Nikotin z otcovy strany zlepšuje paměť strachu, snižuje podávání nikotinu a mění genetickou a nervovou funkci hipokampu u potomků

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-mail:audrey.hu@wecistanche.com

Lisa R. Goldberg1*|Dana Zeid1*|Munir Gunes Kutlu2|Robert D. Cole3|Valeria Lallai4|Aswathy Sebastian5|Istvan Albert5|Christie D. Fowler4|Vinay Parikh6|Thomas J. Gould1

1Department of Biobehavioral Health, Penn State University, University Park, Pennsylvania

2Katedra farmakologie, Vanderbilt School of Medicine, Nashville, Tennessee

3 College of Pharmacy, University of Kentucky, Lexington, Kentucky

4Katedra neurobiologie a chování, University of California Irvine, Irvine, Kalifornie

5Bioinformatika, biochemie a molekulární biologie, Penn State University, University Park, PA

6Katedra psychologie, Temple University, Philadelphia, Pennsylvania

Abstraktní

Užívání nikotinu zůstává vysoce rozšířené u tabáku a elektronických cigaret konzumovaných po celém světě. Stále více důkazů o transgenerační epigenetické dědičnosti však naznačuje, že užívání nikotinu může změnit chování a neurobiologii v následujících generacích. Testovali jsme účinky chronické otcovské expozice nikotinu u myší C57BL6/J na podmiňování strachu u potomků F1 a F2, stejně jako podmíněné vymírání strachu a spontánní zotavení, samoadministraci nikotinu, hipokampální cholinergní fungování, expresi RNA a metylaci DNA u F1 potomek. Expozice nikotinu ze strany otce byla spojena se zvýšeným kontextovým a řízeným podmiňováním strachu a spontánním obnovením vzpomínek na vyhaslý strach. Dále bylo zesílení nikotinu sníženo u myší s nikotinem, jak bylo hodnoceno v paradigmatu samoaplikace. Tyto behaviorální fenotypy byly spojeny se změněnou odpovědí na nikotin, upregulovanou hipokampální vazbou na nikotinový acetylcholinový receptor, sníženým evokovaným hipokampálním cholinergním proudem a změněnou metylací a expresí hipokampálních genů souvisejících s neurálním vývojem a plasticitou. Analýza genové exprese naznačuje vícegenerační účinky na širší genové sítě potenciálně zapojené do neuroplasticity a duševních poruch. Změny v podmiňování strachu podobně naznačují fenotypy analogické úzkostným poruchám podobným posttraumatickému stresu.

KLÍČOVÁ SLOVA: cholinergní, hippocampus, učení, multigenerační, nikotin, transgenerační

účinky cistanche

1. ÚVOD

Hromadné důkazy naznačují, že dopad expozice návykovým drogám přesahuje jednotlivce a ovlivňuje fyziologické a behaviorální fenotypy u neexponovaných potomků.{0}} Charakterizace účinků nikotinu napříč generacemi je kritická vzhledem k prevalenci užívání tabákových výrobků4 a dramatickému nárůstu používání e‐cigaret.5 Prostřednictvím svých účinků na mozkové cholinergní systémy vyvolává expozice nikotinu výrazné změny mozkových funkcí, které mohou být základem závislosti na nikotinu a přispívat ke zvýšenému riziku psychiatrických poruch, včetně deprese6 a úzkosti.7 Epigenetické modifikace po cholinergní aktivaci mohou umožňují trvalé účinky na buněčnou a obvodovou funkci.8,9 Donedávna se věřilo, že tyto epigenetické modifikace byly vymazány po ustavení zárodečné linie, a tudíž sekvestrovány z následujících generací. Nicméně epigenetické modifikace, včetně metylace DNA, histonových posttranslačních modifikací a nekódujících RNA, získané v jedné generaci, mohou být zděděny v další generaci.10,11 Tyto epigenetické modifikace mohou zprostředkovat multigenerační a transgenerační účinky rodičovské expozice nikotinu na chování a neurobiologii potomků. .

Studie na hlodavcích z mnoha nezávislých laboratoří začaly identifikovat vícegenerační a transgenerační důsledky expozice rodičů nikotinu. Tato práce dosud identifikovala účinky rodičovské expozice nikotinu na depresivní a úzkostné fenotypy,1 kognitivní flexibilitu,2 chování podobné poruše pozornosti a hyperaktivitě (ADHD)3 a genovou expresi.1,2 Vícegenerační a transgenerační důsledky expozice nikotinu může ovlivnit endofenotypy zapojené do závislosti na nikotinu a duševní zdraví. Například jsme ukázali, že expozice nikotinu moduluje kontextové podmiňování strachu, model učení strachu závislého na hippocampu, který souvisí se zranitelností vůči poruchám duševního zdraví, jako je posttraumatická stresová porucha (PTSD) a závislost.12-14 Nikotin účinky na kontextové učení strachu moduluje hipokampus.15,16 Zjistili jsme, že akutní vystavení nikotinu zvyšuje učení strachu závislému na hippocampu,15,17 zhoršuje zánik kontextuálního strachu18,19 a zvyšuje spontánní zotavení kontextuálního strachu po zániku.18 Nicméně multigenerační a transgenerační účinky otcovské expozice nikotinu na tyto fenotypy nebyly studovány. Navíc žádné předchozí studie necharakterizovaly vícegenerační účinky nikotinu na cholinergní funkci. Vícegenerační dědičnost se týká fenotypů vznikajících v generaci bezprostředně po exponovaných jedincích, zatímco transgenerační dědičnost sestává z dědičnosti epigenetických informací mezi generacemi zprostředkované zárodečnou linií bez přímých vlivů prostředí, které vedou k fenotypové variaci.11 Zde jsme zkoumali jak vícegenerační a transgenerační účinky otcovské expozice nikotinu na kontextové učení a učení strachu u generace F1 a F2, stejně jako na samoadministraci nikotinu, vazbu na hipokampální nikotinový acetylcholinový receptor (nAChR), hipokampální cholinergní fungování, expresi hipokampálních genů a metylaci hipokampální DNA v generace F1. Předpokládáme, že otcovská expozice nikotinu ovlivní podmiňování strachu, expresi hipokampálních genů a funkci u potomků a vnuků.

účinky extraktu cistanche

2 METODY A MATERIÁLY

2.1 Předměty

Subjekty byli samci a samice myší C57BL/6J (věk 8-20 týdnů, Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). S výjimkou ustájení pro chov v harému byla všechna zvířata ustájena ve skupinách s 12hodinovým cyklem světlo/tma a ad libitním přístupem k potravě a vodě. Během samoaplikace bylo subjektům omezeno jídlo na 85 až 90 procent jejich volné tělesné hmotnosti a voda byla podávána ad libitum. Všechny testy chování probíhaly mezi 9:{8}} AM a 18:{10}} PM. Všechny postupy byly prováděny v souladu s NIH Guide for the Care and Use of Laboratory Animals a schváleny výbory Penn State University, Temple University nebo University of California Irvine IACUC.

2.2 Otcovská expozice nikotinu

Muži (8 týdnů) dostávali 0,9% sterilní fyziologický roztok nebo hydrogentartrát nikotinu (12,6 mg/kg/den, volná základní hmotnost – Fisher Scientific, Waltham, MA nebo MP Biomedical, Santa Ana, CA) rozpuštěný v 0,9% sterilní fyziologický roztok, podávaný subkutánně pomocí osmotických minipump (Alzet, Model 1004, Durect, Cupertino, CA) po dobu 28 dnů. Tato dávka produkuje plazmatické hladiny nikotinu a kotininu srovnatelné s hladinami pozorovanými u středně silných kuřáků.20,21

2.3 Generování myší F1 a F2

Poločas rozpadu nikotinu u myší je přibližně 6 minut.22 Již dříve bylo prokázáno, že účinky vysazení nikotinu se rozplynou do 4 dnů po odstranění nikotinu.23-25 Proto je mezi léčbou nikotinem a šlechtění bylo realizováno k zajištění systémové eliminace nikotinu před rozmnožováním. Samci myší byli umístěni do klecí se dvěma naivními samicemi C57BL/6 J (věk 8-20 týdnů) po dobu 2 týdnů, aby se vytvořili F1 potomci. F2 myši byly vytvořeny pářením naivních samců myší F1 s naivními samicemi.

2.4 Podmiňování strachu

Postupy podmiňování strachu a vyhynutí byly podrobně popsány již dříve.19 Stručně řečeno, myši byly trénovány a testovány v komorách pro tlumení hluku (18,8 × 20 × 18,3 cm, 65 dB hluku pozadí; MED Associates, St. Albans, VT). Myši F1 a F2 byly podmíněné strachem pomocí dvou párů podmíněných stimulů (CS, 30 s, 85‐dB bílý šum) – nepodmíněných stimulů (USA, 2 s, 0,57‐mA šoky do nohy) oddělených 120 sekundami. Aby se prozkoumaly akutní účinky nikotinu na podmiňování strachu u myší F1 a F2, dostali potomci akutní nikotin (0,09 mg/kg, hmotnost volné báze NIC, ip; hydrogentartrát nikotinu, Fisher Scientific) nebo fyziologický roztok (SAL) 2 až 4 minuty před na školení a testovací sezení. Dvacet čtyři hodin po tréninku byly myši vráceny do tréninkového kontextu na 5 minut, aby se vyhodnotilo kontextové zmrazení. Po kontextovém testování byly myši umístěny do oddělených komůrek, aby se vyhodnotilo učení se strachu. Experimentátoři zaslepení vůči podmínkám hodnotili zmrazení, definované jako nepřítomnost dobrovolného pohybu kromě dýchání, pomocí metody nestranného vzorkování času.19 Aby se prozkoumaly potenciální efekty stropu během cued testování, samostatná kohorta myší F1 absolvovala identický trénink pouze s jedním CS‐US bylo také zkoumáno párování a kontextové vyhasnutí strachu a spontánní zotavení. K vyhasnutí strachu došlo během pěti po sobě jdoucích sezení počínaje dnem po kontextovém a cued testu strachu. Po posledním extinkčním sezení byly myši ponechány nerušeně ve svých domácích klecích po dobu 7 dnů a poté byly znovu testovány v kontextu tréninku na spontánní zotavení. Aby se zjistilo, zda nějaké pozorované rozdíly v podmiňování strachu byly způsobeny rozdíly v citlivosti na šok, úzkosti nebo širším deficitem učení, byli samci a samice zvířat NIC‐ a SAL‐Sired dodatečně testováni v otevřeném poli, citlivost na šok, zvýšené plus bludiště ( EPM) a nová paradigmata rozpoznávání objektů (úplné metody a výsledky naleznete v části Podpůrné informace).

