Echinakosid podporuje proliferaci lidských renálních tubulárních epiteliálních buněk blokováním HBX/TREM2 zprostředkované NF‑κB signální dráhy

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

YuFan ZHanG, QinFanG Wu, liMin ZHonG, donGWei GonG

Abstraktní.

Protein X viru hepatitidy B (HBX) je nezbytný pro replikaci HBV a hraje roli v progresi hepatitidy u lidí. Avšak základní funkce HBX během HBV-indukované chronické glomerulonefritidy (HBV-Gn) není známa. (echinakosid z cistanche)(ecH) je fenylethanoidní glykosid z rodu Cistanche, který má silné antiapoptotické a neuroprotektivní účinky. v této studii byla zkoumána funkce HBX a vztah mezi HBX a ecH v lidských renálních tubulárních epiteliálních buňkách (rTecs; HK-2 buněčná linie). Pro kvantifikaci hladin exprese mRNA a proteinů HBX v buňkách HK-2 byly použity kvantitativní analýzy Pcr s reverzní transkripcí a western blot. K analýze buněčné proliferace byl proveden test Kit počítání buněk-8. Pro stanovení rychlosti apoptózy byla použita průtoková cytometrická analýza. HBX vykazoval antiproliferativní a proapoptotické účinky v HK-2 buňkách a byl pozitivně spojen se spouštěcím receptorem exprimovaným na expresi myeloidních buněk 2 (TreM2). Kromě toho ECH narušila funkci HBX v buňkách HK-2, fungující jako supresor HBX. K dalšímu zkoumání vztahu mezi HBX a nF-KB byl navíc použit specifický inhibitor NF‑κB, PdTc. Výsledky naznačují, že nF-KB se podílel na signální dráze HBX/TreM2 a negativně reguloval expresi TreM2 v RTECS. Tato studie poskytla nové poznatky o funkci HBX a také naznačila potenciální hodnotu ECH jako terapeutického činidla pro HBV-Gn.

Úvod

Virus hepatitidy B (HBV) je virus Hepadnaviridae, který vede k akutní a chronické hepatitidě u lidí (1). HBV nejenže způsobuje perzistentní nebo přechodnou infekci v játrech, ale také infikuje extrahepatální tkáň, včetně slinivky břišní, žlučovodu, lymfoidního systému a ledvin (2). Kromě toho je infekce HBV úzce spojena s chronickou glomerulonefritidou (HBV-Gn); molekulární mechanismy HBV během HBV-Gn však nejsou zcela pochopeny (3,4).

Pro replikaci HBV je nezbytný regulační protein viru X viru hepatitidy B (HBX) HBV (5,6). řada studií uvádí, že HBX podporuje buněčnou proliferaci během hepatokarcinomu spojeného s infekcí HBV (7-9). Lidské renální tubulární epiteliální buňky (rTec) jsou hlavní součástí renálního tubulárního intersticia a hrají aktivní roli při zánětu ledvin (10). Apoptóza rTec je úzce spojena s dysfunkcí tubulárního intersticia, která následně vede k progresi HBV-Gn (10). HBX je primárně exprimován v buňkách rTec a způsobuje apoptózu rTec a léze ledvinových trubic u pacientů s HBV-Gn (11,12). Dále bylo hlášeno, že HBX potlačuje proliferaci potkaních rTecs (13) a nadměrná exprese HBX urychluje progresi buněčného cyklu z G1 do S fáze v primárních rTecs, což vede k zastavení buněčného cyklu v S fázi (14). Identifikace inhibitoru HBX tedy může poskytnout nové léčivo pro HBV-Gn. Přesná molekulární síť HBX v lidských rTec však není zcela objasněna.(echinakosid z cistanche)(ecH) je přírodní sloučenina extrahovaná zCistancherostlin, který vykazuje antiapoptotické a protizánětlivé účinky (15,16). Předchozí studie uvedla, že ecH indukuje proliferaci a zabraňuje apoptóze střevních epiteliálních buněk (17). Kromě toho bylo hlášeno, že ecH urychluje regeneraci kostí zvýšením proliferace buněk osteoblastů (18). ecH může také snížit replikaci HBV, expresi antigenu a zánět ve střevních epiteliálních buňkách potkana (16,19). Biologický účinek ecH na rTec však nebyl plně objasněn.

