12 měsíců) myši. Myši z každé věkové skupiny (n=4) byly podrobeny buď falešné operaci (kontrolní skupina) nebo UUO (2, 7, 11 a 21 dnů), aby se vytvořila ledvina modelu ON, jak je popsáno v naší předchozí studii (13).

Příprava vzorku Myši byly hluboce anestetizovány směsí anestetických činidel, jak bylo popsáno dříve (16) a usmrceny cervikální dislokací. Vzorky krve byly odebírány přes femorální tepnu pro analýzu sérových markerů. UUO i kolaterální ledviny byly odebrány a nakrájeny na tenké plátky. Řezy ledvin byly fixovány 10 procenty neutrálního pufrového formalinu (NBF), 4 procenty paraformaldehydu (PFA) a 2,5 procenty glutaraldehydu (GTA) pro histopatologické, imunohistochemické a elektronové mikroskopické studie, v daném pořadí.

Imunohistochemie a imunofluorescence NBF-fixované parafínové bloky byly nařezány na tloušťku 2 mm a obarveny kyselinou jodistou Schiff-hematoxylinem (PAS-H) pro vyšetření renální histopatologie. Imunodetekce buněčných markerů byla provedena tak, jak bylo uvedeno dříve (16) pro B buňky (B220), T buňky (CD3), kapilární endotel (CD31), IL1b, makrofágy (Ibal), podocyty (podocin a synaptopodin) a TLR8. Podmínky barvení jsou uvedeny v tabulce 1.

Histoplanimetrická PAS-H a imunobarvené řezy ledvin byly převedeny na virtuální sklíčka pomocí Nano Zoomer 2.0 RS (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.; Hamamatsu, Japonsko). Pozitivní buňky byly spočítány z náhodně vybraných 20 glomerulů nebo 20 ložisek z tubulointersticia při 400x zvětšení pomocí softwaru NDP.view2 (Hamamatsu Photonics Co., Ltd.). Snímky 20 glomerulů z řezů barvených PAS-H byly také zachyceny při 400x z každé myši pomocí fluorescenčního mikroskopu All-in-One BZ-X710 (Keyence, Osaka, Japonsko). Glomerulární mezangiální oblast a velikost byly měřeny ze zachycených snímků pomocí BZ-X Analyzer (Keyence).

Izolace Glomerulus pro extrakci RNA a kultivaci Glomeruli z ledvin s falešnou operací a UUO byly izolovány, jak bylo popsáno dříve (16). Stručně řečeno, myši byly hluboce anestetizovány a perfundovány levou komorou 40 ml Hankova vyváženého solného roztoku (HBSS) obsahujícího Dynabeads (8 x 107; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Byla vyříznuta ledvina

a nakrájené na malé kousky. Buňky byly poté štěpeny kolagenázou A (1 mg/ml; Roche, Basel, Švýcarsko) a deoxyribonukleázou I (100 U/ml; Life Technologies) v HBSS při 37 stupních po dobu 30 minut. Suspenze obsahující natrávenou tkáň byla jemně protlačena přes 100-mm buněčné síto (BD Falcon, Franklin Lakes, NJ, USA) pomocí plochého tloučku. Výsledná buněčná suspenze byla centrifugována při 200 x g po dobu 5 minut a buněčná peleta byla resuspendována ve 2 ml HBSS. Glomeruli obsahující Dynabeads byly shromážděny pomocí koncentrátoru magnetických částic (Life Technologies) a použity pro izolaci RNA.

Reverzní transkripce a Real-Time PCRCelková RNA byla izolována z glomerulů pomocí soupravy RNeasy (Qiagen, Hilden, Německo). cDNA byla syntetizována z celkové RNA reverzní transkripcí za použití enzymu reverzní transkriptázy ReverTra Ace (Toyobo, Osaka, Japonsko) a náhodných dT primerů (Promega). cDNA byla použita v real-time PCR s Brilliant III SYBR Green QPCR master mix a Mx3000P (Agilent Technologies, La Jolla, CA, USA). Glomerulární genová exprese byla normalizována na expresi Actb. Použité páry primerů jsou uvedeny v tabulce 2.