2.5 Jídlo a nitrožilní samoaplikace nikotinu

A separate cohort of adult SAL‐Sired and NIC‐Sired F1 mice were used for food and nicotine self‐administration studies. Beginning at 6 weeks of age, male F1 mice were weighed, mildly food‐restricted to 85% to 90% of their free‐feeding body weight, and then trained to press a lever in an operant chamber (Med Associates) for food chow pellets (20 mg; TestDiet, Richmond, IN) under a fixed‐ratio 5, time out 20 seconds (FR5TO20 sec) schedule of reinforcement (see Supporting Information for full methods). Once stable responding was achieved (>25 pelet na sezení ve třech následujících sezeních), byla subjektům katetrizována jugulární žíla v anestezii isofluran (1 procento ‐3 procenta)/kyslíkových par, jak bylo popsáno dříve. znovu odpovědět za odměnu za jídlo. Obnovení reakce na potravu zajišťuje, že se myši dostatečně zotavily po intravenózním chirurgickém zákroku a vykazovaly normální operantní odezvu po zpoždění přístupu do operantních komor. Myším pak bylo umožněno, aby si během 1 hodiny denně 6 až 7 dní v týdnu osvojily intravenózní (IV) podávání nikotinu (sůl hydrogentartrátu nikotinu rozpuštěná v 0,9% sterilním fyziologickém roztoku, {{1{101} {12}}}}.03 mg/kg/infuze, volná základní hmotnost; MP Biomedical, Santa Ana, CA). IV nikotin byl podáván injekční pumpou Razel (Med Associates). Každá relace měla dvě zatahovací páky (jedna aktivní, jedna neaktivní). Splnění kritérií odezvy na aktivní páce vedlo k podání IV infuze nikotinu (0.{{20}}objem infuze 3 ml; plán FR5TO20 s). Odezvy na neaktivní páce byly zaznamenány, ale neměly žádné plánované následky. Po osmi akvizičních sezeních v dávce 0,03 mg/kg/infuze byla infuzní dávka změněna na 0,1 mg/kg/infuzi po dobu šesti sezení. Pro každou dávku byl pro statistické analýzy použit průměrný příjem z posledních tří sezení. Katétry byly denně proplachovány fyziologickým sterilním fyziologickým roztokem (0,9 procenta w/v) obsahujícím heparin (100 USP jednotek/ml). Průchodnost katetru byla ověřena Brevitalem (methohexital sodný, Eli Lilly, Indianapolis, IN) po fázi samoaplikace nikotinu. K posouzení chování souvisejícího s relapsem byly myši testovány na inkubaci touhy po sezení bezprostředně po poslední dávce 0,1 mg/kg/infuze IV nikotinu, kterou si sám podal; v tomto postupu je myším umožněno reagovat na aktivní páku, ale nedostávají žádné infuze nikotinu. Při první základní inkubační relaci (den 1) byly myši umístěny do operačních komůrek podle schématu FR5TO20 sec s podmíněnou aktivací signálního světla. Poté byly myši umístěny v domácích klecích po dobu 20 dnů. 21. den abstinence byly myši vyšetřeny na inkubaci touhy, přičemž aktivní pákové signální světlo bylo vydáváno podle plánu FR5TO20 sec. Studie byly prováděny experimentátory zaslepenými vůči skupinovým podmínkám a behaviorální reakce byly automaticky zaznamenávány softwarem MedAssociates.

2.6 Vazba na nikotinový acetylcholinový receptor

Test vazby radioligandu16 byl proveden pomocí hippocampi z 8 týdnů starých myší NIC-Sired (5 M a 10F) a SAL-Sired (9 M a 6F) F1. Vzorky byly homogenizovány pomocí lyzačního pufru (5 mM Tris plus 5 mM EDTA plus 5 mM EGTA), centrifugovány při 100 000 g po dobu 30 minut při 4 stupních, resuspendovány v lyzačním pufru a znovu centrifugovány. Pelety byly resuspendovány v Tris/10% sacharózovém pufru a inkubovány s [3H] Epibatidinem ([3H]EB) (~2 nM na základě27,28) (specifická aktivita 54,1 Ci/mmol, PerkinElmer, Boston, MA) po dobu 1 hodinu při pokojové teplotě. [3H]EB byl vybrán pro vazbu nAChR, protože předchozí výsledky ukázaly, že hipokampální heteromerní 4 2 nAChR zprostředkovávají účinky nikotinu na podmiňování strachu.17 Nespecifická vazba byla hodnocena v přítomnosti 300 μM nikotinu (nikotin hydrogentartarátová sůl rozpuštěný v Tris pufru, koncentrace volné báze). nAChR navázané na [3H]EB byly filtrovány (24-jamkový sběrač buněk, Brandel Co, Gaithersburg, MD) a kapalinový scintilační počítač (Tri‐Carb 2810 TR, Perkin Elmer, Boston, MA) měřil radioaktivitu filtru. Specifická vazba vyjádřená jako fmol/mg tkáně byla vypočtena jako rozdíl mezi celkovou a nespecifickou vazbou.16

2.7 Amperometrické cholinergní záznamy in vivo

Samostatná kohorta naivních 10‐ až 20 týdnů starých myší NIC‐Sired a SAL‐Sired F1 byla použita k posouzení změn v hipokampálním cholinergním přenosu pomocí amperometrie. Mikroelektrody na keramické bázi (Center for Microelectrode Technology, Lexington, KY), se 4 (15 × 333 μm) platinovými záznamovými místy uspořádanými do párů (horní a spodní), byly potaženy cholinoxidázou (EC číslo 1.1.3.17; Sigma‐ Aldrich, St. Louis, MO), jak bylo uvedeno dříve.29 Elektrody byly elektropolymerizovány meta-fenylendiaminem (m-PD; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), aby se zvýšila selektivita pro detekci cholinových proudů. Mikroelektrody s citlivostí větší nebo rovnou 3 pA/μM a limitem detekce menším nebo rovným 400 nM pro cholin byly použity k poskytnutí citlivého indexu uvolňování acetylcholinu (ACh).30 Zvířata byla anestetizována uretanem (1,2‐1,5 g/kg, ip) a enzymem potažené mikroelektrody byly stereotaxicky sníženy na dorzální (A/P ‐1,7 mm, M/L ± 1,5 mm, D/V ‐2,3 mm) nebo ventrální (A/P ‐3,1 mm, M /L ± 3,0 mm, D/V −4,3 mm) hippocampus. Ventrální a dorzální hipokampus byly hodnoceny odděleně, protože rozdílně přispívají ke kontextuálnímu podmiňování strachu: ventrální hipokampus (vHPC) má významnější roli v asociaci a vyjádření strachu, zatímco dorzální hipokampus (DHCP) je kritický pro kontextovou paměť.31 Ag/ Referenční elektrody AgCl byly implantovány do kontralaterálního rostrálního kortexu.

Amperometrické záznamy byly prováděny při 2 Hz aplikací pevného potenciálu plus 0,7 V a data byla digitalizována (potenciostat FAST-16, Quainton, Nicholasville, KY). Proudy pozadí byly stabilizovány po dobu 60 minut, poté byly do hipokampu aplikovány léky pomocí skleněné kapiláry (průměr hrotu: 15 μm) připojené k elektrodě. Uvolňování ACh vyvolané depolarizací bylo měřeno aplikací buď krátkých pulzů draslíku (KCl 70 mM; 100 NL) nebo NIC (1 mM volná báze, tartrát nikotinu; 100 NL) při 2 až 10 psi každé 2 minuty. Záznamy byly vyváženy pro oblast hipokampu (dorzální nebo ventrální) a lék (draslík nebo NIC). Amplitudy cholinového signálu byly měřeny změnou proudu na enzymaticky potaženém kanálu od základního proudu a převedeny na μM ekvivalenty cholinu na základě in vitro kalibrace. Autoreferencování bylo přijato k eliminaci artefaktů odečtením proudů od sentinelových kanálů.29 Umístění mikroelektrody bylo ověřeno Nisslovým barvením řezů koronálního hipokampu (obrázek S1). Pro statistickou analýzu byly použity průměry dvou odpovědí na manipulaci s léčivem na zvíře.