Nadměrná exprese TreM2 podporovala proliferaci gliomových buněk (22). Naproti tomu knockdown TreM2 snižuje translokaci nF-κB do jádra v buňkách degenerativního lidského nucleus pulposus (23). Kromě toho byl TreM2 identifikován jako nový terapeutický cíl pro degeneraci lidské meziobratlové ploténky (23). Biologická funkce TreM2 v lidských rTec však nebyla hlášena. v této studii byla nadměrná exprese HBX (oeHBX) indukována v lidských rTecs (buněčná linie HK-2) ​​a následně účinek ecH(echinakosid z cistanche) na transfekovaných buňkách oeHBX. Cílem této studie bylo prozkoumat funkce HBX a potenciální hodnotu ecH jako účinného terapeutického činidla pro HBV-Gn.

Materiály a metody

Buňka kultura.Lidská buněčná linie rTec HK-2 byla zakoupena od společnosti Shanghai Yaji Biotechnology co., ltd. HK-2 buňky byly kultivovány v médiu DME/F12 (kat. č. SH30023.01B; Hyclone; cytiva) doplněném 10 procenty fetálního bovinního séra (kat. č. 16000‑044; Gibco; Thermo Fisher Scientific, inc .), 2 mM l-glutaminu a 1 procento penicilin/streptomycin (kat. č. P1400-100; Beijing Solarbio Science & Technology co., Ltd.) při 37 °C s 5 procenty CO2.

RNA izolace a zvrátit transkripčně-kvantitativní PCR (RT‑qPCR).Celková rna byla extrahována z buněk HK-2 pomocí Trizol® (kat. č. 1596 -026; Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.), podle protokolu výrobce. Celková RNA byla reverzně transkribována do cDNA pomocí soupravy First-Strand cDNA Synthesis kit podle protokolu výrobce (kat. č. K1622; Thermo Fisher Scientific, Inc.). qPCR byla provedena s použitím SYBr-Green premixu podle protokolu výrobce (kat. č. K0223; Thermo Fisher Scientific, Inc.) na detektoru ABI-7300 v reálném čase (Applied Biosystems; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Podmínky PCR byly: 95 °C po dobu 10 minut následovaných 40 cykly 95 °C po dobu 15 sekund, 60 °C po dobu 45 sekund. Pro každou reakci bylo potřeba tři opakování. Pro qPCR byly použity následující páry primerů: HBX dopředný, 5'-GGcTGcTaGGTTGTacTG-3' a reverzní, 5'-caGaGGTGaaGcGaaGTG -3'; TreM2 vpřed, 5'-TGGcacTcTcaccaTTacG-3' a vzad, 5'-ccTccc aTcaTcTTccTTcac-3'; a GaPdH vpřed, 5'-AAT cccaTcaccaTcTTc-3' a zpět, 5'-aGGcTGTTG TcaTacTTc-3'. Hladiny mRNA byly kvantifikovány pomocí metody 2‑ΔACq a normalizovány na vnitřní referenční genGAPDH (24).

Nadměrná exprese a srazit.K indukci nadměrné exprese HBX a TreM2 byly sekvence cDNA HBX nebo TreM2 v plné délce vloženy do vektoru plVX-puro (cleantech laboratories, Inc.) dvojitým štěpením (Zadníiii aEcoRI). Následně byl rekombinovaný plazmid (1,5 ug) transfekován do buněk HK-2 (2x105). Falešný plazmid (prázdný vektor, 1 µg) byl přechodně transfekován do buněk HK-2 (2x105) jako negativní kontrola (oenc) pomocí lipofectamine® 2000 (kat. č. 11668-027, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). eH(echinakosid z cistanche)(kat. č. 82854-37-3; Biopurify Phytochemicals, ltd.) byl rozpuštěn v DMSO (kat. č. d2650; Sigma-Aldrich; Merck KGaa) v koncentraci 1, 2,5, 5, 10, 20 a

50 mg/l v uvedeném pořadí; a přidán do kultury transfekovaných buněk oeHBX nebo oeTreM2. Následný experiment začal o 48 hodin později.

Pro snížení exprese TreM2 byly syntetizovány tři malé interferující (si)RNA (siTreM2-1, siTreM2-2 a siTreM2-3; 20 µM) zacílené na TreM2 (Shanghai Majorbio Bio-Pharm Technology co . ltd.) a následně transfekovány do buněk HK-2 (2x105) za použití lipofectamine® 2000 podle protokolu výrobce (Invitrogen; Thermo Fisher Scientific, Inc.). Jako negativní kontrola byla použita nespecifická míchaná sekvence siRNA (5'uucuccGaacGuGucacGu3, 25 nM) si-negativní kontrola (nc). Cílený lokus a sekvence sirna TreM2 jsou uvedeny v tabulce Si. Následný experiment byl proveden o 48 hodin později.