Reverzní transkripce a TaqMan-Based Real-Time PCRCelková RNA, včetně mikroRNA (miRNA) v izolovaných glomerulech, byla izolována pomocí miRNeasy kitu (Qiagen). Pro reverzní transkripci celkové RNA podle instrukcí výrobce (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) byly použity miRNA-specifické primery s kmenovou smyčkou RT, reverzní transkriptáza, pufr pro reverzní transkripci, dNTP a inhibitor RNázy. PCR v reálném čase byla provedena s výslednou cDNA pomocí miR-21- specifických TaqMan primerů a specifických sond (Applied Biosystems), TaqMan Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) a Mx3000P (Agilent Technologies).

In vitro léčba izolovaných glomerulů s mimikryGlomeruli byly izolovány z falešně operovaných a UUOledvinypo 11 dnech obstrukce. Médium Roswell Park Memorial Institute-1640 (RPMI{2}}) (Fujifilm Wako, Japonsko) obsahující 300 glomerulů bylo rozděleno do každé jamky 96-jamkové kultivační destičky (TPP, Trasadingen, Švýcarsko) a léčených PBS, negativní kontrolou a miR-21 mimikem (UAG CUU AUC AGA CUG AUG UUG A) (Bioneer, Daejeon, Jižní Korea) při 1 pmol/ul po dobu 4 hodin při 37 stupních v 5 procentech CO2. Exprese Tlr8 a jeho downstream cytokinů byla měřena tak, jak je popsáno v předchozí části.

Rastrovací elektronová mikroskopiePro rutinní rastrovací elektronovou mikroskopii (SEM), malýledvina plátkybyly fixovány 2,5 procenty GTA po dobu 4 hodin a následně fixovány 1 procentem oxidu osmičelého po dobu 1 hodiny, poté následovalo ošetření 1 procentem kyseliny tříslové po dobu 1 hodiny. Vzorky byly poté fixovány 1 procentem oxidu osmičelého po dobu 1 hodiny a ošetřeny 0,5 procentem a 1 procentem kyseliny tříslové po dobu 10 minut, respektive 1 hodiny.ledvinyplátkybyly dehydratovány stoupajícím stupněm alkoholu, převedeny do 3-methyl-butylacetátu a nakonec vysušeny pomocí HCP-2 sušičky kritického bodu (Hitachi, Tokio, Japonsko). Vzorky byly podrobeny iontovému rozprašování a poté zkoumány pod S-4100 rastrovacím elektronovým mikroskopem při urychleném napětí 12 kV.

Statistická analýzaHodnoty jsou vyjádřeny jako průměr ± standardní chyba (se). Výsledky byly statisticky analyzovány pomocí neparametrického Mann–Whitneyho U-testu (P < 0.05).="" kruskal-wallisův="" test="" byl="" použit="" k="" porovnání="" tří="" nebo="" více="" populací="" a="" vícenásobná="" srovnání="" byla="" provedena="" pomocí="" scheffeovy="" metody,="" jakmile="" byly="" pozorovány="" významné="" rozdíly="" (p="">< 0,05).="" korelace="" mezi="" těmito="" dvěma="" parametry="" byla="" analyzována="" pomocí="" spearmanova="" testu="" koeficientu="" pořadové="" korelace="" (p=""><>

VÝSLEDEK

TIL a GL v ucpaných ledvinách mladých myšíNejprve jsme vyšetřili TIL a GL u falešně operovaných a UUO ledvin mladých myší vystavených obstrukci po různá časová období. Zatímco falešně operované ledviny vykazovaly normální tubulointerstitium (obrázek 1A), ucpané ledviny po 2 dnech UUO vykazovaly TIL a byly charakterizovány dilatací tubulů; některé tubuly obsahovaly také močové odlitky. Takové léze se zvětšovaly s postupujícím obstrukce (obrázek 1A). GL, hlavně glomeruloskleróza, byly pozorovány v pozdním stádiu 21 dnů po UUO a byly charakterizovány ukládáním látek pozitivních na kyselinu periodickou-Schiff (PAS). Glomerulární struktura byla normální u simulovaných i časných UUO ledvin (2, 7 a 11 dnů) (obrázek 1B). Počet glomerulárních buněk měl tendenci se zvyšovat až do dne-11 po obstrukci a měl tendenci klesat dne-21 v ledvinách UUO (obrázek 1C). Glomerulární mezangiální akumulace měla tendenci se zvyšovat od 7 dnů po obstrukci (obrázek 1D).

chyběla ve středu glomerulů ledvin UUO 21 dní po obstrukci (obrázek 1F). Polymerázová řetězová reakce odhalila významný pokles PFM (Nphs1 a Synpo) v ledvinách UUO 21 dní po obstrukci (obrázek 1G). Navíc SEM analýza odhalila normální procesy podocytární nohy (PFP) u falešně operovaných ledvin; avšak vymazání PFP a struktury podobné mikrovilům byly hlášeny v ledvinách UUO 21 dní po obstrukci (obrázek 1H). Tyto výsledky společně naznačují výskyt poškození podocytů v ucpané ledvině 21 dní po obstrukci.