2.8 Statistická analýza

Statistická srovnání byla provedena pomocí SPSS (IBM, Armonk, NY) nebo GraphPad Prism (La Jolla, CA, USA). Odlehlé hodnoty byly určeny hodnotami 2 standardní odchylky nad průměrem. Pokud byla zjištěna odlehlá hodnota, jsou informace zahrnuty do sekce výsledků. Kritérium významnosti bylo nastaveno na=0,05. Statistická analýza byla zpočátku provedena včetně pohlaví jako faktoru pro všechny experimenty testující jak mužské, tak ženské potomky. Analýzy se zhroutily napříč pohlavími, když nebyly detekovány třícestné nebo obousměrné interakce s pohlavím (P > 0,05). Data byla analyzována t-testem, 1-cestným nebo 2-cestným ANOVA, podle potřeby. Významné hlavní nebo interakční účinky byly následovány LSD post hoc srovnáním. Po opakovaných měřeních ANOVA následovalo Bonferroniho post hoc srovnání s korekcí pro vícenásobná srovnání. Pokud byly zjištěny nestejné rozptyly, byl použit Welchův t-test pro nestejné rozptyly a stupně volnosti byly zaokrouhleny dolů.

2.9 Izolace RNA/DNA

Dospělé F1 myši (8 týdnů staré; n=3 M a 3 F na skupinu) byly usmrceny cervikální dislokací. Hipokampy byly rychle rozřezány na ventrální a dorzální části (v poměru 1:1), sloučeny z levé a pravé strany a bleskově zmraženy na suchém ledu. DNA a RNA byly společně izolovány a purifikovány pomocí sady AllPrep DNA/RNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA). Koncentrace a kvalita RNA a DNA byly hodnoceny pomocí NanoDrop2000 (NanoDrop, Wilmington, DE) a Agilent Bioanalyzer (Agilent, Santa Clara, CA). Pro extrakci RNA bylo minimální číslo integrity RNA (RIN) 8,5.

2.10 Analýza transkriptomu prostřednictvím

Knihovny sekvenování RNA byly připraveny Huck Institutes of Life Sciences Genomics Core Facility (Penn State University) pro 150 bp single-end čtení pomocí Illumina TruSeq Stranded mRNA Library Prep Kit (Illumina, San Diego, CA) a sekvenováno na Illumina HiSeq 2500 v režimu rychlého běhu (tři po sobě jdoucí běhy s přibližně 10 milionem čtení na vzorek). Soubory FASTQ byly zkontrolovány pomocí FASTQC a měly průměrné skóre kvality Phred na čtení vyšší než 30 (tj. méně než 0,1 procenta chyby v sekvenování). Soubory FASTQ byly porovnány s myším referenčním genomem (mm10; UCSC Genome Browser) pomocí TopHat (v2.1.0)32 na Galaxy Project33. Manžetové knoflíčky a Cuffmerge (v2.2.1.0)34 byly použity k sestavení přepisů z mapovaných čtení a ke sloučení souborů přepisů pro konečné sestavení přepisu. Hodnoty P upravené pro falešnou míru objevování (FDR) byly vypočteny pro rozdílnou genovou expresi ze vzorků NIC-Sired a SAL-Sired pomocí Cuffdiff (v2.2.1.3),34 se standardním limitem FDR 0,05,35 byly uloženy datové soubory transkriptomu do omnibusu genové exprese.

2.11 Analýza obohacení

Diferenciálně exprimované geny byly analyzovány pomocí analýzy vynalézavosti (IPA, prosinec 2018; www.qiagen.com/ingenuity; Qiagen, Redwood City, CA, USA)36 s cílem odhalit potenciální obohacení asociativních biologických sítí. Parametry běhu specifikovaly maximálně 35 molekul na genovou síť a omezenou analýzu na tkáň nebo buněčné linie CNS savců. Statistická významnost pro obohacení byla stanovena pomocí pravostranného Fisherova exaktního testu korigovaného pro vícenásobné testování.

2.12 Cílené bisulfitové sekvenování

DNA koizolovaná s RNA (viz část 2.9) byla použita pro analýzu methylace DNA. RNA‐seq identifikovala 952 a 162 odlišně exprimovaných genů ve vHPC a DHCP, v daném pořadí. 1010 unikátních genů z těchto kombinovaných seznamů bylo vybráno pro obohacení bisulfitovým seq pomocí vlastního systému SeqCap Epi Enrichment System (Roche, Pleasanton, CA, USA; tabulka S1).38 Cílené bisulfitové sekvenování bylo provedeno v Penn State Huck Institutes of Life Sciences Genomics Core Facility. Knihovny byly zkonstruovány pomocí soupravy KAPA Hyper Prep (Kapa Biosystems, Wilmington, MA). Knihovny konvertované hydrogensiřičitanem sodným byly amplifikovány a obohaceny o vybrané genomické oblasti pomocí vlastní sady zachytávacích sond (SeqCap Epi Choice Probes; Roche, Pleasanton, CA, USA). Zachycená DNA byla sekvenována na Illumina HiSeq 2500 s použitím 100 nt párovaných-end čtení. Soubory FASTQ byly zkontrolovány prostřednictvím FASTQC. Sekvence adaptérů Illumina byly odstraněny a nekvalitní báze byly oříznuty pomocí Trimmomatic.39 Nízká kvalita oříznutí báze byla provedena pomocí posuvného okna, ořezání, když průměrná kvalita v rámci okna se čtyřmi páry bází klesla pod práh 20, s minimální délka čtení 35. Po oříznutí měly soubory FASTQ průměrné skóre kvality Phred na čtení větší než 30 (tj. méně než 0,1 procenta chyby sekvenování). Oříznuté hodnoty byly mapovány do myšího referenčního genomu (mm10) pomocí Bowtie240 implementovaného v Bismark. Methyl{20}}extrakt v Bismarku byl použit k extrakci informací o methylaci CpG a k vytvoření zpráv o methylaci. MethylKit42 byl použit pro analýzu diferenciálně methylovaných oblastí (DMR). Stav methylace byl shrnut v nepřekrývajících se oknech 500 párů bází a byla provedena diferenciální methylační analýza se standardní FDR 0,05,35. Soubory dat byly uloženy do Gene Expression Omnibus.

Přínos extraktu z cistanche

3 VÝSLEDKY

3.1 Otcovský nikotin zvyšuje kontextové podmiňování strachu a ruší akutní nikotinové posilování kontextového podmiňování strachu u myší generace F1 a F2

Samci a samice myší NIC-Sired a SAL-Sired F1 byli po akutním podání SAL nebo NIC podmíněni strachem (0.09 mg/kg ip, obrázek 1A). Kompletní analýza základního stavu, před CS a zmrazení CS je součástí podpůrných informací. 3-cestná ANOVA kontextového zmrazení s léčbou otce, akutní léčbou drogami a pohlavím jako faktory odhalila významnou interakci otec × akutní léčba drogami (F(1,36)=32.75, P <.{{27 }}01).="" protože="" nedošlo="" k="" žádné="" významné="" interakci="" mezi="" pohlavím="" a="" otcem="" nebo="" akutní="" léčbou="" drogami,="" byla="" provedena="" dvoucestná="" analýza="" anova="" zhroucená="" napříč="" pohlavími="" a="" odhalila="" významnou="" interakci="" léčbu="" otce="" ×="" akutní="" lékovou="" léčbu="" (f(1,40)="20.96" ,="" p="">< 0,001).="" post="" hoc="" srovnání="" ukázala,="" že="" myši="" nic-sired="" f1="" léčené="" fyziologickým="" roztokem="" vykazovaly="" rozšířené="" kontextové="" podmiňování="" strachu="" ve="" srovnání="" s="" myšmi="" sal-sired="" f1="" léčenými="" fyziologickým="" roztokem="" (t20="2,73," p="">< 0,05).="" v="" souladu="" s="" předchozími="" zjištěními43="" akutní="" nic="" v="" dávce="" 0,09="" mg/kg="" vyvolalo="" u="" myší="" sal‐sired="" zvýšené="" kontextové="" podmiňování="" strachu="" (t22="20,99," p="">< 0,01).="" akutní="" nic="" v="" dávce="" 0,09="" mg/kg="" však="" zhoršila="" kontextové="" podmiňování="" strachu="" u="" myší="" s="" nic="" (t18="30,36," p="">< 0,01).="" celkově="" byly="" hladiny="" kontextového="" zmrazení="" u="" nic-sired="" nic="" myší="" srovnatelné="" s="" hladinami="" pozorovanými="" u="" sal-sired="" sal="" myší="" jak="" při="" 0,09="" mg/kg="" (p=""> 0,05).

Kromě toho byli samci a samice zvířat NIC‐ a SAL‐Sired testováni v citlivosti na šok (obrázek S2), ve zvýšeném plus bludišti (EPM, obrázek S3), v otevřeném poli a v nových paradigmatech rozpoznávání objektů (obrázek S4, úplné metody viz podpůrné informace a výsledky). S výjimkou samic NIC-Sired v EPM (u kterých se projevilo zvýšené chování podobné úzkosti) a zvířat NIC-Sired s citlivostí na šok (kteří vykazovali sníženou hlasovou reaktivitu vůči šoku, což by nezmátlo zvýšený vícegenerační fenotyp učení strachu), žádné rozdíly byly detekovány mezi NIC‐ a SAL‐Sired myšmi.

