Fenylethanolové glykosidy z Cistanche Tubulosa potlačují aktivaci jaterních hvězdicových buněk a blokují vedení signálních drah v TGF-01/smad jako potenciální činidla proti jaterní fibróze
Mar 05, 2022
Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com
Shu-Ping You, Long Ma, Jun Zhao, Shi-Lei Zhang a Tao Liu
Abstraktní: Cistanche tubulosaje tradiční čínská bylinná medicína široce používaná k regulaci imunity afenylethanoidové glykosidy(CPhG) patří mezi primární složky odpovědné za tuto činnost. Předchozí studie ukázaly preventivní a terapeutické účinky CPhG na jaterní fibrózu u potkanů indukovanou bovinním sérovým albuminem (BSA). Cílem studie bylo vyhodnotit účinek CPhG a monomerů proti jaterní fibrózeechinakosidaakteosidinhibicí aktivace hepatických hvězdicových buněk (HSC), blokováním vedení signálních drah v transformačním růstovém faktoru-p1 (TGF-p1)/smad, a stanovením jejich in vitro hepatoprotektivní aktivity. Proliferace HSC byla zjevně inhibována po léčbě CPhG (100,50 ug/ml)/echinakosidem (500,250,125 ug/ml)/akteosidem (6,3 ug/ml), s hodnotami IC50 119,125,520,399 a g ml v MTT testu. Různé koncentrace CPhGs/echinakosid/akteosidneovlivnily buněčnou toxicitu na HSC podle měření laktátdehydrogenázy (LDH). Různé koncentrace CPhGs/echinakosid/akteosidzvýšil hladinu mRNA a proteinovou expresi smad7 a snížil hladiny mRNA smad2, smad3 a proteinovou expresi smad2, fosfo-smad2 (p-smad2), smad3, fosfo-smad3 (p-smad3) v HSC. V souhrnu tyto výsledky ukazují, že CPhGs/echinakosid/akteosidmůže blokovat vedení signálních drah v TGF-p1/smad a inhibovat aktivaci HSC, což naznačuje, žeC. tubulosamůže tak být potenciálním rostlinným lékem pro léčbu jaterní fibrózy.
klíčová slova: Cistanche tubulosa; fenylethanolové glykosidy zCistanche(CPHG);echinakosid; akteosid; jaterní hvězdicové buňky (HSC); TGF-pl/smad
1. Úvod
se stávají proliferativními a fibrogenními, následně akumulují ECM a nakonec se diferencují na fibrogenní buňky podobné myofibroblastům. Transformující růstový faktor-.1 (TGF-p 1) je považován za hlavní profibrogenní mediátor. Signální dráha související s TGF-&1 je důležitým mechanismem jaterní fibrózy a zahrnuje hlavně signalizaci závislou na smad a nezávislou na smad, přičemž se předpokládá, že dráha signální transdukce závislá na smad je hlavním kanálem signalizace TGF-p1. . Blokáda signální dráhy TGF-p1/smad tedy může potlačit produkci kolagenu a případně zmírnit jaterní fibrózu, což z této dráhy v posledních letech učinilo důležitý cíl ve výzkumu léků proti jaterní fibróze.
Navzdory vysoké celosvětové incidenci jaterní fibrózy není k dispozici žádná obecně uznávaná antifibrogenní terapie [2–4]. Tradiční čínské bylinné léky (TCHM) jsou velmi zajímavé pro léčbu poruch jater, protože některé mohou být použity jako terapeutické léky při léčbě a prevenci jaterní fibrózy. V současnosti se mnoho studií zaměřuje na potenciální antifibrogenní léky, které se jako TCHM používají již tisíce let [5].
Cistanche tubulosa W (čeleď Orobanchaceae)fa parazitická rostlina, je široce pěstována v jižní oblasti Xinjiang v Číně [6]. Lidé jej používají k povzbuzení ledvin, výživě krve, uvolnění střev a oddálení stárnutí bez vedlejších účinků a je oficiálně uveden v čínském lékopisu [7]. C. tubulosa obsahuje různé aktivní složky, včetně fenylethanoidových glykosidů (CPhG), iridoidů a polysacharidů. Mezi mnoha aktivními složkami v C. tubulous jsou CPhGs, které mají řadu bioaktivit (antioxidant, antiúnava, radiorezistence, atd.), jsou hlavními charakteristickými složkami této rostliny. V posledních letech se uvádí, že CPhGi mají nadměrné hepatoprotektivní účinky Hent a mohou vychytávat stromové radikály, chránit jaterní membrány a vykazovat imunoregulační účinky, inhibici apoptózy, inhibici exprese povrchového antigenu hepatitidy B (HBs Ag) a hepatitidy B replikační aktivita DNA antigenu (HBeAg) a viru hepatitidy B (HBV) atd. Hladina DNA HBV je nejspolehlivějším indexem, který přímo odráží aktivitu replikace viru, která je klíčovým faktorem při určování přirozené historie chronických infekcí HBV, sledování efektu antivirové terapie oP a hodnocení prognózy akutních a chronických infekcí HBV. Mezi sérologické detekční indexy HBV patří především HBsAg, HBeAg aj. [8—11]. V literatuře však existuje jen málo zpráv o účincích CPhG proti jaterní fibróze. Předchozí studie naznačily preventivní a terapeutické účinky CPhG na jaterní fibrózu indukovanou bovinním sérovým albuminem (BSA) u potkanů, ale antifibrogenní aktivita CPhG a jeho hlavních monomerů (echinakosid a akteosid, obrázek 1) nebyla nikdy hodnocena in vitro.