Infifiltrující imunitní buňky chybí v ucpané ledvině Již dříve jsme ukázali, že poškození podocytů koreluje s infifiltrujícími imunitními buňkami v glomerulu (13, 16, 18). Zkoumali jsme proto infifiltraci B- a T-buněk a také makrofágů v TIL a GL falešně operovaných a UUO ledvin (obrázek 2). Četné infifiltrující B-, T-buňky a makrofágy byly pozorovány v TIL ledvin UUO všechny dny po obstrukci, ale byly téměř nepřítomné nebo jen málo v glomerulech jak simulovaných, tak UUO ledvin (obrázky 2A–E). Počet B-, T-buněk a makrofágů byl velmi malý v glomerulu (data nejsou uvedena), ale významně vyšší v glomerulu.

tubulointerstitium 2-, 7-, 11- a 21-denní ledviny ve srovnání s falešnou ledvinou (obrázek 2F). Proto mohou infiltrující imunitní buňky přispívat k rozvoji TIL v ucpané ledvině. S rozvojem GL však mohou souviset i další faktory.

Exprese různých členů rodiny TLR a downstream cytokinů v falešně operovaných a ucpaných ledvinách mladých myší Předchozí studie odhalily vyšší expresi různých TLR v podocytech nemocných ledvin (15, 16, 19, 20). Je zajímavé, že naše data odhalila významně vyšší expresi Tlr8 a Tlr9 v glomerulech izolovaných ze skupiny UUO 21-denní než v glomerulech falešné skupiny (obrázek 3A). Dále jsme zkoumali expresi downstream cytokinů členů rodiny TLR v glomerulech z falešných a UUO 21-denních skupin a zjistili jsme významnou upregulaci v expresi genů kódujících jak interleukin 1 beta (Il1b), tak interleukin 6 (Il6) ve skupině UUO ve srovnání s kontrolní skupinou (obrázek 3B).

TLR8 spolulokalizovaný s PFM Protože exprese Tlr8 a Tlr9 byla vysoká v glomerulech izolovaných z neprůchodné ledviny, zkoumali jsme jejich lokalizaci imunofluorescenčním barvením. Protein TLR8 nebyl detekován v falešně operovaných ledvinách (obrázek 4A), ale byl kolokalizován s PFM synaptopodinem v ledvině UUO (obrázek 4B). Kromě toho se nám nepodařilo detekovat expresi proteinu TLR9 v ledvinách buď u myší s falešnou operací, ani u myší UUO (data nejsou uvedena).

Produkce IL1b z podocytů v ucpané ledvině mladých myší Jak je ukázáno na obrázku 3B, exprese glomerulárního Il1b (downstream cytokin rodiny TLR) byla významně vyšší v ledvině UUO po 21 dnech než ve falešné ledvině. Proto jsme zkoumali zdroj IL1b v glomerulech ledvin UUO imunofluorescenčním barvením. Exprese proteinu IL1b nebyla detekována v glomerulech falešných ledvin, ale byla pozorována v glomerulech ledvin UUO (obrázky 4C, D). Kromě toho se IL1b kolokalizoval s PFM podocinem (obrázek 4D).

v UUOledvinaza 21 dní než v simulaciledvina.Proto jsme zkoumali zdroj IL1b v glomerulech ledvin UUO imunofluorescenčním barvením. Exprese proteinu IL1b nebyla detekována v glomerulech simulaceledvinyale byl pozorován v glomerulech UUOledviny(Obrázky 4C, D). Kromě toho se IL1b kolokalizoval s PFM podocinem (obrázek 4D).