OBRÁZEK ​​1 Otcovský nikotin zvyšuje kontextové podmiňování strachu a zmírňuje akutní nikotinové zesílení podmiňování strachu. Kontextové zmrazení bylo významně vyšší u kontrol NIC‐Sired plus SAL ve srovnání s kontrolami SAL‐Sired plus SAL. Akutní nikotin v dávce 0,09 mg/kg zvýšil kontextové podmiňování strachu u SAL-Sired, ale významně snížil kontextové podmiňování strachu u zvířat NIC-Sired (n=10‐12 na skupinu). B, Kontextové zmrazení bylo signifikantně vyšší u NIC‐prarodič plus SAL ve srovnání s SAL‐prarodič plus SAL kontroly (n=9‐11 na skupinu). Chybové úsečky označují standardní chybu průměru (SEM), *P <>

Aby se zjistilo, zda narušené kontextové podmiňování strachu pokračovalo do další generace (F2), byli samci a samice myší F2 vyšlechtěni z naivních samců myší F1. Kompletní analýza základního stavu, před CS a zmrazení CS je součástí podpůrných informací. Byla provedena 3-cestná ANOVA kontextového zmrazení s léčbou praotců, akutní medikamentózní léčbou a pohlavím jako nezávislými faktory (obrázek 1B). Protože neexistovala žádná významná interakce mezi pohlavím a otcem nebo akutní medikamentózní léčbou, byla provedena dvoucestná ANOVA zhroucená napříč pohlavími. Byl zjištěn významný hlavní účinek otce (F(1,37)=9.88, P <.01) a="" post="" hoc="" srovnání="" ukázala,="" že="" myši="" nic-prarodiče="" vykazovaly="" rozšířené="" kontextové="" podmiňování="" strachu.="" u="" myší="" sal-prarodiče="" (t39="3,04," p="">< 0,01).="" navíc="" myši="" sal-praotce,="" kterým="" byla="" podávána="" akutní="" nic,="" měly="" zesílené="" kontextové="" podmiňování="" strachu="" (t19="2.41," p="0.026)," ale="" akutní="" nic="" nezvýšilo="" kontextové="" podmiňování="" strachu="" u="" myší="" s="" dědečkem="">

OBRÁZEK ​​2 Otcovský nikotin zvyšuje podmíněnost vyvolaného strachu a spontánní obnovu paměti strachu. Aby se prozkoumaly potenciální efekty stropu během cued testování, samostatná kohorta myší F1 absolvovala identický trénink pouze s jedním párem CS-US. U myší NIC-Sired bylo rozšířeno jak kontextové, tak řízené podmiňování strachu ve srovnání s myšmi SAL-Sired trénovanými s 1 párováním CS-US (n=8‐10 na skupinu). B, Otcovská expozice nikotinu neovlivnila vymizení kontextuálního strachu, ale zvýšila spontánní obnovu paměti strachu 7 dní po poslední relaci extinkce (n=8‐10 na skupinu). Chybové úsečky označují standardní chybu průměru (SEM), *P <>

3.2 Otcovský nikotin zvyšuje u myší generace F1 kondicionování vyvolaného strachu

Aby se prověřilo, zda stropní efekt znemožňuje detekci skupinových rozdílů pro podmiňování vyvolaným strachem (viz Podpůrné informace), byla samostatná skupina myší F1 trénována s jedním párem CS-US. V této kohortě bylo u myší NIC-Sired zjištěno zlepšení kontextového podmiňování strachu (t7=3.21, P < 0,05),="" stejně="" jako="" podmiňování="" vyvolaného="" strachu="" (t6="2.41," p="">< .="" 05,="" obr.="">

3.3 Otcovský nikotin zlepšuje spontánní obnovu kontextové paměti strachu u myší generace F1

Kohorta myší F1, které obdržely jeden pár CS-US, byla následně testována na vyhynutí a spontánní obnovu kontextové paměti strachu. Myši F1 NIC-Sired vykazovaly normální vymírání strachu, ale vykazovaly zlepšenou spontánní obnovu kontextové paměti strachu ve srovnání s myšmi SAL-Sired (t7=3.38, P < 0.05;="" obrázek="">

3.4 Paternální nikotin snižuje samoaplikaci nikotinu

Před nácvikem samoadministrace nikotinu byly subjekty analyzovány na jejich schopnost naučit se operativní úkol pro získání odměny za jídlo a nebyly pozorovány žádné rozdíly (Podpůrné informace, obrázek S5). K testování potenciálních účinků expozice nikotinu otce na posílení nikotinu u potomků F1 bylo posouzeno získání IV samoaplikace nikotinu (0,03 mg/kg/infuze) ve dvoucestném smíšeném návrhu ANOVA, který identifikoval hlavní účinek relace (F(7,119)=13,60, P < .001)="" a="" interakce="" relace="" ×="" ošetření="" otce="" (f(7,119)="5,00," p="">< 0,001).="" post="" hoc="" testy="" však="" neodhalily="" žádné="" statisticky="" významné="" rozdíly="" mezi="" skupinami="" na="" každém="" z="" osmi="" akvizičních="" sezení="" (obrázek="" 3a).="" poté="" byl="" analyzován="" počet="" aktivních="" a="" neaktivních="" stisků="" páky,="" aby="" se="" určilo,="" zda="" si="" skupiny="" během="" akvizice="" udržely="" preferenci="" aktivní="" páky="" napříč="" relacemi="" (obrázek="" 3b),="" což="" identifikovalo="" hlavní="" účinek="" relace="" (f(7,238)="" {{20}="" },18,="" p="">< 0,001)="" a="" interakce="" relace="" ×="" léčba="" otce="" (f(21,238)="11,40," p="">< 0,001).="" post="" hoc="" analýza="" odhalila,="" že="" se="" skupiny="" lišily="" v="" první="" den="" samoaplikace="" nikotinu.="" skupina="" nic-sired="" vykazovala="" větší="" aktivní="" stlačování="" páky="" ve="" srovnání="" se="" skupinou="" sal-sired.="" tento="" účinek="" může="" představovat="" buď="" vyšší="" úroveň="" chování="" při="" hledání="" drogy="" v="" první="" den="" expozice,="" vytrvalost="" v="" reakci="" na="" odměnu="" za="" jídlo="" a/nebo="" sníženou="" kognitivní="" flexibilitu="" při="" přechodu="" reakce="" z="" jídla="" na="" drogu.="" tento="" rozdíl="" však="" nepřetrvával="" v="" dalších="" sezeních.="" myši="" sal‐sired="" vykazovaly="" konzistentní="" statisticky="" významnou="" preferenci="" pro="" aktivní="" páku="" před="" jejich="" neaktivní="" pákou="" (post="" hoc="" p="">< 0,01),="" ale="" myši="" nic‐sired="" nevykazovaly="" tuto="" udrženou="" preferenci="" pro="" sezení="" 3="" až="">

OBRÁZEK ​​3 Nikotin z otcovy strany snižuje samoaplikaci nikotinu. Samci myší NIC‐ a SAL‐Sired (n=9‐10 na skupinu) se nelišili v celkovém počtu infuzí získaných za každou relaci během období akvizice dne 0 0,03 mg/kg/infuzní dávka. B, Během akvizice se počet aktivních a neaktivních stisků páčky při prvním sezení významně lišil, přičemž nikotin u myší NIC‐Sired vykazoval větší počet aktivních stisků páčky ve srovnání s myšmi SAL‐Sired. V průběhu následujících relací však myši NIC-Sired snižovaly reakci, což vedlo k žádným významným rozdílům mezi jejich aktivním a neaktivním počtem stisknutí páky v relacích 3 až 8. Naproti tomu zvířata SAL-Sired vykazovala konzistentní statisticky významnou preferenci pro aktivní páku přes jejich neaktivní páku. C, Průměrný počet infuzí nikotinu během tří posledních akvizičních sezení se významně nelišil mezi myšmi NIC‐ a SAL‐Sired. D, Při mírné dávce 0,1 mg/kg/infuzi si myši NIC‐Sired samy aplikovaly významně nižší počet infuzí nikotinu. E, Inkubace hodnocení bažení odhalila významné zvýšení reakce na dříve aktivní páku po 21 dnech abstinence – pouze u myší SAL-Sired. Chybové úsečky označují standardní chybu průměru (SEM), *P <>

Pro další zkoumání potenciálních skupinových rozdílů při kontrole variability během počáteční fáze akvizice byl zkoumán průměrný počet infuzí nikotinu za poslední tři sezení, což je doba, kdy subjekty vykazovaly konzistentnější reakce na nikotin (obrázek 3C). Skupiny se významně nelišily v průměrném počtu infuzí nikotinu (P > 05). Poté byly myši převedeny na dávku nikotinu 0,1 mg/kg/infuzi, což se dříve ukázalo jako preferované u dospělých myší C57BL6/J.44 Při této dávce si myši NIC‐Sired samy aplikovaly nižší počet infuzí (t{ {7}},20, P < 0,05;="" obrázek="" 3d).="" pro="" inkubaci="" chování="" bažení,="" které="" je="" považováno="" za="" míru="" zvýšeného="" vyhledávání="" drog="" během="" abstinence,="" 2-cestná="" anova="" se="" smíšeným="" designem="" s="" ošetřením="" sezení="" a="" sezení="" identifikovala="" hlavní="" účinek="" sezení="" (f(1,17)="" {{16}="" },90,="" p="">< 0,001).="" zatímco="" zvířata="" sal-sired="" vykazovala="" inkubační="" účinek="" s="" většími="" odpověďmi="" 21.="" den="" abstinence="" ve="" srovnání="" se="" dnem="" 1,="" myši="" nic-sired="" nevykazovaly="" zvýšení="" chování="" při="" vyhledávání="" nikotinu="" (p=""><>