Západní blotování.Celkový protein byl extrahován z buněk HK-2

za použití RIPA lyzačního pufru (kat. č. BYl40825; Jrdun Biotech Co., Ltd.). Celkový protein byl kvantifikován pomocí testovací soupravy Bicinchoninic Acid (kat. č. PICPI23223; Thermo Fisher Scientific, Inc.) podle protokolu výrobce a 20 ug proteinu/dráha bylo separováno pomocí SDS-PaGe na 15% gelu. Denzitometrie vzorků byla stanovena pomocí čtečky mikrodestiček (dnM-9602, Pulangxin). Následně byly separované proteiny přeneseny na PVDF membránu. Po blokování 5% odtučněným sušeným mlékem po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě byla membrána inkubována s primárními protilátkami (tabulka SII) při 4 °C přes noc a znovu inkubována se sekundární protilátkou anti-myší igG (1:1, 000, kat. č. a0216, Beyotime Institute of Biotechnology) po dobu 1 hodiny při 37˚C. Imunoreaktivní proteinové pásy byly vizualizovány pomocí systému ecl (cytiva). Bloty byly provedeny trojmo.GAPDHa H3 byly použity jako kontroly nanášení pro cytoplazmatické a jaderné proteiny, v daném pořadí.

Výsledek

ECH (echinakosid z cistanche)potlačuje funkce z HBX v HK-2 buňky.Posoudit

funkce HBX, nadměrná exprese HBX byla indukována v HK-2 buňkách. Relativní hladiny mrna a proteinu HBX byly významně upregulovány v buňkách oeHBX ve srovnání s buňkami oenc (obr. 1a a B). Následně byly oeHBX buňky kultivovány s různými koncentracemi ecH (1, 2,5, 5, 10, 20 a 50 mg/l; el, e2,5, e5, el0, e20 a e50, v daném pořadí). Nadměrná exprese HBX významně snížila proliferaci buněk HK-2 a tento pokles byl zvrácen pomocí ecH způsobem závislým na dávce po 24 a 48 hodinách (obr. 1c).

Kromě toho rychlost proliferace buněk oeHBX nevykazovala žádný významný rozdíl ve srovnání s buňkami ošetřenými E1 (obr. 1c). Naproti tomu ošetření el0 významně zvýšilo rychlost proliferace buněk oeHBX ve srovnání s ošetřením E20 a E50, které nevykazovalo žádný významný rozdíl (obr. 1c). Proto byl vliv ecH na apoptózu zkoumán v buňkách ošetřených e2.5, e5 a e10-. Nadměrná exprese HBX významně zvýšila apoptózu buněk HK‑2 a míra apoptózy buněk oeHBX se snižovala s léčbou eH způsobem závislým na dávce (obr. 1d). celkově výsledky naznačují, že ecH inhibuje funkci HBX v buňkách HK-2 způsobem závislým na dávce.

TREM2 výraz je inhibována podle ECH(echinakosid z cistanche) v transfekované oeHBX

buňky.rT-qPcr a western blotting byly použity ke zkoumání relativních hladin exprese mrna a proteinu TreM2 v buňkách oeHBX, v daném pořadí. Hladiny exprese TreM2 mrna a proteinu byly významně upregulovány v buňkách oeHBX ve srovnání s buňkami oenc (obr. 2a a B). ecH však snížila hladiny exprese TreM2 v transfekovaných buňkách oeHBX způsobem závislým na dávce (obr. 2a a B). Výsledky tedy naznačovaly, že exprese HBX byla pozitivně spojena s expresí TreM2, a dále naznačovaly supresivní účinek ecH na HBX v buňkách HK-2.