Zvýšená hladina domnělého endogenního ligandu Tlr8 u myší ON modelu Předchozí studie ukázala, že miR-21 slouží jako ligand pro TLR8 (21). Proto jsme porovnali jak glomerulární, tak sérové ​​hladiny miR-21 mezi skupinami s falešnou a UUO 21-denní skupinou. Je zajímavé, že UUO 21-denní skupina vykazovala významně vyšší hladiny glomerulárního miR-21 než ve skupině falešné (P < 0,05),="" nicméně="" rostoucí="" tendenci="" sérového="" mir{="" {10}}="" byl="" pozorován="" v="" první="" skupině="" než="" ve="" druhé="" (p="0.06)" (obrázek="">

Korelace exprese Tlr8 s jeho ligandem miR-21 a PFM v obstrukceledvinyJak je uvedeno v tabulce 3, pozorovali jsme významnou pozitivní korelaci mezi glomerulární expresí mRNA Tlr8 a jejím endogenním ligandem (miR-21), stejně jako downstream cytokiny Il1b a Il6. Na druhé straně byla zřejmá negativní korelace mezi Tlr8 mRNA a PFMs Nphs1 a Synpo.

In vitro stimulace glomerulů pomocí miR{{0}} mimika aktivuje expresi Tlr8 a jeho downstream cytokinů Exprese Tlr8 měla tendenci se zvyšovat (P=0.06), ale jeho downstream cytokiny (Ifng a Il1b) byly významně (P < 0,05 a 0,01) zvýšeny v glomerulech falešných myší po

ošetření miR{0}} napodobeninou ve srovnání s glomeruly myší léčených PBS a napodobeninou negativní kontroly (obrázek 5A). Nebyla však pozorována žádná významná korelace mezi expresí Tlr8 a jeho downstream cytokiny v glomerulech falešných myší po léčbě napodobeninami (tabulka 4). Exprese Tlr8 a jeho downstream cytokinů byla významně vyšší v glomerulech UUOledvinypo léčbě miR-21 mimikem než ty v glomerulech UUOledvinyošetřených PBS a napodobeninou negativní kontroly (obrázek 5B). Byla zjištěna významná korelace mezi expresí Tlr8 a jeho downstream cytokiny v glomerulech ledvin UUO po léčbě mimikry, což svědčí o vyšší aktivaci dráhy jaderného faktoru kappa B (NF-kB) zprostředkovaného Tlr8-a sekrece prozánětlivých cytokinů v ucpané ledvině (tabulka 4).

Lokalizace TLR8 a poranění podocytů v kolaterálních ledvinách mladých myšíFalešně operované ledviny vykazovaly normální glomerulus, zatímco kolaterální ledviny měly glomerulární hypertrofii, zvýšený počet glomerulárních buněk a dilataci glomerulárních kapilár (obrázek 6A). Glomeruly z falešně operovaných ledvin byly pozitivní na expresi synaptopodinu a postrádaly expresi TLR8 (obrázek 6B). Na druhé straně kolaterální ledviny ztratily expresi synaptopodinu ve středu glomerulů, ale vykazovaly expresi TLR8 podél glomerulární rychlosti (obrázek 6C). Kromě toho byl protein TLR8 lokalizován společně se synaptopodinem (obrázek 6C). Falešně operované ledviny vykazovaly normální expresi podocinu, ale žádnou expresi IL1b v glomerulech (obrázek 6D). Glomeruly v kolaterální ledvině však ztratily expresi podocinu ve středu, ale měly expresi IL1b podél glomerulární rychlosti (obrázek 6E). Kromě toho byl protein IL1b kolokalizován s podocinem (obrázek 6E). SEM analýza odhalila normální PFP v falešně operovaných myších ledvinách, ale vymazání PFP a mikrovilózní struktury byly viditelné v kolaterálních ledvinách (obrázek 6F).

Lokalizace TLR8 a poranění podocytů v ucpaných a kolaterálních ledvinách starých myšíFalešně operované ledviny vykazovaly normální expresi synaptopodinu, ale neodhalily žádné barvení na protein TLR8 v jejich glomerulech (obrázek 7A). Je zajímavé, že jak kolaterála, tak ledviny UUO vykazovaly ztrátu exprese synaptopodinu v centru glomerulů, ale udržely expresi TLR8 podél glomerulární sítě (obrázky 7B, C). Protein TLR8 byl kolokalizován se synaptopodinem v kolaterále a ledvinách UUO (obrázky 7B, C). Falešně operované ledviny podobně vykazovaly normální expresi podocinu, ale neměly žádnou expresi IL1b ve svých glomerulech (obrázek 7D). Na druhé straně, jak kolaterální, tak UUO ledviny ztratily expresi podocinu v centru glomerulů, ale vykazovaly expresi IL1b podél glomerulární sítě (obrázky 7E, F). Bylo zjištěno, že pozitivní barvení je kolokalizováno s podocinem v glomerulech kolaterály a UUO ledvin (obrázky 7E, F). SEM vyšetření odhalilo normální PFP v falešně operovaných myších ledvinách, PFP vymazání a mikrovilózní struktury v kolaterální i UUO ledvinách starých myší (obrázek 7G).