organická Cistanche tubulosa
2. Výsledky
2.1. Kvantitativní stanovení CPhG
CPhGs vC. tubulosaobsahují IT dva glykosidy fenylethylalkoholu: echinakosid a stranu acteo a jejich obsah v CPhG byl detekován analýzou HPLC (obrázek 1) na 42,71 procenta 土 0,42 procent a 14,27 procenta 土 0.18 procenta, resp.
2.2. Inhibiční aktivity CPhG, echinakosidu a akteosidu na HSC-T6
CPhG, echinakosid a akteosid (62.5-500 卩g/ml) inhibovaly životaschopnost buněk HSC v závislosti na koncentraci. CPhG a akteosid vykazovaly pozoruhodnou inhibiční aktivitu na HSC buňky, přičemž hodnoty 50procentní inhibice buněčné růstové aktivity (IC50) byly 119,125 昭/ml, respektive 6,999 昭/ml. Echinakosid vykazoval mírnou inhibiční aktivitu (IC50 520,345 昭/ml; tabulka 1 a obrázek 2).
2.3. Buněčná toxicita CPhGs, Echin acoside a Acteorida na HSC
Laktátdehydrogenáza (LDH), stabilní cytoplazmatický enzym přítomný ve všech buňkách, se po poškození plazmatické membrány rychle uvolňuje do supernatantu buněčné kultury. Aktivita enzymu v supernatantu kultury koreluje s podílem lyžovaných buněk [12]. Jak ukazuje tabulka 2, při léčbě různými: koncentracemi C PhG, echinakosidu a akteosidu, ačkoli aktivita LDH vykazovala mírné zvýšení ve srovnání s buněčnou koirtrolní skupinou, rozdíl nebyl statisticky významný (p > 0,05 ), což ukazuje, že většina buněčných membrán si zachovala svou integritu a inhibice CPhG, echinakosidu a akteosidu na HSC není způsobena nespecifickou buněčnou toxicitou.
2.4. Účinek CPhG, Echinacosidu a Acteosde na proliferaci HSC indukovanou TGF-^i
Proliferace, aktivace a diferenciace HSC jsou regulovány řadou faktorů. Mezi různými faktory podílejícími se na jaterní fibróze je TGF{{0}} považován za nejdůležitější, protože může aktivovat HSC, podporovat diferenciaci myofibroblastů, zvyšovat syntézu ECM a inhibovat degradaci ECM a uvolňovat chemokiny a cytokiny podílející se na jaterní fibróze [13]. V této studii, s výjimkou kontrolní skupiny, byly stacionární HSC stimulovány TGF-P1 in vitro, aby se simulovala tvorba časné jaterní fibrózy a aby se prozkoumal účinek CPhG, echinakosidu a akteosidu na TGF-p1- indukovaná proliferace HSC. Jak ukazuje tabulka 3, ve srovnání s kontrolní skupinou skupina TGF-61 významně podporovala proliferaci HSC (p < 0.01).="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" tgf-p1,="" tgf-p1="" plus="" cphg="" (tc)="" (50,100="" 卩g/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf{{18}="" }="" plus="" echinakosid="" (te)="" (125,="" 250,="" 500="" µg/ml,="" p="">< 0,05),="" tgf-p1="" plus="" akteosid="" (ta)="" (3,0,="" 6,0="" µg/ml,="" p="">< 0,05)="" všechny="" pozoruhodně="" inhibovaly="" proliferaci="" hsc="" indukované="" tgf-|3="" 1="" v="" různé="">
2.5. Exprese mRNA smad2)smad3 a smad7 po intervenci CPhGs, ochmacoside a acteaside na HSC
Smad3 a smad2 jsou klíčovými downstream efektory signální dráhy TTGF-p [14,15] a smad7 je inhibitorem signální dráhy smad. Teoreticky může zvýšená exprese smad7 nebo snížená exprese smad2/smad3 blokovat vedení signálních drah v TGF-p 1/smad. Jak je znázorněno na obrázku 3, kvantitativní PCR analýza v reálném čase ukázala, že exprese mRNA smad2 a smad3 indikovala nižší hladinu, zatímco smad7 indikovala vyšší hladiny v kontrolní skupině ve srovnání se skupinou TGF-|31. Ve skupině TC (25, 50, 75,100 |dg/mL) hladina mRNA smad2 (p < 0.{{37="" }}5)="" a="" smad3="" (p="">< 0,01)="" byly="" významně="" sníženy="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" tgf-pf="" a="" byly="" dokonce="" podobné="" kontrolní="" skupině;="" mezitím="" byla="" hladina="" mrna="" smad7="" významně="" zvýšena="" ve="" skupině="" tc="" (50,="" 75="" 100="" µg/ml)="" (p="">< 0,05,="" p="">< 0,05,="" p="">< 0,01).="" nicméně;="" exprese="" smad7="" indikovala="" vzestupný="" trend="" ve="" skupině="" tc="" 25="" µg/ml="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" tgf-p1="" (obrázek="">