Srazit a nadměrná exprese z TREM2 v HK-2 buňky.K dalšímu posouzení funkce TreM2 byly v buňkách HK-2 indukovány knockdown a nadměrná exprese TreM2 pomocí interference rna a lentivirového vektoru, v daném pořadí. Pro knock-down test tři siRNA zacílené na lidský genTREM2(siTreM2-1, siTreM2-2 a siTreM2-3) byly transfekovány do buněk HK‑2 a nespecifická siRNA byla použita jako negativní kontrola (sinc). všechny tři sirna TreM2 úspěšně srazily endogenní expresi TreM2 v buňkách HK-2 (obr. 3a a B). Nejnižší relativní hladiny exprese TreM2 mrna a proteinu však byly pozorovány u buněk transfekovaných siTreM2-1 a siTreM2-2-(obr. 3a a B), tedy siTreM2-1 a siTreM{{13 Transfekované buňky byly vybrány pro následné experimentování. Pro experimenty s nadměrnou expresí byl zkonstruován plazmid obsahující úplnou lidskou sekvenci TreM2cdna a následně transfekován do buněk HK-2 (oeTreM2). A

falešný plazmid sloužil jako negativní kontrola (oenc). Úroveň exprese TREM2 byla významně zvýšena u buněk oeTREM2 ve srovnání s buňkami oenc (obr. 3c a d). Proto byly pro následné experimenty použity buňky oeTreM2.

TREM2 umlčování klesá a apoptóza z oeHBX buňky.Byl hodnocen profil apoptózy buněk oeHBX transfekovaných siTREM2 nebo sinc. Rychlost apoptózy oeHBX plus sinc buněk byla významně vyšší ve srovnání s otevřenými buňkami. Rychlost apoptózy však byla významně snížena u buněk oeHBX plus siTreM2-1 nebo siTreM2-2 ve srovnání s buňkami oeHBX plus sinc (obr. 4a). Výsledky naznačují, že knockdown TreM2 inhiboval funkci HBX během apoptózy HK-2 buněk.

Survivin patří k inhibitoru rodiny proteinů apoptózy, který inhibuje apoptotickou aktivitu a potlačuje buněčnou smrt (25). Targeting Survivin byl identifikován jako nový přístup k léčbě renálního karcinomu (26). nF-κB je také inhibitor apoptózy, který hraje roli v antiapoptotických nádorových procesech (27). Kromě toho je aktivace kaspázy 3 úzce spojena s apoptózou (28). v této studii byl kvantifikován obsah proteinů TreM2, Survivin a štěpené kaspázy3 v buňkách HK‑2. Úroveň exprese TREM2 byla významně snížena u buněk oeHBX plus siTreM2-1/2 ve srovnání s buňkami oeHBX plus sinc (obr. 4B). Úroveň exprese survivinu byla významně zvýšena u buněk oeHBX plus siTreM2-1/2 ve srovnání s buňkami oeHBX. kromě toho byla hladina exprese štěpené kaspázy3 významně snížena u buněk oeHBX plus siTreM2-1/2 ve srovnání s buňkami oeHBX plus sinc (obr. 4B). Kromě toho oeHBX významně snížila translokaci NF‑κB do jádra a transfekce siTREM2‑1/2 významně zvýšila nukleární translokaci nF‑κB (obr. 4B). Celkově vzato výsledky naznačují, že TreM2 byl downstream faktorem HBX v buňkách HK-2, proto by HBX mohl podporovat apoptózu regulací exprese TreM2 v lidských rTecs.

TREM2 nadměrná exprese potlačuje a translokace zNF-κB na a jádro v HK-2 buňky.Účinek eH(echinakosid z cistanche)na oeTreM2-transfekovaných buňkách. Nadměrná exprese TreM2 podpořila apoptózu buněk HK-2 (obr. 5a). Apoptóza buněk oeTREM2 byla významně snížena ošetřením ECH (E10; obr. 5A). Kromě toho ECH významně snížila expresi TreM2 v buňkách oeTreM2. Nadměrná exprese TREM2 významně snížila hladiny exprese survivinu, avšak tento pokles exprese byl zvrácen pomocí ecH. kromě toho byly hladiny proteinové exprese štěpené kaspázy3 významně zvýšeny v buňkách oeTreM2 ve srovnání s buňkami oenc; účinek, který byl významně snížen léčbou ECH. Kromě toho ecH podporoval translokaci nF-KB do jádra v buňkách oeTreM2 (obr. 5B). Celkově vzato výsledky ukázaly, že ecH také potlačila funkci TreM2 v lidských rTec buňkách.