DISKUSENA

prevalence je běžná u kojenců i u starších jedinců (4–7). Proto jsme podrobili mladé a staré myši UUO, abychom napodobili ON stav jedinců různých věkových skupin a zkoumali TIL a GL. U neprůchodné ledviny byla progrese TIL patrná v časnějším stadiu obstrukce (2 dny); avšak progrese GL spolu s poškozením podocytů byla pozorována v pozdější fázi. Kolaterální ledvina vykazovala současně poškození GL a podocytů. Toto pozorování ukazuje, že k poškození podocytů dochází jak v ucpaných, tak v kolaterálních ledvinách, ačkoli počáteční poškození se může lišit. Naše předchozí studie zdůraznily korelaci mezi poškozením podocytů a infiltrací imunitních buněk v glomerulu (13, 16, 18). V této studii však nebyla pozorována infiltrace imunitních buněk do glomerulů falešných nebo neprůchodných ledvin. Zvažovali jsme proto zapojení dalších faktorů do poškození podocytů v neprůchodné ledvině. Předpokládali jsme, že nebezpečné signály (DAMP nebo PAMP), ať už pocházející z krevního oběhu nebo pocházející z poškozeného tubulárního epitelu, mohou přispívat k poškození podocytů v ON, díky jeho jedinečné poloze v glomerulu. Důležité je, že se ukázalo, že interakce mezi DAMP a TLR hraje důležitou roli v patogenezi neinfekčních onemocnění (15). Různí členové rodiny TLR jsou exprimováni na buněčné plazmatické membráně nebo intracelulárních vezikulách (22) a jsou charakterizováni jako vrozené imunitní senzory, které účinně rozpoznávají DAMP nebo PAMP. Po aktivaci odpovídajícími DAMP nebo PAMP, TLR zvýšily expresi downstream cytokinů prostřednictvím NF-kB dráhy a indukovaly obranný systém hostitele (22). Kromě toho DAMP přenášejí přítomnost poškození tkáně na imunitní buňky nebo místní vnitřní buňky a následně zhoršují poškození tkáně (23–26). Důležité je, že všechny TLR aktivují dráhu NF-kB, která řídí expresi řady genů pro zánětlivé cytokiny (27). Navíc aktivace TLR signalizuje jejich downstream cesty k aktivaci NF-kB, který je zodpovědný za zánět a je spojen s patogenezí poškozených tkání (28). Shichita a kol. odhalili patologické interakce mezi endogenními ligandy a TLR2 nebo TLR4, které přispívají k ischemickému poškození mozku (25). Předchozí studie také prokázaly schopnost členů rodiny TLR indukovat TIL v ledvinách (TLR2, 4, 5, 7 a 11) a GL (TLR1–6, 8 a 9) (17, 29–33 ). V této studii jsme našli poškození podocytů v obstrukčních a kolaterálních ledvinách a objasnili jsme je

role různých členů rodiny TLR, které mohou přispívat k poškození podocytů (15, 16, 19, 20). Jak jsme předpokládali, glomerulární exprese Tlr8 a Tlr9 byla vyšší v glomerulech izolovaných z ledviny UUO než v glomerulech z falešně operovaných myší. Navíc glomerulární exprese zánětlivých cytokinů souvisejících s NF-kB dráhou, včetně Il1b a Il6, byla vyšší v ledvině UUO 21 dní po obstrukci. Proto jsme došli k závěru, že dráha NF-kB zprostředkovaná TLR hraje důležitou roli v patogenezi GL v obstrukční ledvině. Na rozdíl od jiných členů rodiny TLR jsou TLR8 a TLR9 detekovány v endozomech buněk. TLR8 rozpoznává jednovláknové RNA a krátké dvouvláknové RNA z mikroorganismů a aktivuje produkci několika cytokinů zprostředkovaných NF-kB (22). Na druhé straně TLR9 rozpoznává dvouvláknové DNA a aktivuje NF-kB dráhu k produkci downstream cytokinů (16, 34). V této studii jsme rozpoznali pouze kolokalizaci proteinu TLR8 spolu s PFM synaptopodinem v glomerulech. Naše předchozí studie také ukázaly, že jak TLR8, tak TLR9 se kolokalizují s PFM a aktivují produkci zánětlivých cytokinů zprostředkovanou NF-kB k indukci poškození podocytů (15, 16). Kromě toho další studie prokázaly patologickou korelaci mezi dráhami zprostředkovanými TLR a poškozením podocytů in vitro (34, 35). Banáš a kol. odhalili interakci TLR4 v podocytech s imunitním systémem během vývoje GL (35). Podocyty tedy mohou přispívat k imunitnímu dozoru prostřednictvím cest zprostředkovaných TLR. V této studii jsme prokázali jak expresi genu TLR8, tak lokalizaci proteinu v podocytech neprůchodné ledviny a také vyšší expresi downstream cytokinů v glomerulu. Proto jsme dospěli k závěru, že dráhy zprostředkované TLR{40}} přispívají k rozvoji GL prostřednictvím poškození podocytů v ucpané ledvině.