Mezitím ve srovnání se skupinou TGF-p1 byla exprese mRNA smad2 a smad3 u TE významně snížena (62,5, 125, 250, 500 卩g /ml) skupina (p < 0.01)="" a="" exprese="" smad7="" mrna="" byly="" významně="" zvýšeny="" ve="" skupině="" te="" (125,="" 250="" 500="" 昭/ml)="" (p="">< 0,01)="" (obrázek="" 4)="" .="" podobně="" skupina="" ta="" (0,75,="" 1,5,="" 3,0,="" 6,0="" ^g/ml)="" také="" vykazovala="" stejný="" trend="" (obrázek="">
2.6. Vliv CPhG, echinakosidu a Ac)eosidů na signální dráhu T GF-^i/smad v HSC
Signální dráha TGF-p 1/smad závisí na smad2, smad3, fosfo-smad2 (p-smad2), fosfo-smad3 (p-smad3) a smad7, kde p-smad2, p-smad3 jsou aktivované formy smad2 a blbý3. V této studii byly analyzovány hladiny proteinů omad2, smad3, p-smad2, p-smsd3 a smad7. Analýza Western blot detekovala zvýšení hladin smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 působením TGF-pl a inhibici těchto zvýšení pomocí CPhG, echinakosidu a akteosidu; mezitím analýza wesiern blot odhalila zvýšené hladiny smad7 pomocí CPhG, echinakosidu a akteosidu. (obrázky 6–8).
Jak je znázorněno na obrázku 6, ve srovnání se skupinou c on2rol (exprese proteinu smad2, smad3, p-smad2, p-smad3 byly významně zvýšeny a exprese proteinu smad7 byla snížena ve skupině TGF-p1. V TC (25 , 50, 75, 100 昭/ml) lékové skupiny, smad/ (obrázek 6A), p-smad2 (obrázek 6B), smad 3 (obrázek 6C), p -smad3 (obrázek 6D) exprese byly významně nižší než ve skupině TGF-p1 (卩 < 0,01) a exprese proteinu smad7 (obrázek 6E) byla vyšší než u skupiny TGF-S1 (p < 0,01) (obrázek 6).
Současně byly měřeny exprese proteinu smad 2, smad3, p-smad2, p-smad3 a smad7 po intervenci echinakosidu a akteosidu na HSC. Jak je znázorněno na obrázcích 7 a 8, hladiny exprese proteinů smad2, smad3, p-smad2 a p-smad3 byly významně inhibovány (p < 0.05="" nebo="" p="">< 0,01="" ),="" hladina="" exprese="" proteinu="" smad7="" byla="" zvýšená="" (p="">< 0,01)="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" tgf-p="" 1="" (obrázky="" 7="" a="">
3. Diskuse
Jaterní fibróza je jednou z hlavních příčin morbidity a mortality na celém světě, ale v současnosti jsou pro tento stav k dispozici velmi omezené terapeutické možnosti, a proto je pro nás velmi důležité hledat potenciální cíle pro terapeutickou intervenci, aby se zabránilo rozvoji jaterní fibrózy. 16]. Nedávno vědci zjistili, že různé bylinné léky mají hepatoprotektivní nebo antifibrotické účinky. Mnoho TCHM, jako jsou pilulky Fufang Biejia Ruangan [17] a odvar Xiao-chai-hu (shosaiko to v Japonsku) [18,19] se široce používá k léčbě jaterní fibrózy v Číně, Koreji a Japonsku po tisíce let. C. tubulosa obsahuje různé aktivní složky včetně CPhG, iridoidů a polysacharidů. Jako jeden z účinných materiálových základů C. tubulosa mají CPhG vynikající hepatoprotektivní aktivitu, ale existují omezené informace o antifibrotických účincích GPhC a jeho příbuzných sloučenin. V této studii jsme zkoumali, jak CPhG, echinakosid a akteosid potlačují aktivaci HSC a blokují vedení signální dráhy u TGF-p1/snaad jako potenciálních látek proti hepatické fibróze in vitro.
Poškození jater jakékoli etiologie nakonec povede k aktivaci HSC, které podléhají transdiferenciaci na fibrogenní buňky podobné myofibroblastům [20]. To znamená, že myofibroblasty
jsou odvozeny z aktivace a proliferace HSCss [21] a je považován za mediátor tvorby jaterní fibrózy. Z tohoto důvodu jsme provedli studie in vitro, abychom porovnali míru životaschopnosti buněk HSC vystavených CPhG, echinakosidu a akteosidu. Výsledky ukázaly, že inhibiční účinek akteosidu na HSC byl nejsilnější a účinek CPhG byl lepší než účinek echinakosidu. CPhG, echinakosidy a akteosidy medikovaná séra všechna inhibovala proliferaci HSC způsobem závislým na dávce.