Funkce HBX jsou potlačeno podle a NF-κB inhibitor PDTCv člověk RTECs.K dalšímu posouzení vztahu mezi

Buňky HBX a nF-κB, HK‑2 byly kultivovány se specifickým inhibitorem nF-κB, PdTc (10 µmol/l; P10). Rychlost buněčné apoptózy buněk oeHBX byla významně zvýšena ve srovnání s buňkami oenc (obr. 6a). Nicméně buňky oeHBX plus PdTc vykazovaly významně zvýšenou míru apoptózy ve srovnání s buňkami oeHBX. Kromě toho se relativní hladiny exprese mRNA a proteinu TreM2 u buněk oeHBX plus PdTc ve srovnání s buňkami oeHBX snížily (obr. 6B). Proto výsledky

navrhl, že nF-kB negativně reguloval expresi TreM2 v oeHBX-transfekovaných buňkách.

NF-κB inhibitor PDTC potlačuje TREM2 promotér aktivita v oeHBX buňky.byl zkonstruován luciferázový reportér (pGl{0}}enhancer-luc2) obsahující promotorovou sekvenci divokého typu TreM2 (pGl3-enhancer-luc2-pTreM2) a následně transfekován do oenc, oeHBX a oeHBX plus P10 kultivované buňky.

Aktivita luciferázy reportérového vektoru obsahujícího promotor TREM2 divokého typu byla významně zvýšena u buněk oeHBX ve srovnání s buňkami oenc. PdTc však významně potlačoval luciferázovou aktivitu reportéru v buňkách oeHBX (obr. 7). celkově výsledky ukázaly, že PdTc inhiboval transkripci TreM2 potlačením promotorové aktivity TreM2 v buňkách oeHBX.

Diskuse

HBX je primárně exprimován v rTecs pacientů s HBV-Gn a funguje jako determinant virové patogeneze (11,29). Proto je zvyšování znalostí o funkci sítě molekul HBX kritickým krokem ve vývoji nového přístupu k léčbě HBV-Gn. Cílem této studie bylo dále prozkoumat funkci HBX a prozkoumat jeho potenciální molekulární síť v lidských rTecs.

HBX inhibuje proliferaci rTecs (11). v této studii byly identifikovány antiproliferační a proapoptózové funkce HBX v lidských RTEC, což naznačuje, že HBX potlačuje rozvoj lidských rTecs. Předchozí studie ukázala, že ecH(echinakosid z cistanche)inhibuje replikaci HBV a expresi antigenu (19). v této studii eH(echinakosid z cistanche)léčba narušila funkci HBX v buňkách HK-2, proto může být HBX ovlivněna eH v buňkách HK-2.

ZPRÁVY o molekulární medicíně 22: 1137-1144, 2020 1143

Kromě toho výsledky naznačovaly, že ech(echinakosid z cistanche)může sloužit jako potenciální terapeutické činidlo pro HBV-Gn.

TreM2 je vrozený imunitní receptor, který hraje roli v zánětlivé odpovědi (30). V této studii byla exprese HBX pozitivně spojena s expresí TreM2 v lidském RTECS. Kromě toho knockdown TREM2 významně snížil rychlost apoptózy buněk oeHBX a ecH(echinakosid z cistanche)léčba snížila účinek oeTreM2 na buněčnou apoptózu. Celkově vzato tyto výsledky naznačují, že TreM2 byl cílen HBX v buňkách HK-2. Proto eH(echinakosid z cistanche)může inhibovat apoptózu lidských rTec blokováním aktivity signální dráhy HBX/TreM2.

Předchozí zpráva prokázala, že nF-KB nejen hraje roli v buněčné apoptóze, ale také se podílí na regulaci imunitních odpovědí a zánětu (31). Kromě toho je TreM2 zprostředkován nF-κB-senzitivní mikroRNA-34a během Alzheimerovy choroby a makulární degenerace (32,33). v této studii byla apoptotická rychlost buněk oeHBX významně zvýšena v přítomnosti PdTc. Podle našich nejlepších znalostí tato studie poprvé naznačila, že inhibitor NF‑κB PdTc potlačoval promotorovou aktivitu TreM2. Výsledky dále naznačovaly, že TreM2 negativně reguloval translokaci nF-KB do jádra v buňkách HK-2, ale byl pozitivně spojen s hladinami exprese štěpené kaspázy3. TreM2 hrál v buňkách HK-2 opačnou roli než v buňkách lidského degenerativního nucleus pulposus a gliomu (22,23). Proto tato studie naznačuje, že TreM2 může mít různé funkce v různých typech lidských buněk.