3.5 Expozice nikotinu ze strany otce mění hipokampální cholinergní vazbu a funkci

Vysokoafinitní hipokampální heteromerní vazba nAChR byla upregulována u NIC-Sired F1 myší (t28=2.14, P <.05; sal-sired="1.21" ±="" {{10}="" },043,="" nic-sired="1,34" ±="" 0,044).="" jeden="" subjekt="" (nic‐sired)="" byl="" odstraněn,="" protože="" hodnoty="" vazby="" byly="" dvě="" standardní="" odchylky="" nad="">

Amperometrické záznamy draslíkem a nikotinem evokovaných ACh proudů byly hodnoceny v F1 dHPC a vHPC. Vzhledem k nestejné velikosti vzorků podle pohlaví nebylo pohlaví v těchto analýzách zahrnuto jako předběžný faktor. Cholinergní signály vyvolané depolarizací KCl se nelišily mezi SAL‐ a NIC‐Sired myšmi v dHPC (P > 0,05; obrázek 4A); lokální aplikace nikotinu však vedla k významnému snížení amplitud cholinergního signálu u NIC‐Sired myší (t8=2.33, P <.05; obrázek="" 4c).="" u="" vhpc="" bylo="" uvolňování="" ach="" sníženo="" u="" nic-sired="" myší="" po="" aplikaci="" kcl="" (t8="2,60," p="">< 0,05;="" obrázek="" 4b)="" nebo="" nikotinu="" (t8="2,98," p="">< 0,05="" obrázek="">

OBRÁZEK ​​4 Paternální nikotin snižuje cholinergní signalizaci v hipokampu. Populace dHPC cholinové signály vyvolané KCl-indukovanou terminální depolarizací. Mezi zvířaty NIC‐ a SAL‐Sired nebyly zjištěny žádné významné rozdíly (n=5 na skupinu). B, vHPC populace cholinové signály vyvolané KCl-indukovanou terminální depolarizací byly sníženy u NIC‐Sired myší. C, Nikotinem evokovaná populace dHPC cholinové signály byly sníženy u NIC-Sired myší. D, Nikotinem evokovaná populace vHPC cholinové signály byly sníženy u NIC-Sired myší. Nebyly pozorovány žádné účinky pohlaví na cholinergní signalizaci. Chybové úsečky označují standardní chybu průměru (SEM), *P <>

3.6 Otcovská expozice nikotinu odlišně mění dorzální a ventrální hipokampální genovou expresi

Analýza hipokampálního transkriptomu F1 prostřednictvím sekvenování RNA odhalila 952 odlišně exprimovaných genů ve vHPC (FDR=0.05; tabulka S2). Z těchto genů bylo 612 downregulovaných a 340 upregulovaných u NIC‐Sired myší. V dHPC bylo pouze 162 genů odlišně exprimováno u NIC-Sired myší ve srovnání s SAL-Sired myší (FDR=0.05). Z těchto 162 genů bylo 86 regulováno směrem dolů a 76 bylo regulováno směrem nahoru. Mezi vHPC a dHPC se překrývalo sto tři genů se změněnou genovou expresí.

3.7 Expozice nikotinu ze strany otce mění transkripční cesty zapojené do vývoje nervového systému

Ve vHPC analýza IPA identifikovala nejlepší síť „Neurologická onemocnění, poškození organismu a abnormality, buněčná smrt a přežití“ (skóre=41, tabulka S3) a druhou nejvyšší síť „Vývoj a funkce nervového systému, morfologie tkání, neurologické Nemoc" (skóre=23). Prvních pět kategorií molekulárních a buněčných funkcí bylo: "morfologie buňky" (88 molekul), "buněčné sestavení a organizace" (79 molekul), "buněčný vývoj" (96 molekul), "buněčná funkce a údržba" (79 molekul), a "Celular Growth and Proliferation" (87 molekul). Nejlepší vývoj a funkce fyziologického systému byly „Vývoj a funkce nervového systému“ (175 molekul) a některé z hlavních funkcí onemocnění a poruch zahrnují „Neurologické onemocnění“ (druhá, 191 molekul) a „Psychologické poruchy“ (čtvrtá, 90 molekul ) (tabulka S4).

Jako doplněk k výsledkům IPA poskytla analýza obohacení pomocí Enrichru další důkazy o změnách v buněčném růstu a vývoji ve vHPC, s nejlepšími biologickými termíny GO včetně „sestřihu RNA“, „odpovědi na nesbalený protein“ a „regulace buněčného růstu“ a „ stabilizace proteinu“ (tabulka S5). Odpovídajícím způsobem byl "spliceosomální komplex" identifikován jako hlavní GO buněčný termín. Analýza KEGG dráhy prostřednictvím Enrichru dále poukázala na fungování spliceosomu a signalizaci MAPK jako potenciálně ovlivněné dráhy.

Navzdory podstatně kratšímu seznamu odlišně exprimovaných genů v dHPC ve srovnání s vHPC byly identifikovány podobné dráhy a termíny obohacené dHPC (tabulky S3 a S4). Analýza IPA identifikovala hlavní síť „Chování, neurologická onemocnění, organická poškození a abnormality“ (skóre=24) a druhou nejvyšší síť „Neurologická onemocnění, organická poškození a abnormality a psychologické poruchy (skóre=20) .

Pět hlavních kategorií molekulárních a buněčných funkcí v dHPC bylo „Buněčný vývoj“ (29 molekul), „Buněčný růst a proliferace“ (29 molekul), „Morfologie buněk“ (27 molekul), „Buněčné sestavení a organizace“ (23 molekul). a "Cellular Function and Maintenance" (25 molekul). „Vývoj a funkce nervového systému“ byl opět identifikován jako nejlépe obohacený termín podle klasifikace vývoje a funkce fyziologického systému (druhá, 44 molekul). Nejoblíbenější termíny v rámci klasifikace funkcí nemocí a poruch zahrnovaly „Neurologická nemoc“ (1., 51 molekul) a „Psychologické poruchy“ (pátá, 31 molekul). Analýza obohacení pomocí Enrichr identifikovala několik různých biologických termínů GO pro dHPC ve srovnání s vHPC, včetně „regulace smrti neuronů“ a „vývoje mozku“ (tabulka S5), což je komplementární k molekulární a buněčné funkci IPA „Smrt buněk a přežití“.

Pro další prozkoumání funkční role odlišně exprimovaných transkriptů překrývajících se mezi dHPC a vHPC byly hodnoceny odlišně exprimované geny společné oběma oblastem (celkem 103). Překrývající se rozdílně exprimované transkripty mezi těmito dvěma oblastmi byly všechny downregulovány nebo upregulovány ve stejném směru, což naznačuje společné změny v transkripčních drahách napříč oblastmi mozku u myší s NIC. Prvních pět kategorií molekulárních a buněčných funkcí identifikovaných pomocí IPA bylo „Smrt a přežití buněk“ (17 molekul), „Celular Movement“ (10 molekul), „Signalizace a interakce mezi buňkami“ (17 molekul), „Celular Growth“ a proliferace" (18 molekul) a "Morfologie buněk" (17 molekul) (tabulka S4)

Diferenciálně exprimované geny jedinečné pro dHPC a vHPC byly následně analyzovány odděleně v IPA, aby se otestovaly rozdílné neurobiologické adaptace mezi těmito dvěma oblastmi (tabulka S6). Mezi unikátními vHPC unikátními dHPC analýzami se nepřekrývají žádné obohacené kanonické cesty. Nejlepší obohacené kanonické dráhy jedinečné pro vHPC (celkem 44) zahrnovaly „kalciovou signalizaci“ a „signalizaci glukokortikoidního receptoru“, zatímco nejlepší kanonické dráhy dHPC (celkem osm) zahrnovaly „metabolismus hormonů štítné žlázy“ a „signalizaci apoptózy zprostředkovanou kyselinou retinovou“. Obohacené nemoci a funkce jedinečné pro vHPC (celkem 295) zahrnovaly „vznik [hipocampu] Ammon's Roh“ a „množství buněčných výběžků“, zatímco jedinečné termíny onemocnění a funkcí obohacené dHPC (celkem 111) zahrnovaly „zánět bílé hmoty“ a „demyelinizace“. ."

3.8 Otcovská expozice nikotinu mění metylaci hipokampální DNA

Byla provedena cílená analýza metylace DNA, aby se určilo, zda změněná metylace DNA v odpovídajících regulačních oblastech odpovídá za rozdílnou genovou expresi u potomků NIC-Sired F1. Cíle zahrnovaly 1114 odlišně exprimovaných genů identifikovaných buď v dHPC nebo vHPC. Ve vHPC bylo detekováno 11 odlišně methylovaných oblastí (DMR), přičemž osm vykazovalo zvýšenou methylaci a tři vykazovaly sníženou methylaci (tabulka 1). Z 11 DMR bylo 10 lokalizováno v oblastech spojených s genem, který vykazoval změněnou expresi ve vHPC. V dHPC bylo detekováno 30 DMR, přičemž 15 vykazovalo zvýšenou methylaci a 15 vykazovalo sníženou methylaci. Z 30 DMR bylo 29 lokalizováno v oblastech spojených s genem, který vykazoval změněnou expresi v dHPC.