LDH je cytoplazmatický enzym v živých buňkách a za normálních okolností nemůže proniknout buněčnou membránou. Když jsou buňky poškozeny, zvyšuje se propustnost membrány a LDH se uvolňuje do vnějšku buňky. LDH obvykle dokáže detekovat stupeň poškození buněk [{{0}}]. Šetření ukázalo, že aktivita LDH CPhG, echinakosidů a akteosidů medikovaného séra vykázala pouze mírné zvýšení ve srovnání s buněčnou kontrolní skupinou a rozdíl nebyl statisticky významný (p > 0,05), což naznačuje, že většina buněčné membrány si zachovala svou integritu a inhibice HSC pomocí CPhG, echinakosidu a akteosidu není způsobena nespecifickou buněčnou toxicitou.
Když dojde k poškození jater, aktivované hepatocyty mohou uvolňovat TGF-pi, který zase aktivuje HSC-T6, proto má TGF-pi úzký vztah s fibrózou [25-27]. V této studii lze CPhG, echinakosid a akteosid považovat za atraktivní terapeutickou strategii pro inhibici proliferace HSC poté, co byly HSC stimulovány pomocí wTGF-pi in vitro. Předpokládáme, že CPhG, echinakosid a akteosid mohou být použity jako druh léčby a/nebo prevence jaterní fibrózy a inhibují tvorbu časné jaterní fibrózy. Vznik jaterní fibrózy je komplexní proces multifaktorového a multibuněčného postižení. V tomto patologickém procesu interakce buňka-buňka, buňka-cytokiny a buňka-matrix tvoří těžkopádnou síť. V této síti může být rozvoj jaterní fibrózy regulován různými signálními cestami a prostředky. TGF-pi je klasickým aktivátorem HSC a klíčovým mediátorem v patogenezi jaterní fibrózy [28]. CPhG, echinakosid a akteosid mohou inhibovat expresi mRNA a proteinů souvisejících s dráhou TGF-pi/smad v HSC.
TGF-pi uplatňuje své buněčné účinky prostřednictvím signální dráhy smad a byl považován za klíčový mediátor ve vývoji jaterní fibrózy a zánětu. Po navázání TGF-pi na receptor TGF-p-typu II kináza receptoru typu II fosforyluje GS doménu receptoru TGF-p typu I, což vede k aktivaci receptoru typu I [29]. Prostřednictvím působení p-smad2 a p-smad3 na dva serinové zbytky v motivu SSXS jejich C-konce se aktivací receptoru typu I aktivují reakce downstream od signální dráhy smad [30]. P-smad2 a p-smad3 tvoří oligomerní komplexy se smad4, poté vstupují do jádra a uplatňují svou biologickou transkripční aktivitu. Smad proteiny tedy přenášejí signály přímo z receptorové kinázy do jádra [3i]. Na druhé straně je smad7 pevně spojen s receptorem TGF-pi, což vede k nemožnosti aktivace smad 2/3 ak inhibici signálních transdukčních drah [32]. Smad7 může působit tak, že inhibuje p-smad2 a p-smad3, nukleární translokaci aktivovaných komplexů smad a aktivaci (CAGA) (9)-MLP-Luc, což vede ke snížení exprese kolagenu I a úplné inhibici transdukce signálu TGF-p [33,34]. Naše výsledky ukázaly, že CPhG, echinakosid a akteosid mohou snížit expresi mRNA smad2 a smad3 a zvýšit expresi mRNA smad7; inhibují expresi proteinů smad2, p-smad2, smad3 a p-smad3 a zvyšují expresi proteinu smad7, což naznačuje, že CPhG, echinakosid a akteosid také hrají roli při inhibici aktivace HSC, a tím inhibují jaterní fibrózu, což zdůrazňuje potenciální antifibrotický účinek mechanismus.
Ukázalo se, že sekvence hepatoprotektivních účinků tří testovaných látek je akteosid > CPhGs > echinakosid. Za účelem dalšího objasnění důvodů rozdílů v mechanismu, kterým CPhG, echinakosid a akteosid chrání před jaterní fibrózou, byly analyzovány jejich chemické struktury. Fenethylalkoholová glykosidová skupina se zdá být základní strukturou pro hepatoprotektivní účinek [35]. Akteosid (C29H36Oi5) je dvojitý glykosid a echinakosid (C35H46O20) je triglykosid, tj. echinakosid má ve své struktuře ve srovnání s akteosidem další glykosid, což vede ke zvětšení jeho prostorové velikosti. Hepatoprotektiva nebo inhibice aktivity HSC u akteosidu je lepší než u echinakosidu, což může být způsobeno existencí sterické zábrany.