Předchozí studie ukázala, že miR-21, endogenní ligand TLR8, může dosáhnout a vázat se na TLR8 v buněčných endozomech, kde může indukovat TLR8-zprostředkovanou aktivaci dráhy NFkB a sekreci prozánětlivých cytokinů (21). V této studii jsme našli významně vyšší hladiny glomerulární miR-21 i zvýšené hladiny sérového miR-21 v ledvinách UUO než u kontrolních skupin a prokázali jsme jejich korelaci s glomerulární expresí Tlr8 . Je zajímavé, že glomeruly z ledvin UUO léčených miR-21 mimikem vykazovaly vyšší expresi Tlr8 a jeho downstream cytokinů ve srovnání s těmi v glomerulech z falešných myší léčených miR-21 mimikem, což ukazuje na zvýšenou dostupnost endogenního miR -21 z poškozených tkání v ucpané ledvině a aktivace nadměrné exprese Tlr8 v ledvinách UUO ve srovnání s falešnou expresí. Společně jsme dospěli k závěru, že vyšší objem miR-21 v ucpané ledvině dosáhne endozomů v podocytech a indukuje Tlr8-zprostředkovanou aktivaci NF-kB dráhy a sekreci prozánětlivých cytokinů. Tyto cytokiny se zase podílejí na vývoji GL prostřednictvím poškození podocytů.

IL1b je jedním z důležitých downstream cytokinů NF-kB dráhy, produkovaný hlavně podocyty v glomerulu za podmínek onemocnění. Předchozí studie ukázaly, že IL1b indukuje poškození podocytů snížením PFM (36, 37). V této studii jsme prokázali vyšší glomerulární expresi Il1b a jeho kolokalizaci s PFM, která vykazovala sníženou expresi. Navíc glomerulární exprese Il1b korelovala s Tlr8 a měla tendenci korelovat s expresí PFM (Nphs1 a Synpo). Tyto výsledky tedy naznačují, že faktory downstream od Tlr8, včetně 111b a 116, mohou způsobit poškození podocytů v ucpané ledvině snížením exprese PFM.

Kolaterální ledviny mladých myší také vykazovaly GL a ztrátu PFM. Tento výsledek byl potvrzen SEM, který odhalil poškození podocytů v kolaterální ledvině. Našli jsme také vyšší hladiny miR-21 v séru v modelu myši ON. Kromě toho protein IL1b lokalizovaný společně s PFM. Tyto výsledky naznačují, že miR-21 v séru interaguje s TLR8 v podocytech kolaterální ledviny a aktivuje produkci downstream cytokinů, což následně snižuje funkci podocytů a poškození podocytů. Poškození podocytů bylo také pozorováno v ucpaných a kolaterálních ledvinách starých myší prostřednictvím mechanismu podobného mechanismu pozorovanému u mladých myší.

Závěrem (obrázek 8), glomerulární miR-21 exprese je zvýšená po unilaterální ureterální obstrukci, kde interaguje s TLR8 v podocytech a indukuje produkci downstream cytokinů (Il1b a Il6), což naznačuje aktivaci NF-kB dráhy. Vyšší hladiny cytokinů snižují PFM, což vede k poškození podocytů a následnému rozvoji GL. Zvýšené hladiny miR-21 v séru aktivují TLR8 v podocytech kolaterální ledviny a indukují GL prostřednictvím poškození podocytů. Tato studie tedy jasně ukazuje vývoj GL v obstrukčních a kolaterálních ledvinách prostřednictvím poškození podocytů po nadměrné expresi Tlr8.