Beneúčinek cistanche echinacosidu

4. DISKUZE

Lepší pochopení epigenetických procesů ve spojení s nedávnými daty, včetně současných zjištění, zpochybnilo tradiční chápání dědičnosti. Faktory mimo samotný genotyp mohou určovat fenotypy v následujících generacích a expozice v rámci jedné generace nemusí být sekvestrovány z potomstva. Tato studie naznačuje, že škodlivé účinky expozice nikotinu na zdraví mohou přesáhnout individuální expozici a ovlivnit následující generace. Identifikovali jsme multigenerační a transgenerační účinky předkoncepční otcovské expozice nikotinu u myší C57BL/6J na pavlovovské podmiňování strachu, což mělo za následek silnější vzpomínky na strach u potomků F1 a F2. Expozice nikotinu ze strany otce také vedla ke snížení samoaplikace nikotinu a zmírnění chování souvisejícího s relapsem, což naznačuje větší averzivní odpověď na nikotin. Na podporu těchto rozdílů v chování byly pozorovány vícegenerační změny v hipokampální cholinergní funkci a epigenetických procesech. Tyto výsledky společně poukazují na změny ve funkci nervového systému u potomků myší vystavených nikotinu, což vede ke změněným fenotypům chování.

Potomci F1 a F2 myších samců vystavených nikotinu vykazovali vylepšené kontextové a stimulované podmiňování strachu. Navzdory žádným rozdílům v kontextuálním vymírání strachu mezi NIC‐ a SAL‐Sired F1 myšmi, NIC‐Sired myši vykazovaly zvýšenou spontánní obnovu kontextových vzpomínek na strach. Důležité je, že nebyly nalezeny žádné rozdíly v citlivosti na šok mezi NIC‐ a SAL‐Sired myšmi, které by mohly být příčinou zvýšeného strachu. Posílené podmiňování strachu může naznačovat obecné zlepšení procesů učení na rozdíl od modulace procesů specifičtějších pro strach učit se. U myší NIC-Sired však nebyly pozorovány žádné změny v rozpoznávání nových objektů, operativním tréninku potravy nebo lokomoci v otevřeném poli, ačkoli byl identifikován pohlavně specifický účinek zvýšené doby otevřené paže EPM u samic myší NIC-Sired. I když to nevylučuje potenciální modifikace jiných systémů učení nebo kognitivních procesů, tato zjištění společně naznačují, že učení strachu může být citlivější na vícegenerační a transgenerační účinky otcovské expozice nikotinu. Navíc tato zjištění naznačují změněnou cholinergní funkci u zvířat NIC-Sired. Nikotin moduluje kontextové podmiňování strachu. Zatímco akutní nikotin posiluje kontextové podmiňování strachu,15,45 odvykání od chronického nikotinu narušuje kontextové podmiňování strachu.16,21 V této studii akutní nikotin zvýšil kontextové podmiňování strachu u myší F1 a F2 z myší léčených fyziologickým roztokem. Naproti tomu akutní podmiňování kontextuálního strachu u NIC-Sired myší narušilo akutní nikotinem a nemělo žádný účinek u NIC-prarodičů, což může poukazovat na změněnou cholinergní funkci v hipokampu.

Účinky otcovské expozice nikotinu na následnou samoaplikaci nikotinu u generace F1 také poukazují na narušenou cholinergní funkci. Při akvizici IV samoaplikace nikotinu v nižší dávce se skupiny nelišily v počtu infuzí nikotinu, i když ve skupině NIC‐Sired bylo zjištěno zvýšení počtu aktivních stlačení páky. To naznačuje, že myši NIC‐Sired mohly vykazovat vytrvalost v reakci na odměnu za jídlo a/nebo sníženou kognitivní flexibilitu při přechodu reakce z potravy na drogu. Je však také užitečné poznamenat, že skupiny se nelišily v den 1 inkubace bažení, což představuje relaci extinkce (např. žádné infuze nikotinu během sezení), a proto se zdá, že tento účinek byl přítomen, když jsou posilovače přepnuto, ale ne v nepřítomnosti posilovače během extinkční relace. Myši NIC‐Sired také vykazovaly sníženou samoaplikaci nikotinu ve střední dávce, což je v souladu s nedávnou prací identifikující snížení podávání alkoholu, kokainu a opioidů spojené s rodičovskou expozicí alkoholu, kokainu a morfinu (např. Vassoler et al,46 jako recenzovaný v Goldberg a Gould47). Pozorované snížení samoaplikace nikotinu lze připsat buď snížené citlivosti na odměňující účinky nikotinu a/nebo zvýšené citlivosti k averzivním účinkům nikotinu. Ve skutečnosti se skupiny lišily v mírné dávce nikotinu, ale ne v nižší dávce nikotinu, což podporuje představu zvýšené averzivní reakce s vyšší dávkou. Zajímavé je, že jsme také zjistili nedostatek inkubace bažení 21. den u NIC-Sired myší po samopodání střední dávky, což naznačuje, že snížené chování při vyhledávání nikotinu by mohlo souviset s averzí spojenou s pamětí na nikotin. Ačkoli různé nervové substráty mohou být základem těchto účinků na příjem nikotinu a reakci související s relapsem, nedávná studie zjistila, že snížená DNA metyltransferáza v hipokampální oblasti CA1 snižuje samoadministraci morfinu.48 Toto zjištění spolu se známou funkcí cholinergní hipokampální funkce procesy učení a paměti, dále podporuje představu narušeného zpracování zprostředkovaného nikotinem v hipokampu myší NIC‐Sired.

V souladu s těmito liniemi vykazovaly myši NIC-Sired zvýšenou hipokampální vazbu nAChR s vysokou afinitou. Zjistili jsme také snížení uvolňování ACh vyvolaného draslíkem u vHPC a také uvolňování ACh vyvolaného nikotinem u dHPC i vHPC zvířat NIC-Sired. Změny v uvolňování ACh vyvolané depolarizací odrážejí změněnou cholinergní funkci po vazbě na receptor, zatímco změny uvolňování ACh vyvolané nikotinem odrážejí změněnou funkci nAChR. Tato data jsou v souladu s předchozími zjištěními o upregulované vysokoafinitní vazbě nAChR po snížené funkci nAChR.49 Protože uvolňování ACh vyvolané draslíkem i nikotinem bylo změněno ve vHPC myší NIC-Sired, vHPC může být citlivější na vícegenerační účinky otcovské expozice nikotinu. Je známo, že DHPC moduluje kontextové podmiňování strachu.31,50 Inhibice vHPC narušuje stav vyvolaný i kontextovým strachem51,52 a cholinergní léze vHPC zhoršují podmiňování vyvolaného strachu.53

Bylina cistanche

Také jsme ukázali, že přímá infuze nikotinu do dHPC zvyšuje kontextové podmiňování strachu, zatímco infuze do vHPC narušuje kontextové podmiňování strachu.15 vHPC může také modulovat spontánní obnovu kontextových vzpomínek na strach, protože inaktivace vHPC-prelimbických obvodů snižuje spontánní obnovu kontextových vzpomínek na strach. 54 Zatímco jiné oblasti mozku zapojené do podmiňování strachu, jako je amygdala,55 mohou být ovlivněny také otcovskou expozicí nikotinu, tato zjištění spolu se současnými údaji naznačují, že změny ve funkci vHPC mohou být zodpovědné za změněné podmiňování strachu u NIC-Sired myší. . Předpokládali jsme, že vícegenerační účinky otcovské expozice nikotinu mohou souviset se změnami v transkripčních efektorech působících proti proudu těchto nervových systémů. Transkripční sekvenování v celém genomu u vHPC a dHPC myší generace F1 identifikovalo 1114 odlišně exprimovaných genů mezi myšmi NIC‐ a SAL‐Sired. Tento rozdíl byl větší u vHPC (952) oproti dHPC (162), v souladu s větší změnou vHPC ve srovnání s cholinergní funkcí dHPC a se změnami jak kontextuálního, tak podmiňování vyvolaného strachem. Následná analýza dráhy naznačila široké změny v transkripčních drahách spojených s glukokortikoidní signalizací a neurálním vývojem/plasticitou v obou hipokampálních oblastech.

Za účelem identifikace potenciálních adaptací specifických pro vHPC byla provedena analýza dráhy s použitím pouze transkriptů specifických pro kteroukoli hipokampální subregion. Mezi vHPC a dHPC, což jsou funkčně odlišné podoblasti hippocampu, se nepřekrývaly žádné obohacené kanonické dráhy IPA.31 Když byly odstraněny geny, které se překrývaly mezi dHPC a vHPC, nejvyšší obohacené kanonické dráhy jedinečné pro vHPC zahrnovaly „signalizaci glukokortikoidních receptorů“, což naznačuje unikátní , další změna funkce glukokortikoidů v této oblasti ve srovnání s dHPC. S cílem identifikovat upstream epigenetické regulátory, které mohou působit na genovou expresi, jsme provedli cílené sekvenování methylace DNA pomocí sestaveného seznamu dHPC a vHPC odlišně exprimovaných genů identifikovaných ze sekvenování RNA. Překvapivě jsme mezi zvířaty NIC‐ a SAL‐Sired našli pouze 11 DMR ve vHPC a 30 DMR v dHPC. Ačkoli je to neočekávané vzhledem k mnohem vyššímu počtu odlišně exprimovaných transkriptů ve vHPC, methylace DNA je pouze jedním z několika regulačních faktorů, které mohou ovlivnit genovou expresi, a metylace DNA se konzistentně nepřekládá do změněné genové exprese.56 Z 11 vHPC DMR je sedm vykazovaly methylační vzory konzistentní se směrem diferenciální transkripce (snížená transkripce se zvýšenou methylací DNA a zvýšená transkripce se sníženou methylací). Diferenciálně methylované geny ve vHPC zahrnovaly Fkbp5, Ksr1 a Pnpla2. Je zajímavé, že transkripce Fkbp5 a Ksr1 byly narušeny v jednom behaviorálním myším modelu PTSD, 57 kde byly myši vystaveny elektrickému šoku do nohou a poté byly prezentovány situační připomínky. Fkbp5 kóduje chaperon glukokortikoidního receptoru, jehož fungování je spojeno s maladaptivní prodlouženou stresovou reakcí u jedinců s PTSD a jinými úzkostnými poruchami.58