chránit játra: extrakt z cistanche
4. Experimentální část
4.1. Chemikálie a činidla
TGF-pi byl zakoupen od Peprotech (Rocky Hill, NJ, USA). Buněčná linie HSC-T6 byla zakoupena od Wuhan Procell Gene Bio-technology Co., Ltd. (Wuhan, Čína). Dimethylsulfoxid (DMSO) byl zakoupen od Sigma Inc. (St. Louis, MO, USA). Primery Smad2, smad3 a smad7 byly vyrobeny společností Shanghai Sangon Biological and Technological Company (Shanghai, Čína). Souprava pro syntézu cDNA prvního vlákna Revert Aid byla zakoupena od společnosti Thermo Scientific (Shanghai, Čína). Zelená PCR souprava Quantifast SYBR byla zakoupena od QIAGEN GmbH (Hilden, Německo). Protilátka p-smad2 (ser465/467), králičí mAb Smad3 (C67H9) a králičí mAb p-smad3 (ser423/425) byly zakoupeny od Cell Signaling Technology (Boston, MA, USA). Protilátka Smad7 byla zakoupena od Boster (Wuhan, Čína). Polyklonální protilátka Smad2 a monoklonální protilátka p-aktinu byly zakoupeny od Proteintech (Wuhan, Čína). Detekce primární protilátky byla provedena pomocí 2stupňového roztoku protilátky (Alk-Phos. konjugovaný, anti-králičí) a 2stupňového roztoku protilátky (Alk-Phos. konjugovaný, anti-myší) zakoupeného od Invitrogen™ (Carlsbad, CA, USA). Testovací souprava laktátdehydrogenázy byla od Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Čína).
4.2. Přírodní materiál
C. tubulosa byla odebrána z Tulufanu v autonomní oblasti Xinjiang Uirghur v Číně v květnu 2006. Rostlinné materiály byly identifikovány jako C. tubulosa Jiang He, Institutem Materia Medica v Xinjiangu. Vzor voucheru byl uložen v Institutu Materia Medica v Xinjiangu v Číně.
4.3. Izolace a purifikace CPhG a jeho sloučenin
Sušené a nakrájené oddenky C. tubulosa (6,{1}} kg) byly postupně třikrát extrahovány pod zpětným chladičem 70procentním ethanolem (4,8 l) a rozpouštědlo bylo poté odstraněno ze spojených extraktů. za získání ethanolového extraktu (1,146 kg). Ethanolové extrakty byly purifikovány pomocí AB-8 pryskyřice za získání surového extraktu fenylethanolglykosidů (CPhGs). Po rozpuštění d ve vodě byl extrakt purifikován AB-8 ad sorpční chromatografií na makroporézní pryskyřici, aby se získaly celkové fenylethanolové glykostrany z C. tubulosa (CPhGs, 210g). CPhG byly aplikovány na ODS OP{{10}} kolonu a eluovány postupně směsmi MeOH-H?.(0:1 -^1:0). Eluáty byly spojeny do pěti dílčích frakcí podle chování TLC za použití systému rozpouštědel CHCh-MeOH-H2 (6:4:0,5). Skvrny byly vizualizovány po postřiku 1 procentem FeCih. Různé frakce byly opakovaně čištěny sloupcovou chromatografií na Sephadexu LH-20 s methanolem jako eluentem a z CPhG byly izolovány dva fenylethanolové glykosidy. Jejich struktury byly potvrzeny jako echinakosid (C35H46O20) a akteosid (C29H36O15) pomocí MS, 1H- a MC-NMR [35], jejichž čistoty byly stanoveny na 99,17 procent a 98,92 procent, v daném pořadí, pomocí UV-HPLC. Struktury echinakosidu a akteosidu jsou znázorněny na obrázku 9.
4.5. Kvantitativní stanovení CPhG
Kapalinová chromatografie (HPLC) (LC{{0}}} HPLC přístroj, Shimadzu Co., Kyoto, Japonsko) byla použita k analýze obsahu echinakosidu a cteosidu v CPhG. Kolona Phenomenex Gemini ODS (250 x 4,6 mm, 5 |^m) byla použita při 30 stupních. Izokratická mobilní fáze obsahující methanol-acetonitril-1procentní kyselinu octovou (15:10:75, obj./obj./obj.) byla použita po dobu 40 minut, při průtoku 0,6 ml/min, s UV detekce při 334 nm.
4.6. Buněčná kultura
HSC buňky byly kultivovány v Dulbeccově modifikovaném Eagleově médiu (High Glucose) (DMEM, Peking, Čína) doplněném 10 procentem fetálního bovinního séra (FBS, Gibco, Carlsbad, CA, USA), 10 0 IU/ml penicilinu a 100 ug/ml streptomycinu (HyClone, Logan, UT, USA) ve zvlhčeném inkubátoru při 37 stupních s 5 procenty CO2. Tyto buňky byly pravidelně subkultivovány 0,25% (1x) roztokem trypsinu (HyClone, Logan, UT, USA) a médium bylo měněno každé 2 dny. Zpočátku byly buňky kultivovány s DMEM obsahujícím 10 procent FBS po dobu 48 hodin. Médium bylo poté nahrazeno DMEM bez FBS, aby se buňky vyhladověly po dobu 12 hodin. Tyto buňky byly propagovány po dobu 48 hodin a po 48 hodinách bylo sérum vyhladověno s 0,5% FBS po dobu 12 hodin před přidáním 5 ng/ml TGF-&1,
4.7. Stanovení hodnot IC50
Po inkubaci přes noc v hladovějícím médiu obsahujícím {{0}}},5 procenta FBS byly buňky HSC nasazeny do 96-jamkové destičky v hustotě 5 x 104 buněk/ml po dobu 24 hodin. Buňky HSC byly ošetřeny CPhG, echinakosidem a akteosidem v různých koncentracích (0, 3,90625, 7,8125, 15,625, 31,25, 62,5, 125, 250 a 500 ug/ml) po dobu 48 hodin. Každá koncentrace měla čtyři jamky. Na konci ošetření bylo přidáno 20 µl MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-difenyltetrazolium bromid] (Sigma; 5 mg/ml) a buňky byly inkubovány další 4 hodiny. Po odstranění supernatantu bylo do každé jamky přidáno DMSO (200 ul). Po protřepávání destičky po dobu 10 minut na třepačce byly hodnoty IC50 získány měřením absorbance při vlnové délce 490 nm za použití přístroje pro enzymatické značení (Benchmark PLUS, Hercules, CA, USA), tento test byl proveden třikrát. Hodnoty IC50 CPhG, echinakosidu a akteosidu byly 119,125, 520,345 a 6,999 Rg/ml, v daném pořadí.