Souhrnně řečeno, tato studie nejen ukázala, že nF-KB byl novou složkou signální dráhy HBX/TreM2, ale také naznačila, že nF-KB negativně reguluje expresi TreM2 v lidských rTecs. Hlavním omezením této studie však byl nedostatekv vivoexperimenty a klinická data. Proto dálev vivoa klinické studie jsou nutné k potvrzení zjištění této studie.

v této studii funkce ecH(echinakosid z cistanche)byl zkoumán a výsledky naznačovaly potenciální účinky eH(echinakosid z cistanche)na signálních drahách v lidských rTecs. Kromě toho tato studie rozšířila stávající znalosti o biologické funkci ecH v lidských rTec buňkách a také navrhla její potenciál jako nového terapeutického činidla pro HBV-Gn.

Reference

1. Karayiannis P: Virus hepatitidy B: virologie, molekulární biologie, životní cyklus a intrahepatální šíření. Hepatology international 11: 1-9, 2017.

2. Seeger c a Mason WS: Biologie viru hepatitidy B. Microbiol Mol Biol rev 64: 51-68, 2000.

3. Usamae, ana Maria S, W ray K a Fervenza Fc: Léčba nefropatie spojené s virem hepatitidy B. nephron clin Pract 119: c41-c49, 2011.

4. Zhang Y, li J, Peng W, Yu G, Wang 1, chen J a Zheng F: Postinfekční akutní glomerulonefritida spojená s HBV: zpráva o 10 případech. PloS one 11: e0160626, 2016.

5. Slagle Bl a Bouchard MJ: Virus hepatitidy B X a regulace exprese virového genu. studený Spring Harb Perspect Med 6: a021402, 2016.

6. Guerrieri F, Belloni l , d'andrea d, Pediconi n, le Peral , Testoni B, Scisciani c, Floriot o, Zoulim F, Tramontano a,et al: Genomová identifikace přímých genomových cílů HBx. BMc genomics 18: 184, 2017.

7. Shi T, Hua Q, Ma Z a lv Q: downregulace mir-200a-3p indukovaná proteinem viru hepatitidy B X (HBx) podporuje buněčnou proliferaci a invazi v souvislosti s infekcí HBV hepatokarcinom. Pathol res Pract 213: 1464-1469, 2017.

8. Tian Y, Xiao X, Gong X, Peng F, Xu Y, Jiang Y a Gong G: HBx podporuje buněčnou proliferaci tím, že narušuje vzájemnou komunikaci mezi mir-181}a a PTen. Sci rep 7: 40089, 2017.

9. Idris Me, Hachem H, Koering c, Merle P, Thénoz M, Montreux F a Wattel e: HBx spouští buď buněčnou senescenci nebo buněčnou proliferaci v závislosti na buněčném fenotypu. J Viral Hepat 23: 130-138, 2016.

10. Wang X, Wangl, Zhun, Zhou Y, GulJ a Yuan WJ: Protein X viru hepatitidy B moduluje reakce T-buněk a makrofágů indukované renálními tubulárními epiteliálními buňkami. Immunol cell Biol 94: 266-273, 2016.

11. He P, Zhang d, li H, Yang X, li d, Zhai Y, Ma 1 a Feng G: Protein X viru hepatitidy B moduluje apoptózu v lidských renálních proximálních tubulárních epiteliálních buňkách aktivací JaK2/STaT3 signální dráhy. int J Mol Med 31: 1017-1029, 2013.

12. Yang Y, Wang X, Zhang Y a Yuan W: Protein X viru hepatitidy B a prozánětlivé cytokiny synergizují a zvyšují Trail-indukovanou apoptózu renálních tubulárních buněk upregulací dr4. int J Biochem cell Biol 97: 62-72, 2018.

13. He P, Zhou G, Qu d, Zhang B, Wang Y a li d: HBx inhibuje proliferaci a indukuje apoptózu prostřednictvím Fas/Fasl upregulace v renálních tubulárních epiteliálních buňkách krys. J nephrol 26: 1033, 2013.

14. Han W, luo M, He M, Zhu Y, Zhong Y, ding H, Hu G, liu l, chen Q a lu Y: Transfekce genu HBx ovlivňuje cyklus primárních renálních tubulárních epiteliálních buněk prostřednictvím regulace exprese cyklinu. Mol Med rep 18: 1947-1954, 2018.