Konkrétně studie na lidech ukazují, že methylace a transkripce Fkbp5 korelují se závažností symptomů PTSD, takže zvýšená metylace a snížená transkripce předpovídají závažnější symptomologii PTSD.59,60 Exprese Fkbp5 moduluje fungování osy HPA, o níž se předpokládá, že zprostředkovává její zapojení do PTSD.59,61 Naše zjištění zvýšené spontánní obnovy paměti strachu ve spojení s dysregulací transkripčních drah spojených se signalizací glukokortikoidů u zvířat NIC‐Sired může poukazovat na zvýšenou zranitelnost vůči fenotypům podobným PTSD. V dHPC byly vzory DMR do značné míry nekonzistentní se směrem exprese diferenciálního transkriptu zjištěného sekvenováním RNA, což naznačuje, že změny v metylaci DNA vHPC produkované expozicí nikotinu z otcovy strany jsou z hlediska ovlivnění genové exprese závažnější než změny v dHPC. To je v souladu s naší identifikací většího počtu odlišně exprimovaných transkriptů a více přehnaných změn v cholinergní transmisi u NIC-Sired vHPC ve srovnání s dHPC. Náš přístup cíleného sekvenování mohl omezit schopnost detekovat potenciální transkripční regulaci distálně methylovanými sekvencemi. Budoucí výzkumy včetně analýzy metylace DNA v celém genomu, modifikací histonů a exprese malé RNA poskytnou úplnější interpretaci těchto zjištění.

Potenciálním omezením našeho návrhu expozice nikotinu je zaměření na otcovskou expozici nikotinu, abychom prozkoumali multigenerační a transgenerační dopad expozice nikotinu. Ačkoli jiné studie zjišťující multi/transgenerační fenotypy po expozici otcovským drogám, včetně kokainu46 a morfinu,62 nezjistily žádné rozdíly v péči o matku, je možné, že otcovská expozice nikotinu může ovlivnit péči o matku. Budoucí studie zkoumající dopad na péči o matku jsou opodstatněné. Vzhledem k tomu, že jsme se v současné době soustředili na otcovskou expozici, budoucí práce by měla také porovnávat dopady otcovské a mateřské expozice. Celkově tato zjištění poskytují nové chápání vícegeneračních a transgeneračních účinků expozice nikotinu, které jsou podporovány rostoucí literaturou charakterizující vícegenerační a transgenerační účinky expozice drogám (jak je uvedeno v Goldberg a Gould47). Tato studie byla první, která testovala kontextové podmiňování strachu u potomků F1 a F2 mužů vystavených nikotinu a identifikovala zvýšenou tvorbu paměti strachu a spontánní obnovu vzpomínek na strach. Tato studie byla také první, která identifikovala změněné samopodání nikotinu a inkubaci bažení u potomků F1 vystavených nikotinu.

U NIC‐Sired myší byla nalezena diferenciální metylace v genech spojených s PTSD a dysregulací osy HPA, stejně jako souběžné narušení transkripčních drah souvisejících se stresem. Otcovský nikotin byl také spojen se sníženou hipokampální cholinergní funkcí a zvýšenou hipokampální vazbou nAChR. Je zajímavé, že pacienti s posttraumatickou stresovou poruchou, kteří nekouří, vykazují významně vyšší mezičasovou kortikální vazbu na nAChR s vysokou afinitou63 a posttraumatická stresová porucha je spojena s větším podmiňováním strachu a spontánním obnovením vyhaslých vzpomínek na strach.64 Naše zjištění společně naznačují, že expozice nikotinu může mít vícegenerační dopad zvyšující se náchylnost potomků k symptomům podobným PTSD. Toto zjištění spolu s dalšími nedávnými zjištěními ukazujícími vícegenerační účinky expozice nikotinu na kognitivní flexibilitu2 naznačuje, že negativní zdravotní výsledky expozice nikotinu vrhají širší síť, než se dříve myslelo.

Extrakt z cistanche

REFERENCE

1 Dai J, Wang Z, Xu W a kol. Otcovská expozice nikotinu definuje odlišné chování v následující generaci prostřednictvím hyper-methylace mmu‐miR‐ 15b. Sci Rep. 2017;7(1):7286.

2. McCarthy DM, Morgan TJ Jr., Lowe SE, et al. Expozice nikotinu u myších samců způsobuje zhoršení chování u mnoha generací potomků. PLoS Biol. 2018;16(10):e2006497.

3. Zhu J, Lee KP, Spencer TJ, Biederman J, Bhide PG. Transgenerační přenos hyperaktivity u myšího modelu ADHD. J Neurosci. 2014;34(8):2768‐2773.

4. Cummings KM, Proctor RN. Měnící se veřejný obraz kouření ve Spojených státech: 1964-2014. Biomarkery epidemie rakoviny Předch. 2014;23(1):32‐36.

5. Huang LL, Kowitt SD, Sutfin EL, Patel T, Ranney LM, Goldstein AO. Užívání elektronických cigaret mezi studenty středních škol a jeho souvislost s užíváním cigaret a odvykáním kouření, North Carolina Youth Tobacco Surveys, 2011 a 2013. Předchozí Chronic Dis. 2016;13:E103.

6. Holliday ED, Nucero P, Kutlu MG, et al. Dlouhodobé účinky chronického nikotinu na emocionální a kognitivní chování a morfologii buněk hippocampu u myší: srovnání expozice nikotinu dospělých a dospívajících. Eur J Neurosci. 2016;44:2818-2828.

7. Johnson JG, Cohen P, Pine DS, Klein DF, Kasen S, Brook JS. Souvislost mezi kouřením cigaret a úzkostnými poruchami během dospívání a rané dospělosti. JAMA. 2000;284:2348-2351.

8. Jung Y, Hsieh LS, Lee AM, a kol. Epigenetický mechanismus zprostředkovává vývojové účinky nikotinu na neuronální strukturu a chování. Nat Neurosci. 2016;19(7):905‐914.

9. Gitik M, Holliday ED, Leung M, et al. Cholin zlepšuje deficity učení dospělých a ruší epigenetickou modifikaci faktorů remodelace chromatinu souvisejících s expozicí dospívajícího nikotinu. Neurobiol Learn Mem. 2018;155:239‐248.

10. Pták A. Vnímání epigenetiky. Příroda. 2007;447:396-398.

11. Skinner MK. Environmentální epigenetická transgenerační dědičnost a somatická epigenetická mitotická stabilita. Epigenetika. 2011;6:838‐842.

12. Davis JA, Gould TJ. Asociativní učení, hipokampus a závislost na nikotinu. Curr Drug Abuse Rev. 2008;1:9‐19.

13. Kutlu MG, Parikh V, Gould TJ. Závislost na nikotinu a psychiatrické poruchy. Int Rev Neurobiol. 2015;124:171‐208.

14. Parikh V, Kutlu MG, Gould TJ. Dysfunkce nAChR jako běžný substrát pro schizofrenii a komorbidní závislost na nikotinu: současné trendy a perspektivy. Schizophr Res. 2016;171:1‐15.

15. Kenney JW, Raybuck JD, Gould TJ. Nikotinové receptory v dorzálním a ventrálním hipokampu odlišně modulují kontextové podmiňování strachu. Hippocampus. 2012;22:1681-1690.

16. Wilkinson DS, Turner JR, Blendy JA, Gould TJ. Genetické pozadí ovlivňuje účinky odvykání od chronického nikotinu na učení a vysokoafinitní vazbu nikotinového acetylcholinového receptoru v dorzálním a ventrálním hipokampu. Psychofarmakologie (Berl). 2013;225(1): 201‐208.

17. Davis JA, Gould TJ. Účinky DHBE a MLA na nikotinem indukované posílení kontextového podmiňování strachu u myší C57BL/6. Psychofarmakologie (Berl). 2006;184:345-352.

18. Kutlu MG, Zeid D, Tumolo JM, Gould TJ. Preadolescentní a adolescentní myši jsou méně citlivé k účinkům akutního nikotinu na vyhynutí a spontánní zotavení. Brain Res Bull. 2018;138:50‐55.

19. Kutlu MG, Gould TJ. Akutní nikotin oddaluje zánik kontextuálního strachu u myší. Behav Brain Res. 2014;263:133‐137.

20. Benowitz NL, Hukkanen J, Jacob P 3. Nikotinová chemie, metabolismus, kinetika a biomarkery. In: Nikotinová psychofarmakologie. Berlín, Heidelberg: Springer; 2009: 29-60.

21. Davis JA, James JR, Siegel SJ, Gould TJ. Odstoupení od chronického podávání nikotinu zhoršuje kontextové podmiňování strachu u myší C57BL/6. J Neurosci. 2005;25:8708-8713.

22. Petersen DR, Norris KJ, Thompson JA. Srovnávací studie dispozice nikotinu a jeho metabolitů u tří inbredních kmenů myší. Drug Metab Dispos. 1984;12:725-731.

23. Gould TJ, Portugalsko GS, Andre JM, et al. Trvání deficitů souvisejících s vysazením nikotinu v kontextuálním podmiňování strachu paralelně se změnami v upregulaci hipokampálního vysokoafinitního nikotinového acetylcholinového receptoru. Neurofarmakologie. 2012;62:2118-2125.