4.8. Inhibiční účinky na proliferaci buněk a životaschopnost buněk
HSC buňky byly vystaveny různým koncentracím CPhG (25, 50, 100 Rg/ml), echinakosidu (125, 250, 500 Rg/ml) a akteosidu (1,5, 3, 6 Rg/ml). Různé koncentrace CPhG, echinakosidu a akteosidu byly aplikovány na destičku ve čtyřech po sobě jdoucích jamkách a inkubovány po dobu 48 hodin. Účinky inhibice buněčné proliferace a úroveň viability buněk (na základě měření aktivity LDH uvolněné z poškozených buněk do supernatantu [36]) byly stanoveny pomocí MTT testu. Míra inhibice byla vypočtena pomocí následujícího vzorce [37]:
Míra inhibice ( procenta ) " [1 — (průměrná absorbance experimentální skupiny/průměrná absorbance slepé kontrolní skupiny)] x 100 procent
Podle návodu k soupravě,
LDH (U/L) {{0}} (měřená vnější průměr – kontrolní vnější průměr)/(standardní vnější průměr – prázdná vnější průměr) x 0,2 mmol/l x 1000
Naše předběžná studie ukázala, že CPhG, echinakosid a akteosid neovlivnily životaschopnost buněk.
4.9. Antiproliferativní aktivity TGF-^1
HSC aktivovaný TGF-p1 byl dlouho považován za asociovaný s jaterní fibrózou a inhibice růstu HSC byla navržena jako způsob léčby jaterní fibrózy [36,38]. Antiproliferativní účinky CPhG, echinakosidu a akteosidu na HSC aktivované TGF-p1 byly stanoveny pomocí MTT testu [39]. S použitím postupů a koncentrací léčiva, jak je popsáno,
experimentální skupiny zahrnovaly kontrolní skupinu, skupinu TGF-pi, skupinu TGF-pi plus různé koncentrace léku. Všechny buněčné skupiny kromě kontrolní skupiny byly kultivovány v DMEM obsahujícím 50 ng/ml TGF-pl (bez FBS) po dobu 24 hodin. Inhibiční aktivita na buněčnou proliferaci byla vypočtena jako 100 x (absorbance ošetřené sloučeniny – absorbance světla pozadí)/(absorbance modelu – absorbance světla pozadí).
4.10. Reverzní transkripčně-polymerázová řetězová reakce (RT-PCR)
Úroveň exprese mRNA smad2, smad3 a smad7 byla stanovena pomocí PCR v reálném čase. Pro stanovení exprese mRNA v HSC buňkách byly buňky (5 x 104 buňky) naočkovány do šestijamkových destiček s 30 ml DMEM s 10% FBS a inkubovány přes noc při 37 stupních a 5 procent CO2. Poté, co bylo kultivační médium vyměněno za bezsérové DMEM, byly do jamek přidány CPhG (100,50,25 µg/ml), echinakosid (500,250,125 µg/ml) a akteosid (6, 3,1,5 ug/ml). Po inkubaci po dobu 48 hodin s CPhG a monomerními kompozicemi byla celková RNA extrahována pomocí činidla TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) a intenzivně míchána s chloroformem po dobu 15 sekund. Po ponechání stát při teplotě místnosti po dobu 3 minut byl lyzát centrifugován při 12,000 xg po dobu 15 minut při 4 stupních. RNA ve vodné fázi byla vysrážena isopropanolem a horní vodná fáze byla přenesena do nové mikrocentrifugační zkumavky. RNA byla precipitována přidáním 0,75% ethanolu, poté byla mikrocentrifugační zkumavka a centrifugována při 12,000xg při 4 stupních po dobu ne delší než 5 minut. Supernatant byl odstraněn a RNA byla sušena při teplotě místnosti po dobu 5-10 min. Primery (Sangon) byly navrženy s použitím dávkového primeru 3 a jsou uvedeny v tabulce 4. Výsledky byly normalizovány na mRNA provozního genu p-aktinu jako vnitřní kontrola a jsou prezentovány jako relativní hladiny mRNA. Reakce byly provedeny s 8 |^L iQ SYBR Green Supermix, 1 10 pM páru primerů, 8,5 ul destilované vody a 2,5 rL cDNA.
Každá polymerázová řetězová reakce byla provedena za následujících podmínek: 95 stupňů po dobu 3 minut, poté 40 cyklů 10 s při 95 stupních , 30 s při 55 stupních a 10 s při 55 stupních -95 stupňů pro prodloužení, následovaných jediné měření fluorescence. Konečné výsledky byly popsány s relativními hodnotami (2_AACt). Výpočet a analýza byly provedeny pomocí iQ5 Real Time PCR Detection System.