24. Kutlu MG, Oliver C, Huang P, Liu‐Chen LY, Gould TJ. Zhoršení kontextuálního zániku strachu chronickým nikotinem a odvykání od chronického nikotinu je spojeno s upregulací nAChR v hipokampu. Neurofarmakologie. 2016;109:341‐348. 25. Damaj MI, Kao W, Martin BR. Charakterizace spontánního a precipitovaného odnětí nikotinu u myši. J Pharmacol Exp Ther. 2003;307:526-534.

26. Fowler CD, Lu Q, Johnson PM, Marks MJ, Kenny PJ. Habenulární alfa5 nikotinový receptor signalizace podjednotky řídí příjem nikotinu. Příroda. 2011;471:597‐601.

27. Lomazzo E, MacArthur L, Yasuda RP, Wolfe BB, Kellar KJ. Kvantitativní analýza heteromerních neuronových nikotinových receptorů v krysím hipokampu. J Neurochem. 2010;115:625‐634.

28. Turner JR, Castellano LM, Blendy JA. Paralelní anxiolytické účinky a upregulace neuronálních nikotinových acetylcholinových receptorů po chronickém nikotinu a vareniklinu. Nikotin Tob Res. 2011;13:41‐46.

29. Parikh V, Ji J, Decker MW, Starter M. Prefrontální beta2 podjednotku obsahující a alfa7 nikotinové acetylcholinové receptory odlišně řídí glutamátergní a cholinergní signalizaci. J Neurosci. 2010;30: 3518-3530.

30. Parikh V, Starter M. Přední mozek cholinergní systémy a kognice: nové poznatky založené na rychlé detekci cholinových špiček pomocí enzymových biosenzorů. In: Mikroelektrodové biosenzory. Totowa, NJ: Humana Press; 2013: 257-277.

31. Fanselow MS, Dong HW. Jsou dorzální a ventrální hipokampus funkčně odlišné struktury? Neuron. 2010;65(1):7‐19.

32. Kim D, Pertea G, Trapnell C, Pimentel H, Kelley R, Salzberg SL. TopHat2: přesné zarovnání transkriptomů v přítomnosti inzercí, delecí a genových fúzí. Genome Biol. 2013;14(4): R36.

33. Afgan E, Baker D, van den Beek M, et al. Platforma Galaxy pro dostupné, reprodukovatelné a kolaborativní biomedicínské analýzy: aktualizace 2016. Nucleic Acids Res. 2016;44:W3-w10.

34. Trapnell C, Williams BA, Pertea G, et al. Sestavení a kvantifikace transkriptů pomocí RNA‐Seq odhaluje nekomentované transkripty a přepínání izoforem během buněčné diferenciace. Nat Biotechnol. 2010;28(5): 511‐515.

35. Benjamini Y, Drai D, Elmer G, Kafkafi N, Golani I. Kontrola míry falešných objevů ve výzkumu behaviorální genetiky. Behav Brain Res. 2001; 125(1-2):279-284.

36. Kramer A, Green J, Pollard J Jr, Tugendreich S. Přístupy kauzální analýzy v Ingenuity Pathway Analysis. Bioinformatika. 2014;30(4): 523‐530.

37. Kuleshov MV, Jones MR, Rouillard AD, et al. Enrichr: aktualizace komplexního webového serveru pro analýzu obohacení genové sady pro rok 2016. Nucleic Acids Res. 2016;44(W1): W90‐W97.

38. Wendt J, Rosenbaum H, Richmond TA, Jeddeloh JA, Burgess DL. Cílené bisulfitové sekvenování pomocí systému obohacení SeqCap epi. Metody Mol Biol. 2018;1708:383‐405.

39. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: flexibilní trimr pro sekvenční data Illumina. Bioinformatika. 2014;30(15):2114‐2120.

40. Langmead B, Salzberg SL. Rychlé zarovnání s mezerami díky metodám Bowtie 2. Nat. 2012;9(4):357‐359.

41. Krueger F, Andrews SR. Bismark: flexibilní aligner a methylation caller pro aplikace Bisulfite‐Seq. Bioinformatika. 2011;27(11):1571-1572.

42. Akalin A, Kormaksson M, Li S, a kol. methylKit: komplexní balíček R pro analýzu profilů metylace DNA v celém genomu. Genome Biol. 2012;13(10): R87.

43. Gould TJ, Lommock JA. Nikotin zvyšuje kontextové podmiňování strachu a zlepšuje deficity vyvolané etanolem v kontextuálním podmiňování strachu. Behav Neurosci. 2003;117(6):1276-1282.

44. Fowler CD, Kenny PJ. Intravenózní samopodání nikotinu a obnovení vyvolané narážkou u myší: účinky dávky nikotinu, rychlost infuze drogy a předchozí přístrojový trénink. Neurofarmakologie. 2011;61(4):687‐698.

45. Gould TJ, Wehner JM. Nikotinové posílení kontextového podmiňování strachu. Behav Brain Res. 1999;102(1‐2):31‐39.

46. ​​Vassoler FM, White SL, Schmidt HD, Sadri‐Vakili G, Pierce RC. Epigenetická dědičnost fenotypu rezistence na kokain. Nat Neurosci. 2013;16(1):42‐47.

47. Goldberg LR, Gould TJ. Multigenerační a transgenerační účinky otcovské expozice zneužívaným drogám na behaviorální a nervové funkce. Eur J Neurosci. 2018;50(3):2453‐2466.

48. Zhang JJ, Jiang FZ, Zheng W, et al. DNMT3a v hipokampálním CA1 je zásadní pro získání samoaplikace morfinu u potkanů. Addict Biol. 2019; ▪: ▪‐ ▪.

49. Schwartz RD, Kellar KJ. Vazebná místa nikotinového cholinergního receptoru v mozku: regulace in vivo. Věda. 1983;220(4593):214-216.

50. Logue SF, Paylor R, Wehner JM. Hippokampální léze způsobují u inbredních myší v Morrisově vodním bludišti poruchy učení a podmíněný strach. Behav Neurosci. 1997;111(1):104-113.

51. Zhang WN, Bast T, Feldon J. Ventrální hippocampus a podmiňování strachu u potkanů: různé anterográdní amnézie strachu po infuzi N-methyl-D-aspartátu nebo jeho nekompetitivního antagonisty MK-801 do ventrálního hipokampu. Behav Brain Res. 2001;126(1‐2):159‐174.

52. Maren S, Holt WG. Podmiňování hippocampu a Pavlovova strachu u potkanů: infuze muscimolu do ventrálního, ale ne dorzálního hipokampu zhoršují získání podmíněného zmrazení na sluchový podmíněný podnět. Behav Neurosci. 2004;118(1):97‐110.

53. Staib JM, Della Valle R, Knox DK. Narušení mediálního septa a diagonálních pásů Brocovy cholinergní projekce do ventrálního hipokampu narušují paměť sluchového strachu. Neurobiol Learn Mem. 2018;152:71‐79.

54. Vasquez JH, Leong KC, Gagliardi CM, Harland B, Apicella AJ, Muzzio IA. Aktivace ventrálních hipokampálních buněk vyčnívajících do prelimbického kortexu specifická pro dráhu snižuje obnovu strachu. Neurobiol Learn Mem. 2019;161:63‐71.

55. LeDoux JE, Cicchetti P, Xagoraris A, Romanski LM. Laterální amygdaloidní jádro: senzorické rozhraní amygdaly v podmiňování strachu. J Neurosci. 1990;10(4):1062-1069.

56. Jones PA. Funkce methylace DNA: ostrovy, startovací místa, genová těla a další. Nat Rev Genet. 2012;13(7):484‐492.

57. Tanaka M, Li H, Zhang X, a kol. Oblast a čas závislá genová regulace v amygdale a přední cingulární kůře myšího modelu podobného PTSD. Mol Brain. 2019;12(1):25.

58. Pojivo EB. Role FKBP5, co-chaperonu glukokortikoidního receptoru v patogenezi a terapii afektivních a úzkostných poruch. Psychoneuroendokrinologie. 2009;34 (Suppl 1): S186-S195.

59. Sarapis C, Cai G, Bierer LM, et al. Genetické markery pro riziko PTSD a odolnost mezi těmi, kteří přežili útoky na Světové obchodní centrum. Dis Markers. 2011;30(2‐3):101‐110.

60. Yehuda R, Daskalakis NP, Desarnaud F, et al. Epigenetické biomarkery jako prediktory a koreláty zlepšení symptomů po psychoterapii u bojových veteránů s PTSD. Přední Psych. 2013;4:118.

61. Yehuda R, Cai G, Grolier JA, et al. Vzorce genové exprese spojené s posttraumatickou stresovou poruchou po vystavení útokům Světového obchodního centra. Biol Psychiatry. 2009;66:708-711.

62. Li CQ, Luo YW, Bi FF a kol. Vývoj úzkostného chování prostřednictvím hipokampální signalizace IGF-2 u potomků vystavených rodičovské expozici morfinu: účinek obohaceného prostředí. Neuropsychofarmakologie. 2014;39(12):2777‐2787.

63. Czermak C, Staley JK, Kasserman S, et al. Beta2 Dostupnost nikotinového acetylcholinového receptoru u posttraumatické stresové poruchy. Int J Neuropsychopharmacol. 2008;11(3):419‐424.

64. Milad MR, Pitman RK, Ellis CB, et al. Neurobiologický základ nevybavení extinkční paměti u posttraumatické stresové poruchy. Biol Psychiatry. 2009;66(12):1075‐1082.