4.11. Analýza Western Blot
Extrakty celých buněk byly připraveny za použití pufru pro radioimunoprecipitační test (RIPA) (Thermo Fisher Scientific, Inc.) s 1 procentem Halt inhibitoru proteázy a 1 procentem koktejlů Halt inhibitoru fosfatázy (Thermo Fisher Scientific, Inc.). Celkový protein byl použit pro detekci smad2, p-smad2, smad3, p-smad3 a smad7. Koncentrace proteinu byla měřena a kvantifikována Bradfordovou metodou. Protein (10-30 Rg) byl separován na 10 procent SDS-PAGE gelu a přenesen na polyvinylidenfluoridové (PVDF) membrány (Millipore, Boston, MA, USA). Membrány byly blokovány po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti pomocí 5% hovězího sérového albuminu a primárních protilátek (polyklonální protilátka smad2, protilátka p-smad2, králičí mAb smad3 a králičí mAb p-smad3, ředění 1:1000; králičí mAb smad7, 1 :200 ředění, p-aktinová monoklonální protilátka, 1:5000 ředění) byly inkubovány při 4 stupních přes noc. Odpovídající Alk-Phos. konjugované sekundární protilátky byly inkubovány při teplotě místnosti. Nakonec byly membrány třikrát promyty 1 x Tris-HCl fyziologickým roztokem s 0,1 procenta Tween 20 a signály byly skenovány a vizualizovány zobrazovacím systémem GEL DOC XR (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). Na sledovaných proteinech byla provedena denzitometrická analýza a normalizována na p-aktin pomocí softwaru GEL DOC Image Studio (Bio-Rad). p-aktin byl použit jako vnitřní kontrola.
4.12. Statistická analýza
Data byla vyjádřena jako průměr ≥ standardní odchylka (SD). Statistické analýzy byly provedeny pomocí softwaru SPSS 16.0 (Xinjiang Medical University). K analýze hodnot IC50 byla použita probitová analýza. Významnost rozdílu byla vypočtena pomocí jednocestného testu ANOVA a hodnoty s p < 0,05="" byly="" považovány="" za="" statisticky="">
5. Závěry
Závěrem lze říci, že CPhG z C. tubulosa a jeho složky echinakosid a akteosid vykazují významné antifibrotické účinky. Mezi nimi je aktivita akteosidu nejsilnější, zatímco aktivita CPhG je mezi těmito dvěma sloučeninami. Inhibice aktivace signalizace TGF-p1/Smad může být základním mechanismem, kterým CPhG chrání před chronickým jaterním onemocněním spojeným s fibrózou, a echinakosid a akteosid jsou účinným antifibrotickým materiálovým základem C. tubulosa.
Poděkování:Tento výzkum byl podporován National Natural Science Foundation of China (81260624). Autoři by rádi vyjádřili své upřímné poděkování profesoru Tao Liuovi za jeho zlepšení psaní v tomto článku.
Příspěvky autora:Experimenty vymysleli a navrhli TL, JZ, S.-PY, LM a S.-LZ. S.-PY, TL a JZ analyzovaly data. S.-PY a JZ napsali rukopis. TL, LM a JZ rukopis recenzovali. Všichni autoři přečetli a schválili konečný rukopis.
Střet zájmů:Autoři neprohlašují žádný střet zájmů.
Reference
1. Subramoniam, A.; Pushpangadan, P. Vývoj fytomedicíny pro onemocnění jater. Ind. J. Pharmacol. 1999, 31, 166-175.
2. Friedman, SL Mechanismy onemocnění: Mechanismy jaterní fibrózy a terapeutické důsledky. Nat. Clin. Praxe. Gastroenterol Hepatol. 2004,1, 98-105. [CrossRef] [PubMed]
3. Friedman, SL; Roll, FJ; Boyles, J.; Bissell, DM Jaterní lipocyty: Hlavní buňky normálních potkaních jater produkující kolagen. Proč. Natl. Akad. Sci. USA 1985, 82, 8681-8685. [CrossRef] [PubMed]
4. Friedman, SL; Bansal, MB Zvrat jaterní fibrózy一Fakt nebo fantazie? H叩atologie 2006, 43, S82-S88. [CrossRef] [PubMed]
5. Ahmad, A.; Ahmad, R. Pochopení mechanismu jaterní fibrózy a potenciálních terapeutických přístupů. Saudi J. Gastroenterol. 2012, 18, 155-167. [CrossRef] [PubMed]
6. Petr, H.; Havran; Zhang, LB Orobanchaceae Ventenat. In Flora of China, 23. vydání; Redakční výbor Flora of China: Čínská akademie věd, Peking, Čína, 2013; str. 1-16.
7. Komise pro čínský lékopis Ministerstva zdravotnictví Čínské lidové republiky. Čínský lékopis; Část 1; Nakladatelství chemického průmyslu: Peking, Čína, 2010; p. 126.
8. Li, J.; Huang, D.; He, L. Vliv roucongrongu (Herba Cistanches Deserticolae) na reprodukční toxicitu u myší indukovanou glykosidem Leigongteng (Radix et Rhizoma Tripterygii). J. Tradit. Brada. Med. 2014, 34, 324-332. [CrossRef]
9. Xing, Y.; Liao, J.; Tang, Y.; Zhang, P.; Tan, C.; NIH.; Wu, X.; Li, N.; Jia, X. ACE a inhibitory agregace krevních destiček z Tamarix hohenackeri Bunge (hostitelská rostlina Herba Cistanches) rostoucí v Xinjiang. Pharmacogn. Mag. 2014, 10, 111-118. [PubMed]
10. Jia, Y; Guan, Q.; Jiang, Y.; Salh, B.; Guo, Y.; Tu, P.; Du, C. Zlepšení kolitidy vyvolané dextransulfátem sodným u myší extraktem z Cistanche tubulosa obohaceným echinakosidem. Phytother. Res. 2014, 28, 110-119. [CrossRef] [PubMed]
11. Wong, HS; Ko, KM Herba Cistanches stimuluje buněčnou redoxní cyklizaci glutathionu pomocí reaktivních forem kyslíku generovaných mitochondriální respirací v kardiomyocytech H9c2. Pharm. Biol. 2013, 51, 64-73. [CrossRef] [PubMed]
12. Martin, A.; Clynes, M. Kyselá fosfatáza: Koncový bod pro testy toxicity in vitro. Vitro Cell. Dev. Biol. 1991, 27, 183-184. [CrossRef]
13. Lechuga, CG; Hernandez-Nazara, ZH; Dominguez Rosales, JA; Morris, ER; Rincon, AR; Rivas-Estilla, AM; Esteban-Gamboa, A.; Rojkind, M. TGF-01 moduluje expresi matricové metaloproteinázy-13 v jaterních hvězdicových buňkách komplexními mechanismy zahrnujícími p38MAPK, PI3-kinázu, AKT a p70S6k. Dopoledne. J. Physiol. Gastrointest Fyziol jater. 2004, 287, G974-G987. [CrossRef] [PubMed]
14. Nguyen, J.; Tang, SY; Nguyen, D.; Alliston, T. Load reguluje tvorbu kosti a expresi sklerostinu prostřednictvím mechanismu závislého na TGFp. PLoS ONE 2013, 8, e53813. [CrossRef] [PubMed]
15. Pessah, M.; Marais, J.; Prunier, C.; Ferrand, N.; Lallemand, F.; Mauviel, A.; Atfi, A. C-Jun se spojuje s onkoproteinem Ski a potlačuje transkripční aktivitu Smad2. J. Biol. Chem. 2002, 277, 29094-29100. [CrossRef] [PubMed]
16. Ding, N.; Yu, RT; Subramaniam, N.; Sherman, MH; Wilson, C.; Rao, R.; Leblanc, M.; Coulter, S.; On, M.; Scott, C.; a kol. Receptor vitaminu D / genomový okruh SMAD hradly jaterní fibrotickou odpověď. Buňka 2013, 153, 601-613. [CrossRef] [PubMed]
17. Yang, FR; Fang, BW; Lou, JS Účinky pilulek Fufang Biejia Ruangan na jaterní fibrózu in vivo a in vitro. World J. Gastroenterol. 2013, 19, 5326-5333. [CrossRef] [PubMed]
18. Sakaida, I.; Hironaka, K.; Kimura, T.; Terai, S.; Yamasaki, T.; Okita, K. Herbal medicine Sho-saiko-to (TJ-9) zvyšuje expresi matricových metaloproteináz (MMP) se sníženou expresí tkáňového inhibitoru metaloproteináz (TIMP) v krysích hvězdicových buňkách. Life Sci. 2004, 74, 2251-2263. [CrossRef] [PubMed]
19. Chen, M.; Chen, J.; Tsai, C.; Wang, W.; Chang, D.; Tu, DG; Hsieh, HY Role TGF-01 a cytokinů v modulaci jaterní fibrózy pomocí Sho-saiko-to v modelu s ligací žlučovodu u potkana. J. Ethnopharmacol. 2005, 97, 7-13. [CrossRef] [PubMed]
20. Bolarin, DM; Azinge, EC Biochemické markery, extracelulární složky u jaterní fibrózy a cirhózy. Nig. QJ Hosp. Med. 2007, 17, 42-52. [CrossRef] [PubMed]
21. Kong, D.; Zheng, S.; Lu, Y. Zdroj a role myofibroblastů v jaterní fibróze. Brada. Pharmacol. Býk. 2011, 27, 297-300.
22. De Lavor, MSL; Binda, NS; Fukušima, FB; Caldeira, FMC; Da Silva, JF; Silva, CMO; de Oliveira, KM; Martins Bde, C.; Torres, BB; Rosado, IR; a kol. Ischemicko-reperfuzní model v míše krys: Studie viability buněk a apoptózy. Int. J. Clin. Exp. Pathol. 2015, 8, 9941-9949. [PubMed]
23. Bahadar, H.; Maqbool, F.; Niaz, K.; Abdollahi, M. Toxicita nanočástic a přehled současných experimentálních modelů. Írán Biomed. J. 2016, 20, 1-11. [PubMed]